JP2021180654A - パーキンソン病の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】パーキンソン病を検出するためのマーカー遺伝子、及び該マーカー遺伝子を用いたパーキンソン病の検出方法を提供する。【解決手段】被験者から採取された生体試料について、ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるパーキンソン病の検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、パーキンソン病マーカーを用いたパーキンソン病の検出方法に関する。

パーキンソン病は病理学的にはα−シヌクレイン凝集体を主体とするＬｅｗｙ小体の形成と中脳黒質のドーパミン神経細胞の変性、細胞死を主体とする進行性の神経変性疾患で、臨床的には筋強剛、振戦、寡動、歩行障害等の運動障害を主体とする疾患である。
パーキンソン病は、神経変性疾患の中でアルツハイマー病に次いで多く、有病率は１０万人に１２０〜１３０人といわれ、日本では約１４万人の患者がいると推定されている。

現状ではパーキンソン病に対する根治療法は存在せず、Ｌ−ＤＯＰＡの補充等による対症療法によって症状コントロールすることがＱＯＬ維持に重要であると考えられている。
しかしながら、運動障害の自覚症状が現れるのは中期以降であり、疾患を早期に診断して早期介入を図ることが求められている。

パーキンソン病を検出するためのバイオマーカーとしては、α-シヌクレイン蓄積を検出するものの他、循環血清由来のマイクロＲＮＡを検出すること（特許文献１）、血中のフェニルアラニンに対するチロシンの濃度比率を測定すること（特許文献２）等が提案されている。また、パーキンソン病患者の皮膚では、脳と同様、α−シヌクレイン凝集体の形成が認められること（非特許文献１）、パーキンソン病患者において、脂漏性皮膚炎、メラノーマ、水疱性類天疱瘡、酒さ等の皮膚疾患や症状が現れること（非特許文献２）が報告され、パーキンソン病と皮膚の状態に何らかの関係があるとも考えられているが、科学的な関連性は全く不明である。

一方、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。核酸を用いた解析は、網羅的な解析方法が確立されており一度の解析で豊富な情報を得られる、及び一塩基多形やＲＮＡ機能等に関する多くの研究報告に基づいて解析結果の機能的な紐付けが容易であるといった利点を有する。生体由来の核酸は、血液等の体液、分泌物、組織等から抽出することができるが、最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として用いること、ＳＳＬから表皮、汗腺、毛包及び皮脂腺のマーカー遺伝子が検出できることが報告されている（特許文献３）。

特表２０１９−５０６１８３号公報 特開２０１６−７５６４４号公報 国際公開公報第２０１８／００８３１９号

Rodriguez-Leyva I et al. Ann Clin Transl Neurol. 2014 (modified) Ravn AH et al. Clin Cosmet Investig Dermatol. 2017

本発明は、パーキンソン病を検出するためのマーカー、及び該マーカーを用いたパーキンソン病の検出方法を提供することに関する。

本発明者らは、パーキンソン病患者と健常者の皮膚からＳＳＬを採取し、ＳＳＬ中に含まれるＲＮＡの発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の遺伝子の発現レベルが両者の間で有意に異なり、これを指標としてパーキンソン病を検出できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）被験者から採取された生体試料について、ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるパーキンソン病の検出方法。
２）前記遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、１）の方法に用いられるパーキンソン病を検出するための検査用キット。
３）表３−１〜３−４及び表６−１〜６−２に示される遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、パーキンソン病の検出マーカー。

本発明によれば、簡便且つ非侵襲的に、パーキンソン病を早期に、高い精度、感度及び特異度で検出することが可能となる。

テストデータにおいて最適な予測モデルにおける予測値と実測値をプロットした混同行列。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。

本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
本明細書中に開示される遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌに従う。一方で遺伝子オントロジー（ＧＯ）に関しては、Ｓｔｒｉｎｇ（[string-db.org/]）に記載のあるＰａｔｈｗａｙ ＩＤ．に従う。

本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。

本発明において、「パーキンソン病」とは、黒質緻密層ドーパミン神経細胞の変性を主病変とし、緩徐進行性に運動３徴候（安静時振戦、固縮、運動緩慢及び無動）を発現する特発性、進行性の疾患を意味する。

本発明において、パーキンソン病の「検出」とは、パーキンソン病の存在又は不存在を明らかにする意味であり、検査、測定、判定、評価又は評価支援という用語で言い換えることもできる。なお、本明細書において「判定」又は「評価」という用語は、医師による判定や評価を含むものではない。

本発明のＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子は、後述する実施例に示す、ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量が健常者に対してパーキンソン病患者で有意に上昇（ＵＰ）又は低下（ＤＯＷＮ）していることが見出された下記表Ａに記載の３３種の遺伝子から選択された遺伝子であり、従来パーキンソン病との関連が知られていなかった遺伝子である（表中、太字で示す。）。

