CN112641429A - 一种抗氧化效能的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗氧化效能的检测方法。所述方法包括荧光检测皮肤中类胡萝卜素的量。

Description

一种抗氧化效能的检测方法
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，特别涉及到类胡萝卜素作为抗氧化指标，荧光光谱在体检测产品的抗氧化性能的方法。
背景技术
皮肤氧化损伤会导致皮肤产生过多的自由基，而这些自由基会攻击肌肤细胞，引起肌体老化、肌肤衰老以及免疫力下降，造成胶原和弹性纤维松弛，表皮细胞新生减缓、脸色暗沉，水分大量流失等。
目前对于抗氧化剂的评价方法主要分为体外和体内两类。体外评估方法主要包括DPPH、超氧、羟基自由基等自由基清除试验，体外模拟生成活性氧自由基，易受溶剂体系的影响，与机体的细胞水平的自由基有很大差距，无法考虑到抗氧化样品的吸收，代谢和药效等因素。体内抗氧化评估主要通过检测抗氧化物质(如抗氧化物歧化酶(SOD)、ROS水平等)对动物模型相关抗氧化指标的影响，以反映其抗氧化作用的强弱。动物损伤模型的评价方法也存在缺点，诱导剂对动物组织损伤使其发生氧化应激反应，然后给药(抗氧化物质)，检测到氧化损伤相应的指标改善时，不一定抗氧化应激就是其作用机制，也有可能是药物的其他作用减轻或缓解了诱导剂对机体的伤害，进而减弱或消除了组织氧化应激损伤的现象。
类胡萝卜素是皮肤主要的抗氧化系统之一，是具有8个异戊二烯共轭双键基本单位组成多烯链化合物，主要包括胡萝卜素和叶黄素两大类，最大吸收峰通常在450～570nm之间。人体自身不能合成类胡萝卜素，血液和皮肤中的类胡萝卜素主要来自于水果和食物的摄入，人每天从食物和水果中摄入的类胡萝卜素约为6mg。皮肤中的类胡萝卜素主要有叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、β-胡萝卜素、番茄红素及茄红素，正常生理状态下，它们的含量主要在0–10nmol/g。据文献报道，日常连续摄入含类胡萝卜素较多的食物和水果(如；胡萝卜、西兰花、西红柿等)，人体内的类胡萝卜素的含量会相应升高。
类胡萝素在对抗氧化应激反应方面发挥着重要作用，尤其是β-胡萝卜素、叶黄素和番茄红素，其抗氧化活性的主要机制是：(1)通过淬灭单线态氧和消除自由基；(2)淬灭自由基阻断自氧化的链式反应，防止自由基对蛋白质、脂质、DNA的过氧化损伤；(3)通过电子转移的方式来清除自由基；(4)可以与自由基发生加成反应，形成类胡萝卜素加合自由基。
目前针对类胡萝卜素的测试方法主要有HPLC法和光学检测法，光学检测法包括共振拉曼光谱法(RRS法)和反射光谱法(RS法)。
HPLC法主要测试血液或其他组织中的类胡萝卜素含量，需要活检和合适的提取方法，除了志愿者的不适，这是一种耗时的方法，也可能会导致类胡萝卜素的氧化损失。因此，它不适合高通量分析和人体皮肤类胡萝卜素水平变化的动力学分析。
RRS法是一种激光光谱学方法，用于检测分子的振动/旋转能级。典型的类胡萝卜素RRS谱主要有三个强而清晰的斯托克斯峰，分别为1525cm-1(C＝C拉伸)、1159cm-1(C-C拉伸)和1008cm-1(C-CH3摇摆运动)，可以此来定量检测类胡萝卜素的含量。RRS法具有高分子特异性、快速、高灵敏性，可选择性检测胡萝卜素和番茄红素，已被应用于营养科学、医学研究等领域中，但该法也存在一定的缺点，如响应信号较弱、仪器设备复杂、需要外部的灵敏度校准，在测试皮肤中类胡萝卜素量时易受黑色素影响。
RS法主要用相同的紫外-可见光谱去测量β-胡萝卜素和几乎所有的类胡萝卜素(除了α-胡萝卜素、叶黄素、β-隐黄质和番茄红素)，主要采用Multiscan OS 20分光光度计和全硅光纤反射束进行无损伤收集350～850nm范围内反射光谱，一般采用二氧化钛作为空白参考标准。RS法具有信号强度高、快速、仪器设备简单、自我校准的优势，但相对于RRS法其灵敏度和特异性较低，在皮肤中应用时也需要克服皮肤的光学特性(自发荧光、皮肤水合、汗液和皮脂生成)干扰及其他有色分子干扰，如黑色素、血红蛋白、氧血红蛋白及胆红素等。
因此，本领域迫切需要提供一种适用于抗氧化剂的在体评价的操作简单、灵敏且可靠的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种在体抗氧化能力的检测方法。
