CN109564147A - 用于分析使用吸附材料从样品中提取的分析物的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

用于分析使用吸附材料从样品中提取的分析物的系统和方法。

Description

用于分析使用吸附材料从样品中提取的分析物的系统和方法
相关申请
本申请要求2016年6月3日提交的美国临时申请序列号62/345,161的权益和优先权，该美国临时申请的内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于分析使用吸附材料从样品中提取的分析物的系统和方法。
背景技术
质谱法(MS)是用于分析复合混合物的强大工具，所述质谱法基于靶标化合物的分子量和化学结构提供特定分子信息。传统上，在MS分析之前通常使用如高性能液相色谱法、气相色谱法和电泳法等色谱技术分离复合生物医学样品，以便最小化基质效应并且预先浓缩分析物。随着环境电离方法的发展，现在可以进行直接MS分析以便快速和直接分析复合生物医学样品而不需要分离过程。同时，具有低样品消耗和缩短的时间的简单方案对定性和定量分析来说仍然是令人满意的。
发明内容
本发明提供一种用于液-固相-液提取的新方法，并且还提供允许样品制备和预处理与电离过程结合的系统和方法。具体地，本发明允许在具有非常小的直径的毛细管(例如具有小至500μm的内径的毛细管)中进行液-固相-液提取。毛细管中的液体可以来回移动，这允许控制提取过程，即提取可以启动和停止。运动引起样品与固相材料的相互作用，导致从所述固体材料上的样品中提取一种或多种靶标分析物。提取溶剂然后用于从固相材料中洗脱靶标分析物。使用薄毛细管的额外好处是少量样品可以被处理用于定量分析。
另外，提取毛细管可能充当电离探针。以此方式，本发明提供允许在不进行单独样品制备和预处理方案的情况下，样品中的靶标分析物由质谱仪提取和分析。相反，本发明的系统和方法被配置使得样品制备和预先浓缩在电离探针内进行。经纯化的分析物然后可以被直接电离(尽管不需要)并从电离探针注入质谱仪中，其中样品制备和预处理在所述电离探针中发生。
使用固相提取材料完成本发明的方面。溶剂和样品被置于本发明的电离探针中。来自样品的一种或多种靶标分析物被提取到固相提取材料上，而样品的非靶标成分(例如，尿液中的盐)保留在样品中。提取溶剂然后用于从固相提取材料中洗脱靶标分析物。然后，电极可操作地耦合至电离探针主体内的提取溶剂，并且靶标分析物被电离并注入质谱仪中。以此方式，样品制备和预处理与电离过程结合，并且当将电压施加到溶剂时，靶标分析物不需要与样品中的非靶标成分竞争以进行充电。因此，本发明的系统和方法有效地抑制基质效应，并且允许从样品中更好地电离靶标分析物，特别是生物样品，如血液、唾液、尿液或脊髓液。本发明的系统和方法还具有将靶标分析物从样品预先浓缩到提取溶剂中的额外优点，由此避免昂贵的层析设备和耗时的分离方案，并且实现定点照护样品分析系统和方法。
在某些实施例中，本发明提供用于从样品中提取分析物的方法，所述方法涉及：将样品引入毛细管中；使所述毛细管内的所述样品与所述毛细管内的吸附材料相互作用，从而使得从所述样品中提取至少一种分析物并且将其结合到所述吸附材料；将提取溶剂引入所述毛细管中；以及使所述提取溶剂与所述吸附材料相互作用以便从所述吸附材料中洗脱所述至少一种分析物。在某些实施例中，毛细管与溶剂流保持离散(即，分开或断开)。相反，样品和提取溶剂等分到毛细管中以进行本发明的方法。根据所使用的方法，提取溶剂可以与样品不可混溶或者与样品可混溶。
存在用于使吸附材料位于毛细管内的许多不同方法。在一种方法中，所述吸附材料涂覆所述毛细管的壁的一部分。在这种方法中，所述毛细管第一次移动以使所述样品与所述吸附材料相互作用，并且然后第二次移动以使所述提取溶剂在所述样品与所述吸附材料相互作用之后与所述吸附材料相互作用。在某些实施例中，所述样品和所述提取溶剂都位于所述毛细管内并且被气隙彼此分离。在其它实施例中，样品和溶剂彼此接触而不彼此混合，即样品和溶剂彼此不可混溶。
在另一种方法中，探针包含吸附材料，并且所述探针被配置成拟合到所述毛细管内。然后，以所述吸附材料进入所述样品的方式将所述探针插入所述毛细管内的所述样品中。然后，以所述吸附材料进入所述提取溶剂的方式将所述探针从所述样品移动到已经位于所述毛细管内的所述提取溶剂中。替代性地，从所述毛细管移除所述样品，并且以所述吸附材料与所述提取溶剂相互作用的方式将所述提取溶剂引入所述毛细管。
本发明的方法可以进一步涉及分析所述已提取分析物。在某些实施例中，分析涉及：向所述毛细管中的包括所述至少一种分析物的所述提取溶剂施加电压，使得将所述分析物排出所述毛细管，由此产生所述分析物的离子；以及分析所述离子(在线方法)。在其它实施例中，分析涉及：从所述毛细管中移除包括所述至少一种分析物的所述溶剂；以及进行分析所述分析物的测定(离线方法)。
本发明的方法还涉及进行与样品中的靶标分析物的反应。在某些实施例中，所述吸附材料包含与所述至少一种靶标分析物反应的一种或多种分子，并且在所述一种或多种分子与所述至少一种靶标分析物之间进行反应以产生反应产物，然后可以通过上述方法中的任一种方法(例如，在线方法或离线方法)分析所述反应产物。在其它实施例中，所述提取溶剂包含与所述至少一种靶标分析物反应的一种或多种分子，并且在所述一种或多种分子与所述至少一种靶标分析物之间进行反应以产生反应产物，然后可以通过上述方法中的任一种方法(例如，在线方法或离线方法)分析所述反应产物。