表Ａに示される３３種の遺伝子は、２つの試験（試験１：健常者／パーキンソン病患者
各１５名、試験２：健常者／パーキンソン病患者 各５０名）の被験者のＳＳＬから抽出されたＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換し、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）を基に、健常者と比較してパーキンソン病患者で、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔでｐ値が０．０５以下となるＲＮＡを同定し（試験１：発現上昇遺伝子１１１種、発現低下遺伝子６８種（計１７９遺伝子、表１−１〜１−５）、試験２：発現上昇遺伝子５６５種、発現低下遺伝子２９４種（計８５９遺伝子、表１−６〜１−２７）から、試験１と試験２において共通に上昇した遺伝子（１８種）と低下した遺伝子（１５種）を選択したものである。
したがって、斯かる１７９遺伝子及び８５９遺伝子（重複を除いた計１００５遺伝子）からなる群より選択される遺伝子又はその発現産物は、パーキンソン病を検出するためのパーキンソン病マーカーとなり得、中でも表Ａに示される３３種の遺伝子からなる群より選択される遺伝子又はその発現産物は、好ましいパーキンソン病マーカーである。
表Ａ及び後記表１中、「Ｐ値（ｐ ｖａｌｕｅ）」とは、統計学的検定において、帰無仮説の下で実際にデータから計算された統計量よりも極端な統計量が観測される確率を示す。したがって「Ｐ値」が小さいほど、比較対象間に有意差があるとみなせる。
「ＵＰ」で示される遺伝子は、パーキンソン病患者で発現レベルが上がる遺伝子であり、「ＤＯＷＮ」で示される遺伝子は、パーキンソン病患者で発現レベルが下がる遺伝子である。

上記で発現変動した遺伝子群には、遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によるｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）及びＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙの探索で、パーキンソン病（ｈｓａ０５０１２）と関連するものが含まれることが示された（後記表２参照）。その一方、上記で発現変動した遺伝子群のうち、後記表３−１〜３−４に示した遺伝子は、これまでにパーキンソン病との関係が全く報告されていない遺伝子である。したがって、これらの遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物は、パーキンソン病を検出するための、新規なパーキンソン病マーカーであり、特に試験１と試験２に共通するＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物は、新規なパーキンソン病マーカーとして好ましい。より好ましくは該群から選択される２種以上、さらに好ましくは３種以上、よりさらに好ましくは４種全てである。また、上記表Ａと後記表Ｂに共通して含まれるＳＮＯＲＡ２４を少なくとも含むことが好ましい。

また、発現変動ＲＮＡの同定は、ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）について、例えばＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）、あるいは整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を用いて行うことも可能である。
例えば、上述した２つの試験の被験者のＳＳＬから抽出されたＲＮＡの発現量のデータとしてＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値を用い、健常者と比較してパーキンソン病患者において、尤度比検定によるｐ値の補正値（ＦＤＲ）が０．２５以下となるＲＮＡを同定すると、試験１では発現上昇遺伝子が７４種、発現低下遺伝子が２０９種、計２８３遺伝子（表４−１〜４−８）、試験２では発現上昇遺伝子が１５１種、発現低下遺伝子が３０８種、計４５９遺伝子（表４−９〜４−２０）が得られる。そして、試験１と試験２において共通に上昇する遺伝子は７種（ＡＮＸＡ１、ＡＱＰ３、ＥＭＰ１、ＫＲＴ１６、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＮＯＲＡ２４）、低下する遺伝子は１０種（ＡＴＰ６Ｖ０Ｃ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＣＬ３、ＣＣＮＩ、ＣＸＣＲ４、ＥＧＲ２、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＲＨＯＡ、ＲＮＡＳＥＫ、ＳＥＲＩＮＣ１）の計１７種（表Ｂ）となる。
したがって、斯かる２８３遺伝子及び４５９遺伝子（重複を除いた計７２５遺伝子）からなる群より選択される遺伝子又はその発現産物は、パーキンソン病を検出するためのパーキンソン病マーカーとなり得、中でも表Ｂに示される１７種の遺伝子からなる群より選択される遺伝子又はその発現産物は、好ましいパーキンソン病マーカーであり、これらのうち上記表Ａに示される遺伝子と共通する、後記表Ｃに示される１１種の遺伝子群からなる群より選択される遺伝子又はその発現産物は、より好ましいパーキンソン病マーカーである。

