CN112955551A - 来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高精度地分析被检测体的RNA的方法。来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法包括在0℃以下保存从被检测体采集的含有RNA的皮肤表层脂质的步骤。来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法包括将被检测体的皮肤表层脂质所含的RNA转变为cDNA后,利用多重PCR进行扩增,再对所得到的反应产物进行精制的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法和使用该核酸的被检测体的皮肤的分析方法。
背景技术
已经开发了通过分析生物体试样中的分子(核酸、蛋白质、代谢物等)来研究人体内的现在乃至将来的生理状态的技术。其中,对于利用核酸分子的分析,已经建立了全面的分析方法,因此具有如下的优点:通过一次分析得到丰富的信息,以及基于与单核苷酸多态性、RNA功能等有关的多个研究报告,分析结果的功能关联变得容易。
在生物体的各种组织中,皮肤由于与外界接触,因此作为能够侵入性低地采集生物体试样的组织而受到关注。作为来自皮肤的非侵入的核酸的采集和分析方法,报告了利用湿润的药棉拭子(棉球)擦拭皮肤表面,由此采集人皮肤样品,进行RNA特征分析(Profiling)(非专利文献1)。在专利文献1中记载了从皮肤表层脂质中分离来自被检测体的皮肤细胞的RNA等的核酸,用作生物体的分析用的试样。
(专利文献1)国际公开公报第2018/008319号
(非专利文献1)Forensic Sci Int Genet,2012,6(5):565-577
发明内容
在一个实施方式中,本发明提供一种来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法,其包括在0℃以下保存从被检测体采集的含有RNA的皮肤表层脂质的步骤。
在另一个实施方式中,本发明提供一种来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法,其包括:通过逆转录将被检测体的皮肤表层脂质所含的RNA转变为cDNA,接着对该cDNA进行多重PCR的步骤;和对该PCR的反应产物进行精制的步骤。
在另一个实施方式中,本发明提供一种被检测体的皮肤、皮肤以外的部位或全身状态的分析方法,其包括对利用上述方法所制备的核酸进行分析的步骤。
在另一个实施方式中,本发明提供一种皮肤外用剂、皮内给药剂、贴剂、口服剂或注射剂对被检测体的效果或效能的评价方法,其包括对利用上述方法所制备的核酸进行分析的步骤。
在另一个实施方式中,本发明提供一种被检测体的血中成分浓度的分析方法,其包括对利用上述方法所制备的核酸进行分析的步骤。
附图说明
图1是保存温度对SSL中RNA的稳定性的影响。18S:18S核糖体RNA,28S:28S核糖体RNA。
图2是来自SSL的RNA中的特应性皮炎相关标记的表达。
图3是基于机器学习模型并根据来自SSL的RNA表达量得到的血中睾酮浓度的预测值。纵轴表示预测值,横轴表示实测值。
图4是基于机器学习模型并根据来自SSL的RNA表达量得到的血中的各种成分的浓度的预测结果。
图5是基于表达因洗面奶的使用而上升的22种RNA组的表达量(0天)得到的被检验者的分组。
图6是因使用洗面奶而引起的角质层水分量的变化。
图7是基于问卷结果的确实感受到使用洗面奶后的保湿效果的人的比例。
图8是皮脂分泌量高的组、低的组中BSG和HCAR2的表达。
图9是水分量高的组、低的组中ASPRV1和PADI3的表达。
图10是皮肤发红高的组、低的组中SOCS3、JUNB和IL-1B的表达。
图11是基于机器学习模型并根据来自SSL的RNA表达量得到的皮肤状态的预测值。纵轴表示预测值,横轴表示实测值。
图12是基于机器学习模型并根据来自SSL的RNA表达量得到的血中皮质醇浓度的预测值。纵轴表示预测值,横轴表示实测值。
图13是基于机器学习模型并根据来自SSL的RNA表达量得到的累积紫外线暴露时间的预测值。纵轴表示预测值,横轴表示基于来自被检验者的问卷得到的计算值。
具体实施方式
关于本说明书中所引用的全部专利文献、非专利文献和其它的出版物,其全部在本说明书中作为参考而被引用。
本说明书中所公开的基因名称是基于NCBI([www.ncbi.nlm.nih.gov/])所记载的官方代号(Official Symbol)。另一方面,关于基因本体(gene ontology、GO),基于String([string-db.org/])所记载的Pathway ID.。
本发明涉及来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法和使用该核酸的被检测体的皮肤的分析方法。
利用本发明的方法,能够稳定地保存来自被检测体的皮肤表层脂质所含的皮肤细胞的核酸试样。因此,本发明能够提高使用核酸试样的分析(例如基因分析、诊断等)的精度。另外,利用本发明的方法制备的来自皮肤细胞的核酸试样所含的来自特定标记基因的成分的浓度与存在于血中的各种成分的浓度相关,因此通过使用该核酸试样,能够进行非侵入性的血中成分浓度测定。
RNA具有容易分解的性质,因此除了实施特殊处理的情况以外,通常在-80℃这样特别的低温条件下保存。使用RNA的量因分解而减少的试样时,分析的精度下降。即使在利用逆转录反应将RNA转变为cDNA的情况下,原有的RNA处于不稳定的状态时,也无法得到充分的量的cDNA,因此分析的精度仍然会下降。
以前,本发明人发现存在于皮肤表层上的脂质(皮肤表层脂质)中含有来自被检测体的皮肤细胞的RNA,能够使用其进行生物体的分析,并申请了专利(专利文献1)。这次本发明人还发现,该皮肤表层脂质所含的RNA能够在一般的低温条件下保存,进一步而言即使不是现有的-80℃这样特别的低温条件,也能够稳定保存。本发明人进一步发现,通过在规定的条件下对从该皮肤表层脂质中分离得到的RNA实施逆转录反应和PCR,接着进行精制,从RNA含量少的皮肤表层脂质中也能够获得分析所需的充分量的核酸试样。
因此,在一个方式中,本发明提供一种来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法。在一个实施方式中,本发明的来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法包括在0℃以下保存从被检测体采集的含有RNA的皮肤表层脂质的步骤。在另一个实施方式中,本发明的来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法包括:通过逆转录将被检测体的皮肤表层脂质所含的RNA转变为cDNA,接着对该cDNA实施多重PCR的步骤;和对该PCR的反应产物进行精制的步骤。
在本说明书中,“皮肤表层脂质(skin surface lipids;SSL)”是指存在于皮肤的表层上的脂溶性成分,有时也称为皮脂。一般而言,SSL主要包含由位于皮肤的皮脂腺等外分泌腺分泌的分泌物,以覆盖皮肤表面的薄层的形式存在于皮肤表层上。
在本说明书中,“皮肤”没有特别限定,是包括体表的表皮、真皮、毛囊以及汗腺、皮脂腺和其它的腺体等组织在内的区域的总称。
利用本发明的方法制备的来自被检测体的皮肤细胞的核酸并不特别限定于DNA、RNA等,优选为RNA或由该RNA制备的DNA。作为RNA,可以列举mRNA、tRNA、rRNA、小分子RNA(small RNA)(例如微RNA(microRNA(miRNA))、小干扰RNA(small interfering RNA(siRNA))、Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA(piRNA))等)、长链基因间非编码RNA(long intergenic non-coding(linc)RNA)等。mRNA为编码蛋白质的RNA,大多具有1000nt以上的长度。miRNA、siRNA、piRNA和lincRNA为不编码蛋白质的非编码RNA(non-coding(nc)RNA)。miRNA为ncRNA中长度19-30nt左右的小的RNA。lincRNA与mRNA同样为具有poly-A的长的non-coding RNA,具有200nt以上的长度(非专利文献1)。更优选本发明的方法中所制备的RNA为具有200nt以上的长度的RNA。进一步优选本发明的方法中所制备的RNA为选自mRNA和lincRNA中的至少1种。作为本发明的方法中所制备的DNA的例子,可以列举由前述的RNA制备的cDNA、来自该cDNA的反应产物(例如PCR产物、克隆DNA等)等。
本发明的方法中的被检测体只要是皮肤上具有SSL的生物即可。作为被检测体的例子,可以列举包括人和非人哺乳动物在内的哺乳动物,优选为人。优选该被检测体为需要或希望进行自身的核酸分析的人或非人哺乳动物。还优选该被检测体为需要或希望进行皮肤的基因表达分析或使用核酸的皮肤或皮肤以外的部位的状态分析的人或非人哺乳动物。
从被检测体采集的SSL含有在该被检测体的皮肤细胞中表达的RNA,优选含有在该被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊、汗腺和真皮中的任意部位表达的RNA,更优选含有在该被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊和汗腺中的任意部位表达的RNA(参照专利文献1)。因此,利用本发明的方法制备的来自被检测体的皮肤细胞的RNA优选为来自选自被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊、汗腺和真皮中的至少1个部位的RNA,更优选为来自选自表皮、皮脂腺、毛囊和汗腺中的至少1个部位的RNA。
在一个实施方式中,本发明的方法还可以包括采集被检测体的SSL的步骤。作为采集SSL的皮肤的部位,可以列举头、脸、颈、躯干、手足等身体的任意部位的皮肤、患有特应性、痤疮、干燥、炎症(发红)、肿瘤等疾病的皮肤、有创伤的皮肤等,但没有特别限定。另外,采集SSL的皮肤的部位优选不包括手掌、背部、足底或手指的皮肤。
从被检测体的皮肤采集SSL时,可以采用用于从皮肤回收或除去SSL的所有方法。优选可以使用后述的SSL吸收性材料、SSL粘附性材料或者从皮肤刮下SSL的器械。作为SSL吸收性材料或SSL粘附性材料,只要是与SSL具有亲合性的材料即可,没有特别限定,例如可以列举聚丙烯、纸浆等。作为从皮肤采集SSL的过程的更详细的例子,可以列举:利用吸油纸、吸油膜等片状材料吸收SSL的方法;使SSL粘附于玻璃板、胶带等的方法;利用刮铲、刮刀等刮下SSL并回收的方法等。为了提高SSL的吸附性,也可以使用预先含有脂溶性高的溶剂的SSL吸收性材料。另一方面,SSL吸收性材料含有水溶性高的溶剂或水分时,会阻碍SSL的吸附,因此优选水溶性高的溶剂或水分的含量少。SSL吸收性材料优选以干燥的状态使用。
在本发明的一个实施方式中,该采集的含有RNA的SSL在0℃以下的低温条件下保存。为了尽可能抑制RNA的分解,该采集的含有RNA的SSL优选在采集后尽快在规定的低温条件下保存。本发明的保存该含有RNA的SSL的温度条件只要为0℃以下即可,优选为-20±20℃~-80±20℃,更优选为-20±10℃~-80±10℃,进一步优选为-20±20℃~-40±20℃,进一步优选为-20±10℃~-40±10℃,进一步优选为-20±10℃,进一步优选为-20±5℃。该温度条件与目前一般的RNA的保存条件(例如-80℃)相比,是相当温和的条件。因此,在优选的低温条件下保存本发明的该含有RNA的SSL,不需要使用超低温冰柜或专用的保存容器等特别的设备,而能够使用通常的冰柜或冰箱的冷冻室。另外,本发明的该含有RNA的SSL在该低温条件下的保存时间没有特别限定,优选为12个月以下、例如6小时以上12个月以下,更优选为6个月以下、例如1天以上6个月以下,进一步优选为3个月以下、例如3天以上3个月以下。