在某些实施例中，所述吸附材料包含内标。可以通过所述提取溶剂从所述吸附材料中洗脱所述内标。所述方法可以进一步涉及：使用上述方法中的任一种方法(例如，在线方法或离线方法)分析所述内标和所述一种或多种靶标分析物。在这种实施例中，可以以定量方式进行所述分析。
附图说明
图1示出了基于涂覆的毛细管的微萃取的示意图。
图2小图A示出了聚(EGDMA-共-AA)涂覆的毛细管的照片。图2小图B示出了聚(EGDMA-AA)层的扫描电子显微照片。
图3示出了由聚合物涂覆的毛细管提取的健康人类血液样品中脂肪酸的质谱。
图4示出了提取循环和样品体积对牛血液样品中脂肪酸的提取效率的影响。5μL乙酸乙酯被用作提取溶剂，亚油酸-d11作为内标。
图5是生物样品与洗脱溶剂之间具有空气塞的基于涂覆的聚合物的微萃取的示意图。
图6是用于毛细管内提取的涂覆的金属线的示意图。
图7小图A到B示出了由聚合物涂覆的毛细管提取的大鼠脊髓的光谱。小图A示出了负模式下的全扫描并且小图B示出了正模式下的全扫描。
图8小图A是将内标引入基于涂覆的毛细管的微萃取的示意图。图8小图B是图示，示出了从牛血液中提取的脂肪酸18:2的强度与通过聚合物涂覆引入的两个内标的脂肪酸18:2的强度之比。
图9A示出了脂肪酸18:1(9Z)(5.0μM)混合物和(11Z)(5.0μM)异构体混合物在负离子模式下的PB反应MS光谱。图9B示出了在图9A中形成的m/z 339的PB-MS/MS光谱。示出了两个脂肪酸18:1异构体的诊断离子。图9C是图示，示出了两个脂肪酸18:1C＝C位置异构体的诊断离子比(I11Z/I9Z)与摩尔比(c11Z/c9Z)之间建立的线性关系。图9D示出了来自由聚合物涂覆的毛细管提取的健康人类血液样品的脂肪酸18:1异构体的PB-MS/MS光谱。
图10小图A示出了牛、人类和大鼠血液以及脊髓均质化溶液中的脂肪酸18:1异构体组合物。图10小图B示出了正常小鼠乳腺组织与癌性小鼠乳腺组织之间来自脂肪酸Cl8:1的Δ11C＝C位置异构体的Rel.％的比较。
图11是图片，示出了微型质谱仪中的各种部件和其布置。
具体实施方式
本发明总体上涉及用于分析使用吸附材料从样品中提取的分析物的系统和方法。本发明的方面描述了毛细管样品预处理方法，所述方法结合毛细管修饰、连续的毛细管内微萃取、内标的引入、喷雾生成以及任选的拉制玻璃毛细管中的在线化学反应，并且用于对复合混合物的快速定性和定量分析。在某些实施例中，毛细管的内表面修饰有一种或多种吸附材料的层。通过以下三相当中的分子交换实现分析物提取：样品溶液、用于洗脱的有机溶剂和涂覆的吸附剂。当样品溶液塞移动到吸附区域中时，分析物首先被吸附到涂覆的吸附剂上。被吸附的分析物然后被洗脱到有机溶剂塞中。过程重复许多次以将分析物富集到有机溶剂中(图1)，毛细管可以在线或离线使用以与纳米ESI-MS联接。在每个提取循环，可以被提取到有机溶剂中的分析物(ni)的量可以由以下发现的等式(1)估计，其中C0是提取之前样品溶液中的分析物浓度；Vs和Vc分别是样品和涂层的体积，K是分析物在涂层与样品基质之间的分布系数，并且ai是从涂层中洗脱分析物的有机相的洗脱率。
在例如Ouyang等人(美国专利申请公开号2016/0201051)中描述了提取以及对所提取样品的分析的其它方面，所述专利申请的内容通过引用以其全文并入本文。
首先根据血液样品中的直接游离脂肪酸谱来研究基于涂覆的毛细管的微萃取-纳米ESI的性能。聚(乙二醇二甲基丙烯酸酯-共-丙烯酰胺)(聚(EGDMA-共-AA)薄层被合成到玻璃毛细管的内表面中。聚合物的薄层是多孔的(图2小图A-B)，具有大量大孔、中孔和微孔，这促进接触生物样品和聚合物的表面，以及增强提取效率。乙酸乙酯由于其从聚(聚(EGDMA-共-AA)层对脂肪酸的良好洗脱能力而被用作有机溶剂。提取在1到2分钟内完成，然后注入具有提取物的乙酸乙酯用于纳米ESI-MS分析。通过使用低至5μF的原始人类血液样品，可以发现游离脂肪酸的多个峰值(图3)。根据报告的数据识别至少24种脂肪酸。还分析了大鼠血液和牛血液。尽管在每个提取循环中仅少量分析物可以被吸附到涂层上，但是可以很容易且简单地应用更多循环来增加提取效率。通过使用掺有亚油酸-d11的牛血液作为内标，研究提取循环的效果(图4A)。需要大约50次来实现提取平衡，然而，提取的总时间可以少至1分钟。通常，有机相和血液样品之比为1:1(5μF和5μL)。然而，血液样品的体积可以增加到比有机相的体积大若干倍。所提取的脂肪酸随着血液体积的增加稳定地增加(图4B)。
出于简化提取操作的目的，血液塞和有机溶剂塞彼此连接。然而，分析物在血液与有机相之间的交换可以限制所述方法的最终提取效率，因为已经洗脱到有机相中的分析物可以扩散回血液样品。约5mm的空气塞可以留在生物样品与提取溶剂之间(图5)。在这种实施例中，生物样品和提取溶剂在提取过程期间不接触彼此，这可以限制生物样品与提取溶剂之间的分析物交换，因此将增加提取效率。
吸附剂还可以涂覆到薄金属线上，如钢丝。生物样品和洗脱溶剂还可以逐一注入毛细管中。当涂覆的钢丝插入生物样品溶液中时，吸附发生，并且当涂覆的钢丝插入洗脱溶剂中时，解吸附立即发生(图6)。采用对血液中脂质的提取作为例子。将5μL的乙酸乙酯和5μL的血液注入玻璃毛细管中。聚合物涂覆的钢丝首先插入血液中，将一些脂质吸附到涂层上。当涂覆的钢丝继续移动到乙酸乙酯中时。吸附到涂层上的脂质将被解吸附到乙酸乙酯中。脂质将通过重复在血液与乙酸乙酯之间移动涂覆的钢丝而富集到乙酸乙酯中。