また、上記で発現変動した遺伝子群のうち、後記表６−１〜６−２に示した遺伝子は、これまでにパーキンソン病との関係が全く報告されていない遺伝子である。したがって、これらの遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物は、パーキンソン病を検出するための、新規なパーキンソン病マーカーであり、特に試験１と試験２に共通するＳＮＯＲＡ２４（表中、太字で示す。）又はその発現産物は、新規なパーキンソン病マーカーとして好ましい。

なお、上記のパーキンソン病マーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、パーキンソン病を検出するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLASTを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。

本発明のパーキンソン病の検出方法は、被験者から採取された生体試料について、標的遺伝子、一態様として、ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。

本発明のパーキンソン病の検出方法において、生体試料を採取する被験者としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。被験者がヒトの場合、その性別、年齢及び人種等は特に限定されず、乳児から老人までを含み得る。好ましくは、該被験者は、パーキンソン病の検出を必要とするか又は希望するヒトである。例えば、該被験者は、パーキンソン病の発症が疑われるヒト又は遺伝的にパーキンソン病の素因を有するヒトである。

本発明において用いられる生体試料としては、パーキンソン病の発生、進行に伴い本発明の遺伝子が発現変化する組織及び生体材料であればよい。具体的には臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、角層、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿、その他、便、毛髪等が挙げられ、好ましくは皮膚、角層又は皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、より好ましくは皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が挙げられる。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば頭又は顔の皮膚が好ましく、顔の皮膚がより好ましい。

ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む（前記特許文献３参照）。また本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。

被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、等が挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。

被験者から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは−２０±２０℃〜−８０±２０℃、より好ましくは−２０±１０℃〜−８０±１０℃、さらに好ましくは−２０±２０℃〜−４０±２０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃〜−４０±１０℃、さらに好ましくは−２０±１０℃、さらに好ましくは−２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。

本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられる。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。

本発明の方法においては、好ましい態様として、生体試料としてＳＳＬが用いられるが、この場合にはＳＳＬに含まれるＲＮＡの発現レベルが解析され、具体的にはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。

該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０〜１２０分間に調整するのが好ましい。

発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。

ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて複数のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４〜１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５〜９９℃で１０〜６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。

当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ等のＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。

精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。

ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。

ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。

ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５〜２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。

シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。

上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ−ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又はイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。

また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）、１−ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２−ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチドを検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。

斯くして、被験者から採取された生体試料中の本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいてパーキンソン病が検出される。検出は、具体的には、測定された本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを対照レベルと比較することによって行われる。
シーケンシングにより複数の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ_２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ−ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ （ＴＰＭ）などによって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ−ＰＣＲなどにより特定の標的遺伝子のみの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いた絶対定量によって得られるコピー数を解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、健常人における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが挙げられる。健常人の発現レベルは、健常人集団から測定した当該遺伝子又はその発現産物の発現レベルの統計値（例えば平均値等）であってもよい。標的遺伝子が複数の場合は、各々の遺伝子又はその発現産物について基準発現レベルを求めることが好ましい。

また、本発明におけるパーキンソン病の検出は、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、被験者由来の生体試料における標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが、各遺伝子又はその発現産物のカットオフ値（参照値）と比較される。カットオフ値は、予め健常者における当該標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを基準データとして取得しておき、それに基づく発現レベルの平均値や標準偏差等の統計的数値に基づき、適宜決定すれば良い。

さらに、パーキンソン病患者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常人由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を利用して、パーキンソン病患者と健常人とを分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式を利用して、パーキンソン病を検出することができる。すなわち、パーキンソン病患者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、パーキンソン病患者と健常人を分ける判別式（予測モデル）を構築し、当該判別式に基づいてパーキンソン病患者と健常人を判別するカットオフ値（参照値）を求める。なお、判別式の作成においては、主成分分析（ＰＣＡ）により次元圧縮を行ない、主要成分を説明変数とすることができる。
そして、被験者から採取された生体試料から標的遺伝子又はその発現産物のレベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果を参照値と比較することによって、被検者におけるパーキンソン病の存在又は不存在を評価できる。

ここで、判別式の構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）などが挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜することができる。

カットオフ値（参照値）の決定方法は特に制限されず、公知の手法に従って決定することができる。例えば、判別式を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線では、縦軸に陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１−特異度）」に関し、「真陽性（感度）」−「偽陽性（１−特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。

後述する実施例に示すとおり、表Ａに示す標的遺伝子（３３種の遺伝子、又はそれから選択された４種の遺伝子）の発現量データ（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）から得た各主成分の値を説明変数とし、健常者とパーキンソン病患者を目的変数として機械学習アルゴリズムを用いて予測モデルを構築したところ、ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐの４種を用いたモデルでパーキンソン病の予測が可能であることが示された。また、３３種を用いたモデルではより高精度なパーキンソン病の予測が可能であることが示された。