从所采集的该含有RNA的SSL中分离RNA时,能够使用常用于从生物体试样提取或精制RNA的方法,例如酚-氯仿(Phenol/chloroform)法、AGPC(酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction))法或使用TRIzol(注册商标)、RNeasy(注册商标)、QIAzol(注册商标)等柱的方法、使用涂布有二氧化硅的特殊的磁体颗粒的方法、使用固相载体可逆化固定(Solid Phase ReversibleImmobilization)磁体颗粒的方法、利用ISOGEN等市售的RNA提取试剂进行提取的方法等。
在本发明的另一个实施方式中,从该含有RNA的SSL分离得到的RNA(来自SSL的RNA)能够以RNA的形态直接用于各种分析。在优选的实施方式中,该来自SSL的RNA被转变为DNA。优选通过逆转录将该来自SSL的RNA转变为cDNA,接着对该cDNA实施PCR,再对所得到的反应产物进行精制。该逆转录可以使用以所要分析的特定的RNA为靶标的引物,为了更全面地保存和分析核酸,优选使用随机引物。另外,在该PCR中,可以使用以所要分析的特定的DNA为靶标的引物对,只扩增该特定的DNA,也可以使用多个引物对,扩增多个DNA。优选该PCR为多重PCR。其是通过在PCR反应系统中同时使用多个引物对而同时扩增多个基因区域的方法。多重PCR可以使用市售的试剂盒(例如Ion AmpliSeq转录组人基因表达试剂盒(Transcriptome Human Gene Expression Kit);Life Technologies Japan株式会社等)实施。
RNA的逆转录可以使用一般的逆转录酶或逆转录试剂盒。适合使用准确性和效率性高的逆转录酶或逆转录试剂盒,作为其例子,可以列举M-MLV逆转录酶(ReverseTranscriptase)及其变体或者市售的逆转录酶或逆转录试剂盒、例如PrimeScript(注册商标)Reverse Transcriptase系列(Takara Bio公司)、SuperScript(注册商标)ReverseTranscriptase系列(Thermo Scientific公司)等。优选使用SuperScript(注册商标)IIIReverse Transcriptase、SuperScript(注册商标)VILO cDNA合成试剂盒(Synthesis kit)(均为Thermo Scientific公司)等。
通过调整该逆转录和PCR的反应条件,PCR反应产物的收率进一步提高,进而使用其的分析的精度进一步提高。合适的是在该逆转录中的延伸反应中,优选将温度调整为42℃±1℃、更优选42℃±0.5℃、进一步优选42℃±0.25℃,另一方面,优选将反应时间调整为60分钟以上、更优选80~100分钟。另外,合适的是该PCR中的退火和延伸反应的温度优选为62℃±1℃,更优选为62℃±0.5℃,进一步优选为62℃±0.25℃。因此,在该PCR中,优选退火和延伸反应在1个步骤中进行。该退火和延伸反应的步骤的时间可以根据所扩增的DNA的大小等来调整,优选为14~18分钟。该PCR中的变性反应的条件可以根据所扩增的DNA来调整,优选以95~99℃进行10~60秒。上述那样的温度和时间下的逆转录和PCR可以使用常用于PCR的热循环仪实施。
利用该PCR得到的反应产物的精制优选通过反应产物的粒析(size separation)进行。利用粒析,能够将目标的PCR反应产物与PCR反应液中所含的引物和其它的杂质分离。DNA的粒析例如可以利用粒析柱、粒析芯片、能够用于粒析的磁珠等进行。作为能够用于粒析的磁珠的优选的例子,可以列举Ampure XP等的固相可逆化固定(Solid PhaseReversible Immobilization,SPRI)磁珠。将Ampure XP和DNA溶液混合时,DNA被涂布于磁珠的表面的羧基吸附,使用磁铁只回收磁珠,从而DNA被精制。另外,如果改变Ampure XP溶液与DNA溶液的混合比时,则吸附于磁珠的DNA的分子大小发生变化。通过利用该原理,能够从磁珠上回收所要捕捉的特定的分子大小的DNA,对其以外的分子大小的DNA和杂质进行精制。
对于精制后的PCR反应产物,为了进行之后的分析,也可以进行必要的更进一步的处理。例如为了进行DNA的测序、片段分析,可以将精制后的PCR反应产物在适当的缓冲液溶液中进行制备,或切断PCR扩增得到的DNA所含的PCR引物区域,或向扩增得到的DNA中进一步添加接头序列。例如可以将精制后的PCR反应产物在缓冲液溶液中进行制备,对扩增DNA进行PCR引物序列的除去和接头连接,使所得到的反应产物根据需要扩增,制作用于各种分析的文库(library)。例如可以使用SuperScript(注册商标)VILO cDNA Synthesis kit(Life Technologies Japan株式会社)所附带的5×VILO RT Reaction Mix、和IonAmpliSeq转录组人基因表达试剂盒(Life Technologies Japan株式会社)所附带的5×IonAmpliSeq HiFi Mix、和Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression CorePanel,基于各试剂盒所带的操作规程进行这些操作。
实施该逆转录和PCR的来自SSL的RNA可以为来自从生物体刚采集之后的含有RNA的SSL的RNA、或来自从生物体采集后室温或冷藏保存的含有RNA的SSL的RNA,优选来自从生物体采集后在0℃以下保存的含有RNA的SSL的RNA。该0℃以下的保存可以为在-80℃的保存,优选为在-20±10℃的保存、更优选为在-20±5℃的保存。该来自SSL的RNA在从SSL分离后,可以直接用于上述逆转录、PCR,也可以利用通常的方法进行保存直至使用。
利用本发明的方法由来自SSL的RNA制备的来自被检测体的皮肤细胞的核酸能够用于使用核酸的各种分析或诊断。因此,本发明还提供一种核酸的分析方法,其包括对利用上述本发明的核酸的制备方法制备的核酸进行分析的步骤。核酸是上述的利用本发明的核酸的制备方法制备的核酸。作为能够使用利用本发明制备的核酸进行的分析和诊断的例子,可以列举如下:
(i)与被检测体的皮肤有关的基因表达分析和其它的基因信息的分析,以及基于这些分析的与被检测体的皮肤有关的功能分析等;
(ii)被检测体的皮肤疾病或状态的分析,例如皮肤的健康状态(例如皮脂分泌、水分量、发红、特应性皮炎、敏感性肌肤等的皮肤状态)的评价、皮肤状态的现状预测或将来预测、皮肤的累积紫外线暴露时间等过去的经历的预测、皮肤疾病的诊断或预后诊断、皮肤癌的诊断或预后诊断、皮肤的细微变化的评价等;
(iii)利用前述的被检测体的皮肤疾病或状态的分析进行的皮肤外用剂、皮内给药剂、贴剂、口服剂、注射剂等的效果或效能的评价;
(iv)被检测体的皮肤以外的部位或全身的状态的分析,例如全身的健康状态的评价或将来预测,以及神经疾病、心血管疾病、代谢性疾病、癌症等各种疾病的诊断或预后诊断等;
(v)被检测体的血中成分浓度的分析。
以下,例示使用利用本发明制备的核酸的分析和诊断的更详细的例子。
基因表达分析
如专利文献1所公开的那样,SSL富含来自被检测体的mRNA等高分子量RNA。SSL是能够从被检测体非侵入地采集的mRNA的供给源,作为基因表达分析用的生物体试样是有用的。另外,SSL中的mRNA反映了皮脂腺、毛囊和表皮的基因表达谱(expression profile)(参照专利文献1的实施例1~4)。因此,利用本发明制备的核酸适合作为皮肤、特别是皮脂腺、毛囊和表皮的基因表达分析用的生物体试样。
皮肤的分析
能够将利用本发明制备的核酸作为试样,对被检测体的皮肤进行分析。作为该皮肤的分析的例子,可以列举前述的基因表达分析、皮肤状态的分析等。作为该皮肤状态的分析的例子,可以列举患有或未患有规定的疾病或状态的皮肤的检测。作为规定的疾病或状态的例子,可以列举皮脂量的不足或过多、皮肤水分量的不足或过多、发红、特应性皮炎、敏感性肌肤等,但并不限定于此。例如,通过根据利用本发明所制备的核酸对被检测体的皮肤的皮脂量、皮肤水分量、发红、特应性皮炎、敏感性肌肤等的规定的疾病或状态的标记基因的表达水平进行分析,能够确定该被检测体的皮肤是否患有该规定的疾病或状态。合适的是通过将对被检测体获得的规定的疾病或状态的标记基因的表达水平与由患有该规定的疾病或状态的组(阳性对照)或者未患有该规定的疾病或状态的组(阴性对照)的SSL利用本发明的方法制备的核酸中的该标记基因的表达水平进行比较,能够确定该被检测体的皮肤是否患有该规定的疾病或状态。标记基因能够使用公知的皮肤状态相关标记基因。
作为皮肤分析的其它的例子,可以列举皮肤状态的预测;作为该皮肤状态的例子,可以列举皮肤物性的预测、皮肤的目测或触诊评价的预测、皮脂组成的预测等。作为该皮肤物性的例子,可以列举角质层水分量、经皮水分蒸散量(TEWL)、皮脂量、黑素量、红斑量等。作为该皮肤的目测或触诊评价的例子,通常可以列举专业判定员通过目测或触诊进行评价的皮肤的状态。作为该目测评价的更具体的例子,可以列举“清洁度”、“透明感”、“明亮度”、“光泽”、“色斑”、“黑眼圈”、“发黄”、“整体发红”、“面颊皱纹”、“嘴角下垂”、“鳞屑”、“痤疮”、“脸颊毛孔粗大”、“鼻毛孔粗大”等的有无或程度的评价;作为触诊评价的例子,可以列举“粗糙感”、“湿润感”等的有无或程度的评价。作为该皮脂组成的例子,可以列举构成皮脂的游离脂肪酸(FFA)、蜡酯(WE)、胆固醇酯(ChE)、角鲨烯(SQ)、角鲨烯环氧化物(SQepo)、氧化角鲨烯(SQOOH)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)等成分的量。
如后述的实施例所示,通过对利用来自SSL的RNA分析得到的RNA表达谱和与其关联的关于各种皮肤状态的测定值和评价值的数据进行相关分析,能够选择与各种皮肤状态相关性高的基因,用于预测模型的构建。作为用于皮肤状态预测的具体的相关基因,可以列举表8所示的基因。
使用多个基因数据作为用于构建预测模型的相关性高的基因的表达数据时,根据需要,可以利用主成分分析对数据进行压缩后,再进行预测模型的构建。
构建预测模型的算法可以利用用于机器学习的算法等公知的算法。作为机器学习算法的例子,可以列举线性回归模型(Linear model)、Lasso回归、随机森林(RandomForest)、神经网络(Neural net)、线性核的支持向量机(SVM(linear))、rbf核的支持向量机(SVM(rbf))等算法。可以向所构建的预测模型输入验证用的数据,算出预测值,选择该预测值与实测值的差的均方根误差(RMSE)最小的模型作为最佳模型。
作为皮肤分析的其它的例子,可以列举皮肤的累积紫外线暴露时间的预测。一般而言,基于与生活习惯、户外休闲活动有关的问卷调査,预测紫外线暴露时间,从而算出累积紫外线暴露时间。如后述的实施例所示,通过对利用来自SSL的RNA分析得到的RNA表达谱和与其关联的累积紫外线暴露时间的计算数据进行相关分析,能够选择与累积紫外线暴露时间相关性高的基因,构建预测模型。模型构建的步骤与上述相同。
