JP7125341B2 - 紫外線感受性の判定方法 - Google Patents

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Description

本発明はヒト皮膚の紫外線感受性を判定する紫外線感受性の判定方法、及び紫外線感受性低減剤の評価又は選択方法に関する。
皮膚は、太陽光曝露により様々なダメージを受けている。特に紫外線領域（２９０～４００ｎｍ）の光により皮膚内に生じる活性酸素種（ＲＯＳ）やＲＯＳとの反応により生成する生体酸化物は、酸化ストレスとして皮膚に有害な作用を及ぼし、短期間の曝露により引き起こされる紅斑や色素沈着形成、さらには長期間の曝露で引き起こされる光老化や発癌などに深く関与していることが知られている（非特許文献１，２）。
この紫外線による障害から皮膚を防御する技術として、サンスクリーン剤や抗酸化剤などを皮膚に塗布し、紫外線照射によるＲＯＳや生体酸化物の産生を抑制して酸化ストレスを予防する方法がある。
一方、生体は紫外線照射等の外部刺激による酸化ストレスに対し、活性酸素種の消去システムや生体内抗酸化物質等の対抗手段を有している。しかし、これらの対抗手段は、年齢、遺伝的要因、生活習慣、食習慣等による個人差があり、個人毎に紫外線に対する予防ケアの必要性が異なってくる。そのため紫外線に対する有効な予防ケアをするには、紫外線照射等が皮膚に及ぼす酸化ストレスや皮膚内の抗酸化力を的確に評価することが必要である。
ヒト皮膚の酸化ストレスを評価する方法としては、生検皮膚を用いた方法が存在するが侵襲的であるために汎用されるには至っていない。角層テープストリッピングによる酸化タンパク質の評価は低侵襲的ではあるが、角層のみの評価に留まり、皮膚内部の状態を反映しているとは言い難い（非特許文献３）。非侵襲的な評価方法として、ラマン分光法による皮膚中カロテノイド測定の報告が存在するが、単一の抗酸化物質の評価であり、これもまた皮膚全体の応答を反映しているとは言い難い（非特許文献４）。
また、紫外線照射による酸化ストレスの感受性を直接的に評価する方法として、紫外線照射２４時間後に紅斑を形成させる最少の紫外線量（ＭＥＤ；Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｒｙｔｈｅｍａ Ｄｏｓｅ）を測定し、紫外線による紅斑のできやすさの指標とすることができるが、紫外線照射２４時間後の紅斑形成を判定する必要があるため簡便な方法とはいえない。
そのような中、非侵襲的に生体の酸化状態を評価できる技術として、生体微弱発光（バイオフォトン）の検出技術が注目されている。バイオフォトンとは、生物が生命活動に伴って放射している極めて弱い自発的発光である。その由来として、一重項酸素や励起カルボニル化合物類が推察されており、生体の酸化反応に起因した発光と考えられている。
バイオフォトンは、植物、微生物、動物など様々な生物で観測され、ヒト皮膚においては、特に紫外線Ａ波（ＵＶＡ）を照射した後のバイオフォトンが計測されており、皮膚色の違いにより発光強度が異なること（非特許文献５）、抗酸化クリーム塗布により発光が低減されることが報告されている（非特許文献６）。
しかしこれらの報告は、ＵＶＡ照射直後から数分間の積算値で評価しており、刻々と変化する酸化ストレス応答の詳細を経時的に評価しておらず、バイオフォトンがどのような挙動を示すかについて明らかにした報告も存在しない。
Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 18, 75-81 (2002) Toxicology 189, 21-39 (2003) Skin Res. Technol. 13, 84-90 (2007) J. Invest. Dermatol. 115, 441-48 (2000) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 25, 65-70 (2009) Skin Pharmacol. Physiol. 24, 300-4 (2011)
本発明は、紫外線に対する感受性を非侵襲的に即判定する方法、及び紫外線感受性低減剤を評価・探索する方法を提供することに関する。
本発明者らは、紫外線による皮膚のダメージを早期に評価し得る方法について検討した結果、ヒト皮膚に紫外線を照射してから所定時間内に検出されるバイオフォトンが、翌日に発症する紅斑形成に深く関与し、当該バイオフォトンの量を指標として、紫外線に対する感受性の評価や、紫外線感受性を低減させる素材の評価・探索ができることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）被験者の皮膚に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて紫外線感受性を判定する工程を含む紫外線感受性の判定方法であって、該所定期間は、その５０％以上が照射後１～３分の期間と重なる期間である、方法。
