JP6482215B2 - 脂質の解析方法 - Google Patents
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Description
なお、内部要因(年齢・性別・人種・ホルモン・食物など)や外部要因(温度・紫外線など)によって脂質の組成や脂質の分泌量が変化する。そのため脂質と肌質などとの関連性を見出すためには、圧倒的多数の検体を分析し統計的に皮脂を解析することが必要である。
従来の脂質の解析方法としては、Sebutape(登録商標)を用いて皮脂の総量を解析する方法や、液体クロマトグラフィーにより試料溶液に含まれる脂質を分離し、分離した脂質に対して質量分析などを行う方法(以下、「LC/MS法」ともいう)が知られている。しかし、Sebutape(登録商標)を用いて皮脂の総量を解析する方法では脂質の含有量の情報しか得られず、脂質の詳細な情報を得ることができない。また、LC/MS法では脂質の詳細な情報が得られるものの、液体クロマトグラフィーを用いた測定対象物質の分離を行うため、分析に長時間要する。
ショットガンリピドミクスは液体クロマトグラフィーによらない解析方法であるので、迅速性に優れる。また、質量を分析することで脂質種を同定することができるので、一度の分析で多数の脂質を網羅的に解析することができ、スループット性に優れた技術である。例えば、非特許文献1には、血液試料に含まれる脂質をショットガンリピドミクスにより解析する方法が記載されている。
また、肌質に大きな影響を及ぼす脂質成分の1種として、過酸化脂質が挙げられる。皮脂を構成する脂質のうち過酸化脂質が占める割合はごくわずかである。しかし、過酸化脂質は、肌の老化、シワやシミ、たるみといった症状、ニキビや体臭の原因ともなる成分である。さらに過酸化脂質からは、変異原性や発癌性を有する短鎖アルデヒドが生成される。
したがってショットガンリピドミクスにおいては、マトリクス効果を抑制し、過酸化脂質も含めた各種脂質の検出感度を向上させることが必要となる。
しかし、水酸化リチウムを試料溶液に添加すると、過酸化脂質などの酸化物(不安定成分)の変性や分解が誘発されやすい。そのため、過酸化脂質の検出感度が低下してしまい、肌質に大きな影響を及ぼす過酸化脂質について正確に解析することが困難となる。
その結果、ショットガンリピドミクスにおいて、試料溶液と、酢酸アンモニウムやギ酸アンモニウムなどのイオン化促進剤をフローインジェクション法により質量分析装置に導入し、各種脂質を含む試料溶液の質量分析を行うと、マトリクス効果を抑制するとともに過酸化脂質の変性や分解を抑制し、脂質解析の高感度化と正確性の向上を実現できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
また本発明における「試料溶液」とは、複数種の脂質を含む試料溶液であり、リピドミクスの対象となる生体由来の試料が好ましい。試料溶液の例としては、血液(血清、血漿)、尿、体液、培養液、細胞、組織抽出物、ヒトなどの皮膚から採取した皮脂を有機溶媒で抽出した皮脂抽出物などが挙げられる。
前述したように、Direct-MS/MSにおいて、共存成分によるマトリクス効果が懸念される。このマトリクス効果を抑制するためには、試料濃度を可能な限り低くする必要があり、そのためには脂質を高感度で検出することが不可欠である。そこで本発明では、試料溶液に前記イオン化促進剤を共存させて脂質のイオン化を促進することで、脂質の検出感度を向上させる。これにより、脂質濃度の低い試料溶液に対して脂質の解析を可能とする。
ここで「インフュージョン法」とは、液体クロマトグラフを通さずに、イオン化促進剤を添加した試料溶液を連続的に質量分析装置に導入する方法である。これに対し「フローインジェクション法」とは、質量分析装置に連結された細いチューブ内を連続的に流れるイオン化促進剤を含むキャリアー溶液(移動相)中に試料溶液を導入し、混合溶液として質量分析装置に導入する方法である。
これら方法のうち、本発明において質量分析装置に試料溶液とイオン化促進剤を導入する方法として、フローインジェクション法を採用する。フローインジェクション法により、質量分析を行う前に試料溶液に含まれる脂質とイオン化促進剤とが共存する時間を短縮し、イオン化促進剤の作用による脂質の変性や劣化等を抑制することができる。特に、このような構成とすることで、過酸化脂質などの不安定成分の変性や分解を抑制し、脂質解析の正確性を向上させることができる。
なお本明細書おける過酸化脂質の具体例としては、スクアレン(以下、単に「SQ」ともいう)の酸化物が代表的である。ただし、全ての脂質由来からの過酸化脂質が本明細書おける過酸化脂質の対象となる。
質量分析装置の具体例としては、フーリエ変換型質量分析装置、飛行時間型質量分析装置、イオントラップ型質量分析装置、磁場偏向型質量分析装置、四重極型質量分析装置、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析装置、加速器質量分析装置、タンデム型質量分析装置が挙げられる。
これらのうち、測定する脂質のクラスごとに検出モードを変更でき、複雑なスペクトル情報から対象成分のみを選択的に抽出することができる点で、多次元検出モードを備えた四重極型質量分析装置が好ましい。