したがって、上記パーキンソン病患者群と健常人群とを分ける判別式を作成する場合に、標的遺伝子としてＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐの４種の標的遺伝子に加えて、表Ａに示すそれ以外の２９遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現データを適宜加えること、好ましくは後出の表８に示された変数重要度に基づき、変数重要度が高い遺伝子を適当数加えることにより、高い検出率及び精度を示す判別式が作成でき、より精度の高いパーキンソン病の検出が可能である。具体的には、ＥＧＲ２、ＲＨＯＡ、ＣＣＮＩ、ＲＮＡＳＥＫ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＳＥＲＰ１、ＡＮＫＲＤ１２、ＳＬＣ２５Ａ３の８種が好ましく、さらにＣＤ８３、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡＸ、ＵＱＣＲＨの４種を加えた１２種が好ましく、さらにＫＣＮＱ１ＯＴ１、ＣＣＬ３、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＬＣＥ３Ｄ、ＣＮＦＮの６種を加えた１８種が好ましく、さらには２９種全てを加えるのが好ましい。

あるいは、標的遺伝子としてＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐの４種の標的遺伝子に加えて、前出の表Ａと表Ｂの両方に発現変動遺伝子として示されている、下記表Ｃに示す１１遺伝子から選ばれるＳＮＯＲＡ２４以外の少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現データを適宜加えることも可能である。

さらに、パーキンソン病患者群と健常人群とを分ける判別式を作成する場合用いる標的遺伝子として、表Ｂに示す遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現データを使用することも可能であり、好ましくはＳＮＯＲＡ２４を含み、それ以外から少なくとも１つを使用することが好ましく、より好ましくは、表Ｃに示す遺伝子又はその発現産物の発現データを使用し、さらに好ましくは表Ｂに示す全ての遺伝子又はその発現産物の発現データを使用する。

本発明のパーキンソン病を検出するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の標的遺伝子の発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やコントロール、生体試料を採取するための用具（例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルムなど）等を含むことができる。

本発明の態様及び好ましい実施態様を以下に示す。
＜１＞被験者から採取された生体試料について、ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるパーキンソン病の検出方法。
＜２＞ＳＮＯＲＡ２４遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定を少なくとも含む、＜１＞のパーキンソン病の検出方法。
＜３＞遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量の測定である、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞遺伝子又はその発現産物が前記被験者の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡである、＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞発現レベルの測定値を前記各遺伝子又はその発現産物の参照値と比較し、パーキンソン病の存在又は不存在を評価する、＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞パーキンソン病患者由来の前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常者由来の同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、パーキンソン病患者と健常人を分ける判別式を作成し、被験者から採取された生体試料から得られた同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を当該判別式に代入し、得られた結果を参照値と比較することによって、被検者におけるパーキンソン病の存在又は不存在を評価する、＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜７＞前記４種の遺伝子群の全ての遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜６＞の方法。
＜８＞前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、下記の２９種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜６＞又は＜７＞の方法、
ＡＮＫＲＤ１２、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＣＣＬ３、ＣＣＮＩ、ＣＤ８３、ＣＮＦＮ、ＣＮＮ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＸＣＲ４、ＥＧＲ２、ＥＭＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＫＣＮＱ１ＯＴ１、ＬＣＥ３Ｄ、ＬＩＴＡＦ、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＤＵＦＳ５、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＲＨＯＡ、ＲＮＡＳＥＫ、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＳ２６、ＳＥＲＩＮＣ１、ＳＥＲＰ１、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＬＣ２５Ａ３、ＳＮＲＰＧ、ＳＲＲＭ２、ＵＱＣＲＨ。
＜９＞前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、下記の１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜８＞の方法、
ＣＣＬ３、ＣＣＮＩ、ＣＸＣＲ４、ＥＧＲ２、ＥＭＰ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＲＨＯＡ、ＲＮＡＳＥＫ、ＳＥＲＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＢ４。
＜１０＞前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、下記の１６種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜６＞又は＜７＞の方法、
ＡＮＸＡ１、ＡＱＰ３、ＡＴＰ６Ｖ０Ｃ、ＢＨＬＨＥ４０、ＣＣＬ３、ＣＣＮＩ、ＣＸＣＲ４、ＥＧＲ２、ＥＭＰ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＫＲＴ１６、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＲＨＯＡ、ＲＮＡＳＥＫ、ＳＥＲＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＢ４。
＜１１＞前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、後記表３−１〜３−４及び後記表６−１〜６−２に示される遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子（但し、前記４種の遺伝子を除く。）又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜６＞又は＜７＞の方法。
＜１２＞前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、後記表１−１〜１−２７で示される１００５種及び後記表４−１〜４−２０で示される７２５種のうち前記４種の遺伝子を除いた遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、＜６＞又は＜７＞の方法。
＜１３＞前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、＜１＞〜＜１０＞のいずれかの方法に用いられるパーキンソン病を検出するための検査用キット。
＜１４＞後記表３−１〜３−４及び後記表６−１〜６−２に示される遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の、パーキンソン病の検出マーカーとしての使用。
＜１５＞ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の、パーキンソン病の検出マーカーとしての使用。
＜１６＞後記表３−１〜３−４及び後記表６−１〜６−２に示される遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、パーキンソン病の検出マーカー。
＜１７＞ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、＜１６＞のパーキンソン病の検出マーカー。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ ＳＳＬから抽出されたＲＮＡを用いたパーキンソン病の検出
１）ＳＳＬ採取
試験は以下の試験１及び試験２の２回行った。
試験１：健常者（４０〜８９歳男女）１５名、及びパーキンソン病患者（ＰＤ）（４０〜８９歳男女）１５名を被験者とした。
試験２：健常者（４０〜８９歳男）５０名、及びＰＤ（４０〜８９歳男）５０名を被験者とした。
ＰＤは、予め脳神経内科医によりパーキンソン病（Ｈｏｅｈｎ＆ＹａｈｒステージＩ又はＩＩ）の診断を受けていた。各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで−８０℃で、約１ヶ月間保存した。