本发明提供一种抗氧化效能的检测方法，所述方法包括荧光检测皮肤中类胡萝卜素的量。
在另一实施方式中，所述方法包括在对皮肤进行紫外光照射前后荧光检测皮肤中类胡萝卜素的量的变化。
在另一实施方式中，所述方法包括步骤：
(1)使皮肤的空白区域和样品区域分别进行荧光检测，得到相应的类胡萝卜素荧光强度H0空白和HO样品；
(2)使步骤(1)中的皮肤的空白区域和样品区域分别进行紫外光照射；
(3)使步骤(2)中经过紫外光照射的皮肤的空白区域和样品区域分别进行荧光检测，得到相应的类胡萝卜素荧光强度H1空白和H1样品；和
(4)根据公式Ⅰ计算样品相对于空白的抗氧化效能：
抗氧化效能＝AC＝((H0空白-H1空白)平均值-(H0样品-H1样品)平均值)/(H0空白-H1空白)平均值*100％＝[1-(H0样品-H1样品)平均值/(H0空白-H1空白)平均值]*100％(Ⅰ)。
在另一实施方式中，步骤(1)在使用样品10-60分钟后进行荧光检测；较佳地，步骤(1)在使用样品30-60分钟后进行荧光检测。
在另一实施方式中，步骤(3)在步骤(2)紫外光照射结束后0-30分钟内进行；较佳地，步骤(3)在步骤(2)紫外光照射结束后0-10分钟内进行。
在另一实施方式中，所述紫外照射剂量为60-80mJ/cm2。
在另一实施方式中，所述荧光强度为激发光350nm，发射光450±4nm处的荧光强度。
据此，本发明提供了一种适用于抗氧化剂的在体评价的操作简单、灵敏且可靠的方法。
附图说明
图1显示实施例中涉及的手臂前臂内侧测试区域(方款内为测试区域)。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，根据类胡萝卜素在一定波长激发下可自发荧光的特性，以类胡萝卜素作为抗氧化指标，通过荧光检测的方法在体评价产品的抗氧化性能。
荧光光谱分析法荧光分析法是指利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法，可在固定的激发光下，在一定发射波长范围内测试荧光物质的荧光强度。类胡萝卜素因其连续的共轭结构具有荧光的特性，在最大350nm激发光下，可观察到452nm的发射光谱，类胡萝卜素的含量越高，其荧光响应信号越强，相应的荧光强度也越高。
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
如本文所用，“类胡萝卜素”是一类天然色素的总称，是一组由8个异戊二烯基本单位构成的多烯链化合物，主要包括胡萝卜素(如：β-胡萝卜素)和叶黄素(如：叶黄素)两大类：
Figure BDA0002858201990000041
并且在激发光350nm，发射光400-480nm下能被检测到荧光。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征，如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
本发明提供一种在体评价产品(样品)抗氧化性能的方法，包括步骤：
第一步，通过荧光光谱仪在最大激发光350nm，发射光400～480nm下检测皮肤中类胡萝卜素的荧光强度H0；
第二步，对皮肤进行紫外(UV)照射；
第三步，通过荧光光谱仪在最大激发光350nm，发射光400～480nm下检测皮肤中类胡萝卜素的荧光强度H1；
第四步，通过H0和H1判断在皮肤上涂抹的产品的抗氧化性能。
上述四步中涉及的皮肤为身体同一部位的皮肤。对于所采用的身体部位没有特别要求，只要是能够通过荧光光谱仪测到类胡萝卜素的荧光强度的部位，例如但不限于，手臂的前臂、手臂的上臂、腹部、大腿、小腿、脸部等。
上述第一步中在皮肤上划分空白区域和样品区域，空白区域即不涂抹样品的区域，而样品区域则涂抹样品；可以根据样品的数量、种类设置n个样品区域；在本发明的一种较佳实施方式中，空白区域与样品区域来自身体相同部位，更佳地，空白区域与样品区域的面积相同或相近。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步在各样品区域涂抹的样品量需基本相同，例如但不限于，1-5mg/cm2、2-4mg/cm2等。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步在涂抹了样品一定时间后进行类胡萝卜素荧光强度的测定，所述时间可以是10-60分钟，例如但不限于，10-45分钟、20-40分钟、15-50分钟、25-35分钟等，只要空白区域、各样品区域所等待的时间基本相同。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步中空白区域测得的荧光强度为H0空白，样品区域测到的荧光强度为H0样品；n个样品区域则有n个H0样品。
