JP2021175395A - 月経前症候群の重症度検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便且つ被験者への負担の少ない月経前症候群の重症度の検出方法の提供。【解決手段】月経前症候群の重症度の検出を可能にするマーカー。該マーカーを用いた被験体の月経前症候群の重症度の検出方法。【選択図】なし
Description
本発明は、月経前症候群の重症度を検出する方法に関する。
女性の月経前及び/又は月経中の身体的及び精神的不快は、月経随伴症状と呼ばれ、月経前症候群(Premenstrual Syndrome;以下、PMSという)、及び月経困難症に代表される。PMSは女性の労働生産性にも関係することが指摘されていることから、PMSや月経困難症に代表される月経随伴症状を緩和又は軽減し、女性のQOL(Quality of Life)を向上させることは、保健的だけでなく、社会的にも重要である。
生体試料中のDNAやRNA等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在、さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。核酸を用いた解析は、網羅的な解析方法が確立されており一度の解析で豊富な情報を得られること、及び一塩基多形やRNA機能などに関する多くの研究報告に基づいて解析結果の機能的な紐付けが容易であることといった利点を有する。生体由来の核酸は、血液等の組織、体液、分泌物などから抽出することができる。特許文献1には、皮膚表上脂質(skin surface lipids;SSL)に含まれるRNAを生体の解析用の試料として用いること、SSLから表皮、汗腺、毛包及び皮脂腺のマーカー遺伝子が検出されたことが記載されている。
女性ホルモンであるエストロゲン又はプロゲステロンの産生に伴って発現が変化する遺伝子が存在する。例えばこれまでに、AQP3(aquaporin 3)、HIF−1α(hypoxia inducible factor 1 subunit α)、MFN2(mitofusin 2)、DEFB4A(defensin beta 4A、又はhBD-2)、hBD−3などが報告されている(非特許文献1〜3、特許文献2)。
Hum Reprod, 2018, 33(11):2060-2073
Biol Reprod, 2018, 99(2):308-318
Mol Cell Endocrinol, 2013, 371:79-86
本発明は、PMSの重症度の検出を可能にするPMS重症度マーカー、及び該マーカー用いたPMSの重症度の検出方法に関する。
すなわち、本発明は、下記に示す遺伝子:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、被験体のPMSの重症度を検出する方法を提供する。
また本発明は、下記遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、PMSの重症度のマーカーを提供する。
また本発明は、下記遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、PMSの重症度のマーカーを提供する。
本発明は、新規なマーカーを含むPMS重症度マーカーを用いてPMSの重症度を検出する方法を提供する。本発明で使用するPMS重症度マーカーは、皮膚表上脂質(SSL)から収集可能であるため、簡便且つ非侵襲的に取得することができる。したがって本発明によれば、被験者に負担をかけずにPMSの重症度を検出することが可能である。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
月経前症候群(Premenstrual Syndrome;PMS)は、1931年にFrank(Archives of Neurology and Psychiatry, 1931, 26:1053)により初めて報告された、月経の1週間程前(黄体期)に発症する身体的症状群又は精神的症状群である。医学的には、PMSは、「月経開始の3〜10日前から始まる身体的、精神的症状で月経開始とともに減退ないし消失するもの」と定義される。PMSの代表的な症状は、身体的症状群としては、下腹痛、腰痛、下腹部が張る、頭痛、肩こり、手足の冷え、食欲が増す、下痢、便秘、むくみ、乳房が痛い、乳房が張る、ニキビができやすい、肌荒れ、疲れやすい、眠くなる、等が挙げられ、精神的症状群としては、イライラする、怒りやすい、攻撃的になる、憂うつ、涙もろい、不安が高まる、等が挙げられる。
本明細書において、PMSが重症であるとは、上記PMSの身体的症状又は精神的症状が重度である状態をいい、PMSが軽症であるとは、上記PMSの身体的症状又は精神的症状が軽度である状態をいう。従来、PMS等の月経随伴症状の重症度は、例えばMenstrual Distress Questionnaire(MDQ)のアンケートのスコアに基づいて評価されていた。黄体期におけるMDQスコアが高いほど、PMSの重症度は高いと評価される。例えば、心理測定尺度集III(サイエンス社、2001発行)に記載されたMDQに従って、黄体期のMDQスコアが66点以上である場合をPMSが重症であると評価し、48点以下である場合をPMSが軽症であると評価することができる。
本発明は、従来は上記のような黄体期における被験者の問診に基づいて評価しなければならなかったPMSの重症度を、遺伝子又はその翻訳産物の発現に基づいてより簡易かつ客観的に検出することを可能にする。また本発明は、PMSが起こる黄体期に先立つ卵胞期における遺伝子又はその翻訳産物の発現に基づいてPMSの重症度を事前に検出することを可能にする。
一態様において、本発明は、PMS重症度マーカーを提供する。後述の実施例に示されるとおり、本発明者は、下記表1に示す51種の遺伝子の発現が、PMSの重症度との間に関連性を有することを見出した。さらに、これら51種のうち表2に示した40種の遺伝子は、従来PMSとの関連性が報告されていない遺伝子であった。したがって、表1に示す遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、各々、PMSの重症度のマーカーとして使用することができる。また、表2に示す遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、新規のPMS重症度マーカーである。
本明細書中に開示される遺伝子の名称は、NCBI([www.ncbi.nlm.nih.gov/])に記載のあるOfficial Symbolに従う。本明細書において、「遺伝子に由来する核酸」は、該遺伝子から転写されたmRNA、該mRNAから調製されたcDNA、該cDNAからの反応産物(例えばPCR産物、クローンDNA等)、などを包含する。
本発明においては、表1に示す各遺伝子又はその翻訳産物の発現量に基づいて被験体のPMSの重症度の検出が可能である。本発明において、表1に示す遺伝子又はその翻訳産物の発現量は、該遺伝子に由来する核酸又は該遺伝子の翻訳産物を定量することで測定することができる。例えば、該遺伝子から転写されたmRNA、該mRNAから調製されたcDNA、該cDNAからの反応産物、又は該mRNAが翻訳されて合成される翻訳産物(タンパク質等)を定量することで、該遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定することができる。
表1に示す遺伝子に由来する核酸又は該遺伝子の翻訳産物は、被験体から採取した生体試料、例えば細胞、体液、分泌物等から常法に従って調製することができる。好ましくは、該核酸は、被験体の皮膚表上脂質(skin surface lipids;SSL)から調製されるmRNAである。また好ましくは、該翻訳産物は、被験体のSSLから調製される翻訳産物である。
本発明において、月経前症候群の重症度の「検出」とは、予測、検査、測定、判定又は評価支援などの用語で言い換えることもできる。なお、本発明における月経前症候群の重症度の「検出」、「予測」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による月経前症候群の重症度の診断を含むものではない。
