CN102617681A

CN102617681A - 一种提取浓缩s-腺苷蛋氨酸的方法

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Publication number: CN102617681A
Application number: CN2012100651060A
Authority: CN
Inventors: 刘卫; 万江陵; 唐宇翔; 周小顺; 杨祥良
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2012-03-13
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2032-03-13
Also published as: CN102617681B

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，为一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法。该方法采用同步解析支撑液膜分离新技术，在支撑液膜分离体系中，料液相、一级解析相和二级解析相均为水溶液相，通过与水不相溶的有机液膜相连接，形成互不相溶的多相体系，各相通过界面化学反应联成一体，支撑液膜依靠分子间作用力和毛细管作用将含提取剂的有机溶液吸附在疏水性中空纤维膜的微孔支撑体内，利用液膜两侧的界面配位化学反应、液膜内发生的促进传递作用和液膜相与解析相界面发生的解析反应，将欲分离物质从料液相通过液膜相传输到解析相。本发明免去了制乳与破乳工序，使分离过程更为简单可靠，更具有实用性，大幅度降低了成本，易于实现大规模化生产。

Description

一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种利用同步解析支撑液膜分离技术从生物发酵液中提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的新方法。

背景技术

S-腺苷蛋氨酸，又称S-腺苷甲硫氨酸，英文名为S-Adenosyl-methionine(SAM)是蛋氨酸的活性形式。SAM是手性物质，只有(S，S)-SAM，即(-)-SAM有生物活性，其化学结构见图1。

SAM是一种重要的生理活性物质，参与了生物体内多种生化反应，表现出广泛的和多样的治疗作用，对于关节炎、抑郁症、肝功能紊乱等均有较好的疗效，也是预防癌症、心血管疾病和抗衰老的保健药品，具有良好的临床应用前景，国内外对其需求量不断提高。

目前，SAM主要通过生物发酵法生产。但是，多年以来，从生物发酵液中分离纯化SAM一直是一个没有得到很好解决的技术难题。由于SAM和残留的原料L-蛋氨酸(Met)具有相近的理化性质，而且生物发酵液中SAM产物的浓度非常低，采用传统的方法难以分离纯化SAM。同时，由于SAM分子中存在高能巯基，容易受到亲核攻击，发生降解及硫原子上的手性异构反应，导致SAM在分离纯化过程中稳定性差，易失活。

中国发明专利ZL 200510019206.X中提出了一种阳离子交换树脂层析提取法，该方法成本高、分离流程长、生产效率低，而且SAM在长时间分离过程中易发生降解。中国发明专利ZL 20081002015.4中采用三氯乙酸溶剂沉淀法对SAM进行分离。但三氯乙酸毒性大、刺激性强，而且后续处理复杂，成本较高。日本有专利文献报道采用活性碳对发酵液中的杂质进行吸附，但其特异性差，产率低。因此，采用溶剂萃取、沉淀、吸附等传统的分离纯化方法存在工艺繁杂、使用大量有机溶剂、特异性差、效率低、能耗高等问题。

研究开发新的分离纯化技术，从生物发酵液中高效率、低成本的分离纯化SAM，是目前SAM生产中亟待解决的难题。

发明内容

为了克服传统分离方法的缺点，本发明提出一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，该方法可以从生物发酵液中高效率、低成本的分离纯化SAM。

本发明提供的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

(1)以浓度为0.1～100mM的S-腺苷蛋氨酸为料液相，将料液相的pH值调至3.0～3.5；利用第一恒流泵使料液相通过第一中空纤维膜组件的管程进行循环，管程流体的流速为50～1000mL/min、压力为5～12psi；

(2)将有机提取剂和有机溶剂充分混合，得到液膜相有机溶液；配制0.1～1.0mM的弱电解质溶液，调节pH至2.0～2.5，加入0.5～3.0mM的氯化钠，得到一级解析相水溶液；搅拌使一级解析相水溶液以液滴均匀分散在有机液膜相中；待料液相流速和压力稳定后，利用第二恒流泵，使液膜相和一级解析相混合溶液通过第一中空纤维膜组件和第二中空纤维膜组件进行壳程循环，与步骤(1)中的管程流体形成逆向流动，壳程流体的流速为100～1200mL/min、压力为2～5psi，保证管程流体压力始终高于壳程流体压力，压力差为2～6psi，防止液膜相进入料液相中；