涂覆的毛细管适用于液体样品，包含血液样品以及组织均质化溶液样品。执行通过聚合物涂覆的毛细管提取大鼠脊髓的研究。健康大鼠脊髓首先均质化到PBS溶液中；大鼠脊髓的浓度可以低至0.05mg/mL。然后将5μL乙酸乙酯和大鼠脊髓均质化溶液推入聚(EGDMA-共-AA)毛细管中以进行毛细管内提取。大鼠脊髓均质化溶液中的脂肪酸可以被MS良好地提取和检测(图7小图A-B)。一些其它种类的脂质也可以在大鼠脊髓样品中提取和检测，如磷酸胆碱(PC)和磷酸乙醇胺(PE)。在不被动作的任何特定理论或机制限制的情况下，据信小块组织可以被多孔聚合物涂层吸附，这些组织中的PC和PE然后被乙酸乙酯洗脱和富集。
毛细管内的涂层可以用作基板以引入内标进行提取和分析。两种同位素标记的脂肪酸，亚油酸-d11和二十二碳六烯酸-d5被用作内标以提取和分析血液样品中的脂肪酸。亚油酸-d11和二十二碳六烯酸-d5首先在乙酸乙酯中溶解；然后将1μL溶液仔细注入聚合物层。多孔聚合物层可以吸附溶液，在干燥之后，内标将保留在聚合物上，实现内标的固定。对于典型提取，当乙酸乙酯和血液样品被引入毛细管中时，内标将从聚合物层中洗脱并且溶解到一种或两种液体塞中，实现引入内标。对于五次重复提取，在相对标准偏差小于12.8％的情况下方法的再现性良好(图8小图A-B)。
基于涂覆的毛细管的微萃取的另一个应用是快速识别和定量原始生物样品中的脂质C＝C位置异构体。提取与在线光化学反应Paterno-Biichi(PB)反应相结合，其中丙酮用作PB试剂用于250nm UV照射。由于丙酮加入到完整的不饱和脂质中，PB反应产物的离子具有+58Da的质量偏移。产物的CID在原始C＝C位置引起分裂并给出C＝C诊断离子，其用于C＝C位置测定(图9A到图9C)。研究了原始血液和组织样品中FA 18:1C＝C异构体的测定。将5μL的乙酸乙酯和血液引入多孔聚(EGDMA-共-AA)涂覆的毛细管中进行提取。提取后，乙酸乙酯通过氮气喷射而蒸发，这将仅需要半分钟。提取物的残余部分通过乙腈/水(1:1，v/v)进行分解，并装入拉制毛细管尖端进行光化学反应和纳米ESI-MS分析。在总共2到3分钟的时间内，可以获得原始血液或组织样品中FA18:1C＝C异构体，即Δ9和Δ11异构体的比率(图9D)。这比可以通过常规提取方法获得要快得多，常规提取方法通常需要超过1小时。已经研究了四种样品，包含人类血液、牛血液、大鼠血液和大鼠脊髓均质溶液。还尝试所述方法以确定健康和疾病状态生物样品之间FA 18:1C＝C异构体比率的差(图10小图A-B)。发现Δ11异构体的脂肪酸18:1(23.4±0.9％vs.4.1+0.4％，癌症vs.正常)在小鼠癌变乳腺组织中显着增加(***p<0.0005)。
其它材料也可以在毛细管中进行修饰。例如，通过修饰亲水聚合物层，毛细管内微萃取方法可用于提取原始血液或组织样品中的极性脂质、代谢物或药物。通过对含有如二氧化钛或硼酸基团等特殊成分的材料进行修饰，所述方法可以用于提取磷酸盐化合物或糖类。
毛细管中的涂层可以是生物/化学反应的平台。例如，当将生物样品或任何其它种类的样品溶液引入毛细管中时，可以将酶固定在涂层上以诱导酶促反应。可以通过提取溶剂塞快速提取产物以用于进一步反应或分析。一些反应性化合物在涂层上进行修饰以引起涂层之间的化学反应。通过提取溶剂塞快速提取产物以用于进一步反应或分析。复杂的生物基质可能会中断一些反应；涂层可以作为中间区解决问题。例如，通过在样品和提取溶剂塞之间放置气塞，当样品溶液流经涂层时，样品中的分析物会吸附到涂层上。当提取溶剂流经涂层时，其将获得分析物以在不接触样品溶液的情况下进行进一步反应。
存在用于分析离子的许多方法。在某些实施例中，分析涉及将离子引入质谱仪或微型质谱仪的质量分析器。本领域已知的任何类型的质谱仪都可以用于本发明的证实。例如，质谱仪可以是标准的台式质谱仪。在其它实施例中，质谱仪是微型质谱仪。例如在Gao等人，(《分析化学(Anal.Chem.)》，2006,78,5994-6002)中描述了示例性微型质谱仪，其内容通过引用以其全文并入本文。与用于具有数千瓦功率的实验室规模仪器的泵送系统相比，微型质谱仪通常具有较小的泵送系统，如具有仅5L/分钟(0.3m3/小时)的隔膜泵和用于Gao等人描述的系统的11L/秒的涡轮泵的18W泵送系统。其它示例性微型质谱仪在例如Gao等人，(《化学分析》，2008,80,7198-7205)，Hou等人，(2011,《化学分析》，83,1857-1861)，以及Sokol等人，(《国际质谱学杂志(Int.J.Mass Spectrom.)》，2011,306,187-195)中进行描述，所述参考中的每一个的内容通过引用以其全文并入本文。微型质谱仪在例如Xu等人(JAFA,2010,15,433-439)；Ouyang等人，(《化学分析》,
2009,81,2421-2425)；Ouyang等人，(《分析化学年评(Ann.Rev.Anal.Chem.)》，2009,2,187-214)；Sanders等人，(《欧洲质谱学杂志(Euro.J.Mass Spectrom.)》，2009,16,11-20)；Gao等人，(《化学分析》，2006,78,5994-6002)；Mulligan等人，(《化学通讯(Chem.Comm.)》，2006,1709-1711)；以及Fico等人，(《分析化学》，2007,79,8076-8082)，所述参考中的每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