本明細書において、「皮膚表上脂質(SSL)」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、SSLは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。SSLは、皮膚細胞で発現したRNAを含む(特許文献1参照)。また本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
被験体の皮膚からのSSLの採取には、皮膚からのSSLの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するSSL吸収性素材、SSL接着性素材、又は皮膚からSSLをこすり落とす器具を使用することができる。SSL吸収性素材又はSSL接着性素材としては、SSLに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのSSLの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へSSLを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へSSLを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりSSLをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。SSLの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたSSL吸収性素材を用いてもよい。一方、SSL吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとSSLの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。SSL吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。SSLが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。
被験体から採取されたSSLは一定期間保存されてもよい。採取されたSSLは、含有するRNAの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該RNA含有SSLの保存の温度条件は、0℃以下であればよく、好ましくは−20±20℃〜−80±20℃、より好ましくは−20±10℃〜−80±10℃、さらに好ましくは−20±20℃〜−40±20℃、さらに好ましくは−20±10℃〜−40±10℃、さらに好ましくは−20±10℃、さらに好ましくは−20±5℃である。該RNA含有SSLの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは12か月以下、例えば6時間以上12ヶ月以下、より好ましくは6ヶ月以下、例えば1日間以上6ヶ月以下、さらに好ましくは3ヶ月以下、例えば3日間以上3ヶ月以下である。
採取したSSLからのRNAの抽出には、生体試料からのRNAの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、AGPC(acid guanidinium thiocyanate−phenol−chloroform extraction)法、又はTRIzol(登録商標)、RNeasy(登録商標)、QIAzol(登録商標)などのカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Solid Phase Reversible Immobilization磁性体粒子を用いる方法、ISOGEN等の市販のRNA抽出試薬による抽出などを用いることができる。また、SSLからの翻訳産物の抽出には、生体試料からのタンパク質の抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、QIAzol Lysis Reagent(Qiagen)等の市販のタンパク質抽出試薬を用いることができる。
以上の手順で調製された核酸又は翻訳産物を用いて表1に示す1つ以上の遺伝子又はその翻訳産物の発現を調べることで、被験体のPMSの重症度を検出することができる。したがって、別の一態様において、本発明は、表1に示す遺伝子又はその翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、被験体のPMSの重症度を検出する方法を提供する。
本発明によるPMSの重症度を検出する方法(以下、本発明の方法)における被験体は、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物の雌性であって、PMSの重症度の検出を必要とする者であればよい。好ましくは、該被験体は、皮膚上にSSLを有する動物であり、より好ましくはヒトである。
一実施形態において、本発明の方法は、被験体における表1に示す遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子(以下、標的遺伝子(群)ともいう)の発現を測定することを含む。別の一実施形態において、本発明の方法は、被験体における表1に示す遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つ(以下、標的産物(群)ともいう)の発現を測定することを含む。あるいは、標的遺伝子(群)の発現と標的産物(群)の発現の両方が測定されてもよい。好ましくは、標的遺伝子(群)の発現が測定される。
表1に示す遺伝子のなかでも、表2に示すものは、従来PMSとの関連性が報告されていない遺伝子である。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、該標的遺伝子(群)は、表2に示す遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つであり、該標的産物(群)は、表2に示す遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つである。さらに、本発明の方法においては、表2に示す遺伝子又はその翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つと、他の遺伝子(すなわち、表1に記載のCTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2)又はそれらの翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つとの組み合わせが標的遺伝子群又は標的産物群として用いられ、それらの発現が測定されてもよい。
好ましくは、本発明の方法における該標的遺伝子(群)又は標的産物(群)の発現の測定は、被験体のSSLに含まれるRNA又は翻訳産物を用いて行われる。一実施形態において、本発明の方法は、被験体のSSLを採取することをさらに含んでいてもよい。一実施形態において、本発明の方法は、該被験体から採取したSSLからRNA又は翻訳産物を抽出することをさらに含んでいてもよい。
被験体由来の試料、例えばSSLから抽出されたRNAに含まれる標的遺伝子由来のRNAの量を定量することで、標的遺伝子の発現量を測定することができる。被験体由来RNAの量の測定は、当該分野で通常用いられるRNAを用いた遺伝子発現解析の手順に従って実施すればよい。RNAを用いた遺伝子発現解析の手法の例としては、RNAを逆転写によりcDNAに変換した後、リアルタイムPCR、マルチプレックスPCR、マイクロアレイ、シーケンシング、クロマトグラフィーなどにより該cDNA又はその増幅産物を定量する方法が挙げられる。翻訳産物の発現量は、当該分野で通常用いられるタンパク質定量法、例えばELISA、免疫染色、蛍光法、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析などを用いて測定することができる。測定される発現量は、生体試料における標的遺伝子(群)又は標的産物(群)の発現の絶対量であってもよく、又は、他の標準物質や、遺伝子又は翻訳産物の総発現量に対する相対発現量であってもよい。