(3)将0.1～1.0mM的弱电解质溶液，加酸调节pH至1.0～1.5，加入0.5～2.0mM的氯化钠，得到二级解析相水溶液；利用第三恒流泵使二级解析相溶液通过第二中空纤维膜组件的管程进行循环，与步骤(2)中的壳程流体形成逆向流动；第二中空纤维膜组件中的管程液体的流速为100～1200mL/min、压力为5～10psi，保证管程流体压力始终高于壳程流体压力，压力差为2～6psi，防止液膜相进入二级解析相中；

(4)对料液相、一级解析相、二级解析相取样进行分析，测定其中S-腺苷蛋氨酸和L-蛋氨酸各自的含量，当各相中S-腺苷蛋氨酸和L-蛋氨酸两次测量的浓度差均≤0.05mM时，提取浓缩工艺完成；将一级解析相水溶液与液膜相有机溶液分离，得到S-腺苷蛋氨酸浓缩水溶液。

本发明技术方案中，将少量解析相水溶液通过强力搅拌以微小液滴形式分散在大量的有机液膜相中，有机液膜相通过中空纤维膜组件进行壳程循环，在支载体微孔形成稳定的液膜体系。一方面极大延长了液膜的使用寿命，另一方面，可以依靠解析相分散所形成的巨大的传质比表面，降低被提取物由液膜相进入解析相的传质阻力。同时，由于流体在流动过程中，中空纤维膜表面的有机液膜相与解析相微液滴不断的合并和分离，形成新的液膜和解析相微液滴，强化了传质；强力搅拌产生剪切力作用也降低了液膜的传质阻力。因此，本发明中总传质系数量级达10^-7m/s，显著高于文献报道的现有液膜分离技术中10^-4～10^-6m/s的传质水平。

本发明技术方案中由于解析相水溶液在有机液膜相中的分散过程不使用表面活性剂，因此，上述提取浓缩工艺完成后，将解析相水溶液与液膜相有机溶液静置进行相分离，即得SAM浓缩水溶液，免去了制乳与破乳工序，使分离过程更为简单可靠，更具有实用性。分离后的液膜相有机溶液可循环使用，大幅度降低了成本。

本发明技术方案提取效率高，操作流程短，条件温和，对SAM的提取率最高可达96％，且分离前后SAM旋光度无明显变化，表明提取过程中SAM未发生消旋作用。

本发明建立的同步解析支撑液膜分离技术既可采用间歇操作，也可采用连续化操作，操作简单可控，易于实现大规模化生产，有望在氨基酸和蛋白质等生物活性物质的分离纯化中得到有效应用。

附图说明

图1是S-腺苷蛋氨酸的化学结构。

图2是SAM在溶液中的解离平衡方程(pK_a1＝1.8，pK_a2＝3.4，pK_a3＝7.8，pK_a4＝12.5)。

图3是同步解析支撑液膜分离技术提取浓缩SAM传质过程示意图。

图4是同步解析支撑液膜分离技术提取浓缩SAM过程示意图，其中，1：料液相容器；2：有机液膜相和一级解析相容器；3：二级解析相容器；4、5、6：恒流泵；7、8：中空纤维膜组件；9：强力搅拌器；10、11：球阀；12、13、14、15：压力表。

图5是实施例1提取过程中各相SAM的浓度变化曲线。

图6是实施例2提取过程中各相SAM的浓度变化曲线。

图7是实施例3提取过程中各相SAM的浓度变化曲线。

具体实施方式

本发明采用同步解析支撑液膜分离新技术，在支撑液膜分离体系中，料液相、一级解析相和二级解析相均为水溶液相，通过与水不相溶的有机液膜相连接，形成互不相溶的多相体系，各相通过界面化学反应联成一体组成液膜传输系统。支撑液膜依靠分子间作用力和毛细管作用将含提取剂(载体)的有机溶液吸附在疏水性中空纤维膜的微孔支撑体内，利用液膜两侧的界面配位化学反应、液膜内发生的促进传递作用和液膜相与解析相界面发生的解析反应，将欲分离物质从料液相通过液膜相传输到解析相。

液膜分离具有传质效率高，分离选择性好等特点，传统液膜分离过程包括乳化液膜分离和支撑液膜分离。乳化液膜分离为了维持乳状液一定的稳定性及选择性，需要在膜相中加入大量表面活性剂和添加剂，对于生物活性物质的分离存在提取效率低，后处理困难等难题。现有支撑液膜分离存在液膜相(溶剂和提取剂)从支载体的微孔中损失导致液膜稳定性差，使用寿命短等问题。