２）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記１）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。

３）データ解析
ｉ）ＲＮＡ発現解析１
上記２）で測定した被験者由来のＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、リードカウントが１０未満のデータについては欠損値として扱い、サンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した後、欠損値についてはＳｉｎｇｕｌａｒ Ｖａｌｕｅ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＳＶＤ）ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎという手法を用いて補填した。但し、全サンプル中被験者の発現量データのうち８０％以上のサンプル被験者で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。解析には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布に近似するため、リードカウントのＲＰＭ値を底２の対数値に変換したＲＰＭ値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）を用いた。

上記で得られた健常者、及びＰＤのＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量（Ｌｏｇ２ＲＰＭ値）を基に、健常者と比較してＰＤでＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔでｐ値が０．０５以下となる発現変動ＲＮＡを同定した。試験１では、健常者と比較してＰＤで１１１種のＲＮＡが発現上昇し（表１−１〜１−３）、６８種が発現低下した（表１−４〜１−５）。一方試験２では、５６５種のＲＮＡが発現上昇し（表１−６〜１−１９）、２９４種が発現低下した（表１−２０〜１−２７）。これらの試験１と試験２において共通に発現上昇したＲＮＡは１８種、発現低下したＲＮＡは１５種であった（表中の太字で示した遺伝子）。

公共データベースであるＳＴＲＩＮＧを用いて遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によるｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）及びＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙの探索を行った。その結果、ＰＤ患者において発現上昇あるいは低下した遺伝子群と関連したＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙが試験１において３０個、試験２において３９個得られ、いずれの試験においてもパーキンソン病を示すタームｈｓａ０５０１２（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）が含まれることが示された（表２−１〜２−２）。

前記表１−１〜表１−２７に示された試験１又は試験２の少なくともいずれかにおいて発現変動が見られた遺伝子について、パーキンソン病との関連性について既報文献を確認したところ、試験１で発現変動が見られた遺伝子のうち表３−１に示す２１種及び試験２で発現変動が見られた遺伝子のうち表３−２〜３−４に示す９２種は、これまでパーキンソン病との関連性が報告されておらず、これらについては新規のパーキンソン病の検出マーカーとなり得ることが明らかとなった。なお、表中の太字で示した遺伝子は試験１と試験２で共通する遺伝子である。

ｉｉ）ＲＮＡ発現解析２
上記２）で測定した被験者由来のＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正した。但し、４１６１個以上の遺伝子が検出されていないサンプルは除外し、除外後の全サンプル中被験者の発現量データのうち９０％以上のサンプル被験者で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。解析には、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を用いた。

上記で得られた健常者、及びＰＤのＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を基に、健常者と比較してＰＤにおいて尤度比検定によるｐ値の補正値（ＦＤＲ）が０．２５以下となる発現変動ＲＮＡを同定した。試験１では、健常者と比較してＰＤで７４種のＲＮＡが発現上昇し（表４−１〜４−２）、２０９種が発現低下した（表４−３〜４−８）。一方試験２では、１５１種のＲＮＡが発現上昇し（表４−９〜４−１２）、３０８種が発現低下した（表４−１３〜４−２０）。これらの試験１と試験２において共通に発現上昇したＲＮＡは７種、発現低下したＲＮＡは１０種であった（表中の太字で示した遺伝子）。