好ましい実施形態において、本発明の方法では、該被験体由来RNAを逆転写によりcDNAに変換し、次いで該cDNAをPCRにかけ、得られた反応産物を精製する。該逆転写には、解析したい特定のRNAを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、M−MLV Reverse Transcriptase及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばPrimeScript(登録商標)Reverse Transcriptaseシリーズ(タカラバイオ社)、SuperScript(登録商標)Reverse Transcriptaseシリーズ(Thermo Scientific社)等が挙げられる。SuperScript(登録商標)III Reverse Transcriptase、SuperScript(登録商標)VILO cDNA Synthesis kit(いずれもThermo Scientific社)などが好ましく用いられる。得られたcDNAのPCRでは、解析したい特定のDNAを標的としたプライマーペアを用いて該特定のDNAのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて複数のDNAを増幅してもよい。好ましくは、該PCRはマルチプレックスPCRである。マルチプレックスPCRは、PCR反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスPCRは、市販のキット(例えば、Ion AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression Kit;ライフテクノロジーズジャパン株式会社等)を用いて実施することができる。
当該逆転写及びPCRの反応条件を調整することで、PCR反応産物の収率がより向上し、ひいてはそれを用いた解析の精度がより向上する。好適には、該逆転写での伸長反応において、温度を好ましくは42℃±1℃、より好ましくは42℃±0.5℃、さらに好ましくは42℃±0.25℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは60分間以上、より好ましくは80〜120分間に調整する。また好適には、該PCRにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存して適宜調整され得るが、例えば上記のマルチプレックスPCRキットを用いる場合、好ましくは62℃±1℃、より好ましくは62℃±0.5℃、さらに好ましくは62℃±0.25℃である。したがって、該PCRでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が1ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきDNAのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは14〜18分間である。該PCRにおける変性反応の条件は、増幅すべきDNAに依存して調整され得るが、好ましくは95〜99℃で10〜60秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びPCRは、一般的にPCRに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。
当該PCRで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のPCR反応産物を、PCR反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。DNAのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズなどによって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ampure XP等のSolid Phase Reversible Immobilization(SPRI)磁性ビーズが挙げられる。
精製したPCR反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、DNAのシーケンシングのために、精製したPCR反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、PCR増幅されたDNAに含まれるPCRプライマー領域を切断したり、増幅されたDNAにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したPCR反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅DNAに対してPCRプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、SuperScript(登録商標)VILO cDNA Synthesis kit(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)に付属している5×VILO RT Reaction Mix、及びIon AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)に付属している5×Ion AmpliSeq HiFi Mix、及びIon AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Core Panelを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。シーケンシングには、好ましくは次世代シーケンサー(例えばIon S5/XLシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社)が用いられる。シーケンシングで作成されたリードの数(リードカウント)に基づいて、RNA発現を定量することができる。
好ましくは、本発明の方法では、該標的遺伝子(群)又は該標的産物(群)の発現量に基づいて、被験体のPMSの重症度を検出する。例えば、表1に示す遺伝子は、PMSの重症度に伴うその発現量の変動のパターンによって表3及び表4に示す2つの群に分けることができる。これらの変動のパターンを利用して被験体のPMSの重症度を検出することができる。
表3に示す遺伝子は、PMSが重症のときに発現が増加し、PMSが軽症のときに発現が低下する遺伝子である。一方、表4に示す遺伝子は、PMSが重症のときに発現が低下し、PMSが軽症のときに発現が増加する遺伝子である。表3及び表4に示す遺伝子又はその翻訳産物のいずれか1つ以上についての発現量を基準にすることで、被験体のPMSの重症度(例えば重症か否か)を検出することができる。表3及び表4に示す遺伝子のうち、下線で示した、それぞれ22種及び18種の遺伝子は、従来PMSとの関連性が報告されていない遺伝子(表2に示す遺伝子)である。
本発明の方法の一実施形態においては、個々の標的遺伝子(群)又は標的産物(群)の発現量を直接、PMSの重症度を検出するためのパラメーターとして用いる。例えば、月経周期の特定の時期(例えば卵胞期又は黄体期、以下同じ)における被験体の標的遺伝子又は標的産物の発現量を定期的に(例えば毎月)測定し、その発現量の変動を追跡することで、該被験体のPMSの重症度を検出することができる。あるいは、月経周期の特定の時期において被験体から測定された標的遺伝子又は標的産物の発現量を、月経周期の同じ時期についての該標的遺伝子又は標的産物の基準発現量と比べることで、該被験体のPMSの重症度を検出することができる。標的遺伝子又は標的産物の基準発現量には、予め決定した値、例えば、該標的遺伝子又は標的産物の月経周期の特定の時期での発現量の統計値(例えば平均発現量)を用いることができる。該基準発現量は、被験体ごとに設定されてもよい。例えば、同じ被験体から複数回測定した月経周期の特定の時期における標的遺伝子又は標的産物の発現量の統計値(例えば平均値など)から算出してもよい。あるいは、該基準発現量は、集団から測定した月経周期の特定の時期における標的遺伝子又は標的産物の発現量の統計値(例えば平均値など)であってもよい。標的遺伝子群又は標的産物群として複数の遺伝子又は翻訳産物を用いる場合は、該遺伝子又は翻訳産物の各々について基準発現量を求めることが好ましい。