本发明方法采用同步解析支撑液膜分离技术从生物发酵液中提取浓缩SAM，具体过程如下：

步骤一：料液相为SAM的生物发酵液，其中SAM的浓度可在0.1～100mM之间，用适量酸将料液相pH值调至3.0～3.5。开动恒流泵，使料液相通过中空纤维膜组件的管程进行循环，控制泵流速为50～1000mL/min，通过球阀控制压力为5～12psi。

步骤二：将有机提取剂和有机溶剂充分混合，得到液膜相有机溶液；配制0.1～1.0mM的弱电解质溶液，加酸调节pH至2.0～2.5，加入0.5～3.0mM的氯化钠，得到一级解析相水溶液；开动强力搅拌器，使一级解析相水溶液以微小液滴均匀分散在有机液膜相中。待料液相流速和压力稳定后，开启恒流泵，使液膜相和一级解析相混合溶液通过中空纤维膜组件进行壳程循环，与管程流体形成逆向流动。调节恒流泵流速为100～1200mL/min，使壳程流体压力为2～5psi，保证管程流体压力始终高于壳程流体压力，压力差为2～6psi，防止液膜相进入料液相中。

步骤三：配制0.1～1.0mM的弱电解质溶液，加酸调节pH至1.0～1.5，加入0.5～2.0mM的氯化钠，得到二级解析相水溶液。开启恒流泵，使二级解析相溶液通过中空纤维膜组件的管程进行循环，与壳程流体形成逆向流动。调节恒流泵流速为100～1200mL/min，使管程流体压力为5～10psi，保证管程流体压力始终高于壳程流体压力，压力差为2～6psi，防止液膜相进入二级解析相中。

步骤四：每隔一段时间(如30min)，对料液相、一级解析相、二级解析相取样进行分析，测定其中SAM和Met的含量。当各相中SAM和Met两次测量的浓度差≤0.05mM时，提取浓缩工艺完成。将一级解析相水溶液与液膜相有机溶液分离，得SAM浓缩水溶液。

上述步骤一中适用于本发明的酸为盐酸、硫酸、醋酸或磷酸。

上述步骤二中适用于本发明的有机提取剂为双(2-乙己基)磺基丁二酸钠(AOT)和二(2-乙基己基)磷酸酯(DEHPA)与氧化三辛基膦(TOPO)形成的复合提取剂，其摩尔比为(2～6)∶(10～50)∶(1～3)。

上述步骤二中适用于本发明的有机溶剂为正丁醇、正己醇、正辛醇或葵醇。

上述步骤二中适用于本发明的弱电解质为磷酸钠、醋酸钠或柠檬酸钠。

上述步骤二中适用于本发明的酸为盐酸、硫酸、醋酸或磷酸。

上述步骤三中适用于本发明的弱电解质为磷酸钠、醋酸钠或柠檬酸钠。

上述步骤三中适用于本发明的酸为盐酸、硫酸、醋酸或磷酸。

适用于本发明的中空纤维膜是疏水性的聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或聚偏氟乙烯中空纤维膜。

SAM在溶液中解离平衡如图3所示。

本发明采用同步解析支撑液膜分离技术提取浓缩SAM发生的传质过程可以通过图4进行说明。

在分离过程中，调节料液相pH值为3.0～3.5，一级解析相pH值为2.0～2.5，二级解析相pH值为1.0～1.5。由SAM在溶液中解离平衡方程可知，当pH＜pK_a1(1.8)和pK_a1(1.8)＜pH＜pK_a2(3.4)时，SAM分子中有大量带正电荷的-NH₃ ⁺。本发明采用双(2-乙己基)磺基丁二酸钠(AOT)作为提取剂，SAM通过-NH₃ ⁺与AOT形成缔合物(SAM-AOT)，将SAM从料液相提取进入有机液膜相中，再采用解析剂(含有反离子Na⁺的盐)，将SAM从有机液膜相解析进入适宜pH的一级解析相水溶液中，从而实现SAM与料液相中大量杂质的分离和浓缩。

料液相中残留原料L-蛋氨酸(Met)(pK_a1≈2.1，pK_a2≈9.3)与SAM理化性质相近，在上述过程中，少量Met也通过-NH₃ ⁺与AOT形成缔合物(Met-AOT)，从料液相中被提取进入有机液膜相，并进一步解析进入一级解析相中。为了除去一级解析相中的少量Met，在本发明的分离体系中加入了复合提取剂DEHPA+TOPO。由于空间位阻效应SAM难以与DEHPA和TOPO结合，而DEHPA和TOPO易与Met形成缔合物(Met-DEHPA-TOPO)而再次进入液膜相中。液膜相中的Met-DEHPA-TOPO可通过H⁺的解析作用进入二级解析相，从而除去一级解析相中的少量Met。