２）試験物質を被検対象に投与又は接触させる工程、及び被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて試験物質を評価する工程を含む紫外線感受性低減剤の評価又は探索方法であって、該所定期間は、その５０％以上が照射後１～３分の期間と重なる期間である、方法。
本発明によれば、紫外線に対する感受性を非侵襲的に即判定でき、紫外線による紅斑形成を未然に防止するための対策、具体的には紫外線の物理的な防御やサンスクリーン等の紫外線防御用皮膚外用剤の塗布等の対策に役立てることができる。また、本発明によれば、紫外線感受性低減剤を簡易且つ効率よく評価又は探索することができる。
紫外線照射後のバイオフォトン量の推移を示す図。 ローズマリー水溶液連続塗布後の応答バイオフォトン量を示す図。
本発明の紫外線感受性の判定方法では、被験者の皮膚に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトン量が指標として用いられる。
また、本発明の紫外線感受性低減剤の評価又は探索方法では、試験物質を被検対象の皮膚又は皮膚細胞に投与又は接触させ、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射した場合の、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトン量が指標として用いられる。
本発明の方法において、照射する紫外線としては、紫外領域に波長を有する光線であれば特に限定されず、具体的には波長が２８５～３２０ｎｍのＵＶ－Ｂ波、または３２０～４００ｎｍのＵＶ－Ａ波が挙げられる。本発明ではＡ波とＢ波の混合紫外線が好ましく、光の強度の割合（Ａ波／Ｂ波）が６～２０であるのが好ましく、７～１５であるのがより好ましく、８～１２であるのが更に好ましい。
照射する紫外線の強度は特に限定されないが、例えば、好ましくは１０ｍＷ／ｃｍ２以上、より好ましくは２０ｍＷ／ｃｍ２以上、より好ましくは３０ｍＷ／ｃｍ２以上であり、且つ好ましくは２００ｍＷ／ｃｍ２以下、より好ましくは１７０ｍＷ／ｃｍ２以下、より好ましくは１５０ｍＷ／ｃｍ２以下である。また、好ましくは１０～２００ｍＷ／ｃｍ２、より好ましくは２０～１７０ｍＷ／ｃｍ２、より好ましくは３０～１５０ｍＷ／ｃｍ２である。なお、本発明において紫外線の強度とは、ＵＶ－Ｂ波とＵＶ－Ａ波を合わせた波長領域（２８５～４００ｎｍ）の紫外線の強度を意味する。
紫外線の強度は、市販されている計測器を用いて計測することが可能であり、Solarmeter Model 5.0 (UVA+B)（Solartech Inc.）、多目的分光放射計 ＭＳＲ－７０００Ｎ（オプトリサーチ社）などが挙げられる。
また、照射時間は、照射する紫外線の強度によって異なるが、例えば５～３００秒間が挙げられ、好ましくは５～２４０秒間、更に好ましくは５～２００秒間である。
照射紫外線強度と照射時間により決定される紫外線照射量（照射エネルギー）としては、好ましくは３００～８０００ｍＪ／ｃｍ２であり、より好ましくは５００～７０００ｍＪ／ｃｍ２、さらに好ましくは６００～６０００ｍＪ／ｃｍ２である。
紫外線を照射するための紫外線照射装置は、上述した波長範囲の光を発することが可能な光源を備えていれば特に限定されず、光源としては、例えば、低圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ウッドランプ、蛍光検査灯等が挙げられ、好ましくはキセノンランプである。
斯かる光源に、必要に応じて、紫外線領域の波長の光を選択できるフィルターを組み合わせることにより、照射波長が調節される。
紫外線照射が行われる被験者の皮膚部位としては、紫外線照射やバイオフォトン測定が可能な部位であれば特に限定されないが、生活紫外線に晒される可能性の高い部位は、日々の紫外線照射の影響により紫外線感受性が変動し、本発明の方法における測定値のバラツキの原因となるおそれがあるため、生活紫外線を受けにくい部位が好ましい。具体的には、前腕内側部、上腕内側部、背部、臀部、腹部等の皮膚が挙げられ、前腕内側部、上腕内側部、背部、臀部が好ましく、前腕内側部又は腹部がより好ましい。
