JP7214679B2 - 肌ダメージの判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は肌ダメージの判定方法、及び肌ダメージ抑制剤の評価又は選択方法に関する。
太陽光曝露等により皮膚は様々なダメージを受けている。特に紫外線領域（２９０～４００ｎｍ）の光は、皮膚に有害な作用を及ぼし、短期間の曝露により引き起こされる紅斑や色素沈着形成、さらには長期間の曝露で引き起こされる光老化や発癌などに深く関与していることが知られている（非特許文献１，２）。紫外線が皮膚性状に与える影響に関しては、例えば動物を用いた単回の紫外線照射により、ＴＥＷＬが上昇する、結合セラミドが減少する、細胞間脂質の構造が乱れるなどの報告がある（非特許文献３，４）。角層水分量に与える影響についても、ヒト皮膚に１ＭＥＤ（最小紅斑量）以上の単回の紫外線照射を行うことにより、照射１週間後に角層水分量が低下することが報告されている（非特許文献５）。また、スクワレンの過酸化物をへアレスマウスに３週間塗布を行うと、表面が粗くなることも報告されている（非特許文献６）。
紫外線による障害から皮膚を防御・改善する技術として、サンスクリーン剤などを塗布する方法がある。紫外線が遮断されると、皮膚初期応答に重要な照射直後に産生する活性酸素種（ＲＯＳ）やＲＯＳとの反応により生成する生体酸化物の産生は抑制される。
一方で、紫外線照射後のＲＯＳやＲＯＳとの反応により生成する生体酸化物を制御することで、紫外線障害から皮膚を制御する方法も示唆されている。抗酸化剤などの皮膚への塗布がそれに相当する。これまでの培養細胞系での検討において、ＲＯＳ産生を引き金にし、細胞外マトリックスの分解（光老化）、炎症の惹起、アポトーシスの誘導など様々な生体反応を誘発することは古くから知られているものの（非特許文献７）、ヒト皮膚に代表されるｉｎ ｖｉｖｏでのＲＯＳの詳細な役割や、時間軸に沿って起こるその後の皮膚障害との関連性は未だ不明な点が多い。その理由として、非侵襲的にＲＯＳや酸化ストレス、皮膚抗酸化能を評価する手法がほとんどないことが挙げられる。
一方で、紫外線照射後のＲＯＳやＲＯＳとの反応により生成する生体酸化物を制御することで、紫外線障害から皮膚を制御する方法も示唆されている。抗酸化剤などの皮膚への塗布がそれに相当する。これまでの培養細胞系での検討において、ＲＯＳ産生を引き金にし、細胞外マトリックスの分解（光老化）、炎症の惹起、アポトーシスの誘導など様々な生体反応を誘発することは古くから知られているものの（非特許文献７）、ヒト皮膚に代表されるｉｎ ｖｉｖｏでのＲＯＳの詳細な役割や、時間軸に沿って起こるその後の皮膚障害との関連性は未だ不明な点が多い。その理由として、非侵襲的にＲＯＳや酸化ストレス、皮膚抗酸化能を評価する手法がほとんどないことが挙げられる。
ヒト皮膚の酸化ストレス、抗酸化能を評価する方法としては、生検皮膚を用いた方法が存在するが侵襲的であるために汎用されるには至っていない。角層テープストリッピングによる酸化タンパク質や抗酸化物質の評価は低侵襲的ではあるが、角層のみの評価に留まり、皮膚内部の状態を反映しているとは言い難い（非特許文献８、９）。非侵襲的な評価方法として、ラマン分光法による皮膚中カロテノイド測定の報告が存在するが、単一の抗酸化物質の評価であり、これもまた皮膚全体の応答を反映しているとは言い難い（非特許文献１０）。
そのような中、非侵襲的に生体の酸化状態を評価できる技術として、生体微弱発光（バイオフォトン）の検出技術が注目されている。バイオフォトンとは、生物が生命活動に伴って放射している極めて弱い自発的発光である。その由来として、一重項酸素や励起カルボニル化合物類が推察されており、生体の酸化反応に起因した発光と考えられている。バイオフォトンは、植物、微生物、動物など様々な生物で観測され、ヒト皮膚においては、特に紫外線Ａ波（ＵＶＡ）を照射した後のバイオフォトン量が測定されており、皮膚色の違いにより発光強度が異なること（非特許文献１１）、抗酸化クリーム塗布により発光が低減されることが報告されている（非特許文献１２）。
しかし、これらの報告は、ＵＶＡ照射直後から数分間の積算値で評価しており、刻々と変化する酸化ストレス応答の詳細を経時的に評価しておらず、また肌のダメージとの相関性に言及した報告でもない。
Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 18, 75-81 (2002)
Toxicology 189, 21-39 (2003)
J. Invest. Dermatol. 123, 1102-9 (2004)
Exp. Dermatol. 16, 985-92 (2007)
Photochem. Photobiol. 93, 1276-81 (2017)
Exp. Dermatol. 8, 471-79 (1999)
J. Invest. Dermatol. 126, 2565-75 (2006)
Skin Res. Technol. 13, 84-90 (2007)
J. Invest. Dermatol. 110, 756-61 (1998)
J. Invest. Dermatol. 115, 441-48 (2000)
Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 25, 65-70 (2009)
Skin Pharmacol. Physiol. 24, 300-4 (2011)
本発明は、紫外線等による肌ダメージを非侵襲的に即判定する方法、及び肌ダメージ抑制剤を評価・探索する方法を提供することに関する。
本発明者らは、紫外線等による皮膚のダメージを早期に評価し得る方法について検討した結果、ヒト皮膚に疑似太陽紫外線を照射してから数分後のバイオフォトン量が、角層水分量の低下、表面粗さの増加、角層細胞間脂質パッキングの低下等の皮膚性状の変化及び抗酸化能の低下、すなわち肌ダメージに深く相関し、当該バイオフォトン量を指標として、肌ダメージを早期に評価できることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）被験者の皮膚に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて肌ダメージを判定する工程を含む肌ダメージの判定方法であって、該所定期間は、その５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なる期間である、方法。
２）試験物質を被検対象に投与又は接触させる工程、及び被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて試験物質を評価する工程を含む肌ダメージ抑制剤の評価又は探索方法であって、該所定期間は、その５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なる期間である、方法。
１）被験者の皮膚に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて肌ダメージを判定する工程を含む肌ダメージの判定方法であって、該所定期間は、その５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なる期間である、方法。
２）試験物質を被検対象に投与又は接触させる工程、及び被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて試験物質を評価する工程を含む肌ダメージ抑制剤の評価又は探索方法であって、該所定期間は、その５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なる期間である、方法。
本発明によれば、単一の皮膚性状を測定するだけでは判別が難しかった肌ダメージを総合的にかつ高精度に評価可能となり、非侵襲的で簡便かつ早期に肌ダメージを判定する技術を提供することができる。
本発明の肌ダメージの判定方法では、被験者の皮膚に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量が指標として用いられる。
また、本発明の肌ダメージ抑制剤の評価又は探索方法では、試験物質を被検対象の皮膚又は皮膚細胞に投与又は接触させ、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射した場合の、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量が指標として用いられる。
本発明の方法において、照射する紫外線としては、紫外領域に波長を有する光線であれば特に限定されず、具体的には波長が２８５～３２０ｎｍのＵＶ－Ｂ波、または３２０～４００ｎｍのＵＶ－Ａ波が挙げられる。本発明ではＡ波とＢ波の混合紫外線が好ましく、光の強度の割合（Ａ波／Ｂ波）が６～２０であるのが好ましく、７～１５であるのがより好ましく、８～１２であるのが更に好ましい。
また、本発明の肌ダメージ抑制剤の評価又は探索方法では、試験物質を被検対象の皮膚又は皮膚細胞に投与又は接触させ、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射した場合の、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量が指標として用いられる。
本発明の方法において、照射する紫外線としては、紫外領域に波長を有する光線であれば特に限定されず、具体的には波長が２８５～３２０ｎｍのＵＶ－Ｂ波、または３２０～４００ｎｍのＵＶ－Ａ波が挙げられる。本発明ではＡ波とＢ波の混合紫外線が好ましく、光の強度の割合（Ａ波／Ｂ波）が６～２０であるのが好ましく、７～１５であるのがより好ましく、８～１２であるのが更に好ましい。
照射する紫外線の強度は特に限定されないが、例えば、好ましくは１０ｍＷ／ｃｍ２以上、より好ましくは２０ｍＷ／ｃｍ２以上、より好ましくは３０ｍＷ／ｃｍ２以上であり、且つ好ましくは２００ｍＷ／ｃｍ２以下、より好ましくは１７０ｍＷ／ｃｍ２以下、より好ましくは１５０ｍＷ／ｃｍ２以下である。また、好ましくは１０～２００ｍＷ／ｃｍ２、より好ましくは２０～１７０ｍＷ／ｃｍ２、より好ましくは３０～１５０ｍＷ／ｃｍ２である。なお、本発明において紫外線の強度とは、ＵＶ－Ｂ波とＵＶ－Ａ波を合わせた波長領域（２８５～４００ｎｍ）の紫外線の強度を意味する。
紫外線の強度は、市販されている測定器を用いて測定することが可能であり、Solarmeter Model 5.0 (UVA+B)（Solartech Inc.）、多目的分光放射計 ＭＳＲ－７０００Ｎ（オプトリサーチ社）などが挙げられる。
紫外線の強度は、市販されている測定器を用いて測定することが可能であり、Solarmeter Model 5.0 (UVA+B)（Solartech Inc.）、多目的分光放射計 ＭＳＲ－７０００Ｎ（オプトリサーチ社）などが挙げられる。
また、照射時間は、照射する紫外線の強度によって異なるが、例えば５～３００秒間が挙げられ、好ましくは５～２４０秒間、更に好ましくは５～２００秒間である。
照射紫外線強度と照射時間により決定される紫外線照射量（照射エネルギー）としては、好ましくは３００～８０００ｍＪ／ｃｍ２であり、より好ましくは３００～７０００ｍＪ／ｃｍ２、さらに好ましくは５００～７０００ｍＪ／ｃｍ２、さらに好ましくは６００～６０００ｍＪ／ｃｍ２である。
紫外線を照射するための紫外線照射装置は、上述した波長範囲の光を発することが可能な光源を備えていれば特に限定されず、光源としては、例えば、低圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ウッドランプ、蛍光検査灯等が挙げられ、好ましくはキセノンランプである。
斯かる光源に、必要に応じて、紫外線領域の波長の光を透過できるフィルターを組み合わせることにより、照射波長が調節される。
斯かる光源に、必要に応じて、紫外線領域の波長の光を透過できるフィルターを組み合わせることにより、照射波長が調節される。