例えば、標的遺伝子又は標的産物が表3に示す遺伝子又はその翻訳産物の場合、その発現量が基準発現量よりも高い場合、被験体のPMSは重症と検出され得、その発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のPMSは重症ではない(又は軽症)と検出され得る。一方、標的遺伝子又は標的産物が表4に示す遺伝子又はその翻訳産物の場合、その発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のPMSは重症と検出され得、その発現量が基準発現量よりも高い場合、被験体のPMSは重症ではない(又は軽症)と検出され得る。
あるいは、表3〜4に示す遺伝子又はその翻訳産物を2つ以上組み合わせて標的遺伝子又は標的産物として用いてもよい。複数の遺伝子又は翻訳産物を用いる場合には、一定割合、例えば50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは100%の遺伝子又は翻訳産物が上述した発現量の基準を満たすか否かに基づいて、被験体のPMSの重症度を検出することができる。例えば、表3から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の50%以上の発現量が基準発現量よりも高い場合、被験体のPMSは重症と検出され得る。あるいは、表4から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の50%以上の発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のPMSは重症と検出され得る。あるいは、表3から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の50%以上の発現量が基準発現量よりも高く、かつ表4から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の50%以上の発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のPMSは重症と検出され得る。但し、本発明の方法における標的遺伝子群又は標的産物群の組み合わせは、上記の例に限定されない。
別の一実施形態においては、標的遺伝子(群)又は標的産物(群)の発現データを用いて構築した予測モデルに基づいて、被験体のPMSの重症度を検出する。発現データとしては、月経周期の特定の時期(例えば卵胞期又は黄体期)における標的遺伝子(群)又は標的産物(群)の発現量についてのデータを用いることができる。例えば、1つ以上の標的遺伝子(群)又は標的産物(群)の各々についての発現データを説明変数とし、PMSの重症度(例えば、重症か軽症か)を目的変数とした機械学習により、PMSの重症度を検出するための最適な予測モデルを構築することができる。例えば、表1又は表2に示す遺伝子又はその翻訳産物の中からPMS重症度における重症群と軽症群のとの間で発現差のより大きいものを複数選択し、それらの発現データの各々を説明変数として用いることができる。
あるいは、予測モデルの構築に複数の遺伝子又は翻訳産物の発現データを使用する場合、必要に応じて、次元削減によってデータを圧縮してから予測モデルの構築を行ってもよい。例えば、表1又は表2に示す遺伝子から複数の遺伝子を選択し、それらの遺伝子又はその翻訳産物を標的遺伝子群又は標的産物群として抽出する。次いで、該抽出した標的遺伝子群又は標的産物群の発現量について主成分分析を実施する。該主成分分析で算出された1つ以上の主成分を説明変数とし、PMSの重症度(例えば、重症か軽症か)を目的変数とした機械学習により、PMSの重症度を検出するための最適な予測モデルを構築することができる。
予測モデルの構築に用いる標的遺伝子(群)又は標的産物(群)は、表1に示す遺伝子又はその翻訳産物のなかでPMSの重症度における重症群と軽症群との間での発現差がより大きいものから1種以上を選択するのが好ましい。例えば、従来PMSとの関連性が報告されていない、表2に示す40遺伝子から選択される1つ以上の遺伝子又はその翻訳産物が、予測モデルの構築に用いられる好ましい標的遺伝子(群)又は標的産物(群)として挙げられる。主成分分析に用いる標的遺伝子(群)又は標的産物(群)も同様である。
一実施形態においては、表2に示す遺伝子の中から、黄体期においてPMS重症群と軽症群との間での発現差がより大きい遺伝子(例えば、表2のNo.1〜20の遺伝子)から5〜20個程度、好ましくは5〜15個程度の遺伝子を選択する。より具体的には、例えば表2からNo.1〜5の5遺伝子、No.1〜10の10遺伝子又はNo.1〜15の15遺伝子、好ましくはNo.1〜10の10遺伝子又はNo.1〜15の15遺伝子を選択する。選択した遺伝子の黄体期における発現量についてのデータを説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。別の一実施形態においては、表2に示す遺伝子の中から、黄体期においてPMS重症群と軽症群との間での発現差がより大きい遺伝子(例えば、表2のNo.1〜20の遺伝子)から5〜20個程度、好ましくは5〜15個程度の遺伝子を選択する。より具体的には、例えば表2からNo.1〜5の5遺伝子、No.1〜10の10遺伝子又はNo.1〜15の15遺伝子、好ましくはNo.1〜5の5遺伝子を選択する。選択した遺伝子の卵胞期における発現量についてのデータを説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。
主成分分析でデータ圧縮を行った場合、予測モデルの構築に用いる主成分の次元や数は、特に限定されないが、寄与率の大きい成分、例えば、第1主成分を含み、かつ合計寄与率が、好ましくは20%以上、より好ましくは50%以上になるような1つ以上の主成分を説明変数とするとよい。一実施形態においては、黄体期における標的遺伝子群の発現データに対して主成分分析を行い、第1主成分を含みかつ合計寄与率が20%以上、好ましくは50%以上、例えば、好ましくは22〜55%又はそれ以上、より好ましくは50〜70%、さらに好ましくは55〜65%になるよう主成分を選択し、選択した主成分を説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。別の一実施形態においては、卵胞期における標的遺伝子群の発現データに対して主成分分析を行い、第1主成分を含みかつ合計寄与率が、80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上になるよう主成分を選択し、選択した主成分を説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。
予測モデルの構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト(Random Forest)、ニューラルネットワーク(Neural net)、線形カーネルのサポートベクターマシン(SVM (linear))、rbfカーネルのサポートベクターマシン(SVM (rbf))などのアルゴリズムが挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば、予測値と実測値の一致度合いを示す値である正解率(Accuracy)が高いモデルを、最適な予測モデルとして選択することができる。
構築された予測モデルに、被験体における該標的遺伝子(群)もしくは標的産物(群)の発現データ(又はそれらから算出された主成分)を入力することで、該被験体のPMSの重症度を検出することができる。