また、本発明の紫外線感受性の評価又は選択方法における被検対象としては、ヒト（被験者）の他に、培養表皮細胞や３Ｄ皮膚モデルや培養皮膚組織等が含まれ、紫外線照射は、上記と同様の被験者の皮膚部位、又は培養表皮細胞や皮膚培養組織における当該細胞又は組織（皮膚）に対して行われる。培養表皮細胞としては、好ましくは表皮角化細胞（ケラチノサイト）が挙げられ、３次元培養皮膚細胞としては、EpiDermTM（MatTek Corporation社製）、EpiSkin（SkinEthic社製）、RHE（SkinEthic社製）、Labcyteエピモデル（J-TEC社製）等の市販品が使用できる。
後記試験例１に示すとおり、皮膚に紫外線照射した場合に発生するバイオフォトンは、紫外線照射直後に最大の発光強度を示し、その後発光は経時的に減衰する。そして本発明により、照射後主として１～３分の期間における発光強度と、紫外線照射２４時間後において観察される紅斑形成が相関することが見出された（試験例２及び３）。
よって、本発明の紫外線感受性の判定方法、又は紫外線感受性低減剤の評価又は探索方法においては、紫外線照射後１～３分の期間と、その５０％以上が当該期間と重なる期間を所定期間とし、当該所定期間のバイオフォトン量が判定又は評価に用いられる。
所定期間は、その５０％以上が上記照射後１～３分の期間と重なる期間として設定されるが、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上が照射後１～３分の期間と重なるように設定するのが好ましく、その１００％が重なる、照射後１～３分内の期間であるのがより好ましい。
ここで、所定期間と照射後１～３分の期間が重なるとは、両期間に共通の期間が存在することを意味し、その５０％以上が重なるとは所定期間の５０％以上が照射後１～３分の期間と重なることを意味する。
また、紫外線照射直後の初期期間はバイオフォトン量が多く、本発明の判定又は評価に及ぼす影響が大きいことから、本発明の所定期間は、紫外線照射直後の初期期間と重ならないように設定するのが好ましい。具体的には、照射終了後から１５秒まで、好ましくは３０秒まで、より好ましくは４５秒までの初期期間と重ならないように設定するのが好ましい。
所定期間の長さは、有効な量のバイオフォトンを測定する観点から、好ましくは３０秒間～３分間、より好ましくは４０秒間～２分間、より好ましくは５０秒間～１分３０秒間、より好ましくは１分間である。
より好適な所定期間としては、例えば照射後１～２分の１分間、照射後２～３分の１分間、照射後１～３分の２分間が挙げられる。
バイオフォトンの検出は、極微弱なバイオフォトンの検出が可能な高感度で低ノイズのＣＣＤ等の検出部を備えた光学検出装置によって行われる。光学検出装置としては、例えば、微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いることができる。検出される放射光の波長は検出装置の光電子増倍管により異なるが、前記装置では３００～８５０ｎｍのバイオフォトンが検出される。また、バイオフォトンの測定は、測定環境に由来する光の影響を極力抑えるため、可能な限り遮光された空間で実施されるのが好ましく、例えば暗室にて実施される。
すなわち、暗室にて、前記の紫外線照射装置を用いて測定部位に紫外線を照射し、次に微弱発光強度検出装置により紫外線照射部位から発するバイオフォトンを測定するのが好ましい。また、紫外線照射装置における紫外線放射部と微弱発光強度検出装置における検出部は別々であっても良いが、紫外線照射とバイオフォトンの検出が装置を付け替えることなく行えるという観点から、紫外線放射部（具体的には紫外線照射装置から伸びている光照射用のファイバー）と検出部を一体とし、光路の切り替えによって使用する装置が替えられる構造となっていることが好ましい。
紫外線照射により発生したバイオフォトンは、予め紫外線照射前の安静時の発光強度（「定常バイオフォトン」とも称す）を測定しておき、続いて紫外線照射後の所定期間内における発光強度（「照射後バイオフォトン」とも称す）を測定し、その値から安静時発光強度を引いた値を発光増分（「応答バイオフォトン」とも称す）として算出できる。
上記のとおり、紫外線照射後２４時間後に観察される紅斑の程度は、紫外線照射後１～３分の期間に検出されるバイオフォトンの量と正の相関を示す。従って、該バイオフォトン量は、紫外線に対する感受性を判定するため、或いは紫外線感受性低減剤を評価又は探索するための指標として利用することが可能である。ここで、「紫外線に対する感受性」とは、紫外線により惹起される紅斑などの炎症性の反応の強弱や持続時間によって示される炎症性反応の程度を指し、その炎症性反応の程度が紫外線に対する感受性を意味する。また、「紫外線感受性の低減」とは、当該紫外線に対する感受性を緩和又は抑制し、紫外線により惹起される紅斑などの炎症性反応の発症を抑制することを意味する。
