CN216274047U - 一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,属于微流控芯片技术领域。所述装置分为两层,第一层包括培养基入口(101)、氨基酸底物入口(102)及浓度梯度形成的通道(103),培养基入口(101)、氨基酸底物入口(102)分别连接至浓度梯度形成的通道(103)的前端;浓度梯度形成的通道(103)由多组弯管构成,其中形成的梯度浓度的前体物能够流向第二层的菌株培养和麦角硫因发酵通道的发酵小室(202);第二层还包括琼脂糖‑高产菌株混合物入口(201)及出口端(203),琼脂糖‑高产菌株混合物入口(201)连接至发酵小室(202),出口端(203)连接至发酵小室(202)的另一端。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,属于微流控芯片技术领域。
背景技术
麦角硫因(L-Ergothioneine,EGT)别名麦角含硫碱、麦硫因等,是一种来源于植物,并且可以在动物中高度积累的天然氨基酸。麦角硫因是天然稀有的手性氨基酸类强抗氧化剂,最初于1909年在麦角真菌中被发现。麦角硫因具有安全、无毒的特点,有很好的抗氧化、预防癌症、抗衰老、美白、消炎祛痘等功效。麦角硫因的应用范围很广,可用于医药、化妆品、食品饮料等领域。其中医药领域,麦角硫因可用于眼科手术、器官移植手术、也可用于生产保健品、医药产品等。
麦角硫因原料的制备方法主要有三种,不同制备工艺所使用的原材料也各不相同。其中化学合成法合成难度大、产率较低导致成本很高,且存在有机溶剂残留问题严重,安全性难以保障等问题。生物提取法主要是从食用菌的子实体、猪血、动物内脏、谷物中提取麦角硫因,但是获得的产品杂质较多,工艺十分复杂,成本高,不适宜产业化发展。
当前发展较快、具有产业化优势的生产工艺主要是生物发酵合成法,该工艺主要是以工程菌为主体的高端发酵技术生物合成制备麦角硫因,不仅生产成本相对较低、且能够保障产品的安全性。但目前基于生物合成法的麦角硫因的产量仍然较低,仅有30%-40%,导致生产成本仍然较高。因此,对麦角硫因的高产菌株的初筛对于生物合成工艺的优化具有至关重要的意义。
实用新型内容
为解决上述问题,本实用新型提供一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,所述装置能够对麦角硫因的生物合成工艺中高产菌株的配比进行筛选,实现高通量筛选高效生物合成麦角硫因的菌株,对利用合成生物学手段高效生产麦角硫因具有重要的应用价值。
[技术方案]
本实用新型提供一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,如图1所示,该微流控装置为一种微流控芯片,其功能是在芯片上接种麦角硫因的生产菌株,并通过加入不同浓度的复配底物刺激,最终优化得到麦角硫因高产菌株初筛的最佳方案。
在一种实施方式中,微流控芯片的整体尺寸为长度8cm-15cm,宽度3cm-8cm,高度为0.1cm-2mm,且基材为PDMS、PMMA,基材与玻璃片键合,键合方式可以是等离子体处理30s-2min。
在一种实施方式中,所述微流控芯片分为两层,第一层包括培养基入口(101)、氨基酸底物入口(102)、及浓度梯度形成的通道(103),第二层为生产菌培养和发酵通道,第一层的浓度梯度形成的通道(103)由多组弯管构成,并连接至第二层;并且,所述浓度梯度形成的通道(103)的前端连接所述培养基入口(101)和所述氨基酸底物入口(102);所述浓度梯度形成的通道(103)中的前体物具有一定的流速,并且形成的梯度浓度的前体物能够流向第二层的所述菌株培养和麦角硫因发酵通道的发酵小室(202)。
在一种实施方式中,所述装置还包括琼脂糖-高产菌株混合物入口(201)及出口端(203),所述琼脂糖-高产菌株混合物入口(201)设置在第二层并连接至所述发酵小室(202),并且所述出口端(203)也设置在第二层并连接至所述发酵小室(202)的另一端。