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔1〕下記に示す遺伝子:SH3BGRL3、NDUFA11、CTNNB1、AQP3、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、ANXA1、SNORA70、HSPA6、ALDH2、ARHGDIB、DEFB4A、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、BIRC3、S100A7、STK10、GHITM、SFN、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、HMGN2、HIF1A、RABGEF1、ARF1、ACTN1、MFN2、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、被験体の月経前症候群の重症度を検出する方法。
〔2〕好ましくは、下記に示す遺伝子:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、〔1〕記載の方法。
〔3〕好ましくは、さらに、下記に示す遺伝子:CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、〔2〕記載の方法。
〔4〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
より好ましくは、前記遺伝子の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、
〔1〕〜〔3〕のいずれか1項記載の方法。
〔5〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の黄体期又は卵胞期での発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、〔4〕記載の方法。
〔6〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づく予測モデルを用いて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
該予測モデルが、月経前症候群の重症群及び軽症群における該遺伝子又は翻訳産物の発現量、又は該発現量の主成分分析で算出された少なくとも1種の主成分を、説明変数とし、月経前症候群の重症度を目的変数として構築される、
〔1〕〜〔5〕のいずれか1項記載の方法。
〔7〕好ましくは、前記遺伝子の発現量が、前記被験体の皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAを定量することにより測定される、〔1〕〜〔6〕のいずれか1項記載の方法。
〔8〕下記の遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、CTNNB1、AQP3、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、ANXA1、SNORA70、HSPA6、ALDH2、ARHGDIB、DEFB4A、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、BIRC3、S100A7、STK10、GHITM、SFN、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、HMGN2、HIF1A、RABGEF1、ARF1、ACTN1、MFN2、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの、月経前症候群の重症度マーカーとしての使用。
〔9〕好ましくは、下記の遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つが使用される、〔8〕記載の使用。
〔10〕好ましくは、さらに、下記の遺伝子に由来する核酸:CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つが使用される、〔9〕記載の使用。
〔11〕好ましくは、前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAである、〔8〕〜〔10〕のいずれか1項記載の使用。
〔12〕下記の遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、月経前症候群の重症度のマーカー。
〔13〕好ましくは、さらに、下記遺伝子に由来する核酸:CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、〔12〕記載のマーカー。
〔14〕好ましくは、前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAである、〔12〕又は〔13〕記載のマーカー。
〔2〕好ましくは、下記に示す遺伝子:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、〔1〕記載の方法。
〔3〕好ましくは、さらに、下記に示す遺伝子:CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、〔2〕記載の方法。
〔4〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
より好ましくは、前記遺伝子の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、
〔1〕〜〔3〕のいずれか1項記載の方法。
〔5〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の黄体期又は卵胞期での発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、〔4〕記載の方法。
〔6〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づく予測モデルを用いて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
該予測モデルが、月経前症候群の重症群及び軽症群における該遺伝子又は翻訳産物の発現量、又は該発現量の主成分分析で算出された少なくとも1種の主成分を、説明変数とし、月経前症候群の重症度を目的変数として構築される、
〔1〕〜〔5〕のいずれか1項記載の方法。
〔7〕好ましくは、前記遺伝子の発現量が、前記被験体の皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAを定量することにより測定される、〔1〕〜〔6〕のいずれか1項記載の方法。
〔8〕下記の遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、CTNNB1、AQP3、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、ANXA1、SNORA70、HSPA6、ALDH2、ARHGDIB、DEFB4A、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、BIRC3、S100A7、STK10、GHITM、SFN、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、HMGN2、HIF1A、RABGEF1、ARF1、ACTN1、MFN2、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの、月経前症候群の重症度マーカーとしての使用。
〔9〕好ましくは、下記の遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つが使用される、〔8〕記載の使用。
〔10〕好ましくは、さらに、下記の遺伝子に由来する核酸:CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つが使用される、〔9〕記載の使用。