公共データベースであるＳＴＲＩＮＧを用いて遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によるｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）及びＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙの探索を行った。その結果、ＰＤ患者において発現上昇あるいは低下した遺伝子群と関連したＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙが試験１において３０個、試験２において２８個得られ、いずれの試験においてもパーキンソン病を示すタームｈｓａ０５０１２（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）が含まれることが示された（表５−１〜５−２）。

前記表４−１〜表４−２０に示された試験１又は試験２の少なくともいずれかにおいて発現変動が見られた遺伝子について、パーキンソン病との関連性について既報文献を確認したところ、試験１で発現変動が見られた遺伝子のうち表６−１に示す１９種及び試験２で発現変動が見られた遺伝子のうち表６−２に示す３０種は、これまでパーキンソン病との関連性が報告されておらず、これらについては新規のパーキンソン病の検出マーカーとなり得ることが明らかとなった。なお、表中の太字で示した遺伝子は試験１と試験２で共通する遺伝子である。

実施例２ 判別モデルの作成と検証１
１）使用データ
実施例１のＲＮＡ発現解析１と同様、被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、リードカウントが１０未満のデータについては欠損値として扱い、サンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した後、欠損値についてはＳｉｎｇｕｌａｒ Ｖａｌｕｅ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＳＶＤ）ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎという手法を用いて補填した。但し、全サンプル中８０％以上のサンプルで欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。機械学習モデルの構築には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布の近似とするため、底２の対数値に変換したＲＰＭ値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）を用いた。

２）データセット分割
試験１の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者１０名及びＰＤ１０名の計２０名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残り１０名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。試験２の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者４０名及びＰＤ４０名の計８０名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残り２０名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。

３）特徴量遺伝子の選択
実施例１のＲＮＡ発現解析１で、健常者と比較して試験１と試験２においてＰＤ患者で共通に発現上昇した１８種のＲＮＡと発現低下した１５種のＲＮＡ（表１−１〜１−２７の太字で示した遺伝子）を特徴量遺伝子として選択し、これらの発現量データを主成分分析により主成分へ変換した後、第１主成分から第１０主成分を説明変数とした。また、試験１と試験２においてＰＤ患者で共通に発現上昇した１８種のＲＮＡと発現低下した１５種のＲＮＡのうち、ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐの４種を特徴量遺伝子として選択し、これらの発現量データを主成分分析により主成分へ変換した後、第１主成分から第４主成分を説明変数とした。

４）モデル構築
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）から得た各主成分の値を説明変数とし、健常者（ＨＬ）とＰＤを目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。予測対象項目毎に、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）の７種のアルゴリズムを用いて、１０分割交差検証を行って予測モデルを学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータの前記特徴量遺伝子発現量（Ｌｏｇ２ＲＰＭ値）から得た各主成分の値を入力して、各予測項目のターゲット予測値を計算した。予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。

５）結果
表７に予測対象項目の、使用アルゴリズム、検出率、精度、Ｆ値を示す。また、テストデータにおいて最適な予測モデルにおける予測値と実測値をプロットした混同行列を図１に示す。尚、図中の数値は各象限のサンプル数を示す。
表８にランダムフォレストを用いてモデル構築を行った場合における、各特徴量遺伝子の変数重要度を算出した結果を示す。

ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０、ＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐの４種を用いたモデルのＦ１は試験１において０．６７、試験２において０．７５、試験１＋試験２を統合した場合において０．７６となりＰＤの予測が可能であることが示された。ＰＤ患者で上昇したＲＮＡ１８種と低下したＲＮＡ１５種の合計３３種を用いたモデルのＦ１は試験１において０．９１、試験２において０．８０、試験１＋試験２を統合した場合において０．８２となり、より高精度なＰＤの予測が可能であることが示された。

実施例３ 判別モデルの作成と検証２
１）使用データ
実施例１のＲＮＡ発現解析２と同様、被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正した。但し、４１６１個以上の遺伝子が検出されていないサンプルは除外し、除外後の全サンプル中被験者の発現量データのうち９０％以上のサンプル被験者で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。解析には、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を用いた。

２）データセット分割
試験１の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者９名及びＰＤ６名の計１５名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残りの健常者４名及びＰＤ１名の計５名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。試験２の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者３７名及びＰＤ３５名の計７２名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残りの健常者１３名及びＰＤ１１名の計２４名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。

３）特徴量遺伝子の選択
実施例１のＲＮＡ発現解析２で、健常者と比較して試験１と試験２においてＰＤ患者で共通に発現上昇或いは低下した１７種のＲＮＡ（表４−１〜４−２０の太字で示した遺伝子）を特徴量遺伝子として選択し、これらの発現量データを主成分分析により主成分へ変換した後、第１主成分から第４主成分を説明変数とした。