薄葉紙や綿棒の脱脂処理方法に特に制限はなく、クロロホルム、メタノールなどの有機溶媒による洗浄処理などが挙げられる。
<3>質量分析を行う際の、試料溶液に共存させる酢酸アンモニウムの濃度が、0.1mM以上、好ましくは1mM以上、200mM以下、好ましくは100mM以下、である、前記<2>項に記載の脂質の解析方法。
<4>前記質量分析装置が、多次元検出モードを備えた四重極型質量分析装置である、前記<1>〜<3>のいずれか1項に記載の脂質の解析方法。
<5>前記質量分析装置における脂質のイオン化方法が、エレクトロスプレーイオン化法である、前記<1>〜<4>のいずれか1項に記載の脂質の解析方法。
<6>前記試料溶液が、ヒトの皮膚から採取した皮脂を有機溶媒で抽出した皮脂抽出物である、前記<1>〜<5>のいずれか1項に記載の脂質の解析方法。
<7>前記脂質が、ヒトの皮膚から採取した皮脂である、前記<1>〜<6>のいずれか1項に記載の脂質の解析方法。
<8>前記皮脂が、麻やパルプなどを原料とする薄葉紙、好ましくはシガレットペーパー若しくはあぶらとり紙、又は綿棒を用いて、皮膚から採取した皮脂である、前記<7>項に記載の脂質の解析方法。
<9>用いる薄葉紙及び綿棒に予め脱脂処理を施す、前記<8>項に記載の脂質の解析方法。
<10>必要最小面積にした薄葉紙を用いて皮脂を採取する、前記<8>又は<9>項に記載の脂質の解析方法。
<11>ヒトの皮膚から採取した皮脂に対して前記<1>〜<10>のいずれか1項に記載の脂質の解析方法を行い、解析した結果に基づいて皮膚の肌質を評価する、肌質の評価方法。
下記に示す方法により、酸化脂質の標準品としてSQ酸化物を調製した。
SQ標準試薬(商品名:スクアレン、Extrasynthese.S.A社製)を透明スクリュー管に移し、UV光を照射(照射条件:254nm、24時間)することで、SQ酸化物含有標準品を調製した。そして、UV照射後のSQ酸化物含有標準品をメタノールに溶解後、LC/MS/MS(MRM)で分析した。その結果を図1(a)に示す。
その結果、SQの他に、SQのモノ過酸化体(SQ-OOH)及びSQのエポキシ体(SQ-epoxide)が観測された(図1(a)参照)。
このようにして、SQ酸化物の存在量を確認したSQ酸化物含有標準品を、下記に示すDirect-MS/MSでの酸化SQ定量用の標準試料として用いた。
シガレットペーパー(商品名:Rizla/Blue、7cm×3.6cm)を8等分に裁断(1.75cm×1.8cm)した。そして、裁断したシガレットペーパーをガラス瓶に入れ、クロロホルム/メタノール=1/1(体積比)溶液を適当量加えて超音波処理(約10分)後、溶媒を除去した。この操作を2〜3回繰り返し、最終的に窒素気流下でシガレットペーパーを乾燥させた。
(Direct-MS/MS条件)
装置:LC/1200シリーズ、質量分析計/6460 トリプル四重極(全てAgilent製)
移動相:15mmol/L酢酸アンモニウム含有クロロホルム/メタノール=1/1(体積比)
移動相流速:0.2mL/min
注入量:1μL
検出:イオン化法=ESI、乾燥ガス温度=300℃、乾燥ガス流量=5L/min、ネブライザー圧力=45psi、シースガス温度=250℃、シースガス流量=11L/min、ネブライザー電圧=0V、キャピラリー電圧=3500V
(質量分析装置の検出モード)
トリグリセリド(TAG):中性分子として脱離した脂肪酸から分子を検出するNeutral Loss Scan
WE:構成脂肪酸由来のプロダクトイオンから分子を検出するPrecursor Ion Scan
ChE:コレステロール骨格由来のプロダクトイオンから分子を検出するPrecursor Ion Scan
ジグリセリド(DG):脱離した水酸基から分子を検出するNeutral Loss Scan
SQ:MRM
FFA:Scan(Negative ion mode)
すなわち、本発明によれば、過酸化脂質の変性や分解を抑制して脂質の検出感度を向上させ、脂質を分子種ごとに網羅的かつ迅速に同定し、定量することができる。
実施例1で用いた移動相に含まれる酢酸アンモニウムの濃度を、1mmol/L、10mmol/L、又は100mmol/Lに代えた以外は実施例1と同様の試験を行った。そして、酢酸アンモニウムの濃度が1mmol/Lの場合の各種脂質の検出強度を「1」とした際の各濃度の相対検出強度を算出した。その結果を表19に示す。
5mLスクリュー管(商品名:マルエム/No.2)を用いて、額にシガレットペーパー(商品名:Rizla/Blue、7cm×3.6cm)を10秒間押し付け、皮脂を採取した(採取面積=1.77cm2)。皮脂を採取したシガレットペーパーをクロロホルム/メタノール=1/1(体積比)溶液5mLに浸漬し、超音波で10分処理し、抽出液を試験管に移した。この操作を2回繰り返し、抽出液を合わせて窒素気流下で乾固させた。
皮脂未採取のシガレットペーパーにおいても同様の抽出操作を実施した。また、シガレットペーパーなしの状態で抽出操作のみを実施した溶液も準備した。