在某些实施例中，质谱仪入口远离电离探针定位，并且离子转移构件用于更长距离的转移。示例性离子转移构件在例如Ouyang等人(美国专利号8,410,431)中描述，其内容通过引用以其全文并入本文。
在某些实施例中，本发明的电离探针在无气动辅助的情况下操作。也就是说，利用本发明的探针，不需要气动辅助来输送分析物；相反，仅仅将电压施加到固持在质谱仪前面的基板上。然而，在某些实施例中，雾化气体可与本发明的系统一起使用以帮助去溶剂化。雾化气体可以是脉冲的或作为连续流提供。在其它实施例中，气体产生装置可操作地联接到探针，使得其可以将气体注入空心体中以将样品和溶剂推到探针的远端尖端。气体将通常为惰性气体，如氮气或氩气，但也可以是空气。
在某些实施例中，电离探针与溶剂流，如连续的溶剂流保持离散(即，分开或断开)。相反，将离散数量的溶剂和样品引入探针的空心体中。然后将探针连接到电压源以产生样品的离子，随后对离子进行质量分析。样品通过空心体而无需单独的溶剂流进行输送。如前所述，输送分析物不需要气动辅助；相反，仅仅将电压施加到探针中包含固持在质谱仪前面的已提取分析物的溶剂中。
本发明不必限于毛细管，其它空心体可以与本发明的方法一起使用。空心体可以具有远端尖端，用于喷射装入到探针中的溶剂喷雾。示例性空心体为具有远端尖端的纳米ESI探针毛细管。示例性的纳米ESI探针在例如Karas等人，(《Fresenius分析化学期刊(Fresenius J.Anal.Chem.)》，2000,366,669-76)和El-Faramawy等人，(《美国质谱学会志(J.Am.Soc.Mass.Spectrom.)》，2005,16,1702-1707)的每一篇中进行了描述，所述参考中的每一个的内容通过引用以其全文并入本文。纳米ESI针可从Proxeon生物系统公司(欧登塞，丹麦)和新目标公司(New Objective Inc)(沃本，马萨诸塞州)商购获得。在其它实施例中，系统可以包含含有有一个或多个喷雾尖端和一个或多个电极的样品盒。
示例性空心体是内径为0.86mm具有拉制尖端的玻璃硼硅酸盐毛细管。尖端将通常具有约2μm到约50μm的直径。塑料和橡胶管也可用于空心体。例如，空心体可以由PEEK管(聚醚醚酮聚合物管)或TEFLON管(聚四氟乙烯(PTFE)聚合物管)或TYGON管(由各种基材组成的柔性管)构成。
示例性空心体是内径为0.5mm或0.25mm且具有或不具有拉制尖端的熔融石英毛细管。
本发明的方法可以与任何类型的样品一起使用，如有机或非有机、生物或非生物等。在某些实施例中，样品源自生物组织，或者为生物流体，如血液、尿液、唾液或脊髓液体。样品可以包含待分析的关注分析物。分析物可以是样品的原生物，或者可以已经引入样品中。示例性分析物包含治疗药物、滥用药物和生物标志物。使用本发明的系统和方法，可以实现对例如，治疗药物、滥用药物和生物标志物的基质效应的有效抑制。在某些实施例中，本发明的系统和方法可用于直接分析生物流体样品或液体样品。
溶剂可以是任何溶剂，并且理想的溶剂可用于样品的提取和电离。通常，所选择的溶剂取决于待分析的样品和/或被认为是样品中的关注分析物。要考虑的因素是溶剂的极性。如果溶剂与样品不可混溶，则理想地，溶剂具有与样品和/或被认为是样品中的关注分析物不同的极性。例如，水性样品通常具有高极性，因此良好的溶剂选择将是具有低极性的有机溶剂(例如，甲醇或乙酸乙酯或包含这些溶剂的混合物，例如，水/甲醇混合物或水/乙酸乙酯混合物)。油样通常具有低极性，因此良好的溶剂选择将是具有较高极性的溶剂，如水/甲醇混合物。技术人员将能够基于待分析的样品确定合适溶剂来使用。
溶剂的另一个考虑因素是除了有利于从样品中提取分析物外，还可以用于电离样品。也就是说，溶剂对于已提取分析物的提取和电离均可以兼容。甲醇和乙酸乙酯有效用于分析物的提取和分析物的电离，而氯仿有效用于提取，但不能有效用于分析物的电离。通常，与电喷雾电离相兼容的溶剂可以与本发明的系统和方法一起使用，只要溶剂也与样品不可混溶且能够从样品中提取分析物。具有质谱分析经验的技术人员将了解与电喷雾电离兼容的特定溶剂。
本领域技术人员将认识到将样品和溶剂引入空心体的顺序无关紧要。在某些实施例中，首先引入溶剂，然后再引入样品。在某些实施例中，首先引入样品，然后再引入溶剂。在某些实施例中，样品和溶剂是不可混溶的。在某些实施例中，使用多于一种溶剂。例如，可以引入位于第一溶剂与样品之间的第二溶剂(三相实施例)。第二溶剂可以充当溶剂桥，并且与样品和第一溶剂不可混溶，在这样的实施例中，样品和第一溶剂通常彼此可混溶。
在某些实施例中，样品和溶剂轻柔地移动。这可以通过轻轻地倾斜毛细管或通过使用移动机构手动进行。示例性移动机构是在空心体内施加改变的气动力以在体内推动和拉动样品由此引起轻柔的移动的泵。其它机构可以是本领域器技术人员已知的标准样品搅拌器或混合机器。在某些实施例中，将磁珠添加到样品和提取溶剂中，并应用交变磁场致使磁珠在样品和溶剂内部移动，从而促进空心体内的湍流以输送分析物从而与空心体内的吸附材料相互作用。
在某些实施例中，待分析的靶标是不能例如通过喷雾电离有效电离的靶标。在这种实施例中，有益的是，通过引入能够赋予靶标带电基团的试剂来衍生靶分子，从而使其更适于电离。例如，类固醇难以通过喷雾电离进行电离。向样品中引入如羟胺等试剂赋予类固醇带电基团，使其适于喷雾电离。