下面以实施例方式对本发明中的技术方案进行说明。本发明中所公开的内容，本领域技术人员可最大限度的应用。因此，本发明所优选的具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明。

实施例1

图4为采用同步解析支撑液膜分离技术提取浓缩SAM过程示意图，现通过图4对本实施例具体技术过程进行描述。

步骤一：料液相容器1中为SAM的生物发酵液，即料液相，其中SAM的浓度为10mM，料液相总体积为800mL，用磷酸调节料液相pH值为3.0。开动恒流泵4，使料液相通过中空纤维膜组件7的管程进行循环，恒流泵流速为400mL/min，通过球阀10控制压力表12压力为9psi。

步骤二：提取剂为AOT/DEHPA/TOPO，摩尔比为5∶30∶2，以正辛醇为溶剂，液膜相体积为800mL。一级解析相体积为400mL，弱电解质溶液为0.5mM的磷酸钠溶液，盐酸调节pH为2.5，加入1.0mM的氯化钠。开动强力搅拌器9，使一级解析相水溶液以微小液滴均匀分散在有机液膜相中。待料液相流速和压力稳定后，开启恒流泵5，使液膜相和一级解析相混合溶液通过中空纤维膜组件7和8进行壳程循环，与管程流体形成逆向流动。调节恒流泵5流速为500mL/min，压力表13压力为4psi，压力表14约3psi。保证压力表12压力始终高于压力表13，防止液膜相进入料液相中。

步骤三：二级解析相体积为800mL，弱电解质溶液为0.5mM的磷酸钠溶液，盐酸调节pH为1.5，加入1.0mM的氯化钠。开启恒流泵6，使二级解析相溶液通过中空纤维膜组件8的管程进行循环，与壳程流体形成逆向流动。调节恒6流泵流速为300mL/min，压力表15压力为7psi。保证压力表15压力始终高于压力表14，防止液膜相进入二级解析相中。

本试验采用聚丙烯中空纤维膜组件，每个组件中含有约1万根中空纤维丝膜，丝膜总有效接触面积为0.58m²，每根丝膜外径为330μm，内径为220μm，膜孔径约0.03μm，孔隙率约40％。

本试验提取时间为300min，图5为提取过程中各相SAM的浓度变化曲线。

根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为4.7*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为91％。

实施例2

步骤一：采用盐酸调节料液相pH值为3.5，恒流泵流速为100mL/min，压力表12压力为5psi，其它条件同实施例1。

步骤二：提取剂AOT/DEHPA/TOPO摩尔比为2∶10∶1，以正丁醇为溶剂，弱电解质溶液为1.0mM的醋酸钠溶液，醋酸调节pH为2.0，加入0.5mM的氯化钠。恒流泵流速为200mL/min，压力表13压力为3psi，压力表14约2psi，其它条件同实施例1。

步骤三：二级解析相中弱电解质溶液为0.5mM的醋酸钠溶液，盐酸调节pH为1.0，加入0.5mM的氯化钠。恒流泵流速为100mL/min，压力表15压力为5psi，其它条件同实施例1。

本试验采用聚丙烯中空纤维膜组件同实施例1。

提取时间为300min，图6为提取过程中各相SAM的浓度变化曲线。

根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为1.3*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为75％。

实施例3

步骤一：采用磷酸调节料液相pH值为3.0，恒流泵流速为800mL/min，压力表12压力为10psi，其它条件同实施例1。

步骤二：提取剂AOT/DEHPA/TOPO摩尔比为6∶50∶3，以葵醇为溶剂，弱电解质溶液为1.0mM的磷酸钠溶液，盐酸调节pH为2.5，加入3.0mM的氯化钠。恒流泵流速为1000mL/min，压力表13压力为5psi，压力表14约4psi，其它条件同实施例1。

步骤三：二级解析相中弱电解质溶液为1.0mM的磷酸钠溶液，盐酸调节pH为1.5，加入2.0mM的氯化钠。恒流泵流速为800mL/min，压力表15压力为10psi，其它条件同实施例1。

本试验采用聚丙烯中空纤维膜组件丝膜总有效接触面积为1.4m²，其它同实施例1所用膜组件。

提取时间为300min，图7为提取过程中各相SAM的浓度变化曲线。

根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为7.6*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为96％。