在本发明的一种较佳实施方式中，上述第一步中的荧光强度在激发光350nm，发射光450±4nm处测得。
上述第二步中，对皮肤上各区域的UV照射剂量基本相同，例如但不限于，60-80mJ/cm2、65-72mJ/cm2、68-75mJ/cm2等。
上述第二步中，对皮肤上各区域的UV照射时间基本相同，例如但不限于，1-5分钟、2-5分钟、3-4.5分钟等。
在本发明的一种实施方式中，在上述第二步UV照射结束后一段时间进行上述第三步，该时间段可以为0-30分钟，例如但不限于，15分钟、25分钟、10分钟等。
在本发明的一种实施方式中，上述第三步中空白区域测得的荧光强度为H1空白，样品区域测到的荧光强度为H1样品，如果有n个样品区域，则有n个H1样品。
在本发明的一种较佳实施方式中，上述第三步中的荧光强度在激发光350nm，发射光450±4nm处测得。
上述第四步通过下述公式(Ⅰ)判断在皮肤上涂抹的每种产品相对于空白的抗氧化效能(Antioxidant capacity，AC)：
AC＝((H0空白-H1空白)平均值-(H0样品-H1样品)平均值)/(H0空白-H1空白)平均值*100％＝[1-(H0样品-H1样品)平均值/(H0空白-H1空白)平均值]*100％ (Ⅰ)
其中的平均值是指同一区域同一样品(或空白)多人一次测定获得的HO与H1的差值的算术平均值。
在本发明的一种实施方式中，UV照射前后和/或各样品的差异采用方差分析法，p＜0.1。
本发明测定的产品/样品可以是各种可施用于人皮肤的化妆品或个人洗护产品，包括但不限于，隔离霜、防晒霜、面霜、眼霜、乳液、精华液、化妆水、遮瑕膏、胭脂等。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，只要这些特征的组合不存在矛盾，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明可以弥补体外自由基清除测试模拟的自由基单一，及无法考虑样品吸收等影响因素，使其与在体应用效果差异较大的缺陷；以及细胞动物损伤模型存在操作较复杂、用时较久等缺陷。
2、本发明提供的在体评估方法操作简单，荧光光谱设备灵敏度高，结果更能相对准确地反映皮肤使用后产品真实的抗氧化性能。
3、本发明可以以类胡萝卜素作为抗氧化指标，直接在人体皮肤上使用，检测UV照射前后，空白组及产品组类胡萝卜素的含量变化，进而反映产品对皮肤UV照射后过氧化的保护程度；
本发明检测UV照射后，活性物不同剂量的产品的抗氧化性能会呈现一定的差异性。产品抗氧化效果可以以抗氧化效能(Antioxidant capacity，AC)表示，此效能是相对于空白对照对皮肤的保护效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量(克)。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
类胡萝卜素在体荧光光谱检测
实验步骤：在随机招募的5名受试者手臂前臂内侧中间区域(参见附图1)，分别用日立荧光光谱仪FL-7000检测测试区域的类胡萝卜素的荧光强度HT0(激发光350nm，发射光400-480nm，激发光和发射光光栅分别为20nm和10nm，PMT电压550V)，随后要求受试者在日常饮食的基础上，每天至少额外进食一个大小约200g西红柿(据文献报道新鲜西红柿中的番茄红素的含量为5～10mg/100g，连续3天，最后在同一测试区域测试其类胡萝卜素的荧光强度HT3。
5名受试者的平均实验结果如表1所示，在日常饮食的基础上，每天至少进食一个西红柿后，类胡萝卜素的荧光强度增大，表明此方法可以检测类胡萝卜素含量的变化。
表1连续3天进食含类胡萝卜素食物的皮肤类胡萝卜素的荧光强度
Figure BDA0002858201990000081
实施例2