本発明の紫外線感受性の判定方法においては、例えば、年齢若しくは年代毎、又は性別毎に予め本発明における紫外線照射後の一定期間に検出されるバイオフォトンの量を測定して、基礎データとして取得しておき、それらから算出された平均値と標準偏差から、被験者の年齢（年代）、性別における偏差値を計算して、紫外線に対する感受性判定の指標とすることができる。
または、感受性が高い（赤くなり易い）、やや感受性が高い（やや赤くなり易い）、標準、やや感受性が低い（やや赤くなりにくい）、感受性が低い（赤くなりにくい）等の紫外線に対する感受性の判定指標に関し、それらと偏差値範囲を関係づける適当な評価基準を作成し、それに基づいて被験者の偏差値から紫外線に対する被験者の感受性を判定することもできる。
上記による紫外線感受性の判定方法は、従来のＭＥＤ測定と比較すると非常に短時間で判定可能で、被験者への負担も少ない。本発明の判定方法により得られた紫外線感受性に関する情報は、紫外線に対する物理的な防御対策やサンスクリーン等の紫外線防御用皮膚外用剤の塗布による紫外線対策に、紫外線防御用皮膚外用剤の購入時における製品選択や紫外線防御用皮膚外用剤の推奨販売における製品推奨の指標として、役立てることができる。
本発明の紫外線感受性の判定方法は、所謂人間の身体の各器官の構造又は機能を計測する等して人体から各種の資料を収集するための方法に該当し、上記の目的で使用される。すなわち、医療目的で人間の病状や健康状態等の身体状態又は精神状態を判断するものではない。斯かる意味において、本発明の紫外線感受性の判定方法は、紫外線感受性の測定方法或いは紫外線感受性の検査方法とも表記し得る。
本発明の紫外線感受性低減剤の評価又は探索は、試験物質を被検対象に投与又は接触させる工程を含み、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて試験物質の評価が行われる。
ここで、投与される試験物質としては、特に制限されず、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。但し、安全性が確保された既知の物質、例えば医薬品、化粧品、及びそれらの原料として使用されている物質や組成物であることが好ましい。尚、試験物質が医薬品や化粧品等の組成物である場合、該組成物が紫外線吸収剤や紫外線散乱剤等の紫外線防御素材を含有していると、本評価又は探索法における紫外線照射において、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に照射される紫外線が物理的に防御されてしまうため、検出されるバイオフォトン量に影響を及ぼすおそれがある。従って、本評価又は探索法において試験物質が組成物である場合、該組成物は、紫外線吸収剤や紫外線散乱剤等の紫外線防御素材を含有していない組成物であることが好ましい。または、本評価又は探索法において試験物質として紫外線防御素材を含有する組成物を評価する場合、バイオフォトン測定前又は紫外線照射前に該組成物を被検対象の皮膚又は皮膚細胞から除く処理を行うことが好ましい。
試験物質の投与形態は、経口又は非経口投与のいずれでも良いが、非経口投与の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の種々の形態で皮膚に塗布する形態が好ましい。
また、試験物質を被検対象へ投与又は接触させる回数は特に限定されない。また、紫外線照射と同時又は直前の単回投与又は接触であっても良いが、紫外線照射前に所定の投与又は接触期間を設け、その期間内において所定の投与又は接触頻度で１回又は複数回投与若しくは接触するのが好ましい。被検対象がヒトである場合、投与期間としては、１日以上が好ましく、１週間以上がより好ましく、４週間以上がさらに好ましい。また６ヶ月以下が好ましく、３ヶ月以下がより好ましく、２ヶ月以下がさらに好ましい。投与頻度は、１日当たり１回以上が好ましく、１回～５回がより好ましく、１回～３回がさらに好ましく、２回がさらに好ましい。
被検対象として培養表皮細胞や３Ｄ皮膚モデルや培養皮膚組織等を用いる場合、接触期間は１時間以上が好ましく、６時間以上がよりに好ましく、２４時間以上がさらに好ましい。また７２時間以下が好ましく、３６時間以下がより好ましく、４８時間以下がさらに好ましい。接触頻度は前記接触期間中１回以上が好ましく、１～４回がより好ましく、１又は２回がさらに好ましい。
そして、紫外線照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンが測定され、バイオフォトン量を低下させる試験物質が、紫外線感受性低減剤として評価される。