在某些实施例中，空心体被配置成使得无电极安置在主体的表面上。相反，电极至少部分地安置在空心体内。在示例性实施例中，电极可以是延伸到空心体中的金属线。通常用于电极的任何金属都可以用于金属电极。金属线连接到电压电源，如高压源。金属线可以延伸任意长度到空心体中。在某些实施例中，金属线可以延伸到空心体的远端。替代性地，金属线可以更短，不延伸到体内那么远。添加到空心体中的溶剂量将决定金属线的长度，因为线应该在体内延伸足够长度以与添加到体内的溶剂相互作用。
金属线可以同轴地安置在空心体内，尽管这不是必需的。通常，金属线不会接触到空心体的壁。金属线电极及其联接件可以可拆卸地或永久地附接到空心体上。在某些实施例中，金属线电极及其联接件可拆卸地附接到空心体。这允许空心体的近端充当将流体引入体内的端口。在这种实施例中，金属线电极及其联接件从空心体中移除，留下开口，使流体通过开口引入体内。一旦引入，金属线电极及其联接件就附接到空心体，密封空心体。
在其它实施例中，附接件是永久性附接件，并且沿着主体的一个或多个单独的流体端口用于将流体引入空心体中。即使金属线电极的附接件及其与空心体的联接件是可拆卸附接件，空心体仍可以包含沿着主体的将流体引入空心体的一个或多个单独的端口。
在示例性实施例中，向空心体内的液体引入高压来以喷雾的形式从空心体的远端尖端喷射液体。质谱仪的入口可操作地定位以接纳从探针喷射的液体。距离通常小于10mm，但是允许来自样品的信号在质谱仪内产生的任何距离都是合适的。距离可以由技术人员通过简单地调节探针与质谱仪的入口之间的间隔并监测由质谱仪产生的读数来确定。
在其它实施例中，拉制尖端的外壁可涂覆有金属。可以通过金属涂层施加高电压以进行喷雾电离。
在某些实施例中，从样品中提取多于一种分析物(例如，多种分析物)并将其提取到吸附材料上。然后使用一种或多种提取溶剂从吸附剂材料中提取多种分析物。也就是说，可以使用单一溶剂同时提取多种分析物，或者替代性地，通常基于分析物的极性和溶剂的极性使用一种或多种溶剂从吸附材料中分开洗脱分析物。
虽然已经使用两种流体(有时是两种不可混溶的流体)讨论了本发明的方法，但本发明的系统和方法不限于使用两种流体。任何数量的流体可以与本发明的系统和方法一起使用，如三种流体、四种流体、五种流体等。在某些实施例中，使用三流体系统。在某些示例性实施例中，两种可混溶的流体由不可混溶的流体分开。在该示例性实施方案中，样品—溶剂桥—提取/喷雾溶剂的极性可以是高—低—高或低—高—低。
在某些实施例中，本发明的系统和方法也可以用于制备稍后将进行分析的样品。提取溶剂可以作为液体样品储存或沉积在纸基板或MALDI板上以制备干燥的样品点。在提取过程中，内标可以掺入干燥的样品点。靶标分析物可在提取过程中进行化学修饰。
在其它实施例中，空心体不需要远侧尖端，因为提取毛细管不用作电离探针。在这种实施例中，如上所述在毛细管中简单地进行提取。提取完成后，从毛细管中移除含有已提取分析物的溶剂，然后使用本领域已知的任何方法进行分析。例如，可以将含有已提取分析物的溶剂装入单独的电离探针中，然后通过质谱法进行分析。在其它实施例中，以不同方式对分析物进行分析，如任何光谱技术或本领域已知的其它试验。
以下对本发明的额外方面进行进一步描述。
离子产生
可以采用本领域已知的用于产生离子的任何方法。在大气压下利用电离源进行质谱分析的示例性质谱分析技术包含：电喷雾电离(ESI；Fenn等人，《科学(Science)》，1989,246,64-71以及Yamashita等人，《物理化学杂志(J.Phys.Chem.)》，1984,88,4451-4459)；大气压电离(APCI；Carroll等人，《分析化学》，1975,47,2369-2373)；以及大气压基质辅助激光解吸电离(AP-MAFDI；Faiko等人，《分析化学》，2000,72,652-657；以及Tanaka等人，《质谱快讯(Rapid Commun.Mass Spectrom.)》，1988,2,151-153)。这些参考中每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
利用直接环境电离/采样方法的示例性质谱分析技术包含：解吸电喷雾电离(DESI；Takats等人，《科学》，2004,306,471-473以及美国专利号7,335,897)；实时直接分析(DART；Cody等人，《分析化学》，2005,77,2297-2302)；大气压介质阻挡放电电离(DBDI；Kogelschatz，《等离子化学与等离子工艺(Plasma Chem.and Plasma P.)》2003,23,1-46以及PCT国际公开号WO 2009/102766)；使用湿润多孔材料进行的离子产生(纸喷雾，美国专利号8,859,956)；以及电喷雾辅助激光解吸/电离(EFDI；Shiea等人，《质谱快讯》，2005,19,3701-3704)。这些参考中每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
可以通过将样品置于多孔材料上并从多孔材料或其它类型的表面产生样品的离子，如Ouyang等人的美国专利号8,859,956中所示出的，所述专利的内容通过引用以其全文并入本文。替代性地，可以用非多孔材料进行测定，并且由非多孔材料产生离子，参见例如，Cooks等人，美国专利申请序列号14/209,304，所述专利申请的内容通过引用以其全文并入本文)。在某些实施例中，可以对其应用高压的固体针形探头或表面用于产生样品的离子(参见例如，Cooks等人，美国专利申请公开号20140264004，所述专利申请的内容通过引用以其全文并入本文)。