紫外線照射が行われる被験者の皮膚部位としては、紫外線照射やバイオフォトン量測定が可能な部位であれば特に限定されないが、紫外線による肌ダメージを評価する際には生活紫外線を受けやすい部位が好ましい。具体的には、前腕外側部、前腕内側部、上腕外側部、上腕内側部、頸部、背部等の皮膚が挙げられ、前腕外側部、前腕内側部、頸部が好ましく、前腕外側部、又は頸部がより好ましい。
また、本発明の肌ダメージ抑制剤の評価又は選択方法における被検対象としては、ヒト（被験者）の他に、培養表皮細胞や３Ｄ皮膚モデルや培養皮膚組織等が含まれ、紫外線照射は、上記と同様の被験者の皮膚部位、又は培養表皮細胞や皮膚培養組織における当該細胞又は組織（皮膚）に対して行われる。培養表皮細胞としては、好ましくは表皮角化細胞（ケラチノサイト）が挙げられ、３次元培養皮膚細胞としては、EpiDermTM（MatTek Corporation社製）、EpiSkin（SkinEthic社製）、RHE（SkinEthic社製）、Labcyteエピモデル（J-TEC社製）等の市販品が使用できる。
後記試験例１～３に示すとおり、皮膚に紫外線照射した後、主として３０秒～３分の期間におけるバイオフォトン量と、露光部の皮膚性状、具体的には角層水分量、表面粗さ及び角層細胞間脂質パッキングと相関関係が認められた（表１）。一方、紫外線曝露習慣の違いが引き起こす皮膚性状の変化（肌ダメージ）を検証したところ、紫外線曝露歴が長いヒトでは短いヒトに比べて角質水分量の低下、毛穴面積の増加、毛穴比率の増加、表面粗さの増加、角層細胞間脂質パッキングの低下傾向が認められ（表２）、実際の皮膚の外見変化として、目の下のシワの増加、頬にあるシミの増加、頬の毛穴の増加や目立ちが認められた（表３）。また、皮膚の特定の外見変化が特定の皮膚性状の変化と相関することも認められた（表５）。
さらに後記試験例４、５に示すとおり、皮膚に紫外線照射した後、主として３０秒～３分の期間におけるバイオフォトン量と露光部の抗酸化酵素量との相関関係が認められた（表６）。一方、紫外線曝露習慣の違いが引き起こす露光部である頬部の抗酸化酵素量の変化を検証したところ、紫外線曝露歴が長いヒトでは短いヒトに比べて抗酸化酵素量の有意な低下が認められた（表７）。
また、さらに後記試験例６、７に示すとおり、紫外線照射後所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を低下させる試験品は、紫外線による皮膚性状の変化や肌ダメージを低下させることが認められた。すなわち、紫外線照射後所定期間内に検出されるバイオフォトンの量は、肌ダメージ抑制剤の評価又は探索するための指標となり得る。
さらに後記試験例４、５に示すとおり、皮膚に紫外線照射した後、主として３０秒～３分の期間におけるバイオフォトン量と露光部の抗酸化酵素量との相関関係が認められた（表６）。一方、紫外線曝露習慣の違いが引き起こす露光部である頬部の抗酸化酵素量の変化を検証したところ、紫外線曝露歴が長いヒトでは短いヒトに比べて抗酸化酵素量の有意な低下が認められた（表７）。
また、さらに後記試験例６、７に示すとおり、紫外線照射後所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を低下させる試験品は、紫外線による皮膚性状の変化や肌ダメージを低下させることが認められた。すなわち、紫外線照射後所定期間内に検出されるバイオフォトンの量は、肌ダメージ抑制剤の評価又は探索するための指標となり得る。
本発明の肌ダメージの判定方法、又は肌ダメージ抑制剤の評価又は探索方法においては、紫外線照射後３０秒～３分の期間と、その５０％を超える期間が当該期間と重なる期間を所定期間とし、当該所定期間のバイオフォトン量が判定又は評価に用いられる。
所定期間は、その５０％を超える期間が上記照射後３０秒～３分の期間と重なる期間として設定されるが、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上が照射後３０秒～３分の期間と重なるように設定するのが好ましく、その１００％が重なる、照射後３０秒～３分内の期間であるのがより好ましい。
ここで、所定期間と照射後３０秒～３分の期間が重なるとは、両期間に共通の期間が存在することを意味し、その５０％を超える期間が重なるとは所定期間の５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なることを意味する。
ここで、所定期間と照射後３０秒～３分の期間が重なるとは、両期間に共通の期間が存在することを意味し、その５０％を超える期間が重なるとは所定期間の５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なることを意味する。
また、紫外線照射直後の初期期間はバイオフォトン量が多く、本発明の判定又は評価に及ぼす影響が大きいことから、本発明の所定期間は、紫外線照射直後の初期期間と重ならないように設定するのが好ましい。具体的には、照射終了後から５秒まで、好ましくは１０秒まで、より好ましくは３０秒までの初期期間と重ならないように設定するのが好ましい。
所定期間の長さは、有効な量のバイオフォトンを測定する観点から、好ましくは２０秒間～３分間、より好ましくは２５秒間～２分３０秒間又は３０秒間～３分間、より好ましくは３０秒間～２分間である。
より好適な所定期間としては、例えば照射後１～２分の１分間、照射後２～３分の１分間、照射後１～３分の２分間、照射後３０秒～１分の３０秒間が挙げられる。
バイオフォトンの検出は、極微弱なバイオフォトンの検出が可能な高感度で低ノイズのＣＣＤ等の検出部を備えた光学検出装置によって行われる。光学検出装置としては、例えば、微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いることができる。検出される放射光の波長は検出装置の光電子増倍管により異なるが、前記装置では３００～８５０ｎｍのバイオフォトンが検出される。また、バイオフォトン量の測定は、測定環境に由来する光の影響を極力抑えるため、可能な限り遮光された空間で実施されるのが好ましく、例えば暗室にて実施される。
すなわち、暗室にて、前記の紫外線照射装置を用いて測定部位に紫外線を照射し、次に微弱発光強度検出装置により紫外線照射部位から発するバイオフォトンの量を測定するのが好ましい。また、紫外線照射装置における紫外線放射部と微弱発光強度検出装置における検出部は別々であっても良いが、紫外線照射とバイオフォトンの検出が装置を付け替えることなく行えるという観点から、紫外線放射部（具体的には紫外線照射装置から伸びている光照射用のファイバー）と検出部を一体とし、光路の切り替えによって使用する装置が替えられる構造となっていることが好ましい。
すなわち、暗室にて、前記の紫外線照射装置を用いて測定部位に紫外線を照射し、次に微弱発光強度検出装置により紫外線照射部位から発するバイオフォトンの量を測定するのが好ましい。また、紫外線照射装置における紫外線放射部と微弱発光強度検出装置における検出部は別々であっても良いが、紫外線照射とバイオフォトンの検出が装置を付け替えることなく行えるという観点から、紫外線放射部（具体的には紫外線照射装置から伸びている光照射用のファイバー）と検出部を一体とし、光路の切り替えによって使用する装置が替えられる構造となっていることが好ましい。
紫外線照射により発生したバイオフォトンの量は、予め紫外線照射前の安静時の発光強度（「定常バイオフォトン量」とも称す）を測定しておき、続いて紫外線照射後の所定期間内における発光強度（「照射後バイオフォトン量」とも称す）を測定し、その値から安静時発光強度を引いた値を発光増分（「応答バイオフォトン量」とも称す）として算出できる。
本発明において、「肌ダメージ」とは、外的内的要因により、正常な肌の状態が変化することを意味し、さらに具体的には紫外線による肌ダメージが挙げられる。本発明において明らかとした紫外線による肌ダメージとしては、例えば角層水分量の低下、毛穴面積の増加、毛穴比率の増加、表面粗さの増加、角層細胞間脂質パッキングの低下等の皮膚性状の変化、及びこれらによって引き起こされる、シワの増加、シミの増加、毛穴の目立ち等の皮膚の変化、並びに抗酸化能に代表される酸化損傷（ダメージ）に対する生体防御機能の低下が挙げられる。また、「肌ダメージの抑制」とは、当該皮膚性状の変化を緩和又は抑制し、シワやシミ、毛穴の目立ち等を抑制又は改善すること、抗酸化能の低下等の酸化損傷（ダメージ）に対する生体防御機能の低下を抑制することを意味する。
ここで、「角層水分量」とは、角層に含まれる水分量を意味し、例えばコルネオメーターを用いて測定することができる。角層水分量は頬にあるシミと良く相関した。
「毛穴面積」とは、毛穴１つ当たりの面積の平均値を意味し、「毛穴比率」とは、毛穴の占める面積の割合を意味する。これらは、例えば皮膚レプリカ標高像から、画像処理ソフトウェアを用いて毛穴領域を抽出し、毛穴部の平均面積（平均毛穴面積）と視野中に占める割合（毛穴面積比率）を算出することにより測定できる。毛穴面積は目の下のシワ、頬の毛穴目立ちと良く相関した。
「表面粗さ」とは、皮膚表面の凹凸の状態を意味し、例えばレプリカ剤を被験部位に塗布し、一定時間経過後、固化したレプリカ剤の表面形状（最大高さ：Ｓｍａｘ、面平均粗さ：Ｓａ、面二乗平方根粗さ：Ｓｑ）を求めることにより測定できる。表面粗さは、目の下のシワ、頬にあるシミ、頬の毛穴目立ちと良く相関した。
「角層細胞間脂質パッキング」は、細胞間脂質の分子会合状態を意味し、共焦点ラマン分光器を用いて、非特許文献（Ｓｋｉｎ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２１, ７６－８３
（２０１５））に記載の方法により、角層細胞間脂質のパッキング評価指標（Ｒ’ＣＨ）を算出できる。例えば６７１ｎｍの光を皮膚に照射し、生じるラマン散乱光を測定することにより算出できる。角層細胞間脂質パッキングは、目の下のシワと良く相関した。
「毛穴面積」とは、毛穴１つ当たりの面積の平均値を意味し、「毛穴比率」とは、毛穴の占める面積の割合を意味する。これらは、例えば皮膚レプリカ標高像から、画像処理ソフトウェアを用いて毛穴領域を抽出し、毛穴部の平均面積（平均毛穴面積）と視野中に占める割合（毛穴面積比率）を算出することにより測定できる。毛穴面積は目の下のシワ、頬の毛穴目立ちと良く相関した。
「表面粗さ」とは、皮膚表面の凹凸の状態を意味し、例えばレプリカ剤を被験部位に塗布し、一定時間経過後、固化したレプリカ剤の表面形状（最大高さ：Ｓｍａｘ、面平均粗さ：Ｓａ、面二乗平方根粗さ：Ｓｑ）を求めることにより測定できる。表面粗さは、目の下のシワ、頬にあるシミ、頬の毛穴目立ちと良く相関した。
「角層細胞間脂質パッキング」は、細胞間脂質の分子会合状態を意味し、共焦点ラマン分光器を用いて、非特許文献（Ｓｋｉｎ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２１, ７６－８３
（２０１５））に記載の方法により、角層細胞間脂質のパッキング評価指標（Ｒ’ＣＨ）を算出できる。例えば６７１ｎｍの光を皮膚に照射し、生じるラマン散乱光を測定することにより算出できる。角層細胞間脂質パッキングは、目の下のシワと良く相関した。
また、「抗酸化能」とは、酸化損傷を引き起こす酸化ストレスに対する生体防御機能を意味する。具体的に生体防御機能を司るものとして、活性酸素種（ＲＯＳ）を低減させる様々な抗酸化酵素や抗酸化物質が知られている。スーパーオキサイドアニオンラジカルを酸素分子と過酸化水素とに不均化する反応を触媒するＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）は重要な抗酸化酵素の一つであり、ヒトでは３種類のＳＯＤがあり、ＳＯＤ１は細胞質に、ＳＯＤ２はミトコンドリアに、ＳＯＤ３は細胞外に存在している。ＳＯＤの外用により紫外線照射後の炎症が低減されることが報告されている（Exp Dermatol. 6, 116-21(1997)）。ＳＯＤ以外の抗酸化酵素としては、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、チオレドキシン等が挙げられる。生体内の抗酸化物質としては、プロビタミンＡ等のカロテノイド、ビタミンＣ、ビタミンＥ、グルタチオン等が挙げられる。抗酸化能は、抗酸化酵素として、例えばＳＯＤ量を測定することにより評価することができる。その際、抗酸化酵素量に代えて抗酸化酵素の活性を抗酸化酵素量の指標として用いることも可能である。または、抗酸化物質として、例えば皮膚中のカロテノイド量をラマン分光法等で測定することにより評価することもできる。