バイオフォトン量を低下させる試験物質の同定は、例えば、異なる濃度の試験物質を投与した場合に測定されるバイオフォトン量を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質投与群とより低濃度の試験物質投与群との間；試験物質投与群とプラセボ投与群との間；試験物質投与群と無投与群との間；又は試験物質投与前後で、バイオフォトン量を比較する。試験物質の投与により、又はより高濃度の試験物質の投与によりバイオフォトン量が低下する場合、当該試験物質をバイオフォトン量低下物質として同定することができる。
例えば、試験物質投与群におけるバイオフォトン量が対照群（プラセボ投与群又は無投与群）と比較して低下傾向が認められた場合、好ましくは統計学的に有意な低下が認められた場合、当該試験物質をバイオフォトン量低下物質として同定することができる。
そして、同定されたバイオフォトン量を低下させる試験物質は、紫外線感受性低減剤として評価することができる。
このようにして選択された紫外線感受性低減剤は、例えば、紫外線感受性を低減するための皮膚外用剤として使用すること、或いは紫外線感受性を低減するための素材又は製剤として皮膚外用剤に配合して使用することができる。
紫外線照射装置
光源としてキセノンランプを備えた３００Ｗ型のキセノン光源（ＭＡＸ－３０１、朝日分光社製）に、ＷＧ－３２０フィルター（厚さ１ｍｍ、渋谷光学社製）を取り付けて使用した（紫外線Ａ波（ＵＶＡ）：紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）＝１０．８：１）。
試験例１ ヒトにおける紫外線照射による微弱発光
被験者は３０歳代健常男性１名で、暗室中にて１０分間馴化した後に測定を行った。測定には微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用い、安静座位にて装置の検出部アタッチメントと前腕内側とを密着させた。なお該検出部アタッチメントには紫外線照射装置からの光照射用ファイバーが繋がって一体となっており、光路を切り替えることで紫外線照射と微弱発光強度検出が替えられる構造となっている。部位を変えて紫外線照射を行い（紫外線強度は１５．４、３２．５又は６１．６ｍＷ／ｃｍ２、照射時間１２０秒間、紫外線照射量は、それぞれ１．８、３．９又は７．４Ｊ／ｃｍ２）、それぞれ照射終了２秒後からの発光強度を１０分間計測した。
計測の結果を図１に示す。紫外線照射による皮膚からのバイオフォトン量は、紫外線照射直後に最大となった後、急速に減少し、ある程度減少した後は時間経過とともに徐々に減衰していくことが確認された。
試験例２ ヒトにおける微弱発光計測と紅斑評価（１）
紫外線照射と微弱発光強度検出は、試験例１と同じ装置を用い、同じ手順にて行った。被験者は２０～３０歳代健常男性３名とし、安静座位にて装置の検出部アタッチメントと前腕内側とを密着させた。紫外線照射前に、安静時の発光強度を３分間計測した。続いて、紫外線照射を行い、照射終了２秒後からの発光強度を１０分間計測した。各時間区分の発光の平均値から安静時発光を引いた値を、紫外線照射による発光増分として算出した。紫外線照射とその後の微弱発光計測は、照射部位を変えて複数の紫外線照射条件で行った。具体的な照射条件と計測結果については表１に記載した。
また、紫外線照射部位における紅斑形成は、照射２４時間後に高速分光光度計（ＣＭＳ－３５ＦＳ、村上色彩技術研究所製）を用いて皮膚色を測定し、照射部位と照射部位近傍の非照射部位との赤みの差分（Δａ＊）として評価し、その結果を表１に記載した。
表１の結果から、Δａ＊と紫外線照射による発光増分との相関係数（Ｒ）を算出した（表２）。
Figure 0007125341000001
Figure 0007125341000002
試験例３ ヒトにおける微弱発光計測と紅斑評価（２）
紫外線照射と微弱発光強度検出は、試験例１と同じ装置を用い、同じ手順にて行った。被験者は２０～３０歳代健常男性１０名とし、安静座位にて装置の検出部アタッチメントと上腕内側とを密着させた。紫外線照射前に、安静時の発光強度を３分間計測した。続いて、紫外線照射を行い、照射終了２秒後からの発光強度を５分間計測した。各時間区分の発光の平均値から安静時発光を引いた値を、紫外線照射による発光増分として算出した。紫外線照射とその後の微弱発光計測は、照射部位を変えて複数の紫外線照射条件で行った。具体的な照射条件と計測結果については表３に記載した。
また、紫外線照射部位における紅斑形成は、試験例２と同様に、赤みの差分（Δａ＊）として評価し、その結果を表３に記載した。
表３の結果から、Δａ＊と紫外線照射による発光増分との相関係数（Ｒ）を算出した（表４）。
Figure 0007125341000003
Figure 0007125341000004