在一种实施方式中,所述培养基入口(101)和所述氨基酸底物入口(102)分别连接微量注射泵,以保证其流速具有稳定性和一致性。
在一种实施方式中,所述浓度梯度形成的通道(103)中的前体物的流速能够为1μl/min -300μl/min。
在一种实施方式中,所述浓度梯度形成的通道(103)中最终形成梯度浓度的特点为所述氨基酸底物入口(102)最近端浓度最高,最远端浓度最低,从而实现浓度梯度。
在一种实施方式中,所述发酵小室(202)用于生产菌培养和发酵,将生产菌在所述发酵小室(202)中培养,并利用第一层通道中前体物的加入进行发酵和麦角硫因的生产。
在一种实施方式中,所述琼脂糖-生产菌混合物入口(201)的直径为0.5mm-4.5mm。
在一种实施方式中,所述出口端(203)的直径为1mm-5mm;所述出口端(203)的直径大于入口端,便于液体流通。
在一种实施方式中,所述装置能够在发酵完成后,采用超纯水将生成的麦角硫因从所述出口端(203)冲洗出来。
在一种实施方式中,所述装置生成的麦角硫因能够直接进入高效液相色谱仪进行含量测定,从而能够优化出前体物加入的最佳浓度。
在一种实施方式中,所述装置能够实现生产麦角硫因的生物合成生产菌的高通量筛选,减少试剂耗材的使用,缩短整体工作时间,提高工艺筛选的效率,降低研发的周期和成本。
在一种实施方式中,该微流控芯片的整体操作步骤如图2所示,其中具体包括如下步骤:
步骤a:配制1.2%琼脂糖-培养基溶液;
步骤b:将1.2%琼脂糖溶液与一定量的细菌或真菌等比例混合,并通过琼脂糖-高产菌株混合物入口(201)通入发酵小室(202),常温放置30min,使细菌固定在小室中;
步骤c:氨基酸前体物以一定浓度的形式配制,可以为甲硫氨酸-组氨酸、甲硫氨酸-半胱氨酸,组氨酸-半胱氨酸等,比例范围为1:1-1:10;
步骤d:将细菌培养基与步骤c配制的前体物装入注射泵中,分别连接培养基入口(101) 和所述氨基酸底物入口(102),并以一定的流速进入芯片的第一层通道,形成稳定的浓度梯度,前体物进入第二层的发酵小室(202);
步骤e:摇床培养6h-24h;
步骤f:将培养基入口(101)和所述氨基酸底物入口(102)连接含有超纯水的注射泵,超纯水以一定的流速流入,可以使发酵形成的麦角硫因通过出口端(203)流出,并收集每个通道的流出液。
步骤g:利用高效液相色谱仪对每个通道中麦角硫因的浓度进行定量,最终优化出最优的前体物的浓度和配方。
[有益效果]
1.本实用新型的装置能够实现高通量的麦角硫因的生物合成工艺中高产菌的筛选,缩短整体工作时间,提高工艺筛选的效率;
2.本实用新型的装置能够实现集成化、自动化;
3.本实用新型的装置能够平行操作,稳定性高;
4.本实用新型的装置能够减少试剂用量,降低成本。
附图说明
图1为本实用新型提供的微流控装置的总体结构示意图;
图2所示为本实用新型提供的微流控装置的操作流程示意图;
其中,101.培养基入口;102.氨基酸底物入口;103.浓度梯度形成的通道;201.琼脂糖- 生产菌混合物入口;202.发酵小室;203.出口端。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型提出的微流控装置作进一步详细说明。根据下述的说明和权利要求书,本实用新型的优点和特征将更清楚。需说明的是,附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例,仅用以方便、明晰地辅助说明本实用新型实施例的目的。
实施例一
本实施例提供一种用于高产麦角硫因的生物合成工艺初筛的微流控装置,如图1所示,该微流控装置为一种微流控芯片,其功能是在芯片上接种麦角硫因高产菌株,并通过加入不同浓度的复配底物刺激,最终优化出麦角硫因高产菌初筛的最佳方案。
在一种实施方式中,微流控芯片的整体尺寸为长度8cm-15cm,宽度3cm-8cm,高度为0.1cm-2mm,且基材为PDMS、PMMA,基材与玻璃片键合,键合方式可以是等离子体处理30s-2min。