４）モデル構築
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値に１を加算し底２の対数値とした値）から得た各主成分の値を説明変数とし、健常者（ＨＬ）とＰＤを目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。予測対象項目毎に、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）の７種のアルゴリズムを用いて、１０分割交差検証を行って予測モデルを学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータの前記特徴量遺伝子発現量（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値に１を加算し底２の対数値とした値）から得た各主成分の値を入力して、各予測項目のターゲット予測値を計算した。予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。

５）結果
表９に予測対象項目の、使用アルゴリズム、検出率、精度、Ｆ値を示す。

試験１と試験２のＤＥＳｅｑ２による補正後の尤度比検定の結果において、共通に発現上昇、或いは低下した１７種のＲＮＡを用いたモデルのＦ値は試験１において１、試験２において０．８７となりＰＤの予測が可能であることが示された。

実施例４ 判別モデルの作成と検証３
１）使用データ
実施例１のＲＮＡ発現解析２と同様、被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正した。但し、４１６１個以上の遺伝子が検出されていないサンプルは除外し、除外後の全サンプル中被験者の発現量データのうち９０％以上のサンプル被験者で欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。解析には、ＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を用いた。

２）データセット分割
試験１の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者９名及びＰＤ６名の計１５名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残りの健常者４名及びＰＤ１名の計５名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。試験２の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者３７名及びＰＤ３５名の計７２名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残りの健常者１３名及びＰＤ１１名の計２４名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。

３）特徴量遺伝子の選択
実施例１のＲＮＡ発現解析２で、健常者と比較して試験１においてＰＤ患者で発現上昇或いは低下した１９種のＲＮＡ（表６−１に示す遺伝子）、或いは健常者と比較して試験２においてＰＤ患者で発現上昇或いは低下した３０種のＲＮＡ（表６−２に示す遺伝子）を特徴量遺伝子として選択し、これらの発現量データを主成分分析により主成分へ変換した後、第１主成分から第４主成分を説明変数とした。

４）モデル構築
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値に１を加算し底２の対数値とした値）から得た各主成分の値を説明変数とし、健常者（ＨＬ）とＰＤを目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。予測対象項目毎に、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）の７種のアルゴリズムを用いて、１０分割交差検証を行って予測モデルを学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータの前記特徴量遺伝子発現量（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値に１を加算し底２の対数値とした値）から得た各主成分の値を入力して、各予測項目のターゲット予測値を計算した。予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。

５）結果
表１０、表１１に予測対象項目の、使用アルゴリズム、検出率、精度、Ｆ値を示す。

試験１のＤＥＳｅｑ２による補正後の尤度比検定の結果において、発現上昇、或いは低下したＲＮＡの内、これまでパーキンソン病との関連性が報告されていない１９種のＲＮＡを用いたモデルのＦ値は１となりＰＤの予測が可能であることが示された。試験２のＤＥＳｅｑ２による補正後の尤度比検定の結果において、発現上昇、或いは低下したＲＮＡの内、これまでパーキンソン病との関連性が報告されていない３０種のＲＮＡを用いたモデルのＦ値は０．８７となりＰＤの予測が可能であることが示された。

実施例５ 判別モデルの作成と検証４
１）使用データ
実施例１のＲＮＡ発現解析１と同様、被験者からのＳＳＬ由来ＲＮＡの発現量のデータ（リードカウント値）において、リードカウントが１０未満のデータについては欠損値として扱い、サンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値に変換した後、欠損値についてはＳｉｎｇｕｌａｒ Ｖａｌｕｅ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＳＶＤ）ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎという手法を用いて補填した。但し、全サンプル中８０％以上のサンプルで欠損値ではない発現量データが得られている遺伝子のみ以下の解析に使用した。機械学習モデルの構築には、負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布の近似するため、底２の対数値に変換したＲＰＭ値（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）を用いた。

２）データセット分割
試験１の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者１０名及びＰＤ１０名の計２０名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残り１０名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。試験２の被験者から得られたＲＮＡプロファイルデータセットのうち、健常者４０名及びＰＤ４０名の計８０名分のＲＮＡプロファイルデータをＰＤ予測モデルの訓練データとし、残り２０名分のＲＮＡプロファイルデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。

３）特徴量遺伝子の選択
実施例１のＲＮＡ発現解析１で、健常者と比較して試験１においてＰＤ患者で発現上昇或いは低下した２１種のＲＮＡ（表３−１に示す遺伝子）、或いは健常者と比較して試験２においてＰＤ患者で発現上昇或いは低下した９２種のＲＮＡ（表３−２〜３−４に示す遺伝子）を特徴量遺伝子として選択し、これらの発現量データを主成分分析により主成分へ変換した後、第１主成分から第４主成分を説明変数とした。