表２、表４に示されるように、紫外線照射後１～２分と２～３分の期間に検出されるバイオフォトン（応答バイオフォトン）の量は、紫外線照射後の紅斑形成の程度と有意な正の相関関係を有することが分かる。
従って、紫外線照射後主として１～３分の期間に検出されるバイオフォトンの量を指標として、紫外線による紅斑形成に代表される炎症性の反応に関する感受性を判定することができる。
試験例４ 紫外線感受性低減剤の評価
１）被験者：健常な成人日本人男性１０名
２）試験品： ３．０％（ｖ／ｖ）＊ ファルコレックス ローズマリー Ｅ 水溶液
１．０％（ｖ／ｖ）＊ ファルコレックス ローズマリー Ｅ 水溶液
プラセボ水溶液
＊試験品である水溶液中におけるファルコレックス ローズマリー Ｅ（一丸ファルコス株式会社製）の濃度
３）応答バイオフォトン測定及び解析：
応答バイオフォトンについては、下記に示す定常バイオフォトンと照射後バイオフォトンを測定し、光照射終了後１－３分の期間の照射後バイオフォトン測定値から定常バイオフォトン測定値を減算することで算出した。統計解析は一元配置分散分析及びBonferroniの多重比較により有意差検定を実施した。
＜定常バイオフォトン＞
微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて、紫外線照射前における各被験部位における微弱発光を１分間計測した。
＜照射後バイオフォトン＞
試験例１と同じ紫外線照射装置を用いて１４３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外光（太陽光と同等の波長域）を被験部位に照射し、微弱発光強度検出装置を用いて、紫外線照射直後から３分までの各被験部位の微弱発光を計測した。
４）試験手順：
腹部をウェットティッシュにて清拭し、被験部位として３ヶ所のマーキングを行った。被験部位は５ｃｍ四方（５×５ｃｍ）とした。暗室にて１０分間の馴化後、バイオフォトン計測を行った。測定日の夕方から、上記試験品を１日２回（朝、夕）４週間、被験部位３ヶ所にそれぞれ２ｍｇ／ｃｍ２塗布してもらった。連用後、連用前と同様の手順でバイオフォトン計測を行った。
５）結果
連用後の応答バイオフォトン値を図２に示す。プラセボと比較した結果、ローズマリー３．０％水溶液で有意に低下した。尚、ローズマリーは、その抽出物の事前塗布により紫外線照射による紅斑形成を抑制することが公知である（特開２００２－８７９７５号公報）。
試験例５ 紫外線感受性低減剤の評価（培養細胞を用いた評価）
１）細胞：正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞（凍結HEKn、LifeTechnologies）
（培養条件）
増殖添加剤（HuMedia-KG、クラボウ）を含む表皮角化細胞用増殖培地（EpiLife、LifeTechnologies）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で常法に従って培養した。微弱発光測定には、Hank’s Balanced Salt Solutions（HBSS、Invitrogen）で洗浄してから細胞を回収した後、HBSSに４×１０６cells/mlとなるように懸濁させた細胞懸濁液を供した。
２）試験品：Ｔｒｏｌｏｘ（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）（Aldrich）
３）応答バイオフォトンの測定：
応答バイオフォトンについては、下記に示す定常バイオフォトンと照射後バイオフォトンを測定し、光照射終了後２～３分の期間の照射後バイオフォトン測定値から定常バイオフォトン測定値を減算することで算出した。尚、バイオフォトン測定及び紫外線照射は、ディッシュの蓋を外した条件下にて行った。
＜定常バイオフォトン＞
細胞懸濁液１．０ｍｌを３５ｍｍディッシュにとり、微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて暗室中にて紫外線照射前の発光強度を３分間測定した。
＜照射後バイオフォトン＞
試験例１と同じ紫外線照射装置を用いて、太陽紫外光シミュレーター光（１２５ｍＷ／ｃｍ２）を４０秒間照射し、照射後の発光強度を５分間計測した。
４）試験方法
７０～８０％コンフルエント状態の正常ヒト表皮角化細胞に、Ｔｒｏｌｏｘ（終濃度１００μＭ）若しくは対照溶媒（７０％ エタノール）を添加した。２４時間後に細胞を回収し、上述の方法に基づき、応答バイオフォトンの測定を行った。測定データは、対照溶媒群の値を１として相対的に評価した。
５）結果