〔11〕好ましくは、前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAである、〔8〕〜〔10〕のいずれか1項記載の使用。
〔12〕下記の遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、月経前症候群の重症度のマーカー。
〔13〕好ましくは、さらに、下記遺伝子に由来する核酸:CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、〔12〕記載のマーカー。
〔14〕好ましくは、前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAである、〔12〕又は〔13〕記載のマーカー。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例1 PMS重症度マーカーの同定
1)SSL採取
健常者(20〜45歳女性、BMI18.5以上25.0未満)38名を被験者とした。健常者は、予め月経周期が約25〜30日で毎回安定していることを確認されていた。月経周期の各時期(月経期:月経開始後2〜4日のいずれかの日、卵胞期:月経開始後10〜12日のいずれかの日、黄体期:月経開始後21〜23日のいずれかの日)に、あぶら取りフィルム(5.0cm×8.0cm、3M社)を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、RNA抽出に使用するまで−80℃で、約1ヶ月間保存した。また、皮脂採取後に、月経関連症状を評価する質問紙である、心理測定尺度集III(サイエンス社、2001発行)に記載のMenstrual Distress Questionnaire(MDQ)を用いて、被験者の月経周期の各時期(月経期、卵胞期及び黄体期)の月経随伴症状(月経困難症、月経前症候群等)の重症度を評価した。
1)SSL採取
健常者(20〜45歳女性、BMI18.5以上25.0未満)38名を被験者とした。健常者は、予め月経周期が約25〜30日で毎回安定していることを確認されていた。月経周期の各時期(月経期:月経開始後2〜4日のいずれかの日、卵胞期:月経開始後10〜12日のいずれかの日、黄体期:月経開始後21〜23日のいずれかの日)に、あぶら取りフィルム(5.0cm×8.0cm、3M社)を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、RNA抽出に使用するまで−80℃で、約1ヶ月間保存した。また、皮脂採取後に、月経関連症状を評価する質問紙である、心理測定尺度集III(サイエンス社、2001発行)に記載のMenstrual Distress Questionnaire(MDQ)を用いて、被験者の月経周期の各時期(月経期、卵胞期及び黄体期)の月経随伴症状(月経困難症、月経前症候群等)の重症度を評価した。
2)RNA調製及びシーケンシング
上記1)のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、QIAzol Lysis Reagent(Qiagen)を用いて、付属のプロトコルに準じてRNAを抽出した。抽出したRNAは、42℃、105分間の条件で逆転写し、得られたcDNAをマルチプレックスPCRで増幅した。マルチプレックスPCRは62℃のアニーリング及び伸長温度で実施した。得られたPCR産物は、Ampure XP(ベックマン・コールター株式会社)で精製した。得られた精製産物の溶液を、SuperScript VILO cDNA Synthesis kitに付属している5×VILO RT Reaction Mix、及びIon AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression Kit(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)に付属している5×Ion Ampliseq HiFi Mix、及びIon AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Core Panelを混合し、次いで各キット付属のプロトコルに従ってプライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをIon 540 Chipにローディングし、Ion S5/XLシステム(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるhg19 AmpliSeq Transcriptome ERCC v1に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
上記1)のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、QIAzol Lysis Reagent(Qiagen)を用いて、付属のプロトコルに準じてRNAを抽出した。抽出したRNAは、42℃、105分間の条件で逆転写し、得られたcDNAをマルチプレックスPCRで増幅した。マルチプレックスPCRは62℃のアニーリング及び伸長温度で実施した。得られたPCR産物は、Ampure XP(ベックマン・コールター株式会社)で精製した。得られた精製産物の溶液を、SuperScript VILO cDNA Synthesis kitに付属している5×VILO RT Reaction Mix、及びIon AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression Kit(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)に付属している5×Ion Ampliseq HiFi Mix、及びIon AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Core Panelを混合し、次いで各キット付属のプロトコルに従ってプライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをIon 540 Chipにローディングし、Ion S5/XLシステム(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるhg19 AmpliSeq Transcriptome ERCC v1に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
3)MDQスコアによる被験者の群分け
MDQではスコアが高いほど月経随伴症状の重症度が高いことを示す。そのため、被験者38名を、黄体期に得られたMDQのスコアに従って、スコアが66点以上である15名(平均スコア87.4)をPMS重症群、スコアが48点以下である15名(平均スコア40.3)をPMS軽症群に群分けした。中間層である8名に関しては、以下のデータ解析から除外した。
MDQではスコアが高いほど月経随伴症状の重症度が高いことを示す。そのため、被験者38名を、黄体期に得られたMDQのスコアに従って、スコアが66点以上である15名(平均スコア87.4)をPMS重症群、スコアが48点以下である15名(平均スコア40.3)をPMS軽症群に群分けした。中間層である8名に関しては、以下のデータ解析から除外した。
4)データ解析