４）モデル構築
訓練データである、ＳＳＬ由来ＲＮＡから選択された前記特徴量遺伝子の発現量のデータ（Ｌｏｇ_２ＲＰＭ値）から得た各主成分の値を説明変数とし、健常者（ＨＬ）とＰＤを目的変数として用い、予測モデルの構築を実施した。予測対象項目毎に、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｌｉｎｅａｒ）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ ｒｂｆ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｒｕｒａｌ ｎｅｔ）、一般線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、正則化線形判別分析（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、正則化ロジスティック回帰（Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）の７種のアルゴリズムを用いて、１０分割交差検証を行って予測モデルを学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータの前記特徴量遺伝子発現量（Ｌｏｇ２ＲＰＭ値）から得た各主成分の値を入力して、各予測項目のターゲット予測値を計算した。予測値と実測値から検出率（Ｒｅｃａｌｌ）、精度（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、及びそれらの調和平均であるＦ値を計算し、そのＦ値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。

５）結果
表１２、表１３に予測対象項目の、使用アルゴリズム、検出率、精度、Ｆ値を示す。

試験１のＬｏｇ２ＲＰＭによる補正後の検定結果において、発現上昇、或いは低下したＲＮＡの内、これまでパーキンソン病との関連性が報告されていない２１種のＲＮＡを用いたモデルのＦ値は０．９１となりＰＤの予測が可能であることが示された。試験２のＬｏｇ２ＲＰＭによる補正後の検定結果において、発現上昇、或いは低下したＲＮＡの内、これまでパーキンソン病との関連性が報告されていない９２種のＲＮＡを用いたモデルのＦ値は０．９となりＰＤの予測が可能であることが示された。

Claims (13)

1. 被験者から採取された生体試料について、ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるパーキンソン病の検出方法。
2. ＳＮＯＲＡ２４遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定を少なくとも含む、請求項１記載のパーキンソン病の検出方法。
3. 遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量の測定である、請求項１又は２記載の方法。
4. 遺伝子又はその発現産物が前記被験者の皮膚表上脂質に含まれるＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 発現レベルの測定値を前記各遺伝子又はその発現産物の参照値と比較し、パーキンソン病の存在又は不存在を評価する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. パーキンソン病患者由来の前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルと、健常者由来の同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、パーキンソン病患者と健常人を分ける判別式を作成し、被験者から採取された生体試料から得られた同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を当該判別式に代入し、得られた結果を参照値と比較することによって、被検者におけるパーキンソン病の存在又は不存在を評価する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
7. 前記４種の遺伝子群の全ての遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項６記載の方法。
8. 前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、下記の２９種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項６又は７記載の方法、
   ＡＮＫＲＤ１２、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＣＣＬ３、ＣＣＮＩ、ＣＤ８３、ＣＮＦＮ、ＣＮＮ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＸＣＲ４、ＥＧＲ２、ＥＭＰ１、ＩＴＧＡＸ、ＫＣＮＱ１ＯＴ１、ＬＣＥ３Ｄ、ＬＩＴＡＦ、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＤＵＦＳ５、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＲＨＯＡ、ＲＮＡＳＥＫ、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＳ２６、ＳＥＲＩＮＣ１、ＳＥＲＰ１、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＬＣ２５Ａ３、ＳＮＲＰＧ、ＳＲＲＭ２、ＵＱＣＲＨ。
9. 前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、下記の１０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項８記載の方法、
   ＣＣＬ３、ＣＣＮＩ、ＣＸＣＲ４、ＥＧＲ２、ＥＭＰ１、ＰＯＬＲ２Ｌ、ＲＨＯＡ、ＲＮＡＳＥＫ、ＳＥＲＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＢ４。
10. 前記４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子の他に、下記表１−１〜１−２７で示される１００５種及び下表４−１〜４−２０で示される７２５種のうち前記４種の遺伝子を除いた遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項６又は７記載の方法。
    

    

    

    

    

    

    

    

    

    

    
11. 前記遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記遺伝子の発現産物を認識する抗体を含有する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法に用いられるパーキンソン病を検出するための検査用キット。
12. 下表３−１〜３−４及び下表６−１〜６−２に示される遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、パーキンソン病の検出マーカー。
    

    

    
13. ＳＮＯＲＡ１６Ａ、ＳＮＯＲＡ２４、ＳＮＯＲＡ５０及びＲＥＸＯ１Ｌ２Ｐからなる４種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、請求項１２記載のパーキンソン病の検出マーカー。

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