类胡萝卜素在体荧光光谱检测的重现性
实验步骤：在8名受试者手臂前臂内侧中间区域(参见附图1)，分别用日立荧光光谱仪FL-7000对此测试区域连续测试30次，计算每个受试者类胡萝卜素值的变异系数CV。
实验结果：如表2所示，8名受试者的类胡萝卜素的荧光检测的变异系数CV值在4％-9％之间，表明此荧光光谱检测法具有较好的重现性。
表2同一时间30次连续测试的类胡萝卜素的荧光强度
Figure BDA0002858201990000082
实施例3
样品在体抗氧化荧光检测
实验步骤：
1.招募受试者6-8人；
2.测试部位：左右手前臂内侧；测试面积2.5*4cm2；样品量2mg/cm2；
3.实验对照：空白对照(不涂抹任何样品)；
4.实验仪器：UV紫外灯、日立荧光光谱仪FL-7000
5.实验样品及具体操作：实验室自制抗氧化面霜A、抗氧化面霜B及基质霜；
抗氧化面霜A的制备：将1.5g甘油单硬脂酸酯，2g甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯复合物，5g聚二甲基硅氧烷，5g棕榈酸乙基己酯，2g鲸蜡硬脂醇加热至溶解(油相)，将5g甘油，3g1,3-丁二醇，0.25g卡波姆，0.02gEDTA2 Na加入71g去离子水加热至75℃(水相)，将油相加入水相边均质边加，乳化5min，降温至30℃以下，加入5g活性物(肌肽+Ve+绿茶+焦亚硫酸钠)，0.1g氢氧化钾，适量的防腐剂和香精。
抗氧化面霜B的制备：制备同抗氧化面霜A，活性物替换为肌肽+Ve。
基质霜的制备：制备同抗氧化面霜A，不添加活性物。
将受试者的手前臂内侧分为4个测试区域，随机分别涂抹抗氧化面霜A、抗氧化面霜B、基质霜、空白区域；30分钟后用日立荧光光谱仪FL-7000检测测试区域的类胡萝卜素的荧光强度H0；测试完毕后即用UV灯分别照射测试区域0.3mW/cm2(即72mJ/cm2)照射4分钟，照射完毕后即刻测试类胡萝卜素的荧光强度H1。最后统计分析每个测试区域照射前后的类胡萝卜素荧光强度的变化、样品与空白之间、样品之间是否存在差异性。
相对于空白组的抗氧化效能(Antioxidant capacity，AC)：
AC＝((H0空白-H1空白)平均值-(H0样品-H1样品)平均值)/(H0空白-H1空白)平均值*100％＝[1-(H0样品-H1样品)平均值/(H0空白-H1空白)平均值]*100％ (Ⅰ)
6.统计分析方法：数据UV照射前后和各组差异采用方差分析法，p＜0.1。
实验结果：
1.皮肤涂抹样品后，经UV照射后，皮肤类胡萝卜素含量呈现不同的变化，如表3所示，与UV照射前皮肤类胡萝卜素H0相比，不涂抹样品，直接UV照射的空白组，照射后即刻皮肤类胡萝卜素H1显著性下降；涂抹实验室自制的抗氧化面霜组，皮肤类胡萝卜素H1无显著性下降；涂抹基质霜组，皮肤类胡萝卜素H1显著性下降。
2.涂抹不同的样品，对皮肤的UV照射后的过氧化的保护效果也有所差异。H1-H0的差值可以表示产品对皮肤的抗氧化保护效果，差值的绝对值越小，表明UV照射后皮肤的类胡萝卜素的变化越小，表明产品的抗氧化效能越高。如表3所示，实验室自制抗氧化面霜A及抗氧化面霜B的差值的绝对值小于空白和基质霜，且其与空白组、基质霜组之间的差异均存在显著性统计学意义，表明抗氧化面霜的抗氧化效果显著优于空白和基质霜组。基质霜组和空白组之间的差异无统计学意义，表明基质霜的抗氧化效果与空白相当。
3.产品的抗氧化效能
产品的抗氧化效能是基于不涂抹产品的空白的计算。如表3所示，抗氧化面霜A对皮肤UV照射的过氧化的保护达81.68％，抗氧化面霜B对皮肤的过氧化的保护效果为44.59％；而无活性成分的基质霜对皮肤无保护效果。
表3不同样品在UV照射前后的类胡萝卜素的荧光强度及样品的抗氧化效能
Figure BDA0002858201990000101
注：1.*，表示与H0相比，p＜0.1，有统计学差异；**，p＜0.0.05，有显著统计学差异。#，表示与空白组相比，p＜0.1，差异有统计学意义；&，表示与基质霜相比，p＜0.1，差异有统计学意义。
2.此检测方法应用的是测试区域类胡萝卜素经UV照射前后的差值的变化，若某志愿者测试区域检测不到类胡萝卜素值，则表明此志愿者不符合试验要求。
比较例
在体抗氧化能力和体外抗氧化DPPH自由基清除能力检测方法比较