或者,可以对从患有该规定的疾病或状态的组(阳性对照)或者未患有该规定的疾病或状态的组(阴性对照)的SSL制备的核酸的表达水平进行分析,使用观察到表达水平在两组间显著变动的基因作为皮肤状态相关标记基因。具体而言,作为关于特应性皮炎的标记基因,可以列举:选自在后述的试验例6中与健康人相比,在特应性皮炎患者中表达显著下降的1911个基因组(表7-1~7-24的(A))中的1个以上的基因;在认为与特应性皮炎相关性强的作为生物过程(biological process(BP))的GO:0050911所含的嗅觉感受器(olfactory receptor(OR))中,与健康人相比,在特应性皮炎患者中表达下降的370种OR基因组(表7-1~7-11的(B));以及选自与皮炎的重症度相对应且表达下降的368种OR基因组(表7-1~7-11的(C))和284种OR基因组(表7-1~7-11的(D))中的1个以上的基因。作为关于敏感性肌肤的标记基因,可以列举:选自在后述的试验例7中,与没有敏感性肌肤的自觉症状的组相比,在有自觉症状的组中表达显著下降的693个基因组(表7-1~7-20的(E))中的1个以上的基因;以及选自在认为与敏感性肌肤相关性强的作为生物过程(BP)的GO:0050911所含的olfactory receptor(OR)中,与没有敏感性肌肤的自觉症状的组相比,在有自觉症状的组中表达下降的344种OR基因组(表7-1~7-10的(F))中的1个以上的基因。作为关于发红的标记基因,可以列举选自在后述的试验例8中,在肌肤的发红强的组与弱的组之间表达显著变动的703个基因组(表7-1~7-20的(G))中的1个以上的基因。作为关于皮肤水分量的标记基因,可以列举选自在后述的试验例8中,在角质层水分量多的组与少的组之间表达显著变动的553个基因组(表7-1~7-16的(H))中的1个以上的基因。作为关于皮脂量的标记基因,可以列举选自在后述的试验例8中,在皮脂量多的组与少的组之间表达显著变动的594个基因组(表7-1~7-17的(I))中的1个以上的基因。
另外,基于前述的被检测体的皮肤的疾病或状态的分析,能够对所给药的皮肤外用剂、皮内给药剂、贴剂、口服剂、注射剂等对该被检测体的效果或效能进行评价。例如通过研究关于被检测体的皮肤的前述的皮肤的疾病或状态的标记基因的表达,能够对该皮肤护理制品的使用对被检测体的皮肤的效果或效能进行评价。作为该评价所使用的关于皮肤的疾病或状态的标记的例子,可以列举选自BNIP3、CALML3、GAL、HSPA5、JUNB、KIF13B、KRT14、KRT17、KRT6A、OVOL1、PPIF、PRDM1、RBM3、RPLP1、RPS4X、SEPT9、SOAT1、SPNS2、UBB、VCP、WIPI2和YPEL3中的1个以上的基因。
血中的各种成分浓度的分析
将利用本发明制备的核酸作为试样,能够对存在于被检测体的血中的各种成分的浓度进行分析。如后述的实施例所示,利用基于来自SSL的RNA中的来自相关标记基因的RNA表达量和血中的各种成分的浓度数据所构建的机器学习模型,根据来自被检测体的SSL的RNA中的来自相关标记基因的RNA表达量,能够预测该被检测体的血中成分浓度。因此,基于来自SSL的RNA中的来自相关标记基因的RNA表达量,能够对血中的各种成分的浓度进行定量。机器学习模型可以按照前述的皮肤状态的预测模型的构建步骤进行构建。作为利用本发明进行分析的存在于血中的各种成分的例子,可以列举激素、胰岛素、中性脂质、γ-GTP、LDL-胆固醇等。作为该血中激素的例子,可以列举睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮等雄激素、雌酮、雌二醇等雌激素、孕酮、皮质醇等。其中,优选睾酮、皮质醇。用于对血中的各种成分的浓度进行定量的来自SSL的RNA中的来自相关标记基因的RNA可以选自其表达量与该血中成分浓度显示相对高的相关的RNA。优选对于群体测定来自SSL的RNA的表达量和目标成分的血中浓度,研究各RNA的表达量与该血中成分的浓度的相关,选择显示相对高相关的RNA即可。
例如,作为用于血中的睾酮、胰岛素、中性脂肪、γ-GTP、LDL-胆固醇各自的浓度定量的来自SSL的RNA中的来自相关标记基因的RNA的例子,可以使用选自以下所示的来自人基因的RNA组中的至少1个,优选全部使用:
(睾酮)SCARNA16、PRSS27、RDBP、PSMB10、SBNO1、EMC3、MAR9、C20orf112、C14orf2和CCDC90B;
(胰岛素)EAPP、SDE2、LYAR、ZNF493、PSMB10、FAM71A、GPANK1、FGD4、MRPL43和CMPK1;
(中性脂肪)CCDC9、C6orf106、CERK、HSD3B2、SUN2、FNDC4、GRAMD1C、DGAT2、ALPL、HOMER3、MTHFS、ADIPOR1、RBM3、EXOC8和ARHGEF37;
(γ-GTP)TMEM38A、BTN3A2、NAP1L2、ABCA2、ALPL、SECTM1、C17orf62、GNB2、R3HDM4、LRG1、SBNO2、CD14、MLLT1、NINJ2和LIMD2;
(LDL-胆固醇)THTPA、LOC100506023、ZNF700、TAB3、PLEKHA1、ZNF845、FXC1、CUL4A、NDUFV1和AMZ2。
对于使用来自SSL的RNA的血中成分浓度定量的优选的步骤,以血中睾酮浓度定量为例说明如下:首先,将从人群得到的来自SSL的RNA所含的与血中睾酮浓度具有高的相关的上述10种基因(SCARNA16、PRSS27、RDBP、PSMB10、SBNO1、EMC3、MAR9、C20orf112、C14orf2和CCDC90B)的RNA的表达量数据作为说明变量并且将从该群体得到的血中睾酮浓度数据作为目标变量,利用这样得到的机器学习,根据该RNA的表达量构建用于预测血中睾酮浓度的最佳预测模型。另一方面,从想要研究血中睾酮浓度的人被检测者采集来自SSL的RNA。基于所构建的模型,根据该被检测体的来自SSL的RNA中的上述10种基因的RNA的表达量数据,能够算出该被检测体的血中睾酮浓度的预测值。
病理学的诊断
根据最近的报告,癌细胞中表达发生变化的RNA组中的约63%为编码蛋白质的mRNA(Cancer Res.2016,76,216-226)。因此认为,通过测定mRNA的表达状态,能够更加忠实地掌握癌症等疾病所导致的细胞的生理状态的变化,并能够更加准确地诊断身体状态。SSL富含mRNA,还含有已报告与癌症的相关性的SOD2的mRNA(Physiol Genomics,2003,16,29-37;Cancer Res,2001,61,6082-6088)。因此,SSL作为皮肤癌等癌症的诊断或预后诊断用的生物体试样是有用的。
近年来,报告了在患有肥胖、阿尔茨海默病、乳腺癌、心脏病等的皮肤以外的组织的疾病的患者中,皮肤中的分子表达会发生变动,因此可以说“皮肤是体内健康状态的窗口(window to body's health)”(Eur J Pharm Sci.2013,50,546-556)。因此,通过测定SSL中的mRNA的表达状态,具有能够对被检测体的皮肤以外的部位的生理状态或全身的生理状态进行分析的可能性。
非编码RNA分析
近年来,细胞的基因表达中的miRNA、lincRNA等non-coding(nc)RNA的参与受到了关注,研究正在积极进行中。目前,还开发了使用尿或血清中的miRNA的非侵入或低侵入的癌症等的诊断方法(例如Proc Natl Acad Sci USA,2008,105,10513-10518;Urol Oncol,2010,28,655-661)。可以将由SSL制备的miRNA、lincRNA等ncRNA用作用于上述研究和诊断的试样。
核酸标记的筛选或检测
可以将由SSL制备的核酸作为试样,进行疾病或状态的核酸标记的筛选或检测。在本说明书中,疾病或状态的核酸标记是指其表达成为用于指定的疾病或状态的判定或其风险判定的指标的核酸。优选核酸标记为RNA标记,该RNA优选为mRNA、miRNA或lincRNA。作为该核酸标记为靶标的疾病或状态,例如可以列举:各种皮肤疾病(特应性皮炎等)、皮肤的健康状态(敏感性肌肤、光老化、炎症(发红)、干燥、水分或油分量、肌肤的紧致度、暗沉等);以及上述“病理学的诊断”的项所述的皮肤癌等癌症和肥胖、阿尔茨海默病、乳腺癌、心脏病等的皮肤以外的组织的疾病,但并不限定于此。核酸的表达分析可以利用使用实时PCR(Real-time PCR)、微阵列、下一代测序仪的RNA表达分析等公知的方法进行。
一个例子是疾病或状态的核酸标记的选择方法。在该方法中,将具有规定的疾病或状态或其风险的群体作为被检测体,按照本发明的核酸的制备方法,制备来自被检测体的皮肤细胞的核酸。对于从该群体制备的核酸,将其表达(表达水平等)与对照的表达进行比较。作为该对照,可以列举不具有该规定的疾病或状态或其风险的群体和基于此得到的统计学的数据等。可以选择与对照相比显示不同的表达的核酸作为该规定的疾病或状态的标记或其候补。作为如此选择的核酸标记或其候补的例子,可以列举表7-1~7-24所记载的标记基因。
另一个例子是疾病或状态的核酸标记的检测方法或基于该标记检测的疾病或状态或其风险的判定方法。在该方法中,从希望或需要判定规定的疾病或状态或其风险的被检测体按照本发明的核酸的制备方法制备来自被检测体的皮肤细胞的核酸。接着,从所制备的核酸中检测出规定的疾病或状态的核酸标记。基于该核酸标记的有无或表达量,判定被检测体的该疾病或状态或其风险。
利用本发明制备的核酸的分析可以利用用于核酸分析的通常的方法、例如Real-time PCR、RT-PCR、微阵列、测序、色谱等进行实施,但本发明的核酸的分析方法并不限定于此。
作为本发明的例示的实施方式,在本说明书中进一步公开以下的物质、制造方法、用途、方法等。但是,本发明并不限定于这些实施方式。
〔1〕一种来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法,其包括在0℃以下保存从被检测体采集的含有RNA的皮肤表层脂质的步骤。
〔2〕如〔1〕所述的方法,其中,上述保存的温度优选为-20±20℃~-80±20℃,更优选为-20±10℃~-80±10℃,进一步优选为-20±20℃~-40±20℃,进一步优选为-20±10℃~-40±10℃,进一步优选为-20±10℃,进一步优选为-20±5℃。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的方法,其中,上述保存的时间优选为12个月以下、例如6小时以上12个月以下,更优选为6个月以下,例如1天以上6个月以下、进一步优选为3个月以下,例如3天以上3个月以下。
〔4〕一种来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法,其包括:通过逆转录将被检测体的皮肤表层脂质所含的RNA转变为cDNA,接着对该cDNA实施多重PCR的步骤;和
对该PCR的反应产物进行精制的步骤。
〔5〕如〔4〕所述的方法,其中,上述多重PCR中的退火和延伸反应的温度优选为62℃±1℃,更优选为62℃±0.5℃,进一步优选为62℃±0.25℃。
〔6〕如〔4〕或〔5〕所述的方法,其中,优选上述逆转录中的延伸反应在以下的条件下进行:
以42℃±1℃进行60分钟以上;
以42℃±1℃进行80~100分钟;
以42℃±0.5℃进行60分钟以上;
以42℃±0.5℃进行80~100分钟;
以42℃±0.25℃进行60分钟以上;或
以42℃±0.25℃进行80~100分钟。
〔7〕如〔4〕~〔6〕中任一项所述的方法,其中,优选上述PCR的反应产物的精制为利用粒析的精制。
〔8〕如〔4〕~〔7〕中任一项所述的方法,其中,优选上述被检测体的皮肤表层脂质所含的RNA通过从该被检测体的皮肤表层脂质中分离RNA而制备。
