CN106045984B - 一种双水相萃取-超声波联合分离提纯葛根素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双水相萃取‑超声波联合分离提纯葛根素的方法，具体操作步骤为：将葛根粉采用50‑70％醇水溶液中回流提取12‑24小时得到粗体液，再采用聚乙二醇‑无机盐双水相萃取，并置于超声波中超声20‑40分钟，再静置10‑20分钟，取上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20‑26小时后，再经冷冻干燥得葛根素粉末。本发明选用50‑70％醇水溶液作为提取液，既能获得高收率和高纯度，又能快速分离固液相；选用双水相萃取和超声波联合的方法对粗体液进行提纯，对葛根素的选择性高，体系分相速度快，不需借助离心机等设备即可快速分相，所制葛根素粉末中葛根素纯度高达97.5％，总收率高达86.6％。

Description

一种双水相萃取-超声波联合分离提纯葛根素的方法
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，涉及一种葛根素的分离提纯方法，尤其涉及一种双水相萃取-超声波联合分离提纯葛根素的方法。
背景技术
葛根素，又名葛根黄酮，性状为黄色结晶，溶于水、甲醇、乙醇、吡啶，易溶于热水，难溶于苯、氯仿、乙醚等。葛根素是葛根的主要有效成分，有降低心肌耗氧量，增加冠脉、脑血管血流量，扩张冠状动脉血管和脑血管，促进血液循环等多种功效，临床上用于治疗高血压、心绞痛、脑供血不足、脑梗塞及突发性耳聋等。我国葛根资源非常丰富，因此，研究开发从葛根中分离纯化得到高纯葛根素的优化工艺路线，不仅有利于充分合理地利用葛根资源，通过中药材深加工增加产品的附加值，使药材加工企业和药农增收，而且对实现中药现代化，使中医药产品走向世界具有非常重要的意义。
葛根素的提取工艺种类繁多，但主要可归结为溶剂法(包括水提法、醇提法、正丁醇法)、铅酰法、柱层析法(大孔吸附树脂、硅胶、氧化铝、聚酰胺等)以及这些方法的综合工艺。中国专利CN1057093A将葛根水提醇沉后，经聚酰胺柱层析，以水洗脱、浓缩、放置析出葛根素粗品，粗品再次经聚酰胺柱层析，水洗脱、浓缩、析出结晶，再经冷冻干燥或喷雾干燥或用70-80％醇重复结晶制得精品，其葛根素含量在90％以上。该法操作复杂，步骤繁多，且产品的纯度不高，分析其原因可能是由于葛根中的淀粉、纤维素及一些糖类在水中有一定的溶解度，造成溶液粘稠，分离困难。
双水相萃取技术近年来愈来愈得到研究者的青睐，其相对传统的分离纯化技术具有提纯效率高、设备常规、操作简便，适于大规模生产等优点，且不存在有机溶剂的残留问题，易于放大和连续操作，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。双水相萃取是利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。然而现有的双水相萃取技术需要在体系分相后辅以离心等操作，从而加速系统分相，并向体系中加入中性盐KCl增加目标产物的分配系数和收率增加了操作难度和经济成本。因此，开发一种步骤简单，设备常规，分离效果好，分离效率高的双水相萃取分离葛根素的方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种双水相萃取-超声波联合分离提纯葛根素的方法，所用设备常规，操作简便，分离效率高，适合工业化生产。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种高效分离提纯葛根素的方法，包括如下步骤：
(1)粗提液制备：将葛根粉加入50-70％醇水溶液中回流提取12-24小时后，冷却至室温过滤，再经浓缩得含葛根素的粗提液。葛根中的葛根素、淀粉、纤维素及一些糖类都具有较好的水溶性，水提法葛根素的得率较高，但含量较低，且操作中固液分离较困难；纯醇提法，虽葛根素纯度高，但得率较低，因此本发明选用50-70％醇水溶液作为提取溶剂，既能获得高收率和高纯度，又能快速分离固液相。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含葛根素的粗提液中加入聚乙二醇和无机盐，震荡混合后，置于超声波中超声20-40分钟后，静置10-20分钟，收集上相。双水相萃取体系由互不相溶的聚乙二醇和无机盐构成，利用葛根素在聚乙二醇和无机盐中的选择性分配，使其与粗提液中其他杂质分离，从而达到分离纯化的目的。然而单纯双水相萃取分相速度较慢，通常需要静置4-6小时后，再在离心作用下才能分相，且所得葛根素的纯度不高。本发明在加入双水相萃取液的同时，辅以超声作用，能够加快分子运动，从而加快分相速度，提高体系的分配系数，在短时间内获得葛根素含量较高的上相。