上記2)で取得した卵胞期及び黄体期における被験者のSSL由来RNAのシーケンシングで得られた各リードのリードカウントを、各RNAの発現量のデータとし、リードカウントが10未満のリードは欠損値として扱った。サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、各リードカウントをRPM(Reads per million mapped reads)値に変換した。80%以上の被験者で欠損値ではない発現量データが得られた1884種の遺伝子を選択した。これら1884種の遺伝子について、PMSが発症する黄体期におけるそれらの発現量データ(RPM値)に基づいて群間(PMS重症群及び軽症群)でStudent’s t testを行い、p<0.05となる遺伝子を抽出した。なお、欠損値についてはSingular Value Decomposition(SVD)imputationにて補填した。群間で発現が変動する遺伝子が51個得られ(表5)、そのうち表6に示す40種の遺伝子が従来PMSとの関連が報告されていない遺伝子であった。これら表5中の遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、各々、PMS重症度のマーカーとして使用できる。さらに、これら表5中の遺伝子のうち、表6に示す遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、新規のPMS重症度マーカーである。
上記2)で取得した卵胞期及び黄体期における被験者のSSL由来RNAのシーケンシングで得られた各リードのリードカウントを、各RNAの発現量のデータとし、リードカウントが10未満のリードは欠損値として扱った。サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、各リードカウントをRPM(Reads per million mapped reads)値に変換した。80%以上の被験者で欠損値ではない発現量データが得られた1884種の遺伝子を選択した。これら1884種の遺伝子について、PMSが発症する黄体期におけるそれらの発現量データ(RPM値)に基づいて群間(PMS重症群及び軽症群)でStudent’s t testを行い、p<0.05となる遺伝子を抽出した。なお、欠損値についてはSingular Value Decomposition(SVD)imputationにて補填した。群間で発現が変動する遺伝子が51個得られ(表5)、そのうち表6に示す40種の遺伝子が従来PMSとの関連が報告されていない遺伝子であった。これら表5中の遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、各々、PMS重症度のマーカーとして使用できる。さらに、これら表5中の遺伝子のうち、表6に示す遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、新規のPMS重症度マーカーである。
実施例2 黄体期RNA発現量データに基づくPMS重症度予測モデルの構築
1)データセット分割
実施例1で得られた被験者の黄体期のSSL由来RNA発現量データセットのうち、全解析対象者数の67%に当たる各群(PMS重症群及び軽症群)10名分ずつについてのデータをPMS重症度予測モデルの訓練データとし、残り33%に当たる各群5名分ずつのデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。負の二項分布に従うRPM値を正規分布に近似するため、実施例1で求めたRNAの発現量データ(リードカウントのRPM値)を、底2の対数値に変換したRPM値(Log2RPM値)に変換した。
1)データセット分割
実施例1で得られた被験者の黄体期のSSL由来RNA発現量データセットのうち、全解析対象者数の67%に当たる各群(PMS重症群及び軽症群)10名分ずつについてのデータをPMS重症度予測モデルの訓練データとし、残り33%に当たる各群5名分ずつのデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。負の二項分布に従うRPM値を正規分布に近似するため、実施例1で求めたRNAの発現量データ(リードカウントのRPM値)を、底2の対数値に変換したRPM値(Log2RPM値)に変換した。
2)特徴量の選択
実施例1で抽出した遺伝子のうち、PMSとの関連が報告されていない表6に示す40個の遺伝子から、以下の2つの方法により予測モデル構築に用いる特徴量を選択した。
(方法1)表6に示す遺伝子のうち、PMS重症群と軽症群との発現差のp値が小さいものから5〜15種の遺伝子、具体的には表6のNo.1〜5の5種、表6のNo.1〜10の10種、又は表6のNo.1〜15の15種の遺伝子の発現量データ(Log2RPM値)を、PMS重症度検出の特徴量として選択した。
(方法2)表6に示す遺伝子の発現量データについて、統計解析環境Rのtidyverseパッケージを使用して主成分分析を行い、変数圧縮を実施した。主成分分析によって得られた、新しい次元を持つデータ(第1〜第10主成分、表7)をPMS重症度検出の特徴量として選択した。
実施例1で抽出した遺伝子のうち、PMSとの関連が報告されていない表6に示す40個の遺伝子から、以下の2つの方法により予測モデル構築に用いる特徴量を選択した。
(方法1)表6に示す遺伝子のうち、PMS重症群と軽症群との発現差のp値が小さいものから5〜15種の遺伝子、具体的には表6のNo.1〜5の5種、表6のNo.1〜10の10種、又は表6のNo.1〜15の15種の遺伝子の発現量データ(Log2RPM値)を、PMS重症度検出の特徴量として選択した。
(方法2)表6に示す遺伝子の発現量データについて、統計解析環境Rのtidyverseパッケージを使用して主成分分析を行い、変数圧縮を実施した。主成分分析によって得られた、新しい次元を持つデータ(第1〜第10主成分、表7)をPMS重症度検出の特徴量として選択した。
3)モデル構築
モデル構築は統計解析環境Rのcarnetパッケージを使用して行った。前記2)で方法1及び2により選択した特徴量を説明変数として用い、PMS重症度(重症又は軽症)を目的変数として用いて、予測モデルを構築した。特徴量毎に、ランダムフォレスト(Random Forest)、ニューラルネットワーク(Neural net)、線形カーネルのサポートベクターマシン(SVM (linear))、及びrbfカーネルのサポートベクターマシン(SVM (rbf))の4種のアルゴリズムを用いて、10倍交差検証を行って予測モデルを学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータのRNAの発現量データ(Log2RPM値)又は主成分データを入力してPMS重症度の予測値を計算した。予測値と実測値の一致度合いを示す値である正解率(Accuracy)を計算し、その値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
モデル構築は統計解析環境Rのcarnetパッケージを使用して行った。前記2)で方法1及び2により選択した特徴量を説明変数として用い、PMS重症度(重症又は軽症)を目的変数として用いて、予測モデルを構築した。特徴量毎に、ランダムフォレスト(Random Forest)、ニューラルネットワーク(Neural net)、線形カーネルのサポートベクターマシン(SVM (linear))、及びrbfカーネルのサポートベクターマシン(SVM (rbf))の4種のアルゴリズムを用いて、10倍交差検証を行って予測モデルを学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータのRNAの発現量データ(Log2RPM値)又は主成分データを入力してPMS重症度の予測値を計算した。予測値と実測値の一致度合いを示す値である正解率(Accuracy)を計算し、その値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
4)結果