在一种实施方式中,所述微流控芯片分为两层,第一层包括培养基入口101、氨基酸底物入口102、及浓度梯度形成的通道103,第二层为生产菌培养和发酵通道,第一层的所述浓度梯度形成的通道103由多组弯管构成,并连接至第二层;其中,所述浓度梯度形成的通道 103的前端连接至所述培养基入口101和氨基酸底物入口102;所述浓度梯度形成的通道103 中的前体物具有一定的流速,并且形成的梯度浓度的前体物能够流向第二层的所述生产菌培养和发酵通道的发酵小室202。
在一种实施方式中,所述装置还包括琼脂糖-生产菌混合物入口201及出口端203,所述琼脂糖-生产菌株混合物入口201设置在第二层并连接至所述发酵小室202,所述出口端203 也设置在第二层并连接至所述发酵小室202的另一端。
在一种实施方式中,所述培养基入口101和所述氨基酸底物入口102分别连接微量注射泵,以保证其流速具有稳定性和一致性。
在一种实施方式中,所述浓度梯度形成的通道103的流速能够为1μl/min-300μl/min。
在一种实施方式中,所述浓度梯度形成的通道103中最终形成梯度浓度的特点为所述氨基酸底物入口102最近端的浓度最高,最远端浓度最低,从而实现浓度梯度。例如,最终形成的浓度梯度能够为所述氨基酸底物入口102的初始氨基酸底物浓度的100%,93.75%, 81.25%,59.375%,34.375%,15.625%,6.25%。
在一种实施方式中,所述发酵小室202用于菌株的培养和发酵,将生产菌在所述发酵小室(202)中培养,并利用第一层通道中前体的加入进行发酵和麦角硫因的生物合成。
在一种实施方式中,所述琼脂糖-生产菌混合物入口201的直径为0.5mm-4.5mm。
在一种实施方式中,所述出口端203的直径为1mm-5mm。
在一种实施方式中,所述装置能够在发酵完成后,采用超纯水将合成的的麦角硫因从所述出口端203冲洗出来,而细菌则仍然固定在芯片中。
在一种实施方式中,所述装置生成的麦角硫因能够直接进入HPLC进行含量测定,从而能够优化出麦角硫因高产菌初筛的最佳方案。
本实施例还提供一种基于所述微流控芯片的里氏木酶菌丝发酵麦角硫因生产及分离的方法,具体步骤如下:
1)将1.2g琼脂糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于100ml LB培养基(广东环凯微生物科技有限公司)中,80摄氏度加热10min,得到1.2%琼脂糖-培养基溶液;
2)将1.2%琼脂糖溶液与1×107个里氏木酶菌等比例混合,通过201入口进入到小室202,常温放置30min,使里氏木酶菌固定在小室中;
3)混合组氨酸-甲硫氨酸,并溶解于LB培养基中,使其终浓度分别为5-50mg/ml,比例为1:0.5-1:5之间。
4)将培养基与c前体物装入注射泵中,分别连接101入口和102入口,以20μl/min的速度进入第一层芯片,形成稳定的浓度梯度,前体物进入发酵小室202。
5)摇床培养12h,进行麦角硫因的发酵。
6)将101入口和102入口分别连接含有超纯水的注射泵,以50μl/min流速流入,可以将发酵形成的麦角硫因通过出口端203流出,收集每个通道的流出液。
7)利用高效液相色谱仪对每个通道中麦角硫因的浓度进行定量,最终优化出最优的前体物的浓度和配方。
实施例二:
本实施例提供实施例一中所述微流控芯片的制备方法。
根据本实施例的芯片式活体固相微萃取装置系统的制备方法,包括以下步骤:
步骤1):造模;利用AutoCAD构建一定尺寸的掩膜,打印,在单晶硅片上均匀涂抹SU8-2050光刻胶,利用掩膜光刻,未交联的光刻胶通过强碱清洗掉,最终形成具有一定尺寸和形状的第一模具;
步骤2):浇筑、成型、脱模;将聚二甲基硅氧烷与交联剂以质量比10:1比例(在其他实施例中,比例可以为9:1或12:1混合均匀后,倒入第一模具中,利用抽真空的方式使混合液中的气泡浮至表面并用移液枪吹破裂,再放入90℃电热鼓风干燥箱中烘1h左右,获得成型的芯片,用刀片划动四周将成型的芯片脱离第一模具;
步骤3):切割、打孔;用切割刀片正面对着成型的芯片进行切割,形成若干微通道的芯片,再用打孔器(外径1mm)将微通道的入口端和微通道的出口端打在端子的正中间并垂直;打完孔后,可使用胶纸粘贴住芯片,使其保持干净;