本発明の肌ダメージの判定方法においては、例えば、年齢若しくは年代毎、又は性別毎に予め本発明における紫外線照射後の一定期間に検出されるバイオフォトンの量を測定して、基礎データとして取得しておき、それらから算出された平均値と標準偏差から、被験者の年齢（年代）、性別における偏差値を計算して、肌ダメージの指標とすることができる。または、訓練を受けた専門家がシワ、シミ、毛穴目立ちに関して目視で評価した老化スコアや、機器測定による皮膚性状の変化（角層水分量の低下、毛穴面積の増加、毛穴比率の増加、表面粗さの増加、角層細胞間脂質パッキングの低下等）、抗酸化能の程度を示す皮膚中の抗酸化酵素や生体内抗酸化物質等の測定値に関し、それらと偏差値範囲を関係づける適当な評価基準を作成し、それに基づいて被験者の偏差値から被験者の肌ダメージを判定することもできる。
上記による肌ダメージの判定方法は、非常に短時間で判定可能で、被験者への負担も少ない。本発明の判定方法により得られた肌ダメージに関する情報は、紫外線照射による障害を軽減するＵＶケア対策に、ＵＶケア化粧料の購入時における製品選択やＵＶケア化粧料の推奨販売における製品推奨の指標として、役立てることができる。
本発明の肌ダメージの判定方法は、所謂人間の身体の各器官の構造又は機能を測定する等して人体から各種の資料を収集するための方法に該当し、上記の目的で使用される。すなわち、医療目的で人間の病状や健康状態等の身体状態又は精神状態を判断するものではない。斯かる意味において、本発明の肌ダメージの判定方法は、肌ダメージの測定方法或いは肌ダメージの検査方法とも表記し得る。
本発明の肌ダメージの判定方法は、所謂人間の身体の各器官の構造又は機能を測定する等して人体から各種の資料を収集するための方法に該当し、上記の目的で使用される。すなわち、医療目的で人間の病状や健康状態等の身体状態又は精神状態を判断するものではない。斯かる意味において、本発明の肌ダメージの判定方法は、肌ダメージの測定方法或いは肌ダメージの検査方法とも表記し得る。
本発明の肌ダメージ抑制剤の評価又は探索は、試験物質を被検対象に投与又は接触させる工程を含み、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて試験物質の評価が行われる。
ここで、投与される試験物質としては、特に制限されず、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。但し、安全性が確保された既知の物質、例えば医薬品、化粧品、及びそれらの原料として使用されている物質や組成物であることが好ましい。尚、試験物質が医薬品や化粧品等の組成物である場合、該組成物が紫外線吸収剤や紫外線散乱剤等の紫外線防御素材を含有していると、本評価又は探索法における紫外線照射において、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に照射される紫外線が物理的に防御されてしまうため、検出されるバイオフォトンの量に影響を及ぼすおそれがある。従って、本評価又は探索法において試験物質が組成物である場合、該組成物は、紫外線吸収剤や紫外線散乱剤等の紫外線防御素材を含有していない組成物であることが好ましい。または、本評価又は探索方法において試験物質として紫外線防御素材を含有する組成物を評価する場合、バイオフォトン量測定前又は紫外線照射前に該組成物を被検対象の皮膚又は皮膚細胞から除く処理を行うことが好ましい。
ここで、投与される試験物質としては、特に制限されず、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。但し、安全性が確保された既知の物質、例えば医薬品、化粧品、及びそれらの原料として使用されている物質や組成物であることが好ましい。尚、試験物質が医薬品や化粧品等の組成物である場合、該組成物が紫外線吸収剤や紫外線散乱剤等の紫外線防御素材を含有していると、本評価又は探索法における紫外線照射において、被検対象の皮膚又は皮膚細胞に照射される紫外線が物理的に防御されてしまうため、検出されるバイオフォトンの量に影響を及ぼすおそれがある。従って、本評価又は探索法において試験物質が組成物である場合、該組成物は、紫外線吸収剤や紫外線散乱剤等の紫外線防御素材を含有していない組成物であることが好ましい。または、本評価又は探索方法において試験物質として紫外線防御素材を含有する組成物を評価する場合、バイオフォトン量測定前又は紫外線照射前に該組成物を被検対象の皮膚又は皮膚細胞から除く処理を行うことが好ましい。
試験物質の投与形態は、経口又は非経口投与のいずれでも良いが、非経口投与の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の種々の形態で皮膚に塗布する形態が好ましい。
また、試験物質を被検対象へ投与又は接触させる回数は特に限定されない。また、紫外線照射と同時又は直前の単回投与又は接触であっても良いが、紫外線照射前に所定の投与又は接触期間を設け、その期間内において所定の投与又は接触頻度で１回又は複数回投与若しくは接触するのが好ましい。被検対象がヒトである場合、投与期間としては、１日以上が好ましく、１週間以上がより好ましく、４週間以上がさらに好ましい。また６ヶ月以下が好ましく、３ヶ月以下がより好ましく、２ヶ月以下がさらに好ましい。投与頻度は、１日当たり１回以上が好ましく、１回～５回がより好ましく、１回～３回がさらに好ましく、２回がさらに好ましい。
被検対象として培養表皮細胞や３Ｄ皮膚モデルや培養皮膚組織等を用いる場合、接触期間は１時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましく、２４時間以上がさらに好ましい。また７２時間以下が好ましく、４８時間以下がより好ましく、３６時間以下がさらに好ましい。接触頻度は前記接触期間中１回以上が好ましく、１～４回がより好ましく、１又は２回がさらに好ましい。
また、試験物質を被検対象へ投与又は接触させる回数は特に限定されない。また、紫外線照射と同時又は直前の単回投与又は接触であっても良いが、紫外線照射前に所定の投与又は接触期間を設け、その期間内において所定の投与又は接触頻度で１回又は複数回投与若しくは接触するのが好ましい。被検対象がヒトである場合、投与期間としては、１日以上が好ましく、１週間以上がより好ましく、４週間以上がさらに好ましい。また６ヶ月以下が好ましく、３ヶ月以下がより好ましく、２ヶ月以下がさらに好ましい。投与頻度は、１日当たり１回以上が好ましく、１回～５回がより好ましく、１回～３回がさらに好ましく、２回がさらに好ましい。
被検対象として培養表皮細胞や３Ｄ皮膚モデルや培養皮膚組織等を用いる場合、接触期間は１時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましく、２４時間以上がさらに好ましい。また７２時間以下が好ましく、４８時間以下がより好ましく、３６時間以下がさらに好ましい。接触頻度は前記接触期間中１回以上が好ましく、１～４回がより好ましく、１又は２回がさらに好ましい。
そして、紫外線照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量が測定され、バイオフォトン量を低下させる試験物質が、肌ダメージ抑制剤として評価される。
バイオフォトン量を低下させる試験物質の同定は、例えば、異なる濃度の試験物質を投与した場合に測定されるバイオフォトン量を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質投与群とより低濃度の試験物質投与群との間；試験物質投与群とプラセボ投与群との間；試験物質投与群と無投与群との間；又は試験物質投与前後で、バイオフォトン量を比較する。試験物質の投与により、又はより高濃度の試験物質の投与によりバイオフォトン量が低下する場合、当該試験物質をバイオフォトン量低下物質として同定することができる。
例えば、試験物質投与群におけるバイオフォトン量が対照群（プラセボ投与群又は無投与群）と比較して低下傾向が認められた場合、好ましくは統計学的に有意な低下が認められた場合、当該試験物質をバイオフォトン量低下物質として同定することができる。
そして、同定されたバイオフォトン量を低下させる試験物質は、肌ダメージ抑制剤として評価することができる。
バイオフォトン量を低下させる試験物質の同定は、例えば、異なる濃度の試験物質を投与した場合に測定されるバイオフォトン量を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質投与群とより低濃度の試験物質投与群との間；試験物質投与群とプラセボ投与群との間；試験物質投与群と無投与群との間；又は試験物質投与前後で、バイオフォトン量を比較する。試験物質の投与により、又はより高濃度の試験物質の投与によりバイオフォトン量が低下する場合、当該試験物質をバイオフォトン量低下物質として同定することができる。
例えば、試験物質投与群におけるバイオフォトン量が対照群（プラセボ投与群又は無投与群）と比較して低下傾向が認められた場合、好ましくは統計学的に有意な低下が認められた場合、当該試験物質をバイオフォトン量低下物質として同定することができる。
そして、同定されたバイオフォトン量を低下させる試験物質は、肌ダメージ抑制剤として評価することができる。
このようにして選択された肌ダメージ抑制剤は、例えば、肌ダメージ、好ましくは紫外線による肌のダメージ、例えばシワやシミの発生、毛穴の増加や目立ち等を抑制又は改善するための皮膚外用剤、すなわちＵＶケア化粧料として使用すること、或いは肌ダメージを抑制するための素材又は製剤としてＵＶケア化粧料等の皮膚外用剤に配合して使用することができる。
（実施例１）
１．被験者
２０歳代健常女性で、後記の光曝露歴による群分けで低曝露群（インドア派）に群分けされた２２名と高曝露群（アウトドア派）に群分けされた２１名の計４３名。
１．被験者
２０歳代健常女性で、後記の光曝露歴による群分けで低曝露群（インドア派）に群分けされた２２名と高曝露群（アウトドア派）に群分けされた２１名の計４３名。
２．光曝露履歴による群分け
被験者が、一定の年齢範囲において太陽光に曝露されていた標準的な時間を、生活習慣や屋外レジャー活動に関するアンケート調査に基づいて予測し、実年齢を考慮して累積光曝露時間を計算した。なお、アンケートの質問項目は米国がんセンター公開の光曝露歴に関する質問票をもとに作成した（Arch. Dermatol. 144, 217-22 (2008)）。次いで、被験者の年間平均光曝露時間を求め、その時間の長さに基づき、ほぼ均等となるよう低曝露群と高曝露群の２群に切り分けた。
被験者が、一定の年齢範囲において太陽光に曝露されていた標準的な時間を、生活習慣や屋外レジャー活動に関するアンケート調査に基づいて予測し、実年齢を考慮して累積光曝露時間を計算した。なお、アンケートの質問項目は米国がんセンター公開の光曝露歴に関する質問票をもとに作成した（Arch. Dermatol. 144, 217-22 (2008)）。次いで、被験者の年間平均光曝露時間を求め、その時間の長さに基づき、ほぼ均等となるよう低曝露群と高曝露群の２群に切り分けた。
３．試験方法
被験者は、被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）を市販のメイク落としと洗顔料を用いて洗浄し、環境可変室（室温２１±１℃、湿度５０％ＲＨ）にて２０分間馴化した。その後、皮膚性状測定を行った。最後に暗室にてバイオフォトン量測定を行った。
