CN105085523B - 一种高速逆流色谱分离制备高纯度石杉碱丙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高速逆流色谱分离制备高纯度石杉碱丙的方法。本发明以正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水(体积比为3～5:6:3～5:6)作为高速逆流色谱分离的两相溶剂体系，其中该溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；首先以大流速将固定相泵入至逆流色谱柱中；待柱中充满固定相后，开启逆流色谱仪主机，设定转速，开启主机旋转，然后以一定流速将流动相泵入柱中；待两相在分离柱中达到动态平衡后，通过进样阀将包含有石杉碱丙的样品溶液进样；采用高效液相色谱检测分离样品的纯度，将含有石杉碱丙成分的馏分合并后挥干溶剂，得到纯度大于90％的石杉碱丙。本发明首次利用高速逆流色谱技术分离纯化得到高纯度的石杉碱丙，该方法操作简便、高效快速，且制备量大、纯度高，适用于高纯度石杉碱丙的制备分离。

Description

一种高速逆流色谱分离制备高纯度石杉碱丙的方法

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种应用高速逆流色谱法分离纯化石杉碱丙的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer)是一组原因未明的原发性脑变性疾病,常起病于老年或老年前期，多缓慢发病，并逐渐进展，最终以痴呆为主要表现。随着我国人均期望寿命的提高和老龄化社会的步步逼近，阿尔茨海默病开始大面积地出现在我国老年人群中，对患者及其家庭产生了严重危害。截至2012年底，我国60岁及以上老年人口已达1.94亿，占总人口的14.3％，预计2013年将突破2亿，2034年突破4亿。而据有关资料显示，60岁以上阿尔茨海默病的患者占老龄人口的6％，阿尔茨海默病已成为一个严重的社会问题。因此，寻找和创制对阿尔茨海默病具有显著疗效的新型药物意义重大。

临床实验早已证实石杉碱甲(Huperzine A)治疗阿尔茨海默病的疗效显著，但近年来，由于提取石杉碱甲高额利润的驱使，人们对蛇足石杉地毯式的采收使得该类植物锐减，除了寻找生产石杉碱甲的新途径外，充分利用蛇足石杉资源，挖掘与石杉碱甲等效的石松生物碱势在必行。石杉碱丙(Huperzine C)作为一种与石杉碱甲结构相近的lycodine型生物碱，其AchE活性抑制能力接近石杉碱甲，但由于其含量较低、获得难度较大而未得到足够的重视。

高速逆流色谱(HSCCC)是基于流体动力学平衡而发展起来的色谱技术。它的固定相和流动相由互不相溶的溶剂体系的上下相组成，依据特殊的离心力场将固定相保留在分离柱内，流动相由液相泵带动，不断穿过固定相完成高效、快速、多次、连续萃取。目前HSCCC已在天然产物分离领域获得了巨大成功。而现有文献中未见有应用高速逆流色谱分离纯化石杉碱丙的报道。

针对上述问题，本发明公开了一种应用高速逆流色谱技术分离纯化石杉碱丙单体化合物的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高制备量地分离制备高纯度石杉碱丙的方法，所述方法高效快速，操作简便。

本发明的分离制备方法是通过如下的技术方案实现的：

一种高速逆流色谱分离制备高纯度石杉碱丙的方法，包括如下步骤：

A、分离的两相溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水3～5:6:3～5:6混匀后分层得到；

B、将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；

C、将固定相泵入至逆流色谱柱内，然后开动主机，并按设定转速开启旋转，再向柱内泵入流动相；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡；