基于实施例1的结果表明在体荧光检测法可以检测出不同样品的抗氧化性能，在此，我们再通过常用的体外DPPH自由基清除法来检测两款样品抗氧化性能，并比较两种检测方法的差异性。
实验步骤：
1.DPPH自由基清除法测试方法：移液器取2×10-4mol/L的DPPH·加入到10ml棕色离心管中，再分别加入相同体积的待测样品，设置空白组和control组，室温避光反应30min，反应后迅速在紫外分光光度计517nm下测定吸光度。空白组为不加样品组，control组为不加DPPH·组。DPPH·及所有样品均用无水乙醇配制，样品的处理方式相同，最终的测试浓度也相同。
2.测试样品：与实施例1相同的实验室自制抗氧化面霜A/B和基质霜
3.DPPH自由基清除率计算公式：
DPPH自由基清除率＝[1－(A1－A2)/A0]×100％
A0：加DPPH·，不加待测物，加无水乙醇/样品溶剂；
A1:加DPPH·，加待测物；A2:不加DPPH·，加待测物。
实验结果：
1.抗氧化性能力不同将表现不同的DPPH自由基清除能力，抗氧化能力越高，DPPH自由基的清除率越高。如表4所示，抗氧化面霜在体外具有较好的DPPH自由基清除能力(56.56％和40.11％)，而基质霜的DPPH自由基清除力很弱(12.36％)。
2.表4的DPPH自由基清除法的实验结果显示出抗氧化面霜的抗氧化效果优于基质霜，此结果和在体荧光检测的趋势一致。
3.如表4所示，抗氧化面霜A和抗氧化面霜B的体外DPPH自由基清除率分别为56.56％和40.41％；在体荧光检测的抗氧化面霜A和抗氧化面霜B的抗氧化效能分别为81.68％和44.59％，表明在体荧光检测在区分产品的抗氧化效果上的灵敏度要优于体外DPPH自由基清除试验。
这两种检测方法的检测结果表明，在体荧光检测法可以较好的检测样品的抗氧化能力的差异性，且检测灵敏度要优于体外单一的DPPH自由基清除法。
表4两个样品抗氧化性能的两种检测方法结果
Figure BDA0002858201990000111
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (9)

1.一种抗氧化效能的检测方法，其特征在于，所述方法包括荧光检测皮肤中类胡萝卜素的量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括在对皮肤进行紫外光照射前后荧光检测皮肤中类胡萝卜素的量的变化。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)使皮肤的空白区域和样品区域分别进行荧光检测，得到相应的类胡萝卜素荧光强度H0空白和HO样品；
(2)使步骤(1)中的皮肤的空白区域和样品区域分别进行紫外光照射；
(3)使步骤(2)中经过紫外光照射的皮肤的空白区域和样品区域分别进行荧光检测，得到相应的类胡萝卜素荧光强度H1空白和H1样品；
(4)根据公式Ⅰ计算样品相对于空白的抗氧化效能：
抗氧化效能＝AC＝((H0空白-H1空白)平均值-(H0样品-H1样品)平均值)/(H0空白-H1空白)平均值*100％＝[1-(H0样品-H1样品)平均值/(H0空白-H1空白)平均值]*100％(Ⅰ)。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)在使用样品10-60分钟后进行荧光检测。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)在使用样品30-60分钟后进行荧光检测。
6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)在步骤(2)紫外光照射结束后0-30分钟内进行。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)在步骤(2)紫外光照射结束后0-10分钟内进行。
8.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述紫外照射剂量为60-80mJ/cm2。
9.如权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，所述荧光强度为激发光350nm，发射光450±4nm处的荧光强度。
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