被験者は、被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）を市販のメイク落としと洗顔料を用いて洗浄し、環境可変室（室温２１±１℃、湿度５０％ＲＨ）にて２０分間馴化した。その後、皮膚性状測定を行った。最後に暗室にてバイオフォトン量測定を行った。
４．光源
光源は３００Ｗ型のキセノン光源（ＭＡＸ－３０２、朝日分光社製）に、ＷＧ－３２０フィルター（厚さ１ｍｍ、渋谷光学社製）を取り付けて使用した（紫外線Ａ波（ＵＶＡ）／紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）＝１０．８）。
光源は３００Ｗ型のキセノン光源（ＭＡＸ－３０２、朝日分光社製）に、ＷＧ－３２０フィルター（厚さ１ｍｍ、渋谷光学社製）を取り付けて使用した（紫外線Ａ波（ＵＶＡ）／紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）＝１０．８）。
５．バイオフォトン量測定方法
微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて、暗室中にて測定を行った。非特許文献（Skin Res. Technol. 14, 112-120, 2008.）記載の方法を参考に、１０分間の暗室馴化を行った。その後、安静座位にて装置の検出部アタッチメントと測定部位（上腕内側または前腕外側）とを密着させた。なお該検出部アタッチメントには光源からの光照射用ファイバーが繋がって一体となっており、光路を切り替えることで紫外線照射とバイオフォトン検出が替えられる構造となっている。紫外線照射前に、安静時の発光強度（定常バイオフォトン量）を２分間測定した。続いて、紫外線照射（４７．６ｍＷ／ｃｍ２、３０秒間）を行い、直後からの発光強度（照射後バイオフォトン量）を４分間測定した。データは０．１秒毎に取得した。
特定時間区分（照射直後から１分まで、照射１分後から３分後まで、及び照射３０秒後から１分後まで）の発光の平均値から安静時発光を引いた値を、紫外線照射による発光増分（応答バイオフォトン量）として算出し、それぞれＢＰ０－１ｍｉｎ、ＢＰ１－３ｍｉｎ、及びＢＰ３０－６０ｓｅｃと表記した。
微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて、暗室中にて測定を行った。非特許文献（Skin Res. Technol. 14, 112-120, 2008.）記載の方法を参考に、１０分間の暗室馴化を行った。その後、安静座位にて装置の検出部アタッチメントと測定部位（上腕内側または前腕外側）とを密着させた。なお該検出部アタッチメントには光源からの光照射用ファイバーが繋がって一体となっており、光路を切り替えることで紫外線照射とバイオフォトン検出が替えられる構造となっている。紫外線照射前に、安静時の発光強度（定常バイオフォトン量）を２分間測定した。続いて、紫外線照射（４７．６ｍＷ／ｃｍ２、３０秒間）を行い、直後からの発光強度（照射後バイオフォトン量）を４分間測定した。データは０．１秒毎に取得した。
特定時間区分（照射直後から１分まで、照射１分後から３分後まで、及び照射３０秒後から１分後まで）の発光の平均値から安静時発光を引いた値を、紫外線照射による発光増分（応答バイオフォトン量）として算出し、それぞれＢＰ０－１ｍｉｎ、ＢＰ１－３ｍｉｎ、及びＢＰ３０－６０ｓｅｃと表記した。
６．老化スコア測定方法
ＶＩＳＩＡ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて顔画像を取得し、訓練を受けた専門の判定者により、被験部位の視覚的老化度について、目の下のシワ、頬にあるシミの密度、頬の毛穴の計３項目の目視評価を行った。目の下のシワは眼窩の下端から発生するシワのうち、最も深いシワの深さについて１０段階で評価を実施した。頬にあるシミの密度はシミの密度のみを８段階で評価、頬の毛穴は全毛穴中、上位１０個の平均サイズを６段階で評価した。評価にあたってはスキンエイジングアトラス 第２巻：アジア系編（ＭＥＤ’ＣＯＭ）を参照した。
ＶＩＳＩＡ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて顔画像を取得し、訓練を受けた専門の判定者により、被験部位の視覚的老化度について、目の下のシワ、頬にあるシミの密度、頬の毛穴の計３項目の目視評価を行った。目の下のシワは眼窩の下端から発生するシワのうち、最も深いシワの深さについて１０段階で評価を実施した。頬にあるシミの密度はシミの密度のみを８段階で評価、頬の毛穴は全毛穴中、上位１０個の平均サイズを６段階で評価した。評価にあたってはスキンエイジングアトラス 第２巻：アジア系編（ＭＥＤ’ＣＯＭ）を参照した。
７．角層水分量測定方法
ＭＰＡ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社製）のコルネオメータープローブを用いて、被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）の角層水分量を測定した。
ＭＰＡ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社製）のコルネオメータープローブを用いて、被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）の角層水分量を測定した。
８．表面形状測定方法
レプリカ剤ＳＩＬＦＬＯ（アミックグループ社製）を被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）に塗布し、一定時間経過後、固化したレプリカ剤を剥離して皮膚レプリカを採取した。皮膚レプリカの表面形状（最大高さ：Ｓｍａｘ、面平均粗さ：Ｓａ、面二乗平方根粗さ：Ｓｑ）をＰＲＩＭＯＳ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて測定した。
レプリカ剤ＳＩＬＦＬＯ（アミックグループ社製）を被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）に塗布し、一定時間経過後、固化したレプリカ剤を剥離して皮膚レプリカを採取した。皮膚レプリカの表面形状（最大高さ：Ｓｍａｘ、面平均粗さ：Ｓａ、面二乗平方根粗さ：Ｓｑ）をＰＲＩＭＯＳ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて測定した。
９．毛穴指標測定方法
頬より取得した皮膚レプリカの標高像をＰＲＩＭＯＳ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて測定した。取得した頬の皮膚レプリカ標高像 に対し、以下の画像処理を行った。標高像から多項式フィルタによる、うねり除去を行った後、標高像を２値化し、毛穴領域を抽出した。抽出した毛穴領域が視野中に占める割合（毛穴面積比率）や、毛穴の平均面積を算出した。
頬より取得した皮膚レプリカの標高像をＰＲＩＭＯＳ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて測定した。取得した頬の皮膚レプリカ標高像 に対し、以下の画像処理を行った。標高像から多項式フィルタによる、うねり除去を行った後、標高像を２値化し、毛穴領域を抽出した。抽出した毛穴領域が視野中に占める割合（毛穴面積比率）や、毛穴の平均面積を算出した。
１０．細胞間脂質構造測定方法
共焦点ラマン分光器Ｍｏｄｅｌ ３５１０（ＲｉｖｅｒＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用い、被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）の角層細胞間脂質のパッキングを測定した。角層領域における、皮膚のラマンスペクトルを取得した（励起波長：６７１ｎｍ、露光時間：１０秒）。取得したスペクトルから、非特許文献（Ｓｋｉｎ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２１, ７６－８３ （２０１５））に記載の方法により、角層細胞間脂質のパッキング評価指標（Ｒ’ＣＨ）を算出した。
共焦点ラマン分光器Ｍｏｄｅｌ ３５１０（ＲｉｖｅｒＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用い、被験部位（上腕内側または前腕外側または頬）の角層細胞間脂質のパッキングを測定した。角層領域における、皮膚のラマンスペクトルを取得した（励起波長：６７１ｎｍ、露光時間：１０秒）。取得したスペクトルから、非特許文献（Ｓｋｉｎ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２１, ７６－８３ （２０１５））に記載の方法により、角層細胞間脂質のパッキング評価指標（Ｒ’ＣＨ）を算出した。
１１．過酸化脂質量測定方法
被験者の頬から洗顔後９０分時点の回復皮脂を、対象箇所１か所あたり１枚のシガレットペーパー（RIZLA社：リズラ・ブルー・ダブル、１．７ｃｍ×１．７ｃｍ、クロロホルム／メタノール＝１／１により脱脂処理済み、以下ＣＰ）をスクリュー管の底部を用いて被験者の皮膚に１０秒間押し付け採取した。皮脂を採取したＣＰには、スクリュー管内にて即時１ｍｌのメタノールを添加し、測定時まで－８０℃にて冷凍保管した。測定時に、窒素気流下にて溶媒を留去し、次いでスクリュー管内へ、クロロホルム／メタノール＝１／１を１ｍｌ添加し、スクリュー管内の溶媒へＣＰが十分に浸っていることを確認した上で、５分間の超音波処理による脂質抽出を行った。微量バイアル内に１００μｍｏｌ／ｌのＤｉｒｅｃｔ－ＭＳ／ＭＳ測定用の脂質内部標準混合溶液２０μｌを乾固させ、そこへ上記手順にて調製した皮脂溶液１００μｌを添加し、溶解・混合することで、内部標準入り皮脂試料溶液を調製した。調製した試料から、Ｄｉｒｅｃｔ－ＭＳ／ＭＳにて被験者毎に、脂質総量及びスクアレン過酸化物の絶対量を算出した。算出したスクアレン過酸化物絶対量を脂質総量で除し、過酸化脂質量の指標とした。
被験者の頬から洗顔後９０分時点の回復皮脂を、対象箇所１か所あたり１枚のシガレットペーパー（RIZLA社：リズラ・ブルー・ダブル、１．７ｃｍ×１．７ｃｍ、クロロホルム／メタノール＝１／１により脱脂処理済み、以下ＣＰ）をスクリュー管の底部を用いて被験者の皮膚に１０秒間押し付け採取した。皮脂を採取したＣＰには、スクリュー管内にて即時１ｍｌのメタノールを添加し、測定時まで－８０℃にて冷凍保管した。測定時に、窒素気流下にて溶媒を留去し、次いでスクリュー管内へ、クロロホルム／メタノール＝１／１を１ｍｌ添加し、スクリュー管内の溶媒へＣＰが十分に浸っていることを確認した上で、５分間の超音波処理による脂質抽出を行った。微量バイアル内に１００μｍｏｌ／ｌのＤｉｒｅｃｔ－ＭＳ／ＭＳ測定用の脂質内部標準混合溶液２０μｌを乾固させ、そこへ上記手順にて調製した皮脂溶液１００μｌを添加し、溶解・混合することで、内部標準入り皮脂試料溶液を調製した。調製した試料から、Ｄｉｒｅｃｔ－ＭＳ／ＭＳにて被験者毎に、脂質総量及びスクアレン過酸化物の絶対量を算出した。算出したスクアレン過酸化物絶対量を脂質総量で除し、過酸化脂質量の指標とした。
＜Ｄｉｒｅｃｔ－ＭＳ／ＭＳ測定条件＞
特許文献（６４８２２１５号）に記載の方法により、脂質総量及びスクアレン過酸化物量の測定を行った。
装置：ＬＣ／Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ、質量分析計／６４６０ トリプル四重極（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
移動相：１５ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム含有クロロホルム／メタノール＝１／１
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：１μｌ
検出条件：イオン化法＝ＥＳＩ、乾燥ガス温度＝３００℃、乾燥ガス流量＝５ｌ／ｍｉｎ、ネブライザー圧力＝４５ｐｓｉ、シースガス温度＝２５０℃、シースガス流量＝１１ｌ／ｍｉｎ、ネブライザー電圧＝０Ｖ、キャピラリー電圧＝３５００Ｖ