在某些实施例中，使用纳米喷雾ESI来产生样品的离子。例如在Wilm等人，(《分析化学》2004,76,1165-1174)中描述了示例性纳米喷雾尖端以及制备这种尖端的方法，其内容通过引用以其全文并入本文。例如在Karas等人，(《Fresenius分析化学期刊》2000,366,669-676)中描述了纳米ESI，其内容通过引用以其全文并入本文。
离子分析
在某些实施例中，通过将离子引导到质谱仪(台式或微型质谱仪)中来分析所述离子。图11是图片，示出了微型质谱仪中的各种部件和其布置。控制系统Mini 12(Linfan Li、Tsung-Chi Chen、Yue Ren、Paul I.Hendricks、R.Graham Cooks和Zheng Ouyang，“微型环境质量分析系统(Miniature Ambient Mass Analysis System)”，《分析化学》，2014,862909-2916.DOI:10.1021/ac403766c；Paul I.Hendricks、Jon K.Dalgleish、JacobT.Shelley、Matthew A.Kirleis、Matthew T.McNicholas、Linfan Li、Tsung-Chi Chen、Chien-Hsun Chen、Jason S.Duncan、Frank Boudreau、Robert J.Noll、John P.Denton、Timothy A.Roach、Zheng Ouyang和R.Graham Cooks，“使用背包微型质谱仪进行自主原位分宜和实时化学检测：概念，仪器发展和性能(Autonomous in-situ analysis and real-time chemical detection using a backpack miniature mass spectrometer:concept,instrumentation development,and performance)”，《分析化学》，2014,86,2900-2908.DOI:10.1021/ac403765x，所述参考中的每一个的内容通过引用以其全文并入本文)以及真空系统Mini 10(Liang Gao、Qingyu Song、Garth E.Patterson、R.Graham Cooks和Zheng Ouyang，“手持式直线离子阱质谱仪(Handheld Rectilinear Ion Trap MassSpectrometer)”，《分析化学》，2006,78,5994-6002.DOI:10.1021/ac061144k，所述参考的内容通过引用以其全文并入本文)可以组合以产生图11中示出的微型质谱仪。其可以具有类似于鞋盒的大小(H20cm x W25cm x D35cm)。在某些实施例中，微型质谱仪使用双LIT配置，其例如在Owen等人(美国专利申请序列号14/345,672)和Ouyang等人(美国专利申请序列号61/865,377)中描述，所述参考中的每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
质谱仪(微型或台式)可以配备有不连续界面。例如在Ouyang等人(美国专利号8,304,718)和Cooks等人(美国专利申请公开号2013/0280819)中描述了不连续界面，所述参考中的每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
样品
如以上所讨论的，本发明的系统和方法可以用于分析许多不同类型的样品。可以分析广泛的异质样品，如生物样品、环境样品(包含例如工业样品和农业样品)和食物/饮料产品样品等)。
示例性环境样品包含但不限于地下水、地表水、饱和土壤水、不饱和土壤水；工业化加工，如废水、冷却水；加工中使用的化学品、工业加工中的化学反应以及将涉及来自垃圾站的沥出液的其它系统；垃圾和水注入加工；储存罐周围的液体流入或泄漏检测；来自工业设施、水处理厂或设施的排放水；来自农业用地的排水和沥出液、来自城市用地的排水使用如地表、地下和下水道系统；来自废水处理技术的水；以及来自采矿或提取自然资源，如石油生产和原位能量生产的其它过程的排水。
另外，示例性环境样品包含但当然不限于农业样品，如农作物样品，如谷物和草料产物，如大豆、小麦和玉米。通常，期望关于产物成分的数据，如水分、蛋白质、油、淀粉、氨基酸、可提取淀粉、密度、测重、消化性、细胞壁含量以及具有商业价值的任何其它成分或性质。
示例性生物样品包含人类组织或体液并且可以以任何临床上可接受的方式收集。组织是大量源自例如人类或其它哺乳动物的连接细胞和/或细胞外基质物质，例如皮肤组织、头发、指甲、鼻腔组织、CNS组织、神经组织、眼组织、肝组织、肾组织、胎盘组织、乳腺组织、胎盘组织、乳腺组织、胃肠组织、肌肉骨骼组织、泌尿生殖器组织、骨髓等，并且包含与细胞和/或组织相关联的连接物质和液体物质。体液是源自例如人类或其它哺乳动物的液体物质。这种体液包含但不限于黏液、血液、血浆、血清、血清衍生物、胆汁、血液、母血、粘液、唾液、痰液、汗液、羊水、月经流体、乳腺流体、腹膜液、尿液、精液以及脑脊液(CSF)，如腰椎或心室CSF。样品还可以是细针抽吸物或活检组织。样品还可以是含有细胞或生物材料的培养基。样品还可以是血凝块，例如已经在血清移除后从全血中获得的血凝块。