实施例4

步骤一：料液相中SAM的浓度为0.5mM，采用硫酸调节料液相pH值为3.0，恒流泵流速为300mL/min，压力表12压力为7psi，其它条件同实施例1。

步骤二：提取剂AOT/DEHPA/TOPO摩尔比为2∶30∶1，以正己醇为溶剂，弱电解质溶液为0.3mM的磷酸钠溶液，磷酸调节pH为2.5，加入1.0mM的氯化钠。恒流泵流速为400mL/min，压力表13压力为3psi，压力表14约2psi，其它条件同实施例1。

步骤三：二级解析相中弱电解质溶液为0.5mM的磷酸钠溶液，磷酸调节pH为1.0，加入0.8mM的氯化钠。恒流泵流速为300mL/min，压力表15压力为5psi，其它条件同实施例1。

本试验采用聚乙烯中空纤维膜组件，其基本参数同实施例1所用膜组件。提取时间为300min，根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为0.9*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为85％。

实施例5

料液相中SAM的浓度为40mM，采用聚四氟乙烯中空纤维膜组件，其它试验条件同实施例1。提取时间为300min，根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为4.2*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为83％。

实施例6

料液相中SAM的浓度为40mM，采用聚偏氟乙烯中空纤维膜组件。采用醋酸调节料液相pH值为3.5，一级解析相和二级解析相中弱电解质溶液均为0.5mM的柠檬酸钠溶液，其它试验条件同实施例1。提取时间为300min，根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为0.76*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为59％。实施例7

料液相中SAM的浓度为100mM，其它试验条件同实施例1。提取时间为300min，根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为2.7*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为62％。

实施例8

料液相中SAM的浓度为30mM，其它试验条件同实施例3。提取时间为300min，根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为6.5*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为87％。

实施例9

料液相中SAM的浓度为100mM，其它试验条件同实施例3。提取时间为300min，根据试验结果计算得本操作条件下体系的总传质系数为3.4*10^-7m/s，300min内SAM的提取率为74％。

实施例10

SAM旋光度测定

将实施例1～8提取操作前和操作后的SAM进行旋光度测定，测试仪器采用上海申光仪器仪表有限公司的WZ-2S-2SS型旋光仪，测试温度为25±1℃。测试结果见表1.

由表1的旋光度测试结果可知，本发明中不同试验条件下SAM在提取操作前后的旋光度无明显变化，表明同步解析支撑液膜分离技术条件温和，提取过程中SAM未发生消旋作用。

实施例11

有机液膜稳定性评价

将实施例1～3采用的同步解析支撑液膜分离体系反复进行SAM的提取浓缩试验，连续5次，每次300min，中间间隔60min。在每次提取浓缩过程中，更新料液相和解析相，保持有机液膜相不变，通过测定SAM提取率的变化来评价体系中有机液膜的稳定性。结果显示，在5次连续重复提取浓缩试验中，SAM的提取率没有显著降低，这表明由于本发明采用同步解析支撑液膜分离体系，有机液膜相稳定性好，使用寿命长，克服了常规支撑液膜技术液膜稳定性差的缺点，展现了良好的工业应用前景。

表1 提取分离前后SAM旋光度测试结果

	实例1	实例2	实例3	实例4	实例5	实例6	实例7	实例8
									提取操作前	28.42	28.32	28.38	28.43	28.17	28.25	28.13	28.37
提取操作后	28.15	27.78	28.09	28.21	27.96	28.17	28.01	28.23

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用酸调节料液相的pH值，酸包括盐酸、硫酸、醋酸或磷酸。

3.根据权利要求1或2所述的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述有机提取剂为双(2-乙己基)磺基丁二酸钠(AOT)和二(2-乙基己基)磷酸酯(DEHPA)与氧化三辛基膦(TOPO)形成的复合提取剂，其摩尔比为(2～6)∶(10～50)∶(1～3)。

4.根据权利要求1或2所述的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述有机溶剂为正丁醇、正己醇、正辛醇或葵醇。

5.根据权利要求1或2所述的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，利用酸调节料液相的pH值，酸包括盐酸、硫酸、醋酸或磷酸。

6.根据权利要求1或2所述的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述弱电解质为磷酸钠、醋酸钠或柠檬酸钠。

7.根据权利要求1或2所述的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，中空纤维膜是疏水性的聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或聚偏氟乙烯中空纤维膜。

8.根据权利要求1或2所述的一种提取浓缩S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述弱电解质为磷酸钠、醋酸钠或柠檬酸钠。