表５に示すように、対照溶媒群に比較して、ビタミンＥの水溶性アナログであり抗酸化剤として知られているＴｒｏｌｏｘ添加群にて応答バイオフォトン強度の抑制傾向が認められた（ｐ＜０．１：対応のないｔ検定、両側）。
Figure 0007125341000005
試験例６ 紫外線感受性低減剤の評価（組織培養皮膚を用いた評価）
１）皮膚組織：米国スキンバンクNational Disease Research Interchange（NDRI）から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を購入した。なお、組織提供機関において、皮膚組織を研究用途で使用することに対する同意が書面で所得されている。
（培養条件）
ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約１ｃｍ×１ｃｍの大きさに小片化し、６穴プレートを使用して３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培養には、Fetal Bovine Serum（FBS）を１０％（v/v）含むAdvanced Dulbecco's Modified Eagle Medium（いずれもLife Technologies）を使用した。
培養１日後の皮膚をバイオフォトン測定に供した。
２）試験品：Ｔｒｏｌｏｘ（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）
３）応答バイオフォトンの測定：
応答バイオフォトンについては、下記に示す定常バイオフォトンと照射後バイオフォトンを測定し、光照射終了後１～３分の期間の照射後バイオフォトン測定値から定常バイオフォトン測定値を減算することで算出した。尚、バイオフォトン測定及び紫外線照射は、皮膚組織を培養液から取り出した条件下にて行った。
＜定常バイオフォトン＞
微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて暗室中にて太陽紫外光シミュレーター光照射前の発光強度を３分間測定した。
＜照射後バイオフォトン＞
試験例１と同じ紫外線照射装置を用いて、太陽紫外光シミュレーター光（３０ｍＷ／ｃｍ２）を３分２０秒間照射し、照射後の発光強度を５分間計測した。
４）試験方法
培養１日後の培養ヒト皮膚組織に、Ｔｒｏｌｏｘ（終濃度１００μＭ）若しくは対照溶媒（７０％エタノール）を培地中に添加し、２４時間後に皮膚組織をＰＢＳで洗浄した後、上述の方法に基づき、応答バイオフォトンの計測を行った。測定データは、対照溶媒群の値を１として相対的に評価した。
５）結果
表６に示すように、対照溶媒群に比較してＴｒｏｌｏｘ添加群にて応答バイオフォトン強度の有意な抑制が認められた（ｐ＜０．０５：対応のないｔ検定、両側）。
Figure 0007125341000006

Claims (8)

  1. 被験者の皮膚に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて紫外線感受性を判定する工程を含む紫外線感受性の判定方法であって、該所定期間は、その５０％以上が照射後１～３分の期間と重なる期間である、方法。
  2. 所定期間の長さが、３０秒間～３分間である請求項１記載の方法。
  3. 所定期間が、紫外線照射後１～２分の１分間、紫外線照射後２～３分の１分間、又は紫外線照射後１～３分の２分間である請求項１又は２記載の方法。
  4. 紫外線照射が、Ａ波とＢ波の混合紫外線の照射である請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 紫外線照射が、３００～８０００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線照射量である請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. バイオフォトンの発光強度によりバイオフォトンの量を算出する請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 紫外線感受性が、紫外線による紅斑形成である請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 試験物質を被検対象に投与又は接触させる工程、及び被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて試験物質を評価する工程を含む紫外線感受性低減剤の評価又は探索方法であって、該所定期間は、その５０％以上が照射後１～３分の期間と重なる期間である、方法。
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