表8に、PMS重症度の検出に用いた特徴量、最大のAccuracyを与えた最適アルゴリズム、及びそのAccuracyを示す。PMS重症度に関連する遺伝子の黄体期における発現量データ、又はそれらの主成分に基づいて、高いAccuracyでPMS重症度を検出することができた。したがって、SSL由来RNAの黄体期における発現量のデータを用いてPMS重症度の検出が可能であることが示された。また、主成分に基づく予測モデルの場合、第1〜第5主成分による予測モデルのAccuracyは、主成分1による予測モデルよりも高く、一方、第1〜第6主成分による予測モデルと同等であった。これらの結果から、合計寄与率が20%以上、例えば22〜55%又はそれ以上、好ましくは50〜70%、より好ましくは55〜65%になるような1つ以上の主成分を説明変数とすることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。また、遺伝子発現量から直接構築した予測モデルの場合、10遺伝子による予測モデルのAccuracyは、5遺伝子による予測モデルよりも高く、一方、15遺伝子による予測モデルと同等であった。PMS重症度による発現差の大きいものから10〜15個程度の遺伝子又はそれより多くの遺伝子の発現データを用いることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。
表8に、PMS重症度の検出に用いた特徴量、最大のAccuracyを与えた最適アルゴリズム、及びそのAccuracyを示す。PMS重症度に関連する遺伝子の黄体期における発現量データ、又はそれらの主成分に基づいて、高いAccuracyでPMS重症度を検出することができた。したがって、SSL由来RNAの黄体期における発現量のデータを用いてPMS重症度の検出が可能であることが示された。また、主成分に基づく予測モデルの場合、第1〜第5主成分による予測モデルのAccuracyは、主成分1による予測モデルよりも高く、一方、第1〜第6主成分による予測モデルと同等であった。これらの結果から、合計寄与率が20%以上、例えば22〜55%又はそれ以上、好ましくは50〜70%、より好ましくは55〜65%になるような1つ以上の主成分を説明変数とすることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。また、遺伝子発現量から直接構築した予測モデルの場合、10遺伝子による予測モデルのAccuracyは、5遺伝子による予測モデルよりも高く、一方、15遺伝子による予測モデルと同等であった。PMS重症度による発現差の大きいものから10〜15個程度の遺伝子又はそれより多くの遺伝子の発現データを用いることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。
実施例3 卵胞期RNA発現量データに基づくPMS重症度予測モデルの構築
1)データセット分割及び特徴量の選択
表6に示す遺伝子についての被験者の卵胞期のSSL由来RNA発現量データセットを用いた以外は、実施例2の1)と同様の手順で訓練データとテストデータを作成した。次いで実施例2の2)と同様の手順で、RNAの発現量データのLog2RPM値及び発現量データの主成分分析によって得られた第1〜第15主成分(表9)をPMS重症度検出の特徴量として選択した。
1)データセット分割及び特徴量の選択
表6に示す遺伝子についての被験者の卵胞期のSSL由来RNA発現量データセットを用いた以外は、実施例2の1)と同様の手順で訓練データとテストデータを作成した。次いで実施例2の2)と同様の手順で、RNAの発現量データのLog2RPM値及び発現量データの主成分分析によって得られた第1〜第15主成分(表9)をPMS重症度検出の特徴量として選択した。
2)モデル構築
1)で選択した特徴量を説明変数として用いて、実施例2の3)と同様の手順で予測モデルを学習させ、正解率(Accuracy)が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
1)で選択した特徴量を説明変数として用いて、実施例2の3)と同様の手順で予測モデルを学習させ、正解率(Accuracy)が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
3)結果
表10に、PMS重症度の検出に用いた特徴量、最大のAccuracyを与えた最適アルゴリズム、及びそのAccuracyを示す。PMS重症度に関連する遺伝子の卵胞期における発現量データ、又はそれらの主成分に基づいて、高いAccuracyでPMS重症度を検出することができた。したがって、SSL由来RNAの卵胞期における発現量のデータを用いて、次回月経に伴うPMSの重症度の検出が可能であることが示された。また、主成分に基づく予測モデルの場合、第1〜第15主成分による予測モデルのAccuracyが最も高く、合計寄与率が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上になるような1つ以上の主成分を説明変数とすることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。一方、遺伝子発現量から直接構築した予測モデルの場合、PMS重症度との相関が高いものから5〜20個程度、好ましくは5〜15個程度の遺伝子の発現データを用いることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。
表10に、PMS重症度の検出に用いた特徴量、最大のAccuracyを与えた最適アルゴリズム、及びそのAccuracyを示す。PMS重症度に関連する遺伝子の卵胞期における発現量データ、又はそれらの主成分に基づいて、高いAccuracyでPMS重症度を検出することができた。したがって、SSL由来RNAの卵胞期における発現量のデータを用いて、次回月経に伴うPMSの重症度の検出が可能であることが示された。また、主成分に基づく予測モデルの場合、第1〜第15主成分による予測モデルのAccuracyが最も高く、合計寄与率が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上になるような1つ以上の主成分を説明変数とすることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。一方、遺伝子発現量から直接構築した予測モデルの場合、PMS重症度との相関が高いものから5〜20個程度、好ましくは5〜15個程度の遺伝子の発現データを用いることで、より精度の高いPMS重症度予測モデルが構築可能であることが示された。
Claims (8)
- 下記に示す遺伝子:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、被験体の月経前症候群の重症度を検出する方法。
- さらに、下記遺伝子:CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つの発現を測定することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、請求項1又は2記載の方法。
- 前記遺伝子又は翻訳産物の黄体期又は卵胞期での発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、請求項3記載の方法。
- 前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づく予測モデルを用いて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
該予測モデルが、月経前症候群の重症群及び軽症群における該遺伝子又は翻訳産物の発現量、又は該発現量の主成分分析で算出された少なくとも1種の主成分を、説明変数とし、月経前症候群の重症度を目的変数として構築される、
請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。 - 前記遺伝子の発現量が、前記被験体の皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAを定量することにより測定される、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 下記の遺伝子に由来する核酸:SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、月経前症候群の重症度のマーカー。
- 前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のmRNAである、請求項7記載のマーカー。
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