〔9〕如〔4〕~〔8〕中任一项所述的方法,其中,上述被检测体的皮肤表层脂质优选是在0℃以下、更优选在-20±20℃~-80±20℃、更优选在-20±10℃~-80±10℃、进一步优选在-20±20℃~-40±20℃、进一步优选在-20±10℃~-40±10℃、进一步优选在-20±10℃、进一步优选在-20±5℃保存后的皮肤表层脂质。
〔10〕如〔9〕所述的方法,其中,上述被检测体的皮肤表层脂质优选是保存12个月以下、例如保存6小时以上12个月以下、更优选6个月以下、例如1天以上6个月以下、进一步优选3个月以下、例如3天以上3个月以下的皮肤表层脂质。
〔11〕一种被检测体的皮肤、皮肤以外的部位或全身状态的分析方法,其包括对利用〔1〕~〔10〕中任一项所述的方法所制备的核酸进行分析的步骤。
〔12〕如〔11〕所述的分析方法,其中,上述分析
优选为皮肤的疾病或状态的分析;
更优选为患有或未患有发红、敏感性肌肤或特应性皮炎的皮肤的检测;或者
为皮脂量或皮肤水分量多或少的皮肤的检测;或者
为皮肤状态的预测,例如皮肤物性的预测、皮肤的目测或触诊评价的预测或皮脂组成的预测;或者
为皮肤的累积紫外线暴露时间的预测。
〔13〕如〔11〕所述的方法,其中,优选上述分析为患有或未患有特应性皮炎的皮肤的检测,上述核酸为选自表7-1~7-11的(B)、(C)和(D)所记载的基因中的至少1种,更优选为全部;或者
上述分析为患有轻度症状或中度症状的特应性皮炎或未患有特应性皮炎的皮肤的检测,上述核酸为选自表7-1~7-11的(C)和(D)所记载的基因中的至少1种,更优选为全部;或者
上述分析为患有或未患有敏感性肌肤的皮肤的检测,上述核酸为选自表7-1~7-20的(E)所记载的基因中的至少1种,更优选为全部;或者
上述分析为患有或未患有敏感性肌肤的皮肤的检测,上述核酸为选自表7-1~7-10的(F)所记载的基因中的至少1种,更优选为全部;或者
上述分析为患有或未患有发红的皮肤的检测,上述核酸为选自表7-1~7-20的(G)所记载的基因中的至少1种,更优选为全部;或者
上述分析为水分量多或少的皮肤的检测,上述核酸为选自表7-1~7-16的(H)所记载的基因中的至少1种,更优选为全部;或者
上述分析为皮脂量多或少的皮肤的检测,上述核酸为选自表7-1~7-17的(I)所记载的基因中的至少1种,更优选为全部;或者
上述分析为皮肤物性的预测、皮肤的目测或触诊评价的预测、或皮脂组成的预测,上述核酸为选自表8所记载的基因中的至少1种,更优选为全部。
〔14〕一种皮肤外用剂、皮内给药剂、贴剂、口服剂或注射剂对被检测体的效果或效能的评价方法,其包括对利用〔1〕~〔10〕中任一项所述的方法所制备的核酸进行分析的步骤。
〔15〕如〔14〕所述的方法,其中,上述皮肤外用剂、皮内给药剂、贴剂、口服剂或注射剂对被检测体的效果或效能优选为皮肤护理制品对被检测体的皮肤状态的改善效果,上述核酸优选为选自BNIP3、CALML3、GAL、HSPA5、JUNB、KIF13B、KRT14、KRT17、KRT6A、OVOL1、PPIF、PRDM1、RBM3、RPLP1、RPS4X、SEPT9、SOAT1、SPNS2、UBB、VCP、WIPI2和YPEL3中的至少1种,更优选为全部。
〔16〕一种被检测体的血中成分浓度的分析方法,其包括对利用〔1〕~〔10〕中任一项所述的方法所制备的核酸进行分析的步骤。
〔17〕如〔16〕所述的分析方法,其中,优选上述血中成分为激素、胰岛素、中性脂肪、γ-GTP或L-胆固醇。
〔18〕如〔17〕所述的分析方法,其中,上述激素优选为睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、雌酮、雌二醇、孕酮或皮质醇,更优选为睾酮或皮质醇。
〔19〕如〔16〕所述的分析方法,其中,上述血中成分优选为睾酮,上述核酸优选为选自来自包含SCARNA16、PRSS27、RDBP、PSMB10、SBNO1、EMC3、MAR9、C20orf112、C14orf2和CCDC90B的10种基因的10种RNA中的至少1种,更优选为该10种RNA。
〔20〕如〔16〕所述的分析方法,其中,上述血中成分优选为胰岛素,上述核酸优选为选自来自包含EAPP、SDE2、LYAR、ZNF493、PSMB10、FAM71A、GPANK1、FGD4、MRPL43和CMPK1的10种基因的10种RNA中的至少1种,更优选为该10种RNA。
〔21〕如〔16〕所述的分析方法,其中,上述血中成分优选为中性脂肪,上述核酸优选为选自来自包含CCDC9、C6orf106、CERK、HSD3B2、SUN2、FNDC4、GRAMD1C、DGAT2、ALPL、HOMER3、MTHFS、ADIPOR1、RBM3、EXOC8和ARHGEF37的15种基因的15种RNA中的至少1种,更优选为该15种RNA。
〔22〕如〔16〕所述的分析方法,其中,上述血中成分优选为γ-GTP,上述核酸优选为选自来自包含TMEM38A、BTN3A2、NAP1L2、ABCA2、ALPL、SECTM1、C17orf62、GNB2、R3HDM4、LRG1、SBNO2、CD14、MLLT1、NINJ2和LIMD2的15种基因的15种RNA中的至少1种,更优选为该15种RNA。
〔23〕如〔16〕所述的分析方法,其中,上述血中成分优选为LDL-胆固醇,上述核酸优选为选自来自包含THTPA、LOC100506023、ZNF700、TAB3、PLEKHA1、ZNF845、FXC1、CUL4A、NDUFV1和AMZ2的10种基因的10种RNA中的至少1种,更优选为该10种RNA。
〔24〕一种被检测体的血中成分的浓度的分析方法,其包括:
从利用〔1〕~〔10〕中任一项所述的方法制备的被检测体的核酸获取来自与血中成分浓度具有高的相关的基因的RNA的表达量的步骤;和
基于来自与该血中成分浓度具有高的相关的基因的RNA的表达量,利用机器学习模型对该被检测体的血中成分的浓度进行分析的步骤,
该机器学习模型是将从人群得到的来自皮肤表层脂质的RNA所含的来自与该血中成分浓度具有高的相关的基因的RNA的表达量数据作为说明变量,并且将从该人群得到的该血中成分的浓度数据作为目标变量而构建的机器学习模型。
〔25〕如〔24〕所述的方法,其中,优选上述血中成分为激素、胰岛素、中性脂肪、γ-GTP或LDL-胆固醇,
该激素优选为睾酮或皮质醇。
〔26〕如〔25〕所述的方法,其中,上述血中成分优选为睾酮,上述与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自SCARNA16、PRSS27、RDBP、PSMB10、SBNO1、EMC3、MAR9、C20orf112、C14orf2和CCDC90B中的至少1种,更优选为全部;或者
上述血中成分优选为胰岛素,上述与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自EAPP、SDE2、LYAR、ZNF493、PSMB10、FAM71A、GPANK1、FGD4、MRPL43和CMPK1中的至少1种,更优选为全部;或者
上述血中成分优选为中性脂肪,上述与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自CCDC9、C6orf106、CERK、HSD3B2、SUN2、FNDC4、GRAMD1C、DGAT2、ALPL、HOMER3、MTHFS、ADIPOR1、RBM3、EXOC8和ARHGEF37中的至少1种1种,更优选为全部;或者
上述血中成分优选为γ-GTP,上述与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自TMEM38A、BTN3A2、NAP1L2、ABCA2、ALPL、SECTM1、C17orf62、GNB2、R3HDM4、LRG1、SBNO2、CD14、MLLT1、NINJ2和LIMD2中的至少1种,更优选为全部;或者
上述血中成分优选为LDL-胆固醇,上述与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自THTPA、LOC100506023、ZNF700、TAB3、PLEKHA1、ZNF845、FXC1、CUL4A、NDUFV1和AMZ2中的至少1种,更优选为全部。
〔27〕一种数据库,其是用于构建用于分析血中成分的浓度的机器学习模型的数据库,包括:
从人群得到的来自皮肤表层脂质RNA所含的来自与血中成分浓度具有高的相关的基因的RNA的表达量数据;和
从该人群得到的该血中成分的浓度数据,
该血中成分优选为睾酮,该与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自SCARNA16、PRSS27、RDBP、PSMB10、SBNO1、EMC3、MAR9、C20orf112、C14orf2和CCDC90B中的至少1种,更优选为全部;或者
该血中成分优选为胰岛素,该与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自EAPP、SDE2、LYAR、ZNF493、PSMB10、FAM71A、GPANK1、FGD4、MRPL43和CMPK1中的至少1种,更优选为全部;或者
该血中成分优选为中性脂肪,该与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自CCDC9、C6orf106、CERK、HSD3B2、SUN2、FNDC4、GRAMD1C、DGAT2、ALPL、HOMER3、MTHFS、ADIPOR1、RBM3、EXOC8和ARHGEF37中的至少1种1种,更优选为全部;或者
该血中成分优选为γ-GTP,该与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自TMEM38A、BTN3A2、NAP1L2、ABCA2、ALPL、SECTM1、C17orf62、GNB2、R3HDM4、LRG1、SBNO2、CD14、MLLT1、NINJ2和LIMD2中的至少1种,更优选为全部;或者
该血中成分优选为LDL-胆固醇,该与血中成分浓度具有高的相关的基因优选为选自THTPA、LOC100506023、ZNF700、TAB3、PLEKHA1、ZNF845、FXC1、CUL4A、NDUFV1和AMZ2中的至少1种,更优选为全部。
〔28〕一种用于进行〔24〕~〔26〕中任一项所述的分析方法的程序。
〔29〕一种用于进行〔24〕~〔26〕中任一项所述的分析方法的装置。
实施例
以下,基于实施例对本发明进行更详细地说明,但本发明并不限定于此。
试验例1保存温度对SSL中的RNA的稳定性的影响
1)SSL中的RNA的稳定性
利用吸油膜(5×8cm、聚丙烯制、3M公司)从健康人的整个面部回收皮脂。将该吸油膜移至玻璃瓶中,以4℃放置数小时后,对该膜所含的SSL中RNA进行精制。在RNA精制中,将该吸油膜切成适当的大小,使用QIAzol(注册商标)裂解试剂(Lysis Reagent)(Qiagen),按照附带的操作规程提取RNA。基于所提取的RNA,使用SuperScript(注册商标)VILO cDNA合成试剂盒(Synthesis kit)(Life Technologies Japan株式会社),以42℃进行30分钟逆转录,进行cDNA的合成。逆转录反应的引物使用试剂盒所附带的随机引物。利用多重PCR,由所得到的cDNA制作包含来自20802种基因的DNA的文库。使用Ion AmpliSeq转录组人基因表达试剂盒(Life Technologies Japan株式会社),在[99℃、2分钟→(99℃、15秒→60℃、16分钟)×20次循环→4℃、Hold]的条件下进行多重PCR。利用TapeStation(AgilentTechnologies株式会社)和高灵敏度(High Sensitivity)D1000 ScreenTape(AgilentTechnologies株式会社),测定所制作的文库,但没有检测出来自文库的峰。考虑无法检测出峰的原因在于:被检验者的皮脂的回收量少,并且在回收后精制前以4℃放置,从而被分解,精制得到的RNA量少。