在一个实施例中，生物样品可以是血液样品，可以从所述血液样品中提取血浆或血清。可以通过标准静脉切开放血手术获得血液，然后分离。用于制备血浆样品的典型分离方法包括血液样品离心。例如，可以在抽血后立即将蛋白酶抑制剂和/或抗凝血剂加入血液样品中。然后将管冷却并进行离心，并且随后可以置于冰上。将得到的样品分成以下成分：上层相中血浆的清液；血沉棕黄层，其是白细胞与血小板混合的薄层；以及红细胞(红血球)。通常，8.5mL的全血将产生约2.5mL到3.0mL的血浆。
血清以非常类似的方式制备。收集静脉血，然后通过倒置将蛋白酶抑制剂和凝血剂与血液混合。在室温下允许通过垂直竖立管使血液凝结。然后将血液离心，其中所得上层清液是指定的血清。随后将血清样品置于冰上。
在分析样品之前，可以例如通过过滤或离心来纯化样品。这些技术可用于例如去除微粒和化学干扰。用于去除微粒的各种过滤介质包含滤纸，如纤维素和薄膜过滤器，如再生纤维素、醋酸纤维素、尼龙、PTFE、聚丙烯、聚酯、聚醚砜、聚碳酸酯和聚乙烯吡咯烷酮。用于去除微粒和基质干扰的各种过滤介质包含官能化膜，如离子交换膜和亲和膜；SPE盒，如基于硅胶和聚合物的盒；以及SPE(固相萃取)圆盘，如基于PTFE和玻璃纤维。这些过滤器中的一些可以以圆盘形式提供，用来松散地放置在过滤器保持器/壳体中，其它过滤器可以提供在可以放置在例如标准血液采集管上的一次性尖端内，还有一些以阵列的形式提供，其具有用于接纳移液样品的孔。另一种过滤器包含旋转过滤器。旋转过滤器由具有醋酸纤维素滤膜的聚丙烯离心管组成，并与离心结合使用以从通常在水性缓冲液中稀释的样品，如血清和血浆样品中去除微粒。
过滤受到孔隙率值的部分影响，使得较大的孔隙率仅过滤较大的微粒而较小的孔隙度过滤较小和较大的孔隙率。用于样品过滤的典型孔隙率值是0.20μm和0.45μm孔隙率。可能需要含有胶质材料或大量细颗粒的样品、相当大的压强来迫使液体样品通过过滤器。因此，对于如土壤提取物或废水等样品，可以使用预滤器或深度过滤床(例如“2-in-l”过滤器)并将其置于膜的顶部以防止与含有这些类型的微粒的样品堵塞。
在某些情况下，不使用过滤器的离心可用于去除微粒，这通常在尿样中进行。例如，将样品离心。然后去除所得上层清液并冷冻。
在已经获得并纯化样品之后，可以分析样品。关于分析血浆样品，有许多元素存在于血浆中，如蛋白质(例如，白蛋白)、离子和金属(例如，铁)、维生素、激素和其它元素(例如，胆红素和尿酸)。可以检测这些元素中的任何元素。更具体地，本发明的系统可以用于检测生物样品中指示疾病状态的分子。
当样品中的靶标分子中的一个或多个是细胞的一部分时，水性介质还可以包括用于裂解细胞的裂解剂。裂解剂是破坏细胞膜完整性由此释放细胞的细胞内的内容物的化合物的化合物或混合物。裂解剂的实例包含但不限于例如非离子清洁剂、阴离子清洁剂、两性清洁剂、低离子强度水性溶液(低渗溶液)、细菌剂、脂肪醛以及使得实施独立裂解的抗体。各种辅助材料可能存在于稀释介质中。水性介质中的所有材料以足够实现期望的效果或功能的浓度或量存在。
在一些实例中，当靶标分子中的一个或多个是细胞的一部分时，可能期望固定样品的细胞。固定细胞使细胞不动并且保留细胞结构并将细胞维持在非常类似于细胞在体内等状况下的状况，并且抗原所关注的状况能够被特异性亲和剂识别。所采用的固定剂的量是保留细胞但不导致随后测定中的错误结果的量。固定剂的量可以取决于例如固定剂的性质和细胞的性质中的一个或多个。在一些实例中，固定剂的量为约0.05重量％到约0.15重量％，或约0.05重量％到约0.10重量％，或约0.10重量％到约0.15重量％。用于执行固定细胞的试剂包含但不限于例如：交联剂，如例如醛试剂(如例如，甲醛、戊二醛和多聚甲醛)；醇类(如例如，C1-C5醇类，如甲醇、乙醇和异丙醇)；酮类(如C3-C5酮类，如丙酮)。命名C1-C5或C3-C5指醇类或酮类中的碳原子数量。可以使用缓冲的水性介质对固定的细胞执行一个或多个冲洗步骤。
如果在固定之后必要，则细胞制备还可以经历透化。在一些实例中，如醇类(例如，甲醇或乙醇)或酮类(例如，丙酮)等固定剂还导致透化，并且不需要额外透化步骤。透化提供通过细胞膜访问感兴趣的靶标分子。所采用的透化剂的量为破坏细胞膜并允许访问靶标分子的量。透化剂的量取决于透化剂的性质和细胞的性质和量中的一个或多个。在一些实例中，透化剂的量为约0.01％到约10％或约0.1％到约10％。用于执行细胞的透化的试剂包含但不限于：醇类(如例如，C1-C5醇类，如甲醇和乙醇)；酮类(如C3-C5酮类，如丙酮)；清洁剂(如例如，皂苷、TRITON X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔-辛基苯基醚缓冲液，可从西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)商购)，以及TWEEN-20(聚山梨醇酯20，可从西格玛奥德里奇公司商购))。可以使用缓冲的水性介质对透化的细胞执行一个或多个冲洗步骤。
引用参考
贯穿本公开已经参考和引用了其它文献，如专利、专利申请、专利出版物、杂志、书籍、论文、网页内容。出于所有目的将所有这些文献特此通过引用以其全文并入本文。
等效物