特許文献（６４８２２１５号）に記載の方法により、脂質総量及びスクアレン過酸化物量の測定を行った。
装置：ＬＣ／Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ、質量分析計／６４６０ トリプル四重極（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
移動相：１５ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム含有クロロホルム／メタノール＝１／１
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：１μｌ
検出条件：イオン化法＝ＥＳＩ、乾燥ガス温度＝３００℃、乾燥ガス流量＝５ｌ／ｍｉｎ、ネブライザー圧力＝４５ｐｓｉ、シースガス温度＝２５０℃、シースガス流量＝１１ｌ／ｍｉｎ、ネブライザー電圧＝０Ｖ、キャピラリー電圧＝３５００Ｖ
１２．肌悩みアンケート
「頬の毛穴が目立つ」などの肌悩みについて、被験者が現在の肌状態をもとに「気になる・やや気になる・あまり気にならない・気にならない」の４段階から選択した。
「頬の毛穴が目立つ」などの肌悩みについて、被験者が現在の肌状態をもとに「気になる・やや気になる・あまり気にならない・気にならない」の４段階から選択した。
１３．角層のタンパク質の解析
肌表面に粘着テープ（２．５ｃｍ×５．０ｃｍ、フィルムマスキングテープ４６５＃４０、寺岡製作所製）を一定圧で押し当てた後はがすことにより角層を採取した。採取は同一部位から３回連続して行い、前腕外側部、頬部それぞれから３枚ずつ、合計６枚の粘着テープを用いて角層を採取した。
角層を採取した３枚の粘着テープを抽出溶液（７ｍｏｌ／Ｌ Ｕｒｅａ、２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｈｉｏｕｒｅａ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＬＳ水、１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）の混合物水溶液）１ｍＬに浸漬させ、２０分間氷水中で超音波処理した。そこへ、１ｍｏｌ／Ｌ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ混合物水溶液を１０μＬ加えて３７℃で一晩振盪した。そこへ １ｍｏｌ/Ｌ Ｉｏｄｅ Ａｃｅｔｏａｍｉｄｅ、５０ｍｍｏｌ/Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ混合水溶液５０μＬ加えて、３０分間室温で静置し、タンパク質の抽出溶液とした。
ＥＺＱＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて、抽出溶液中のタンパク質量を定量した。
抽出溶液に５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ水溶液２ｍＬを加えて、０．２μｇ／μＬに調製したＬｙｓ－Ｃ溶液（富士フィルム和光純薬）をタンパク質重量に対して１００分の１になるように加え、３７℃で３時間振とうした。その後、０．２μｇ／μＬに調製したＴｒｙｐｓｉｎ溶液（富士フィルム和光純薬）をタンパク質量に対して１００分の１になるように加えて、３７℃で終夜振とうした。処理溶液を３本の２ｍＬチューブにそれぞれ１ｍＬずつ分け、それぞれ酢酸エチル１ｍＬ及び５０％（v/v）ＴＦＡ水溶液を終濃度０．５％（v/v）になるように加えた後、２分間撹拌し、１５，０００ｒ／ｍｉｎで３分間遠心分離した。上層の酢酸エチルを除去し、残りの溶液を５０℃で減圧乾固した。その後、脱塩処理を行い、０．１％(v/v)ＴＦＡ含有２％(v/v)アセトニトリル水溶液を加えて溶かし、タンパク質終濃度が１μｇ／μＬのＬＣ－ＭＳ測定用試料溶液を調製した。
肌表面に粘着テープ（２．５ｃｍ×５．０ｃｍ、フィルムマスキングテープ４６５＃４０、寺岡製作所製）を一定圧で押し当てた後はがすことにより角層を採取した。採取は同一部位から３回連続して行い、前腕外側部、頬部それぞれから３枚ずつ、合計６枚の粘着テープを用いて角層を採取した。
角層を採取した３枚の粘着テープを抽出溶液（７ｍｏｌ／Ｌ Ｕｒｅａ、２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｈｉｏｕｒｅａ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＬＳ水、１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）の混合物水溶液）１ｍＬに浸漬させ、２０分間氷水中で超音波処理した。そこへ、１ｍｏｌ／Ｌ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ混合物水溶液を１０μＬ加えて３７℃で一晩振盪した。そこへ １ｍｏｌ/Ｌ Ｉｏｄｅ Ａｃｅｔｏａｍｉｄｅ、５０ｍｍｏｌ/Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ混合水溶液５０μＬ加えて、３０分間室温で静置し、タンパク質の抽出溶液とした。
ＥＺＱＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて、抽出溶液中のタンパク質量を定量した。
抽出溶液に５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ水溶液２ｍＬを加えて、０．２μｇ／μＬに調製したＬｙｓ－Ｃ溶液（富士フィルム和光純薬）をタンパク質重量に対して１００分の１になるように加え、３７℃で３時間振とうした。その後、０．２μｇ／μＬに調製したＴｒｙｐｓｉｎ溶液（富士フィルム和光純薬）をタンパク質量に対して１００分の１になるように加えて、３７℃で終夜振とうした。処理溶液を３本の２ｍＬチューブにそれぞれ１ｍＬずつ分け、それぞれ酢酸エチル１ｍＬ及び５０％（v/v）ＴＦＡ水溶液を終濃度０．５％（v/v）になるように加えた後、２分間撹拌し、１５，０００ｒ／ｍｉｎで３分間遠心分離した。上層の酢酸エチルを除去し、残りの溶液を５０℃で減圧乾固した。その後、脱塩処理を行い、０．１％(v/v)ＴＦＡ含有２％(v/v)アセトニトリル水溶液を加えて溶かし、タンパク質終濃度が１μｇ／μＬのＬＣ－ＭＳ測定用試料溶液を調製した。
＜ＬＣ－ＭＳ測定＞
調製した試料について、以下のようにＬＣ－ＭＳ測定を行った。
液体クロマトグラフィー（以下、「ＬＣ」ともいう）装置としてＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ社製）を、質量分析（以下、「ＭＳ」ともいう）装置としてＴｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ５６００＋（商品名、ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）を用いた。
ＬＣ条件及びＭＳ条件は、以下に示す通りである。
（１）ＬＣ条件
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）１００ Ｎａｎｏ Ｔｒａｐ Ｃ１８ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ
粒子径３μｍ 内径７５μｍ×長さ２０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）
試料ロード溶液：０．１％(v/v)ギ酸水溶液
分離カラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）ＲＳＬＣ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ
粒子径３μｍ、内径７５μｍ×長さ１５ｃｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）
溶離液Ａ：０．１％(v/v)ギ酸水溶液
溶離液Ｂ：０．１％(v/v)ギ酸含有アセトニトリル
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：溶離液Ｂ ５％（０－５ｍｉｎ）→Ｂ５０％（１２５ｍｉｎ）→Ｂ９５％（１２６－１５０ｍｉｎ）→オートキャリブレーションＢ９５％（１５５ｍｉｎ）→Ｂ５％（１５６－１８０ｍｉｎ）
注入量：１μＬ
カラム温度：４０℃
調製した試料について、以下のようにＬＣ－ＭＳ測定を行った。
液体クロマトグラフィー（以下、「ＬＣ」ともいう）装置としてＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ社製）を、質量分析（以下、「ＭＳ」ともいう）装置としてＴｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ５６００＋（商品名、ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）を用いた。
ＬＣ条件及びＭＳ条件は、以下に示す通りである。
（１）ＬＣ条件
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）１００ Ｎａｎｏ Ｔｒａｐ Ｃ１８ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ
粒子径３μｍ 内径７５μｍ×長さ２０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）
試料ロード溶液：０．１％(v/v)ギ酸水溶液
分離カラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）ＲＳＬＣ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ
粒子径３μｍ、内径７５μｍ×長さ１５ｃｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）
溶離液Ａ：０．１％(v/v)ギ酸水溶液
溶離液Ｂ：０．１％(v/v)ギ酸含有アセトニトリル
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：溶離液Ｂ ５％（０－５ｍｉｎ）→Ｂ５０％（１２５ｍｉｎ）→Ｂ９５％（１２６－１５０ｍｉｎ）→オートキャリブレーションＢ９５％（１５５ｍｉｎ）→Ｂ５％（１５６－１８０ｍｉｎ）
注入量：１μＬ
カラム温度：４０℃
（２）ペプチド定性用ＭＳ条件
イオン化法：ナノエレクトロスプレーイオン化法（ｎａｎｏ ＥＳＩ法）
スプレーチップ：Ｐｉｃｏ Ｔｉｐ ＮａｎｏＳｐｒａｙ Ｅｍｉｔｔｅｒ ＦＳ３６０－５０－１５－Ｎ
外径３６０μｍ、先端外径５０μｍ、内径１５μｍ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）
極性：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
スプレー電圧：２３００Ｖ
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｈｅａｔｅｒ温度：１５０℃
スキャン範囲：ｍ／ｚ ３５０－１２５０
スキャン時間：２５０ｍｓ
ＭＳ／ＭＳ測定：衝突誘起解離（ＣＩＤ）
測定モード：Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙモード
ＭＳ／ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ １００－２０００
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）：３５
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ Ｓｐｒｅａｄ（ＣＥＳ）：１５
Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：１００ｍｓ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｃｈａｒｇｅ ｓｔａｔｅ：２ ｔｏ ５（ｗｈｉｃｈ ｅｘｃｅｅｄｓ １５０ｃｐｓ）
Ｍａｓｓ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：５０ｍＤａ
Ｍａｘｉｍｕｍ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｉｏｎｓ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｐｅｒ ｃｙｃｌｅ：２０
Ｅｘｃｌｕｄｅ ｆｏｒｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｏｎｓ：１５ｓｅｃ
イオン化法：ナノエレクトロスプレーイオン化法（ｎａｎｏ ＥＳＩ法）
スプレーチップ：Ｐｉｃｏ Ｔｉｐ ＮａｎｏＳｐｒａｙ Ｅｍｉｔｔｅｒ ＦＳ３６０－５０－１５－Ｎ
外径３６０μｍ、先端外径５０μｍ、内径１５μｍ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）
極性：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
スプレー電圧：２３００Ｖ
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｈｅａｔｅｒ温度：１５０℃
スキャン範囲：ｍ／ｚ ３５０－１２５０
スキャン時間：２５０ｍｓ
ＭＳ／ＭＳ測定：衝突誘起解離（ＣＩＤ）
測定モード：Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙモード
ＭＳ／ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ １００－２０００
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）：３５
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ Ｓｐｒｅａｄ（ＣＥＳ）：１５
Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：１００ｍｓ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｃｈａｒｇｅ ｓｔａｔｅ：２ ｔｏ ５（ｗｈｉｃｈ ｅｘｃｅｅｄｓ １５０ｃｐｓ）
Ｍａｓｓ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：５０ｍＤａ
Ｍａｘｉｍｕｍ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｉｏｎｓ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｐｅｒ ｃｙｃｌｅ：２０
Ｅｘｃｌｕｄｅ ｆｏｒｍｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｏｎｓ：１５ｓｅｃ
（３）ペプチド定量用ＭＳ条件（ＳＷＡＴＨ（登録商標） Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）
イオン化法：ナノエレクトロスプレーイオン化法（ｎａｎｏ ＥＳＩ法）
スプレーチップ：Ｐｉｃｏ Ｔｉｐ ＮａｎｏＳｐｒａｙＥｍｉｔｔｅｒ ＦＳ３６０－５０－１５－Ｎ
外径３６０μｍ、先端外径５０μｍ、内径１５μｍ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）
極性：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
スプレー電圧：２３００Ｖ
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｈｅａｔｅｒ温度：１５０℃
スキャン範囲：ｍ／ｚ ３５０－１２５０（ペプチドイオンの検出）
ＳＷＡＴＨ ｗｉｄｔｈ：２５Ｄａ
スキャン時間：１５０ｍｓ
ＭＳ／ＭＳ測定：衝突誘起解離（ＣＩＤ）
測定モード：Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙモード
ＭＳ／ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ １００－１５００
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）：Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ Ｓｐｒｅａｄ（ＣＥＳ）：１５
Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：１００ｍｓ
イオン化法：ナノエレクトロスプレーイオン化法（ｎａｎｏ ＥＳＩ法）
スプレーチップ：Ｐｉｃｏ Ｔｉｐ ＮａｎｏＳｐｒａｙＥｍｉｔｔｅｒ ＦＳ３６０－５０－１５－Ｎ
外径３６０μｍ、先端外径５０μｍ、内径１５μｍ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）
極性：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
スプレー電圧：２３００Ｖ
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｈｅａｔｅｒ温度：１５０℃
スキャン範囲：ｍ／ｚ ３５０－１２５０（ペプチドイオンの検出）
ＳＷＡＴＨ ｗｉｄｔｈ：２５Ｄａ
スキャン時間：１５０ｍｓ
ＭＳ／ＭＳ測定：衝突誘起解離（ＣＩＤ）
測定モード：Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙモード
ＭＳ／ＭＳスキャン範囲：ｍ／ｚ １００－１５００
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）：Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ Ｓｐｒｅａｄ（ＣＥＳ）：１５
Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：１００ｍｓ
各タンパク質の酵素消化物の同定には、データベースとしてＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）を、―データベース解析ソフトとしてＰｒｏｔｅｉｎ ｐｉｌｏｔ１．２（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）を、ペプチドピーク面積の算出ソフトとしてＰｅａｋＶｉｅｗ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）を使用し、各タンパク質あたり、１～５種のペプチドのピーク面積にて比較解析を行った。
検索条件及び定量条件は、以下に示すとおりである。
検索条件及び定量条件は、以下に示すとおりである。
（４）タンパク質データベースサーチ
解析ソフトウェア：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｉｌｏｔ１．２（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｐａｒａｇｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
Ｃｙｓ－Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ：Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ
Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ｔｒｙｐｓｉｎ
ＩＤ ｆｏｃｕｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ
Ｄａｔａｂａｓｅ：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ
Ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｃｅ
Ｓｅａｒｃｈ ｅｆｆｏｒｔ：Ｔｈｏｒｏｕｇｈ ＩＤ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｕｎｕｓｅｄ ＰｒｏｔＳｃｏｒｅ（Ｃｏｎｆ）＞０．０５（１０％）
解析ソフトウェア：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｉｌｏｔ１．２（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｐａｒａｇｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
Ｃｙｓ－Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ：Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ
Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ｔｒｙｐｓｉｎ
ＩＤ ｆｏｃｕｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ
Ｄａｔａｂａｓｅ：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ
Ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｃｅ
Ｓｅａｒｃｈ ｅｆｆｏｒｔ：Ｔｈｏｒｏｕｇｈ ＩＤ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｕｎｕｓｅｄ ＰｒｏｔＳｃｏｒｅ（Ｃｏｎｆ）＞０．０５（１０％）
（５）ペプチドピーク面積算出
解析ソフトフェア：Ｐｅａｋ Ｖｉｅｗ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ：５
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ：５
Ｆｉｌｔｅｒ ｂｙ：Ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＞９５％，Ｅｘｃｌｕｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｅｘｃｌｕｄｅ Ｓｈａｒｅｄ
ＸＩＣ ｗｉｄｔｈ：５０ｐｐｍ
解析ソフトフェア：Ｐｅａｋ Ｖｉｅｗ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ：５
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ：５
Ｆｉｌｔｅｒ ｂｙ：Ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＞９５％，Ｅｘｃｌｕｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｅｘｃｌｕｄｅ Ｓｈａｒｅｄ
ＸＩＣ ｗｉｄｔｈ：５０ｐｐｍ
試験例１ バイオフォトン量と相関する皮膚性状の探索
紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）と皮膚性状との相関性を評価したところ、露光部である前腕外側では、角層水分量と有意な相関関係が、平均粗さ（Ｓａ）、二乗平方根粗さ（Ｓｑ）、角層細胞間脂質パッキングとに相関傾向が認められた（表１）。弱露光部である上腕内側においても、角層水分量、平均粗さ（Ｓａ）、二乗平方根粗さ（Ｓｑ）とに相関傾向が認められた（表１）。一方、紫外線照射直後から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ０－１ｍｉｎ）に関しては、他の皮膚性状との相関性は認められなかった（表１）。紫外線照射３０秒から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ３０－６０ｓｅｃ）に関しては、前腕外側では、角層水分量、角層細胞間脂質パッキングと有意な相関関係が、平均粗さ（Ｓａ）、二乗平方根粗さ（Ｓｑ）とに相関傾向が認められた（表１）。上腕内側においても、平均粗さ（Ｓａ）とに相関傾向が認められた（表１）。紫外線照射直後のバイオフォトン量は、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を示唆しているが、ＢＰ０－１ｍｉｎではなく、ＢＰ１－３ｍｉｎ、及びＢＰ３０－６０ｓｅｃを指標とすることで、肌ダメージを評価できることが推察された。
紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）と皮膚性状との相関性を評価したところ、露光部である前腕外側では、角層水分量と有意な相関関係が、平均粗さ（Ｓａ）、二乗平方根粗さ（Ｓｑ）、角層細胞間脂質パッキングとに相関傾向が認められた（表１）。弱露光部である上腕内側においても、角層水分量、平均粗さ（Ｓａ）、二乗平方根粗さ（Ｓｑ）とに相関傾向が認められた（表１）。一方、紫外線照射直後から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ０－１ｍｉｎ）に関しては、他の皮膚性状との相関性は認められなかった（表１）。紫外線照射３０秒から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ３０－６０ｓｅｃ）に関しては、前腕外側では、角層水分量、角層細胞間脂質パッキングと有意な相関関係が、平均粗さ（Ｓａ）、二乗平方根粗さ（Ｓｑ）とに相関傾向が認められた（表１）。上腕内側においても、平均粗さ（Ｓａ）とに相関傾向が認められた（表１）。紫外線照射直後のバイオフォトン量は、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を示唆しているが、ＢＰ０－１ｍｉｎではなく、ＢＰ１－３ｍｉｎ、及びＢＰ３０－６０ｓｅｃを指標とすることで、肌ダメージを評価できることが推察された。
試験例２ 光曝露と相関する皮膚性状の探索
露光部である頬部において、高曝露群では低曝露群に比べ、角層水分量の低下、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）の増加、毛穴面積の増加、毛穴比率の増加、が統計学的有意に認められ、角層細胞間脂質パッキングの低下、過酸化脂質量の増加、の傾向が認められた（表２）。また皮膚の変化として、高曝露群では低曝露群に比べ、目の下のシワの増加、頬にあるシミの増加、頬の毛穴目立ちの増加、が統計学的有意に認められた（表３）。さらにアンケートより、高曝露群では低曝露群に比べ、頬の毛穴が目立つ、という実感が多かった（表４）。
露光部である頬部において、高曝露群では低曝露群に比べ、角層水分量の低下、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）の増加、毛穴面積の増加、毛穴比率の増加、が統計学的有意に認められ、角層細胞間脂質パッキングの低下、過酸化脂質量の増加、の傾向が認められた（表２）。また皮膚の変化として、高曝露群では低曝露群に比べ、目の下のシワの増加、頬にあるシミの増加、頬の毛穴目立ちの増加、が統計学的有意に認められた（表３）。さらにアンケートより、高曝露群では低曝露群に比べ、頬の毛穴が目立つ、という実感が多かった（表４）。
試験例３ 外見の変化と相関する皮膚性状の検証
目の下のシワに関しては、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）、毛穴面積、と統計学的有意な相関関係が認められ、毛穴比率、角層細胞間脂質パッキング、とに相関傾向が認められた（表５）。
頬にあるシミに関しては、角層水分量、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）、と統計学的有意な相関関係が認められた（表５）。
頬の毛穴に関しては、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）、毛穴面積、と統計学的有意な相関関係が認められ、毛穴比率、過酸化脂質量、とに相関傾向が認められた（表５）。
目の下のシワに関しては、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）、毛穴面積、と統計学的有意な相関関係が認められ、毛穴比率、角層細胞間脂質パッキング、とに相関傾向が認められた（表５）。
頬にあるシミに関しては、角層水分量、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）、と統計学的有意な相関関係が認められた（表５）。
頬の毛穴に関しては、表面粗さ（Ｓｍａｘ、Ｓａ、Ｓｑ）、毛穴面積、と統計学的有意な相関関係が認められ、毛穴比率、過酸化脂質量、とに相関傾向が認められた（表５）。
試験例４ バイオフォトン量と相関する角層タンパク質の探索
紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）と角層タンパク質との相関性を評価したところ、露光部である前腕外側では、酸化ストレス／抗酸化能に関わるタンパク質との相関性が認められた。具体的には、抗酸化酵素であるＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ１と負の相関傾向が認められた（表６）。一方、紫外線照射直後から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ０－１ｍｉｎ）に関しては、角層タンパク質との相関性は認められなかった（表６）。紫外線照射３０秒から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ３０－６０ｓｅｃ）に関しては、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ１と相関傾向が認められた（表６）。
紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）と角層タンパク質との相関性を評価したところ、露光部である前腕外側では、酸化ストレス／抗酸化能に関わるタンパク質との相関性が認められた。具体的には、抗酸化酵素であるＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ１と負の相関傾向が認められた（表６）。一方、紫外線照射直後から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ０－１ｍｉｎ）に関しては、角層タンパク質との相関性は認められなかった（表６）。紫外線照射３０秒から１分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ３０－６０ｓｅｃ）に関しては、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ１と相関傾向が認められた（表６）。
試験例５ 光曝露と相関する角層タンパク質の探索
露光部である頬部において、高曝露群では低曝露群に比べ、抗酸化能の低下が認められた。具体的には、抗酸化酵素であるＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ１の減少が統計学的有意に認められた（表７）。
露光部である頬部において、高曝露群では低曝露群に比べ、抗酸化能の低下が認められた。具体的には、抗酸化酵素であるＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ１の減少が統計学的有意に認められた（表７）。
以下の実施例２、実施例３では、紫外線によるダメージに対する防御効果が報告されているローズマリー抽出物（例えば、J. Photochem. Photobiol. B, 136, 12-18 (2014)）を用いて、その肌ダメージ抑制剤としての効果を評価した。
（実施例２）
１．被験者
健常な成人男性で、後記のローズマリーエキス含有サンスクリーン剤使用群１５名、プラセボサンスクリーン剤使用群１３名の計２８名。
１．被験者
健常な成人男性で、後記のローズマリーエキス含有サンスクリーン剤使用群１５名、プラセボサンスクリーン剤使用群１３名の計２８名。
２．試験品
・ローズマリーエキス含有サンスクリーン剤；ファルコレックスローズマリーＥ（５０％エタノール水溶液、一丸ファルコス社製）を３．０％（ｖ／ｖ）含有するサンスクリーン剤。
・プラセボサンスクリーン剤；ファルコレックスローズマリーＥの代わりに、５０％エタノール水溶液を含有するサンスクリーン剤。
・ローズマリーエキス含有サンスクリーン剤；ファルコレックスローズマリーＥ（５０％エタノール水溶液、一丸ファルコス社製）を３．０％（ｖ／ｖ）含有するサンスクリーン剤。
・プラセボサンスクリーン剤；ファルコレックスローズマリーＥの代わりに、５０％エタノール水溶液を含有するサンスクリーン剤。
３．試験方法
被験者は、被験部位（頬及び頸部）を市販のメイク落としと洗顔料を用いて洗浄し、環境可変室（室温２１±１℃、湿度５０％ＲＨ）にて２０分間馴化した。その後、皮膚性状測定を行った。測定日の翌日から、上記試験品を１日１回（朝）、全顔に０．３ｇ、頸部に０．５ｇずつ、４週間連用塗布してもらった。尚、被験者は連用期間中、被験部位に試験品以外の紫外線防御効果を有する化粧品の塗布を控え、過度の光曝露を避けて過ごしてもらった。連用後、連用前と同様の手順で皮膚性状測定を行い、最後に暗室にてバイオフォトン量測定を行った。
被験者は、被験部位（頬及び頸部）を市販のメイク落としと洗顔料を用いて洗浄し、環境可変室（室温２１±１℃、湿度５０％ＲＨ）にて２０分間馴化した。その後、皮膚性状測定を行った。測定日の翌日から、上記試験品を１日１回（朝）、全顔に０．３ｇ、頸部に０．５ｇずつ、４週間連用塗布してもらった。尚、被験者は連用期間中、被験部位に試験品以外の紫外線防御効果を有する化粧品の塗布を控え、過度の光曝露を避けて過ごしてもらった。連用後、連用前と同様の手順で皮膚性状測定を行い、最後に暗室にてバイオフォトン量測定を行った。
４．バイオフォトン量測定方法
実施例１と同様の光源と方法により、微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて、暗室中にて被験部位（頸部正面）の測定を行った。測定に不備がありデータに異常値が認められたものは除外した。
実施例１と同様の光源と方法により、微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて、暗室中にて被験部位（頸部正面）の測定を行った。測定に不備がありデータに異常値が認められたものは除外した。
５．表面形状測定方法
実施例１と同様に、レプリカ剤ＳＩＬＦＬＯ（アミックグループ社製）を被験部位（頬）に塗布し、一定時間経過後、固化したレプリカ剤を剥離して皮膚レプリカを採取した。皮膚レプリカの表面形状（面平均粗さ：Ｓａ）をＰＲＩＭＯＳ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて測定した。
実施例１と同様に、レプリカ剤ＳＩＬＦＬＯ（アミックグループ社製）を被験部位（頬）に塗布し、一定時間経過後、固化したレプリカ剤を剥離して皮膚レプリカを採取した。皮膚レプリカの表面形状（面平均粗さ：Ｓａ）をＰＲＩＭＯＳ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて測定した。
６．老化スコア測定方法