これら3試料において、内部標準を加えてクロロホルム/メタノール=1/1(体積比)溶液に溶解し、実施例1と同様の条件下でDirect-MS/MSにてScan測定を実施した。その結果を図2(a)〜(c)に示す。
図3に示すように、皮脂採取面積は同じであるにもかかわらず、使用したシガレットペーパーの面積に応じて脂肪酸の強度比が増減することが確認された。
図4から明らかなように、シガレットペーパーの事前洗浄と裁断によって、図2(c)のスペクトルと比較して、TAGや脂肪酸由来のスペクトルがほぼ消失した。すなわちシガレットペーパーの事前洗浄と裁断によって、シガレットペーパー由来の脂肪酸は検出下限以下となり、Scan/Positive ion modeにおいてもノイズが大幅に低減した。したがって、シガレットペーパーを脂質の採取が可能な程度まで小さく裁断し、事前にクロロホルム/メタノール洗浄することで、シガレットペーパー由来の脂質の混入を大幅に減少させることができた。
5mLスクリュー管(商品名:マルエム/No.2)を用いて、額に前記シガレットペーパーを10秒間押し付け、皮脂を採取した(採取面積=1.77cm2)。採取した皮脂をクロロホルム/メタノール=1/1(体積比)溶液1mLで3回抽出(超音波10分)した。そして、各々1回目、2回目、3回目の抽出液を実施例1と同様の条件下でDirect-MS/MSに付して各脂質分子を分析した(各n=6)。3回抽出の合計を総皮脂量とし、総皮脂量に対する1回目の皮脂抽出率を算出した。その結果を表20に示す。
本発明でフローインジェクション方式を採用した利点として、脂質とイオン化促進剤とが共存する時間を短縮し、イオン化促進剤の作用による脂質の変性や劣化等を抑制することができる点にある。
そこで、実際にイオン化促進剤と脂質の混在状態で、どの脂質がどの程度変性するのかを確認した。
このように採取した皮脂と、一般的にLC/MSやLC/MS/MSで用いられる各種イオン化促進剤(酢酸、ギ酸、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム)をイオン化促進剤の終濃度が100mmol/Lになるように試験管内で混合した。そして、混合直後(0時間)、24時間後、48時間後・・・と同じ溶液を実施例1で用いた質量分析装置に導入した。この操作により、インフュージョン方式で起こるであろう状況を作り出した。
混合直後に分析した各試料溶液のSQ酸化物及びDGの定量値を「1」としたときの、各時間での相対定量値を算出した(n=6)。その結果を図5に示す。
具体的には、図5(b)及び(c)に示すように、イオン化促進剤として酸を用いた場合、SQ-epoxide量が時間の経過とともに減少した。一方、図5(d)及び(e)に示すように、イオン化促進剤として塩を用いた場合、トリグリセリド量が時間の経過とともに分解が進み、結果としてDAG量が増加した。
すなわち、予めイオン化促進剤と脂質を混合させるインフュージョン方式では、混合後すぐに測定する必要がある。一方、本発明のようなフローインジェクション方式では試料溶液にイオン化促進剤を混ぜる必要がない。そのため、試料溶液状態で即座に変性が生じることもなく、長期間安定的に試料溶液を分析することが可能である。
図6に示すように、酢酸アンモニウム濃度に応じてDG組成が増加する傾向が確認された。さらに、酢酸アンモニウムの濃度が1mmol/Lであっても長期共存状態下ではDG組成が変化することが明らかとなった。
Claims (6)
- 質量分析装置を用いたショットガン分析法に付して試料溶液に含まれる脂質を網羅的に解析する脂質の解析方法であって、試料溶液と、酢酸アンモニウムをイオン化促進剤としてフローインジェクション法により質量分析装置に導入し、前記イオン化促進剤の存在下で酸化若しくは過酸化脂質の質量分析を行う、脂質の解析方法。
- 酸化若しくは過酸化脂質の質量分析装置を用いた分析法において、ショットガン分析法とし、かつ、試料溶液と、酢酸アンモニウムをイオン化促進剤としてフローインジェクション法により質量分析装置に導入することで、酸化若しくは過酸化脂質に対するマトリクス効果を抑制し、かつ、酸化若しくは過酸化脂質の変性若しくは分解を抑制する方法。
- 質量分析を行う際の、試料溶液に共存させる酢酸アンモニウムの濃度が、1mM以上、100mM以下、である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記質量分析装置が、多次元検出モードを備えた四重極型質量分析装置である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記質量分析装置における脂質のイオン化方法が、エレクトロスプレーイオン化法である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酸化若しくは過酸化脂質が、スクアレンのモノ過酸化体、スクアレンのエポキシ体、及びトリアシルグリセロールのモノ過酸化体からなる群より選ばれる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
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