2)保存温度的影响
为了研究保存温度对SSL中人RNA的影响,向1)中采集皮脂后的吸油膜进一步涂布来自人表皮细胞的RNA溶液40ng作为RNA后,以(i)室温(RT)、(ii)4℃、(iii)-20℃或(iv)-80℃保存4天。其中,作为来自表皮细胞的RNA溶液,使用将从冻结NHEK(NB)(Kurabo公司)提取的RNA溶解在50%(v/v)乙醇溶液而得到的溶液。将保存后的吸油膜切成适当的大小,使用QIAzol(注册商标)裂解试剂(Lysis Reagent)(Qiagen),按照附带的操作规程提取RNA。利用TapeStation(Agilent Technologies株式会社)和High Sensitivity RNAScreen Tape(Agilent Technologies株式会社),测定所提取的RNA。
将测定的结果示于图1。在以RT或4℃保存的SSL中RNA中,来自人的RNA(28S和18S核糖体RNA)的峰显著下降,其它的RNA的峰也几乎未检出。另一方面,显示了在以-20℃或-80℃保存的SSL中RNA中,检测出28S和18S核糖体RNA的峰,RNA稳定地被保存。另外,与-80℃保存相比,以-20℃保存时,28S和18S核糖体RNA的峰面积变得更大,因此推定SSL中RNA的保存温度与目前一般的RNA的保存温度的-80℃相比,-20℃更适合。
试验例2利用多重PCR的来自SSL的RNA的核酸制备
1)逆转录反应条件的最佳化
利用吸油膜(3M公司)从皮脂量少的健康人的整个面部回收皮脂,按照与试验例1相同的步骤从该吸油膜提取RNA。对所提取的RNA实施逆转录,合成cDNA。使用SuperScript(注册商标)VILO cDNA 合成试剂盒(Synthesis kit)(Thermo Scientific公司),实施逆转录反应。逆转录反应的引物使用试剂盒所附带的随机引物。逆转录的延伸温度和时间的条件为(i)40℃、60分钟、(ii)40℃、90分钟、(iii)42℃、60分钟或(iv)42℃、90分钟(温度精度±0.25℃)。使用所得到的cDNA,在与试验例1相同的条件下进行多重PCR。利用Ampure XP(Beckman Coulter株式会社)对所得到的PCR产物进行精制。利用TapeStation(AgilentTechnologies株式会社)和High Sensitivity D1000 ScreenTape(Agilent Technologies株式会社)对所得到的精制物的溶液中的PCR产物的浓度进行定量。将结果示于表1。以42℃进行90分钟逆转录时,得到最多的PCR产物。
[表1]
2)PCR条件的最佳化
利用吸油膜(3M公司)从皮脂量少的健康人的整个面部回收皮脂,按照与试验例1相同的步骤从该吸油膜提取RNA。使用所提取的RNA,按照与1)相同的步骤,但改变PCR中的退火和延伸的温度,进行cDNA合成和多重PCR。逆转录的条件为42℃、90分钟。退火和延伸的温度为(i)60℃、(ii)62℃、(iii)63℃、(iv)64℃(温度精度±0.25℃)。对于所得到的PCR产物,利用Ampure XP(Beckman Coulter株式会社)进行精制,利用TapeStation(AgilentTechnologies株式会社)和High Sensitivity D1000 ScreenTape(Agilent Technologies株式会社)进行定量。将结果示于表2。退火和延伸的温度为62℃时,得到最多的PCR产物。
[表2]
3)PCR产物的精制
利用吸油膜(3M公司)从皮脂量少的健康人的整个面部回收皮脂,按照与试验例1相同的步骤从该吸油膜提取RNA。使用所提取的RNA,按照与1)相同的步骤进行cDNA合成和多重PCR。逆转录的条件为42℃、30分钟。退火和延伸的温度为60℃(温度精度±0.25℃)。将所得到的PCR产物分为2份,一份利用Ampure XP(Beckman Coulter株式会社)进行精制,另一份没有进行精制。将各样品溶液、SuperScript(注册商标)VILO cDNA 合成试剂盒(Synthesis kit)所附带的5×VILO RT Reaction Mix、Ion AmpliSeq转录组人基因表达试剂盒(Life Technologies Japan株式会社)所附带的5×Ion Ampliseq HiFi Mix和IonAmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Core Panel混合,再构成缓冲液组成,按照各试剂盒所附带的操作规程,进行引物序列的消化、接头连接和精制、扩增,制作文库。利用TapeStation(Agilent Technologies株式会社)和High Sensitivity D1000ScreenTape(Agilent Technologies株式会社)对所得到的文库的浓度进行定量。将结果示于表3。在没有进行精制的样品中,没有检测出文库。
[表3]
根据上述1)和2)的结果,在由SSL中RNA制备核酸样品时,逆转录反应的最佳条件约为42℃、90分钟,多重PCR的退火和延伸温度的最佳条件约为62℃。可以认为通过在这些条件下实施多重RT-PCR,能够增加来自SSL中RNA的核酸样品的收量。另外,根据3)的结果,显示了通过在PCR后追加精制工序,能够增加核酸样品的收量,由RNA量少的SSL也能够制备核酸样品。另外,如试验例1所示,可以认为通过将从被检测体采集的SSL中RNA以-20℃进行保存至用于核酸样品制备,能够抑制RNA的变性,进一步增加核酸样品的收量。
其中,上述的逆转录反应时所使用的逆转录酶为SuperScript(注册商标)IIIReverse Transcriptase,引物为随机引物(Random Primers);实施PCR时所使用的酶为AmpliSeq HiFi Mix Plus,引物为AmpliSeq Transcriptome Panel Human GeneExpression CORE。
试验例3使用来自SSL的RNA的特应性皮炎的检测
SSL采集
将20名健康人(20~39岁男性、BMI 18.5以上且小于25.0)和11名特应性皮炎患者(AD)(20~39岁男性、BMI 18.5以上且小于25.0)作为被检验者。健康人预先由皮肤科医生确认了皮肤没有异常,AD预先由皮肤科医生接受了特应性皮炎的诊断。对整个面部进行照片摄影后,利用吸油膜(3M公司)从各被检验者的整个面部回收皮脂。将该吸油膜移至玻璃瓶中,以-80℃保存约1个月,直至用于RNA提取。另外,在包括本试验例的以下的试验例中,从被检测体采集的SSL以作为一般的保存条件的-80℃进行保存,直至用于RNA提取,但如试验例1所示,如果在能够更稳定保存的条件(-20℃)下保存SSL中RNA,则能够更稳定地得到RNA表达分析数据,因此认为可以得到同等以上的分析结果。
RNA的制备和序列分析
按照与试验例1相同的步骤从所保存的吸油膜提取RNA。对所提取的RNA在42℃、90分钟的条件下进行逆转录,多重PCR以62℃的退火和延伸温度实施。对于所得到的PCR产物,利用Ampure XP(Beckman Coulter株式会社)进行精制后,按照与试验例2、3)相同的步骤,进行缓冲液的再构成、引物配列的消化、接头连接和精制、扩增,制作文库。将所制作的文库输入Ion 540Chip中,利用Ion S5/XL系统(Life Technologies Japan株式会社)进行测序。
RNA表达分析
对于通过测序确认了表达的来自SSL的RNA种类,在健康人和AD中对其表达量进行比较。在比较对象的RNA种类中,使用19种免疫应答相关RNA和17种角质化相关RNA。关于这些RNA种类,在文献(J Allergy Clin Immunol,2011,127:954-964)中报告了在AD的皮肤组织的罹患部位与非罹患部位之间相对于健康人的表达量的比率不同。
将结果示于图2。图中的数值表示关于各RNA的本试验例所测得的AD相对于健康人的表达量的比率以及上述文献所测得的AD的罹患部位、非罹患部位相对于健康人的表达量的比率。在图中,在AD中表达上升的RNA以淡的灰色表示,相反地减少的RNA以浓的灰色表示。关于显著差检验,进行学生t检验(Student’s t-test)。来自SSL的RNA中的免疫应答相关RNA大多数与上述文献的报告同样,与健康人相比,在AD中表达量上升。另一方面,来自SSL的RNA中的角质化相关RNA大多数与上述文献的报告同样,与健康人相比,在AD中表达量减少。根据本结果,显示了来自SSL的RNA中含有反映炎症状态的增强或屏障功能的减少等的特应性皮炎相关标记,并且基于来自SSL的RNA中的标记的表达能够判定特应性皮炎患者。
试验例4使用来自SSL的RNA的血中成分浓度的预测
被检验者
将预先由皮肤科医生确认了皮肤没有异常的38名健康男性(20~59岁、BMI 18.5以上且小于25.0)作为被检验者。
血液采集和血中成分的浓度定量
使用真空采血管,从各被检验者的胳膊采集血液3mL,分离血清并以-80℃保存。利用所保存的血清,使用睾酮ELISA试剂盒(Testosterone ELISA Kit)(Cyman公司),按照附带的操作规程对血清睾酮浓度进行定量。对于血清中的胰岛素、中性脂质、γ-GTP和LDL-胆固醇的浓度,委托外部检査机构(株式会社LSI Medience)进行定量。
来自SSL的RNA的制备和序列分析
对整个面部进行照片摄影后,利用吸油膜(3M公司)从各被检验者的整个面部回收皮脂。将该吸油膜移至玻璃瓶中,以-80℃保存约1个月。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中的RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定它们的表达量。
使用来自SSL的RNA的血中睾酮浓度的预测
将上述所测得的来自被检验者的来自SSL的RNA的表达量数据(reads permillion mapped reads:RPM值)随机分成33人和5人。利用关于该33人的来自SSL的RNA表达量(RPM值)和血清睾酮浓度,构建利用机器学习的血清睾酮浓度的预测模型。首先,以RPM值为基础,选取与血清睾酮浓度的相关性最高的10种RNA(来自SCARNA16、PRSS27、RDBP、PSMB10、SBNO1、EMC3、MAR9、C20orf112、C14orf2和CCDC90B的RNA)。
作为学习数据,将该33人的关于前述所选取的10种RNA的来自SSL的RNA的表达量(RPM值)用作说明变量,将该33人的血清睾酮浓度用作目标变量,利用Visual MiningStudio软件(株式会社NTT数理系统),实施最佳的预测模型的构建、选取。
利用所选取的预测模型,根据剩余5人的来自SSL的RNA表达量算出血中睾酮浓度的预测值。其结果如图3所示,所算出的预测值与血清睾酮浓度的实测值具有高的相关性(相关系数=0.93)。由此明确了来自SSL的RNA具有对于预测血中睾酮浓度的重要的信息。
使用来自SSL的RNA的血中胰岛素、中性脂质、γ-GTP和LDL-胆固醇浓度的预测