步骤4):键合;将芯片的两层按照步骤3)处理后的芯片正面向上放入等离子清洗仪中等离子处理内1min后,将其取出,正面对正面进行贴合,90℃电热鼓风干燥箱烘2h,获得制备的芯片;
实施例三
本实施例提供通过HPLC检测里氏木酶菌丝中麦角硫因的含量。
将流体中每个通道中的麦角硫因收集起来,用0.22μm的水相微孔滤膜过滤后,利用 HPLC检测麦角硫因的浓度,对照品麦角硫因(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)加入蒸馏水溶解至10mg/L进行上样。其中,HPLC检测仪为Agilent 1260Infinity LC,检测柱为Agilent ZOBAX-NH2氨基柱,流速1.0mL/min,进样量10μl,用外标法按峰面积定量。
上述实验结果表明:该菌株在组氨酸-甲硫氨酸1:1比例,以5mg/ml的浓度下发酵12h,能够和合成8mg/g(d.w.)麦角硫因,为最优的前体物比例和浓度。
虽然本实用新型已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本实用新型,任何熟悉此技术的人,在不脱离本实用新型的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本实用新型的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,其特征在于,所述装置分为两层,第一层包括培养基入口(101)、氨基酸底物入口(102)、及浓度梯度形成的通道(103),第二层为生产菌培养和发酵通道;所述浓度梯度形成的通道(103)由多组弯管构成,并连接至第二层;
其中,所述浓度梯度形成的通道(103)的前端连接至所述培养基入口(101)和所述氨基酸底物入口(102);所述浓度梯度形成的通道(103)中的前体物具有流速,并且形成的梯度浓度的前体物能够流向第二层的所述生产菌培养和发酵通道的发酵小室(202);
所述装置还包括琼脂糖-生产菌混合物入口(201)及出口端(203),所述琼脂糖-生产菌混合物入口(201)设置在第二层并连接至所述发酵小室(202),所述出口端(203)也设置在第二层并连接至所述发酵小室(202)的另一端。
2.如权利要求1所述的一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,其特征在于,所述养基入口(101)和所述氨基酸底物入口(102)分别连接微量注射泵,以保证其流速具有稳定性和一致性。
3.如权利要求1所述的一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,其特征在于,所述浓度梯度形成的通道(103)中的前体物的流速为1μl/min-300μl/min。
4.如权利要求1所述的一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,其特征在于,所述浓度梯度形成的通道(103)中最终形成梯度浓度的特点为所述氨基酸底物入口(102)最近端的浓度最高,最远端浓度最低,从而实现浓度梯度。
5.如权利要求1所述的一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,其特征在于,所述发酵小室(202)用于菌株培养和麦角硫因的发酵,将生产菌在所述发酵小室(202)中培养,并利用第一层通道中前体物的加入进行麦角硫因的合成。
6.如权利要求1所述的一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,其特征在于,所述琼脂糖-生产菌混合物入口(201)的直径为0.5mm-4.5mm。
7.如权利要求1所述的一种基于麦角硫因高产菌株工艺初筛的微流控装置,其特征在于,所述出口端(203)的直径为1mm-5mm。
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