D、然后将包含石杉碱丙的样品溶于两相溶剂体系的下相；通过进样阀将样品溶液注入至逆流柱内；

E、收集高纯度石杉碱丙馏分。

上述A步骤中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比为2:3:2:3混合得到。

C步骤中泵入固定相时的流速为20-50mL/min，泵入流动相时的流速为1.2～2.0mL/min。

C步骤中高速逆流色谱的主机转速为800～900rpm。

优选C步骤中泵入流动相时的流速为1.5mL/min；高速逆流色谱的主机转速为900rpm。

上述方法的操作温度为25～35℃，优选25℃。

上述方法使用紫外检测器作为高速逆流色谱的检测器，检测波长为254～365nm。优选检测波长为254nm。

D步骤中所述的包含石杉碱丙的样品为蛇足石杉提取物。

D步骤中包含石杉碱丙的样品溶于两相溶剂体系的下相中的浓度为10-40mg/mL。

本发明所述方法使用的原料为中药蛇足石杉提取物，系参考专利(申请号：200410084633.1)从蛇足石杉中提取得到的生物碱复合成分。

本发明采用自动馏分收集器接收馏分；分离完成后，采用高效液相色谱对收集的馏分进行纯度检测；合并纯度较高的包含石杉碱丙的馏分；随后使用旋转蒸发除去合并馏分中的溶剂，得到石杉碱丙固体；高效液相色谱分析测得最终分离得到的石杉碱丙的纯度为93％。

本发明首次利用高速逆流色谱技术分离纯化得到高纯度的石杉碱丙，该方法具有操作简单、高效快速、制备量大及纯度高等优点，是一种适于大量制备生产高纯度石杉碱丙的方法。

附图说明

图1为实施例1分离石杉碱丙的高速逆流色谱图；

图2为实施例1分离得到的石杉碱丙的高效液相色谱纯度分析图；

图3为对比例2分离石杉碱丙的高速逆流色谱图；

图4为对比例2分离得到的石杉碱丙的高效液相色谱纯度分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

高速逆流色谱法分离纯化蛇足石杉粗提物中的石杉碱丙。

1.样品的制备：使用中药蛇足石杉提取物作为本实施例的样品，该样品是参考专利(申请号：200410084633.1)从蛇足石杉中提取得到，是一生物碱复合物，包含石杉碱丙以及石杉碱甲、石杉碱乙等。利用旋转蒸发仪除去粗提物的溶剂后，得到粗提物浸膏。

2.两相溶剂体系的制备：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照2:3:2:3(v:v)的比例充分混合均匀后，将上、下相分层，并分别使用超声脱气30min，除去溶剂中的气泡。

3.样品溶液的配制：取步骤1中得到的浸膏200mg溶解于5mL两相溶剂体系的下相。

4.仪器：本实施例使用的高速逆流色谱仪为上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300B，纯度分析中使用的高效液相色谱仪为美国戴安公司生产的Ultimate 3000。

5.高速逆流色谱分离：将固定相以20mL/min的流速泵入到逆流色谱柱内，待固定相充满逆流柱后开动主机，设定转速900rpm，待转速达到设定的转速后，以1.5mL/min的流速向柱内泵入流动相；当两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡后，通过进样阀将5mL样品溶液注入至逆流柱内；分离过程中使用紫外检测器对馏分进行检测，波长设定为254nm，采用色谱工作站对数据进行采集与处理，同时采用自动馏分收集器接收馏分，4min每管；所得到的高速逆流色谱图如图1所示，从图中可以看出粗提物中成分较为复杂，而石杉碱丙与其他化合物有较好的分离度。

6.纯度分析：分离完成后，采用高效液相色谱对收集的馏分进行纯度检测，以石杉碱丙的峰面积占总峰面积的百分比来考察分离得到的馏分纯度；色谱分析的条件为：色谱柱WatersODS2(250mm×4.6mm i.d.,5μm)，柱温30℃，流动相为乙腈:0.4％的醋酸水溶液体积比40:60，流速为1.0mL/min，进样量为10μL，检测器为紫外检测器，检测波长为254nm；如图2所示，分离得到的石杉碱丙具有较高的纯度。

7.样品合并：合并纯度较高的石杉碱丙馏分，随后使用旋转蒸发除去合并馏分中的溶剂，得到石杉碱丙固体。高效液相色谱分析测得最终分离得到的石杉碱丙的纯度为93％。

实施例2：

两相溶剂体系采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水1:2:1:2，其余步骤同实施例1。高效液相色谱分析测得最终分离得到的石杉碱丙的纯度为90％以上。

实施例3：

两相溶剂体系采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水5:6:5:6，其余步骤同实施例1，高效液相色谱分析测得最终分离得到的石杉碱丙的纯度为90％以上。

对比例1：

使用本发明方法分离本发明原料中的石杉碱甲或石杉碱乙的效果不理想，纯度均低于50％。

专利200510028714.4和200410052688.4中虽然提供的是采用高速逆流色谱分离石杉碱甲的方法，但石杉碱甲和石杉碱丙结构上的差异导致其极性、亲水性等方面存在差别，进而导致使用上述两个专利所述的方法无法得到高纯度的石杉碱丙。上述的两种方法仅对石杉碱甲有效。