実施例１と同様に、ＶＩＳＩＡ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて顔画像を取得し、被験部位の視覚的老化度（目の下のシワ）について、訓練を受けた専門の判定者により目視評価を行った。
実施例１と同様に、ＶＩＳＩＡ－ＣＲ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ社製）を用いて顔画像を取得し、被験部位の視覚的老化度（目の下のシワ）について、訓練を受けた専門の判定者により目視評価を行った。
試験例６ 肌ダメージ抑制剤の評価（１）
ローズマリーエキス含有サンスクリーン剤を連用した群で、頸部における４週後の紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）は、プラセボサンスクリーン群に比べて統計学的有意に低下した（表８）。なお、Ｔｈｏｍｐｓｏｎの棄却検定により外れ値を除いた後の、プラセボサンスクリーン群５名及びローズマリーエキス含有サンスクリーン群８名のデータを用いて解析を実施した。頬における平均粗さ（Ｓａ）は、ローズマリーエキス含有サンスクリーン群では連用前後で低下する傾向が認められたのに対し、プラセボサンスクリーン群では連用前後で変化は認められなかった（表９）。連用前後で頬における平均粗さ（Ｓａ）の改善した上位５名を対象にすると、ローズマリーエキス含有サンスクリーン群で、４週後の目の下のシワのスコアは、プラセボサンスクリーン群に比べて低下している傾向が認められた（表１０）。 ローズマリーエキス含有サンスクリーン剤はプラセボサンスクリーン剤に比べて、紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）を低下させるとともに、実施例１で示されたように、紫外線曝露が影響する肌性状のひとつである肌の表面形状（平均粗さ：Ｓａ）を抑えることが推察され、肌ダメージの指標である老化スコア（目の下のシワ）を抑制させることにもつながることが示唆された。
ローズマリーエキス含有サンスクリーン剤を連用した群で、頸部における４週後の紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）は、プラセボサンスクリーン群に比べて統計学的有意に低下した（表８）。なお、Ｔｈｏｍｐｓｏｎの棄却検定により外れ値を除いた後の、プラセボサンスクリーン群５名及びローズマリーエキス含有サンスクリーン群８名のデータを用いて解析を実施した。頬における平均粗さ（Ｓａ）は、ローズマリーエキス含有サンスクリーン群では連用前後で低下する傾向が認められたのに対し、プラセボサンスクリーン群では連用前後で変化は認められなかった（表９）。連用前後で頬における平均粗さ（Ｓａ）の改善した上位５名を対象にすると、ローズマリーエキス含有サンスクリーン群で、４週後の目の下のシワのスコアは、プラセボサンスクリーン群に比べて低下している傾向が認められた（表１０）。 ローズマリーエキス含有サンスクリーン剤はプラセボサンスクリーン剤に比べて、紫外線照射１～３分後に測定されたバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）を低下させるとともに、実施例１で示されたように、紫外線曝露が影響する肌性状のひとつである肌の表面形状（平均粗さ：Ｓａ）を抑えることが推察され、肌ダメージの指標である老化スコア（目の下のシワ）を抑制させることにもつながることが示唆された。
（実施例３）
１．被験者
健常な成人男性１０名。
１．被験者
健常な成人男性１０名。
２．試験品
・ローズマリーエキス水溶液；ファルコレックスローズマリーＥ（５０％エタノール水溶液、一丸ファルコス社製）を、蒸留水で３．０％（ｖ／ｖ）となるように希釈した水溶液。
・ローズマリーエキス水溶液；ファルコレックスローズマリーＥ（５０％エタノール水溶液、一丸ファルコス社製）を、蒸留水で３．０％（ｖ／ｖ）となるように希釈した水溶液。
３．試験方法
被験者に、恒温恒湿条件（ＲＴ２１±１℃、ＲＨ５０±５％）の測定室に入室してもらい、腹部をウェットティッシュでふき取り、腹部の衣服を脱いだ状態で２０分間馴化した。腹部の被験部位は１か所、５ｃｍ四方（５×５ｃｍ）とした。馴化後、角層水分量の測定を行った。その後、暗室にてバイオフォトン量測定を行った。測定日の夕方から、上記試験品を１日２回（朝、夕）、被験部位に２ｍｇ／ｃｍ２ずつ、４週間連用塗布してもらった。連用後、連用前と同様の手順で角層水分量測定、バイオフォトン量測定を行った。
被験者に、恒温恒湿条件（ＲＴ２１±１℃、ＲＨ５０±５％）の測定室に入室してもらい、腹部をウェットティッシュでふき取り、腹部の衣服を脱いだ状態で２０分間馴化した。腹部の被験部位は１か所、５ｃｍ四方（５×５ｃｍ）とした。馴化後、角層水分量の測定を行った。その後、暗室にてバイオフォトン量測定を行った。測定日の夕方から、上記試験品を１日２回（朝、夕）、被験部位に２ｍｇ／ｃｍ２ずつ、４週間連用塗布してもらった。連用後、連用前と同様の手順で角層水分量測定、バイオフォトン量測定を行った。
４．バイオフォトン量測定方法
実施例１と同様の光源と方法により、微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて、暗室中にて被験部位（腹部）の測定を行った。測定データは、連用前の値を１として相対的に評価した。
実施例１と同様の光源と方法により、微弱発光強度検出装置（ＣＬＡ－ＩＤＦｓｋ、東北電子産業社製）を用いて、暗室中にて被験部位（腹部）の測定を行った。測定データは、連用前の値を１として相対的に評価した。
５．角層水分量測定方法
ＭＰＡ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社製）のコルネオメータープローブを用いて、被験部位（腹部）の角層水分量を測定した。連用前後の測定ができた７名を対象に解析を行った。測定データは、連用前の値を１として相対的に評価した。
ＭＰＡ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社製）のコルネオメータープローブを用いて、被験部位（腹部）の角層水分量を測定した。連用前後の測定ができた７名を対象に解析を行った。測定データは、連用前の値を１として相対的に評価した。
試験例７ 肌ダメージ抑制剤の評価（２）
ローズマリーエキス水溶液を連用すると、腹部における４週後のバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）は、連用前に比べて低下する傾向が認められた（表１１）。腹部における角層水分量は、ローズマリーエキス水溶液を連用すると連用前に比べて統計学的有意に増加した（表１１）。ローズマリーエキス水溶液は、バイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）を低下させるとともに、角層水分量を増加させることが推察された。実施例１で示されたように、角層水分量は、肌ダメージ（皮膚の変化）と相関する光曝露歴と密接な関係を有することから、バイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）を指標として肌ダメージ抑制効果を評価することが可能であると推察される。
ローズマリーエキス水溶液を連用すると、腹部における４週後のバイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）は、連用前に比べて低下する傾向が認められた（表１１）。腹部における角層水分量は、ローズマリーエキス水溶液を連用すると連用前に比べて統計学的有意に増加した（表１１）。ローズマリーエキス水溶液は、バイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）を低下させるとともに、角層水分量を増加させることが推察された。実施例１で示されたように、角層水分量は、肌ダメージ（皮膚の変化）と相関する光曝露歴と密接な関係を有することから、バイオフォトン量（ＢＰ１－３ｍｉｎ）を指標として肌ダメージ抑制効果を評価することが可能であると推察される。
Claims (9)
- 被験者の皮膚に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて肌ダメージを判定する工程を含む肌ダメージの判定方法であって、該肌ダメージが紫外線による肌ダメージであり、該紫外線による肌ダメージが角層水分量の低下、毛穴面積の増加、毛穴比率の増加、表面粗さの増加及び角層細胞間脂質パッキングの低下から選ばれる皮膚性状の変化又は抗酸化能の低下であるか、又はシワの増加、シミの増加又は毛穴の目立ちであり、該所定期間は、その５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なる期間である、方法。
- 所定期間の長さが、２０秒間～３分間である請求項１記載の方法。
- 所定期間の長さが、３０秒間～３分間である請求項１記載の方法。
- 所定期間が、紫外線照射後１～２分の１分間、紫外線照射後２～３分の１分間、紫外線照射後１～３分の２分間、又は紫外線照射後３０秒～１分の３０秒間である請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
- 紫外線照射が、Ａ波とＢ波の混合紫外線の照射である請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
- 紫外線照射が、３００～８０００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線照射量である請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
- 紫外線照射が、３００～７０００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線照射量である請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
- バイオフォトンの発光強度によりバイオフォトン量を算出する請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
- 試験物質を被検対象に投与又は接触させる工程、及び被検対象の皮膚又は皮膚細胞に紫外線を照射し、該照射後の所定期間内に検出されるバイオフォトンの量を用いて試験物質を評価する工程を含む肌ダメージ抑制剤の評価又は探索方法であって、該肌ダメージが紫外線による肌ダメージであり、該紫外線による肌ダメージが角層水分量の低下、毛穴面積の増加、毛穴比率の増加、表面粗さの増加及び角層細胞間脂質パッキングの低下から選ばれる皮膚性状の変化又は抗酸化能の低下であるか、又はシワの増加、シミの増加又は毛穴の目立ちであり、該所定期間は、その５０％を超える期間が照射後３０秒～３分の期間と重なる期間である、方法。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| PRASAD, A., et al.，Ultraweak photon emission induced by visible light and ultraviolet A radiation via photoactivated skin chromophores: in vivo charge coupled device imaging，Journal of Biomedical Optics，2012年08月14日，Vol.17,No.8，085004，<DOI: 10.1117/1.JBO.17.8.085004> |
| 岩佐 琥偉，小林 正樹，ヒト体表におけるバイオフォトン発光と遅延発光の分光的比較，２０１７年＜第６４回＞応用物理学会春季学術講演会［講演予稿集］ The 64th JSAP Spring Meeting, 2017 [，公益社団法人応用物理学会，2017年03月01日 |
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