将上述所测得的来自被检验者的来自SSL的RNA的表达量数据(RPM值)随机分成31人和7人。利用关于该31人的来自SSL的RNA表达量(RPM值)和血清中的胰岛素、中性脂质、γ-GTP和LDL-胆固醇浓度,分别构建利用机器学习的血清中的胰岛素、中性脂肪、γ-GTP和LDL-胆固醇浓度的预测模型。首先,以RPM值为基础,作为与1)胰岛素、2)中性脂肪、3)γ-GTP、4)LDL-胆固醇各自的血清中浓度的相关性最高的RNA,选取来自以下所示的分子的RNA。
1)胰岛素:EAPP、SDE2、LYAR、ZNF493、PSMB10、FAM71A、GPANK1、FGD4、MRPL43和CMPK1;
2)中性脂肪:CCDC9、C6orf106、CERK、HSD3B2、SUN2、FNDC4、GRAMD1C、DGAT2、ALPL、HOMER3、MTHFS、ADIPOR1、RBM3、EXOC8和ARHGEF37;
3)γ-GTP:TMEM38A、BTN3A2、NAP1L2、ABCA2、ALPL、SECTM1、C17orf62、GNB2、R3HDM4、LRG1、SBNO2、CD14、MLLT1、NINJ2和LIMD2;
4)LDL-胆固醇:THTPA、LOC100506023、ZNF700、TAB3、PLEKHA1、ZNF845、FXC1、CUL4A、NDUFV1和AMZ2。
作为学习数据,将该31人的关于前述所选取的RNA各自的来自SSL的RNA的表达量(RPM值)用作说明变量,将该31人的血中的胰岛素、中性脂肪、γ-GTP或LDL-胆固醇浓度用作目标变量,利用Visual Mining Studio软件(株式会社NTT数理系统),实施最佳的预测模型的构建、选取。
利用所选取的预测模型,根据剩余7人的SSL来自RNA表达量,分别算出血中的胰岛素、中性脂肪、γ-GTP和LDL-胆固醇浓度预测值。其结果如图4所示,所算出的预测值与血清中的胰岛素、中性脂肪、γ-GTP和LDL-胆固醇浓度各自的实测值具有正的相关性。由此明确了来自SSL的RNA在预测血中的胰岛素、中性脂肪、γ-GTP和LDL-胆固醇浓度方面是有用的指标。
试验例5皮肤外用剂(洗面奶)的评价
(1)洗面奶对皮肤的效果预测所使用的RNA种类的鉴定
被检验者和SSL采集
将9名健康男性(20~39岁)作为被检验者。作为被检验品,使用具有使角栓分解并脱落的效果的洗面奶(Biore家庭装de Aesthe、花王株式会社)。对于被检验者,使用适量(约1g)的被检验品,以1日2次(早、晚)在1周内对整个面部进行清洗。在被检验品洗面奶的使用开始前(0天)和使用开始2天后,利用吸油膜(3M公司)从被检验者的整个面部采集SSL。
来自SSL的RNA的制备和序列分析
将上述含有所采集的SSL的吸油膜移至玻璃瓶中,以-80℃保存约1个月。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
数据分析
以上述所测得的清洗剂使用开始前和使用开始2天后的来自SSL的RNA表达量(RPM值)为基础,鉴定了来自BNIP3、CALML3、GAL、HSPA5、JUNB、KIF13B、KRT14、KRT17、KRT6A、OVOL1、PPIF、PRDM1、RBM3、RPLP1、RPS4X、SEPT9、SOAT1、SPNS2、UBB、VCP、WIPI2和YPEL3这22种分子的RNA,这些RNA与0天相比,在使用开始2天后,利用学生t检验得到的p值为0.05以下,并且RPM值上升至2倍以上(表4)。在这些分子中包含BNIP3、OVOL1、KRT14、KRT17这样的与皮肤的终末角质化相关的分子、JUNB、PRDM1等这样的与抗炎症作用相关的分子。这些分子因使用本清洗剂而表达量上升,因此教导了作为表示皮肤状态改善的标记的可能性。
[表4]
表达因清洗剂的使用而上升的RNA组
(2)洗面奶的效果预测
被检验者以及皮肤状态数据和SSL采集
将18名健康男性(20~48岁)作为被检验者。作为被检验品,使用具有使角栓分解并脱落的效果的洗面奶(Biore家庭装de Aesthe、花王株式会社)。与上述“(1)洗面奶对皮肤的效果预测所使用的RNA种的鉴定”同样地对于被检验者,使用适量(约1g)的被检验品,以1日2次(早、晚)在1周内对整个面部进行清洗。在被检验品洗面奶的使用开始前(0日)和使用开始1周后,如下所述,对被检验者实施SSL的采集和皮肤状态的测定。
i)利用吸油膜(3M公司)从整个面部采集SSL。
ii)实施面部清洗后,在恒温室(20±5℃、40%RH)中实施15分钟的适应环境。
iii)拍摄面颊部的放大图像后,利用皮肤水分测试仪(Corneometer)(MPA580、Courage+Khazaka公司、德国),计测左侧面颊部1个部位的角质层水分量。
iv)实施关于肌肤状态的问卷。
来自SSL的RNA的制备和序列分析
将上述含有所采集的SSL的吸油膜移至玻璃瓶中,以-80℃保存约1个月。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
数据分析
使用关于上述“(1)洗面奶对皮肤的效果预测所使用的RNA种的鉴定”中所选取的22种RNA组的0日的RPM值(表4),利用Gene Spring(TOMY DIGITAL BIOLOGY)软件的自组织映射(Self-Organizing Map)分为该22种RNA的表达整体具有高的倾向的组(高值组)和具有低的倾向的组(低值组)这2个组(图5)。
作为使具有使表达因疾病等而下降了的RNA组的表达上升的效果的药剂等起作用的疾病改善方法,Francesco Iorio等报告了“Signature reversion”(Drug DiscovToday,2013,18(7-8):350-357)。如果基于该方法,则能够预测:由于本被检验品的使用,该低值组与高值组相比,该22种RNA组更加显著地上升,皮肤状态改善。实际上,对被检验品使用1周后的角质层水分量的变化量(使用1周后的值-0天的值)进行了比较,将所得到的结果示于图6。关于角质层水分量,与本试验的使用开始0天的试验日相比,在使用开始1周后,由于试验日的气温大大降低的影响,角质层水分量的变化量成为负值,观察到了角质层水分量减少的倾向。然而,与高值组的角质层水分量的减少幅度相比,低值组其减少幅度小,显示了水分量的减少被抑制的倾向。另外,在关于使用实感的问卷调査中也观察到:低值组与高值组相比,确实感受到肌肤的保湿状态改善了的人的比例更多(图7)。
根据这些结果,教导了通过使用来自SSL的RNA分析技术能够在商品的使用开始前预测皮肤外用剂的效果。例如,对在容易享受某种皮肤外用剂的效果的人中特征表达或不表达的来自SSL的RNA(例如本实施例中选出的22种RNA)进行预鉴定,接着研究被检验者的来自该SSL的RNA的表达量,从而能够预测该被检验者在使用该皮肤外用剂时是否可以获得效果。
试验例6使用来自SSL的RNA的新型特应性皮炎标记分子的检测
被检验者
将55名健康人(20~49岁男性、BMI 18.5以上且小于25.0)和15名轻度症状特应性皮炎患者(20~39岁男性、BMI 18.5以上且小于25.0)、25名中度症状特应性皮炎患者(20~39岁男性、BMI 18.5以上且小于25.0)作为被检验者。健康人预先由皮肤科医生确认了皮肤没有异常,特应性皮炎患者预先由皮肤科医生接受了特应性皮炎的诊断。
来自SSL的RNA的制备和序列分析
利用吸油膜(3M公司)从各被检验者的整个面部回收皮脂。将该吸油膜移至玻璃瓶中,以-80℃保存约1个月,直至用于RNA提取。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中的RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
数据分析
基于来自SSL的RNA信息(RPM值),将转换成以2为底的对数值的RPM值供于数据分析。提取如下的1911个基因组:与健康人相比,在特应性皮炎患者中,转换成以2为底的对数值的RPM值下降2倍以上,并且利用学生t检验得到的p值为0.05以下(表7-1~7-24的(A))。接着,使用将RPM值转换成以2为底的对数值的值,将错误发现率(false discoveryrate(FDR))的水准设为5%,按照现有文献(Nature Protoc,2009,4:44-57;Nucleic AcidsRes,2009,37:1-13),进行利用基因本体(GO)富集分析的生物过程(BP)的探索。作为其结果,在特应性皮炎患者中得到了与表达下降的基因组相关的19个BP,其中,GO:0050911(关于嗅觉的化学刺激的检测(detection of chemical stimulus involved in sensoryperception of smell))显示相关性最强(表5)。构成GO:0050911的RNA中含有约400种olfactory receptor(OR),与健康人相比,在特应性皮炎患者中,370种OR的表达在统计学上显著减少,它们的表达下降有助于GO的显著性。由此教导了来自SSL的RNA信息中所含的这370种OR的表达量成为区分健康人与特应性皮炎患者的有用的标记的可能性。另外,关于OR的RNA表达,对健康人与轻度症状特应性皮炎患者以及轻度症状特应性皮炎患者与中度症状特应性皮炎患者分别进行了比较,作为结果,368种OR在轻度症状特应性皮炎患者中相对于健康人下降,另外,284种OR在中度症状特应性皮炎患者中相对于轻度症状特应性皮炎患者下降(表7-1~7-11的(B)~(D))。根据这些结果,明确了SSL中的表7-1~7-11的(B)~(D)所示的OR的表达量随着特应性皮炎的症状恶化而下降,教导了通过将这些OR的表达量作为指标而能够掌握特应性皮炎的重症度的可能性。
[表5]
(健康人与特应性皮炎患者之间不同的生物过程)
试验例7使用来自SSL的RNA的新型敏感性肌肤标记分子的检测
被检验者
将预先由皮肤科医生确认了皮肤没有异常的42名健康女性(20~59岁、BMI 18.5以上且小于25.0)作为被检验者的候补者。对于这些候补者,实施关于有无敏感性肌肤的自我感受(自觉)的问卷(从“在意”、“不太在意”、“不在意”、“完全不在意”这4个中选择1个),将选择“不在意”或“完全不在意”的10人分在没有敏感性肌肤的自觉症状的组,将选择“在意”的13人分在有敏感性肌肤的自觉症状的组,作为被检验者。
来自SSL的RNA的制备和序列分析
利用吸油膜(3M公司)从各被检验者的整个面部回收皮脂。将该吸油膜移至玻璃瓶中,由-80℃保存约1个月,直至用于RNA提取。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中的RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
数据分析
基于来自SSL的RNA信息(RPM值),将转换成以2为底的对数值的RPM值(Log2RPM值)供于数据分析。提取如下的693个基因组:与没有敏感性肌肤的自觉症状的组相比,在有敏感性肌肤的自觉症状的组中,Log2RPM值下降2倍以上,并且利用学生t检验得到的p值为0.05以下(表7-1~7-20的(E))的基因组。接着,使用Log2RPM值,将FDR的水准设为5%,按照上述现有文献进行利用基因本体富集分析的BP的探索。作为其结果,在有敏感性肌肤的自觉症状的组中得到了与表达下降了的基因组相关的4个BP,GO:0050911显示相关性最强(表6)。在GO:0050911所含的约400种OR中,与没有敏感性肌肤的自觉症状的人相比,有敏感性肌肤的自觉症状的人的344种(表7-1~7-10的(F))OR的表达在统计学上显著减少,它们的表达下降有助于GO的显著性。由此教导了来自SSL的RNA信息中所含的这些OR的表达量成为检测敏感性肌肤的自觉症状的有用的标记的可能性。