对比例2：

采用与本发明不同比例的两相溶剂体系的高速逆流色谱法分离纯化蛇足石杉粗提物中的石杉碱丙效果不佳，具体如下。

1.样品的制备：使用中药蛇足石杉提取物作为本实施例的样品，该样品是参考专利(申请号：200410084633.1)从蛇足石杉中提取得到，是一生物碱复合物，包含石杉碱丙以及石杉碱甲、石杉碱乙等。利用旋转蒸发仪除去粗提物的溶剂后，得到粗提物浸膏。

2.两相溶剂体系的制备：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照10:6:10:6(v:v)的比例充分混合均匀后，将上、下相分层，并分别使用超声脱气30min，除去溶剂中的气泡。

3.样品溶液的配制：取步骤1中得到的浸膏200mg溶解于5mL两相溶剂体系的下相。

4.仪器：本实施例使用的高速逆流色谱仪为上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300B，纯度分析中使用的高效液相色谱仪为美国戴安公司生产的Ultimate 3000。

5.高速逆流色谱分离：将固定相以20mL/min的流速泵入到逆流色谱柱内，待固定相充满逆流柱后开动主机，设定转速900rpm，待转速达到设定的转速后，以1.5mL/min的流速向柱内泵入流动相；当两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡后，通过进样阀将样品溶液注入至逆流柱内；分离过程中使用紫外检测器对馏分进行检测，波长设定为254nm，采用色谱工作站对数据进行采集与处理，同时采用自动馏分收集器接收馏分，4min每管；所得到的高速逆流色谱图如图3所示，从图中可以看出石杉碱丙与其他化合物之间的分离度较差，出现色谱峰重叠。

6.纯度分析：分离完成后，采用高效液相色谱对收集的馏分进行纯度检测，以石杉碱丙的峰面积占总峰面积的百分比来考察分离得到的馏分纯度；色谱分析的条件为：色谱柱WatersODS2(250mm×4.6mm i.d.,5μm)，柱温30℃，流动相为乙腈:0.4％的醋酸水溶液体积比40:60，流速为1.0mL/min，进样量为10μL，检测器为紫外检测器，检测波长为254nm。

7.样品合并：合并包含石杉碱丙的馏分，随后使用旋转蒸发除去合并馏分中的溶剂，得到石杉碱丙固体，采用高效液相色谱对其纯度进行测定，如图4所示，分析结果显示最终分离得到的石杉碱丙纯度仅为58％。

对比例3：

两相溶剂体系采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水1:6:1:6，其余步骤同实施例1，实验结果显示所得的样品中并未发现石杉碱丙，这是由于目标化合物全部保留在高速逆流色谱柱内，未能成功洗脱。

对比例4：

两相溶剂体系采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水18:6:18:6，其余步骤同实施例1，分析结果显示最终分离得到的石杉碱丙纯度仅为30％。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种高速逆流色谱分离制备高纯度石杉碱丙的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、分离的两相溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水3～5:6:3～5:6混匀后分层得到；

B、将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；

C、将固定相泵入至逆流色谱柱内，然后开动主机，并按设定转速开启旋转，再向柱内泵入流动相；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡；

D、然后将包含石杉碱丙的样品溶于两相溶剂体系的下相；通过进样阀将样品溶液注入至逆流柱内；

E、收集高纯度石杉碱丙馏分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：A步骤中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比为2:3:2:3混合得到。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：C步骤中泵入固定相时的流速为20-50mL/min，泵入流动相时的流速为1.2～2.0mL/min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：C步骤中高速逆流色谱的主机转速为800～900rpm。

5.如权利要求1或3或4所述的方法，其特征在于：C步骤中泵入流动相时的流速为1.5mL/min；高速逆流色谱的主机转速为900rpm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：操作温度为25～35℃。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：操作温度为25℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用紫外检测器作为高速逆流色谱的检测器，检测波长为254～365nm。

9.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于：使用紫外检测器作为高速逆流色谱的检测器，检测波长为254nm。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：D步骤中所述的包含石杉碱丙的样品为蛇足石杉提取物。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：D步骤中包含石杉碱丙的样品溶于两相溶剂体系的下相中，样品浓度为10-40mg/mL。