根据本文档的全部内容，包含对本文所引用的科学专利文献的参考，除了那些在本文中示出并且描述的内容之外，本发明的各种修改及其许多另外实施例对于本领域技术人员将变得显而易见。本文的主题包含重要信息、例证、以及指导，它们可以适合于在本发明的不同的实施例及其等效物中实践本发明。

Claims (27)

1.一种用于从样品中提取分析物的方法，所述方法包括：
将样品引入毛细管中；
使所述毛细管内的所述样品与所述毛细管内的吸附材料相互作用，从而使得从所述样品中提取至少一种分析物并且将其结合到所述吸附材料；
将提取溶剂引入所述毛细管中；以及
使所述提取溶剂与所述吸附材料相互作用以便从所述吸附材料中洗脱所述至少一种分析物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述吸附材料涂覆所述毛细管的壁的一部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述毛细管第一次移动以使所述样品与所述吸附材料相互作用，并且然后第二次移动以使所述提取溶剂在所述样品与所述吸附材料相互作用之后与所述吸附材料相互作用。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品和所述提取溶剂都位于所述毛细管内并且被气隙彼此分离。
5.根据权利要求1所述的方法，其中探针包括所述吸附材料，所述探针被配置成拟合到所述毛细管内。
6.根据权利要求5所述的方法，其中以所述吸附材料进入所述样品的方式将所述探针插入所述毛细管内的所述样品中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中以所述吸附材料进入所述提取溶剂的方式将所述探针从所述样品移动到已经位于所述毛细管内的所述提取溶剂中。
8.根据权利要求6所述的方法，其中从所述毛细管移除所述样品，并且以所述吸附材料与所述提取溶剂相互作用的方式将所述提取溶剂引入所述毛细管。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括分析所述已提取分析物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中分析包括：
向所述毛细管中的包括所述至少一种分析物的所述提取溶剂施加电压，使得将所述分析物排出所述毛细管，由此产生所述分析物的离子；以及
分析所述离子。
11.根据权利要求9所述的方法，其中分析包括：
从所述毛细管中移除包括所述至少一种分析物的所述溶剂；以及
进行分析所述分析物的测定。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂不能与所述样品混溶。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂能够与所述样品混溶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述吸附材料包括与所述至少一种靶标分析物反应的一种或多种分子。
15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括在所述一种或多种分子与所述至少一种靶标分析物之间进行反应以产生反应产物。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括分析所述反应产物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中分析包括：
向所述毛细管中的包括所述反应产物的所述提取溶剂施加电压，使得将所述反应产物排出所述毛细管，由此产生所述分析物的离子；以及
分析所述离子。
18.根据权利要求6所述的方法，其中分析包括：
从所述毛细管移除包括所述反应产物的所述提取溶剂；以及
进行分析所述反应产物的测定。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取溶剂包括与所述至少一种靶标分析物反应的一种或多种分子。
20.根据权利要求19所述的方法，其进一步包括在所述一种或多种分子与所述至少一种靶标分析物之间进行反应以产生反应产物。
21.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括分析所述反应产物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中分析包括：
向所述毛细管中的包括所述反应产物的所述提取溶剂施加电压，使得将所述反应产物排出所述毛细管，由此产生所述分析物的离子；以及
分析所述离子。
23.根据权利要求21所述的方法，其中分析包括：
从所述毛细管移除包括所述反应产物的所述提取溶剂；以及
进行分析所述反应产物的测定。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述吸附材料包含内标。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述内标由所述提取溶剂从所述吸附材料中洗脱。
26.根据权利要求25所述的方法，其进一步包括分析所述内标和所述一种或多种靶标分析物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述分析以定量方式进行。
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