[表6]
(有敏感性肌肤的自觉症状的人与没有敏感性肌肤的自觉症状的人之间不同的生物过程)
试验例8使用来自SSL RNA的皮脂分泌、水分量、发红相关标记分子的检测
被检验者
将预先由皮肤科医生确认了皮肤没有异常的38名健康男性(20~59岁、BMI 18.5以上且小于25.0)作为被检验者。
皮肤物性的测定
对整个面部进行照片拍摄后,利用Sebumeter(MPA580、Courage+Khazaka公司、德国)测定各被检验者的前额清洗前的日常皮脂量(casual sebum amount)。之后,实施面部清洗,在环境可变室中实施15分钟适应环境(温度20℃(±2℃)、湿度50%(±5%))。适应环境结束后,利用Corneometer(MPA580、Courage+Khazaka公司、德国)测定面颊部的水分量。
来自SSL的RNA的制备和序列分析
在上述的皮肤物性测定的日常皮脂量测定后,利用吸油膜(3M公司)从各被检验者的整个面部回收皮脂。将该吸油膜移至玻璃瓶中,以-80℃保存约1个月。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中的RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
数据分析
1)皮脂分泌相关分子
将利用Sebumeter测得的前额的日常皮脂量的值小于100的人作为低值组,将150以上的人作为高值组,实施分组。按照与试验例7相同的步骤实施低值组与高值组这2组间的来自SSL的RNA的表达量(RPM值)的比较后,显示594种RNA在统计学上发生了显著的表达变动(表7-1~7-17的(I))。其中,如图8所示,明确了皮脂分泌高值组与低值组相比,Basigin(BSG)的表达量在统计学上显著(学生t检验、p<0.05)上升。报告了在BSG基因敲除小鼠中,在生物学、结构学上与皮脂腺类似的睑板腺中,显示脂质的蓄积减少并萎缩的表达型(Cell Death and Disease,2015,6:e1726)。进而明确了皮脂分泌高值组与低值组相比,羟基羧酸受体2(Hydroxycarboxylic ashid reseptor 2(HCAR2))的表达量在统计学上显著减少。还报告了HCAR2具有在巨噬细胞中抑制脂质蓄积的效果(J Lipid Res,2014,2501-2508)。根据这些见解,教导了SSL中所含的RNA是反映皮脂的分泌量的有用的指标。
2)水分量相关分子
基于Corneometer的测定结果,选取角质层水分量高的上位15名(高值组)和低的下位15名(低值组)。按照与试验例7相同的步骤在这些高值组与低值组这2组间实施来自SSL的RNA的表达量(RPM值)的比较后,显示了553种RNA在统计学上发生显著的表达变动(表7-1~7-16的(H))。报告了天然保湿因子在能够保持皮肤的保湿力方面发挥重要的作用(Dermatol Ther,17Suppl,2004,1:43-48)。对与天然保湿因子的生成相关的因子的表达进行验证后,如图9所示,明确了与高值组相比,在低值组中,逆转录病毒样天冬氨酸肽酶1(Aspartic peptidase retroviral like 1)(ASPRV1)、肽基精氨酸脱亚氨酶3(Peptidylarginine deiminase 3)(PADI3)等的表达量在统计学上显著(学生t检验、p<0.05)减少。报告了在缺失ASPRV1的小鼠中,角质层水分量实际上减少(EMBO Mol Med,2011,3:320-333)。另一方面,报告了PADI3在天然保湿因子的生成中发挥了重要的作用(J InvestDermatol,2005,124:384-393)。根据这些见解,教导了SSL中所含的RNA是反映皮肤的水分量的有用的指标。
3)发红相关分子
基于对面部图像进行目测评价而得到的结果,选取肌肤发红强的人8人(高值组)和弱的人6人(低值组)。按照与试验例7相同的步骤在这些高值组与低值组这2组间实施来自SSL的RNA的表达量(RPM值)的比较后,显示了703种RNA在统计学上发生显著表达变动(表7-1~7-20的(G))。其中,如图10所示,明确了发红高值组与低值组相比,细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine shignaling 3)(SOCS3)和JunB原癌基因(JunBproto-oncogene)(JUNB)的表达量在统计学上显著(学生t检验、p<0.05)减少。报告了在JUNB和SOCS3的基因敲除小鼠中,皮肤发炎(Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:20423-20428、PLoS One,2012,7:e40343)。另外,虽然在统计学上显著性差异没有被确认,但明确了在发红高值组中,与低值组相比,已知在皮肤中引发炎症的IL-1B有上升倾向。根据这些见解,教导了SSL中所含的RNA是反映皮肤发红的有用的指标。
[表7-1]
[表7-2]
[表7-3]
[表7-4]
[表7-5]
[表7-6]
[表7-7]
[表7-8]
[表7-9]
[表7-10]
[表7-11]
[表7-12]
[表7-13]
[表7-14]
[表7-15]
[表7-16]
[表7-17]
[表7-18]
[表7-19]
[表7-20]
[表7-21]
[表7-22]
[表7-23]
[表7-24]
试验例9使用来自SSL的RNA的皮肤状态的预测
被检验者
将面部、手指、上臂的皮肤没有问题的39名健康女性(30多岁)作为被检验者。
皮脂的采集
利用吸油膜(5cm×8cm、3M公司)从洗脸前的各被检验者的整个面部采集皮脂,作为来自SSL的RNA分析用的样品,以-80℃保存约1个月。
皮肤的目测评价和触诊评价
采集皮脂后,被检验者使用市售的洗面奶清洗面部,在环境可变室(温度20℃±1℃、湿度40%±5%)中适应环境10分钟。在该适应环境期间,对被检验者的面部皮肤的状态进行目测评价和触诊评价。
·目测评价项目:“清洁度”、“透明感”、“明亮度”、“发黄”、“全身发红”、“色斑”、“鳞屑”、“光泽”、“面颊皱纹”、“黑眼圈”、“嘴角下垂”、“痤疮”、“毛孔粗大(面颊)”、“毛孔粗大(鼻)”。
·触诊评价:“粗糙感”、“湿润感”。
对于各评价项目,基于评价基准(3:有很多;2:有;1:有一些;0:无),3名专业评价者进行评分,将3名评价者的平均值作为评价值。
皮肤物性的测定
对于适应环境结束后的被检验者,利用Corneometer(MPA580、Courage+Khazaka公司、德国)和Skicon(株式会社YAYOI)测定角质层水分量,利用Tewameter(MPA580、Courage+Khazaka公司、德国)测定经皮水分蒸散量(TEWL),利用Sebumeter(MPA580、Courage+Khazaka公司、德国)测定皮脂量,利用CM26000d(KONICA MINOLTA JAPAN)测定黑素量和红斑量。其中,除了在前额部测定皮脂量以外,其它全部在面颊部进行测定。
皮脂组成分析
对于从洗脸经过1小时以上后的被检验者,以仰卧位将利用氯仿/甲醇=1/1进行脱脂处理后的2张卷烟纸(cigarette paper)(1.7cm×1.7cm、RIZLA公司:RIZLA BlueDouble)不重叠地搁置在前额的正中附近并轻轻按压10秒,采集皮脂。将采集皮脂后的卷烟纸装入螺旋管内,即时添加甲醇,以-80℃冷冻保管至分析时。
在氮气流下从该螺旋管中蒸馏除去溶剂,接着,向该螺旋管内添加1mL氯仿/甲醇=1/1。确认卷烟纸在该螺旋管内的溶剂中充分浸润后,通过5分钟的超声波处理进行脂质提取,得到皮脂溶液。在微量瓶内使100μmol/L的Direct-MS/MS测定用的脂质内部标准混合溶液20μL干固,向其中添加按照上述步骤制备的皮脂溶液100μL,进行溶解和混合,从而制备加入内部标准的皮脂试样溶液。由所制备的试样溶液,对于每名被检验者,利用Direct-MS/MS测定游离脂肪酸(FFA)、蜡酯(WE)、胆固醇酯(ChE)、角鲨烯(SQ)、角鲨烯环氧化物(SQepo)、氧化角鲨烯(SQOOH)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)的量,基于内部标准算出绝对量。
<Direct-MS/MS测定条件>
按照文献(专利6482215号)所记载的方法,以下述的条件进行测定。
装置:LC/Agilent 1200系列、质谱仪/6460三重四级杆(Agilent公司制造)
移动相:含有15mmol/L乙酸铵的氯仿/甲醇=1/1
流速:0.2mL/min
注入量:1μL
检测条件:离子化方法=ESI、干燥气体温度=300℃、干燥气体流量=5L/min、雾化器压力=45psi、鞘气温度=250℃、鞘气流量=11L/min、雾化器电压=0V、毛细管电压=3500V
(质量分析装置的检测模式)
FFA:扫描(Scan)(负模式(Negative mode))
WE:利用来自构成脂肪酸的子离子(product ion)检测分子的母离子扫描(Precursor Ion Scan)
ChE:利用来自胆固醇骨架的子离子检测分子的母离子扫描(Precursor IonScan)
SQ、SQepo、SQOOH:MRM
DAG:利用脱掉的羟基检测分子的中性丢失扫描(Neutral Loss Scan)
TAG:利用作为中性分子脱掉的脂肪酸检测分子的中性丢失扫描(Neutral LossScan)
来自SSL的RNA的制备和序列分析
按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
机器学习模型的构建
·使用数据
在上述所测得的来自被检验者的来自SSL的RNA的表达量的数据(Lead Count值)中,对于Lead Count小于10的数据,作为缺失值进行处理,转换成对样品间的总Lead数的差异进行修正后的RPM值后,对于缺失值,通过奇异值分解(SVD)填补(Singular ValueDecomposition(SVD)imputation)进行填补。其中,只将全部被检验者的80%以上且得到了不是缺失值的表达量数据的基因用于以下的分析。在机器学习模型的构建中,为了将遵循负的二项分布的RPM值近似为标准分布,使用转换成以2为底的对数值的RPM值(Log2RPM值)。另外,各预测对象项目(来自上述的皮肤的目测和触诊评价、皮肤物性测定、皮脂组成分析的数据、表8)的评价值、测定值转换成各对象数据组内的偏差值,将其值作为目标值。
·数据组分割
在从被检验者得到的RNA谱数据组中,将相当于80%的31人的RNA谱数据作为肌肤状态预测模型的训练数据,将剩余的相当于20%的8人的RNA谱数据作为用于模型精度评价的试验数据。在训练数据和试验数据的分割中,对年龄分布变得均匀的分割方法(分割1)和预测对象项目的目标值变得均匀的分割方法(分割2)进行了研究。
·特征量基因的选择
在训练数据中,算出预测对象项目的目标值与Log2RPM值的斯皮尔曼相关系数(rho)的绝对值,选择表8所示的前10种基因(或5种基因)作为各预测对象项目的特征量基因。
·模型构建
使用统计分析环境R的caret包进行模型构建。
··将训练数据的来自SSL的RNA的表达量的数据(Log2RPM值)用作说明变量,将预测对象项目各自的目标值用作目标变量,实施预测模型的构建。
··对于每个预测对象项目,使用线性回归模型(Linear model)、Lasso回归、随机森林(Random Forest)、神经网络(Neural net)、线性核的支持向量机(SVM(linear))、rbf核的支持向量机(SVM(rbf))这6种算法,进行10倍交叉验证,使预测模型学习。
··对于各算法,向学习后的模型输入试验数据的来自SSL的RNA的表达量(Log2RPM值),计算各预测项目的目标预测值。
··对于每个预测项目,计算预测值与实测值的差的均方根误差(RMSE),选取其值最小的模型作为最佳预测模型。
[表8]
(结果)
表9表示对各预测对象项目提供最小的RMSE的数据分割方法、使用算法、RMSE。另外,将对最佳预测模型的目标值的预测值和实测值进行绘图而得到的散点图示于图11。另外,图中的R表示预测值与实测值的皮尔逊相关分析的相关系数。在全部预测对象项目中,得到了正的相关系数,显示了使用来自SSL的RNA的表达量的数据,能够预测皮肤状态。
[表9]
预测对象项目 | 数据组分割方法 | 最佳算法 | RMSE |
角质层水分量(Corneo) | 分割1 | Lasso | 7.14 |
角质层水分量(Skicon) | 分割1 | Lasso | 7.89 |
TEWL | 分割1 | SVM(rbf) | 11.05 |
皮脂量 | 分割1 | Randon forest | 11.88 |
黑素量 | 分割1 | SVM(rbf) | 7.76 |
纤斑量 | 分割1 | SVM(rbf) | 6.60 |
清洁度 | 分割2 | Randon forest | 10.67 |
透明感 | 分割2 | SVM(rbf) | 9.94 |
明亮度 | 分割1 | SVM(linear) | 8.63 |
光泽 | 分割1 | Randon forest | 9.64 |
色斑 | 分割2 | SVM(rbf) | 12.66 |
黑眼圈 | 分割1 | Lasso | 5.76 |
发黄 | 分割1 | Randon forest | 5.60 |
全身发纤 | 分割1 | SVM(rbf) | 6.22 |
面颊皱纹 | 分割1 | Randon forest | 9.35 |
嘴角下垂 | 分割1 | SVM(linear) | 6.12 |
鳞屑 | 分割1 | SVM(linear) | 3.26 |
痤疮 | 分割2 | Lasso | 7.48 |
毛孔(面颊) | 分割2 | SVM(rbf) | 9.27 |
毛孔(鼻) | 分割1 | Neural net | 7.82 |
粗糙 | 分割1 | Lasso | 8.79 |
湿润 | 分割1 | Randon forest | 6.81 |
FFA | 分割1 | Linear model | 10.81 |
WE | 分割1 | Neural net | 6.99 |
ChE | 分割1 | Randon forest | 9.82 |
SQ | 分割1 | SVM(linear) | 8.85 |
SQepo | 分割1 | Linear model | 10.09 |
SQOOH | 分割1 | Linear model | 10.45 |
DAG | 分割2 | Randon forest | 13.27 |
TAG | 分割1 | Lasso | 10.00 |
试验例10使用来自SSL的RNA的血中皮质醇浓度的预测
被检验者
将面部、手指、上臂的皮肤没有问题的128名健康女性(20~50岁)作为被检验者。
皮脂的采集和SSL-RNA的测序
利用吸油膜(5cm×8cm、3M公司)从洗脸前的各被检验者的整个面部采集皮脂,作为来自SSL的RNA分析用的样品,以-80℃保存约1个月。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
血中皮质醇浓度的测定
利用真空采血管从各被检验者的胳膊采集血液15mL,分离血清并以-80℃保存。委托外部检査机构(株式会社LSI Medience),利用化学发光免疫测定法(CLIA法)对所保存的血清中的皮质醇浓度进行定量。
机器学习模型的构建
·使用数据
与试验例9同样,对于来自被检验者的来自SSL的RNA的表达量的数据(Lead Count值)的Lead Count小于10的数据,作为缺失值进行处理,转换成对样品间的总Lead数的差异进行修正后的RPM值后,通过SVD imputation填补缺失值。在机器学习模型的构建中,只将全部被检验者的80%以上且得到了不是缺失值的表达量数据的基因用于分析,作为表达量数据,使用Log2RPM值。
·数据组分割
利用从被检验者得到的RNA谱数据组,随机提取相当于80%的102人的RNA谱数据,作为血中皮质醇浓度预测模型的训练数据。将剩余的相当于20%的26人的RNA谱数据作为用于模型精度评价的试验数据。
·特征量基因的选择
在训练数据中,提取血中皮质醇浓度和皮尔逊相关系数大的1000种基因。
·使用算法(超参数候补值)
支持向量机(Support vector machine)(C:[0.1,1,10],kernel:[‘linear’,‘rbf’,‘poly’])
随机森林(Random forest)(max_depth:[1,2,3],max_features:[1,2],n_estimators:[10,100])
多层感知机(Multilayer perceptron)(solver:[‘lbfgs’,‘adam’],alpha:[0.1,1,10])
·模型构建
使用Python的机器学习库scikit-learn进行模型构建。
··将训练数据的来自SSL的RNA的表达量的数据(Log2RPM值)作为说明变量,将血中皮质醇浓度作为目标变量,进行10倍交叉验证,使预测模型学习。
··在交叉验证内,利用主成分分析将作为特征量基因提取的1000种基因的表达量数据从第一向第十主成分压缩后,对于各算法和超参数候补值,一边实施网格搜索(gridsearch)一边进行模型学习。
··向学习后的各模型输入试验数据的来自SSL的RNA的表达量(Log2RPM值),计算预测值,选取与实测值的差的RMSE最小的模型作为最佳预测模型。
(结果)
向使用得到了最小的RMSE的随机森林(max_depth=2,max_features=2,n_estimator=100)的预测模型输入试验数据的来自SSL的RNA的表达量(Log2RPM值),将所得到的血中皮质醇浓度的预测值相对于实测值进行绘图,将所得到的散点图示于图12。其中,在图中显示预测值与实测值的皮尔逊相关分析的相关系数(R)和RMSE值。如图中所示,得到了正的相关系数,显示了使用来自SSL的RNA的表达量的数据,能够预测血中皮质醇浓度。
试验例11使用来自SSL的RNA的累积紫外线暴露时间的预测
被检验者
将面部、手指、上臂的皮肤没有问题的130名健康女性(20~50岁)作为被检验者。
皮脂的采集和SSL-RNA的测序
利用吸油膜(5cm×8cm、3M公司)从洗脸前的各被检验者的整个面部采集皮脂,作为来自SSL的RNA分析用的样品,以-80℃保存约1个月。按照与试验例3相同的步骤从所保存的吸油膜提取SSL中RNA,进行文库制作,通过测序鉴定RNA种类,测定各自的表达量。
累积紫外线暴露时间的计算
对于被检验者,基于关于生活习惯和户外休闲活动的问卷调査,预测一定的年龄范围内暴露在阳光下的标准时间,并考虑真实年龄,计算累积紫外线暴露时间(小时(hour))。其中,问卷的提问项目以美国癌症中心所公开的关于阳光暴露史的调查问卷为基础而制成(Arch.Dermatol.144,217-22(2008))。
机器学习模型的构建
与试验例9同样,对于来自被检验者的来自SSL的RNA的表达量的数据(Lead Count值)的Lead Count小于10的数据,作为缺失值进行处理,转换成对样品间的总Lead数的差异进行修正后的RPM值后,通过SVD imputation填补缺失值。在机器学习模型的构建中,只将全部被检验者的80%以上且得到了不是缺失值的表达量数据的基因用于分析,作为表达量数据,使用Log2RPM。
·数据组分割
利用从被检验者得到的RNA谱数据组,随机提取相当于80%的104人的RNA谱数据,作为累积紫外线暴露时间预测模型的训练数据。将剩余的相当于20%的26人的RNA谱数据作为用于模型精度的评价的试验数据。
·特征量基因的选择
在训练数据中,提取累积紫外线暴露时间和皮尔逊相关系数大的1000种基因。除了这1000种基因以外,还将被检验者的年龄加入了特征量中。
·使用算法(超参数候补值)
使用与试验例10相同的算法。
·模型构建
与试验例10同样进行10倍交叉验证,选取与实测值的差的RMSE最小的模型作为最佳预测模型。其中,作为特征量,除了上述所选择的1000种基因以外,还使用了被检验者的年龄。
(结果)
向使用得到了最小的RMSE的支持向量机(C=10,kernel=‘linear’)的预测模型输入试验数据的来自SSL的RNA的表达量(Log2RPM值),将所得到的累积紫外线暴露时间的预测值相对于基于问卷的计算值进行绘图,将所得到的散点图示于图13。其中,在图中显示预测值与计算值的皮尔逊相关分析的关系数(R)和RMSE值。如图中所示,得到了正的相关系数,显示了通过使用来自SSL的RNA的表达量的数据,即使不借助问卷,也能够预测累积紫外线暴露时间。
Claims (14)
1.一种来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法,其特征在于:
包括在0℃以下保存从被检测体采集的含有RNA的皮肤表层脂质的步骤。
2.一种来自被检测体的皮肤细胞的核酸的制备方法,其特征在于,包括:
通过逆转录将被检测体的皮肤表层脂质所含的RNA转变为cDNA,接着对该cDNA实施多重PCR的步骤;和
对该PCR的反应产物进行精制的步骤。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:
所述多重PCR中的退火和延伸反应的温度为62℃±1℃。
4.如权利要求2或3所述的方法,其特征在于:
所述逆转录中的延伸反应以42℃±1℃进行60分钟以上。
5.如权利要求2~4中任一项所述的方法,其特征在于:
所述被检测体的皮肤表层脂质所含的RNA通过从该被检测体的皮肤表层脂质中分离RNA而制备。
6.如权利要求2~5中任一项所述的方法,其特征在于:
所述被检测体的皮肤表层脂质是在0℃以下保存后的皮肤表层脂质。
7.一种被检测体的皮肤、皮肤以外的部位或全身状态的分析方法,其特征在于:
包括对利用权利要求1~6中任一项所述的方法所制备的核酸进行分析的步骤。
8.如权利要求7所述的分析方法,其特征在于:
所述分析是患有或未患有发红、敏感性肌肤或特应性皮炎的皮肤的检测,或者皮脂量或皮肤水分量多或少的皮肤的检测。
9.如权利要求7所述的分析方法,其特征在于:
所述分析是皮肤状态的预测。
10.如权利要求9所述的分析方法,其特征在于:
所述皮肤状态的预测是皮肤物性的预测、皮肤的目测或触诊评价的预测或皮脂组成的预测。
11.如权利要求7所述的分析方法,其特征在于:
所述分析是皮肤的累积紫外线暴露时间的预测。
12.一种皮肤外用剂、皮内给药剂、贴剂、口服剂或注射剂对被检测体的效果或效能的评价方法,其特征在于:
包括对利用权利要求1~6中任一项所述的方法所制备的核酸进行分析的步骤。
13.一种被检测体的血中成分浓度的分析方法,其特征在于:
包括对利用权利要求1~6中任一项所述的方法所制备的核酸进行分析的步骤。
14.如权利要求13所述的分析方法,其特征在于:
所述血中成分为激素、胰岛素、中性脂肪、γ-GTP或LDL-胆固醇。
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