(3)成品制备：将步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20-26小时后得葛根素水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥10-18小时得葛根素粉末。
作为优选，步骤(1)中所述醇为甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇中的一种。
作为优选，步骤(1)中葛根粉与醇水溶液的质量比为1:25～50。
作为优选，步骤(2)中无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的一种。
作为优选，步骤(2)中所述聚乙二醇的平均分子量为600或1000。聚乙二醇的分子量是影响葛根素分配系数和纯度的重要因素，随着PEG分子量的增加，端羟基数目减少，分子内羟基等极性基团的比重相对较低，从而导致极性程度减小，疏水性增强，亲水性的葛根素不再向富含PEG相(上相)中聚集而转向另一相(下相)。当PEG的分子量较小时，虽分配系数较大，但成相所需PEG浓度较高，成本增加，而对葛根素选择性降低。因此本发明选用平均分子量为600或1000的PEG，对葛根素的选择性最佳。
作为优选，步骤(2)中所述聚乙二醇质量为双水相体系总质量的15-20％，无机盐质量为双水相体系总质量的12-18％，含葛根素的粗提液的质量为双水相体系总质量的64-70％。不同浓度组成的双水相体系萃取效果不同，聚乙二醇浓度过低，分相困难；随着聚乙二醇浓度在一定范围内的增加，双水相体系两相差别较大，利于葛根素在上相中富集，其他水溶性杂质在下相中富集，但是随着聚乙二醇浓度继续增大，更多的杂质进入上相，使上相中葛根素的纯度降低。随着无机盐浓度在一定范围内的提高，物质在两相中界面张力增大，有利于葛根素在上相富集，杂质在下相富集；当无机盐浓度更大时，上相体积逐渐减小，同时粘度逐渐增大，不利于葛根素在上相的富集。
本发明的有益效果为：
1、本发明选用50-70％醇水溶液作为提取液，既能获得高收率和高纯度，又能快速分离固液相。
2、本发明选用双水相萃取和超声波联合的方法对粗体液进行提纯，对葛根素的选择性高，体系分相速度快，不需借助离心机等设备即可快速分相。
3、采用本发明所述方法制得葛根素粉末中葛根素纯度高达97.5％，总收率高达86.6％。
4、本发明所采用的分离纯化方法，操作简便，设备常规，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
(1)葛根素粗提液的制备
将10g葛根粉加入250g 70％乙醇-水溶液中，于索氏提取器中回流提取浸泡12小时后，冷却至室温，过滤，并减压蒸馏浓缩得31.2g葛根素粗提液，葛根素纯度为30.2％，收率为94.3％。葛根素的纯度采用高效液相色谱测量，流动性为50％甲醇-水溶液，流速为1mL/min，柱温为室温。
(2)双水相萃取
取14g含葛根素的粗提液、3g PEG600和3g硫酸铵加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声30分钟，静置10分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20小时后得葛根素水溶液，再于-15℃冷冻干燥10小时得13.2g葛根素粉末，其中葛根素的纯度为97.5％，回收率为91.8％，总收率为86.6％。
实施例2
(1)葛根素粗提液的制备
将10g葛根粉加入400g 60％乙醇-水溶液中，于索氏提取器中回流提取浸泡20小时后，冷却至室温，过滤，并减压蒸馏浓缩得31.4g葛根素粗提液，葛根素纯度为29.5％，收率为92.7％。
(3)双水相萃取
取12.8g含葛根素的粗提液、3.6g PEG 1000和3.6g硫酸钠加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声20分钟，静置20分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析25小时后得葛根素水溶液，再于-15℃冷冻干燥15小时得12.3g葛根素粉末，其中葛根素的纯度为94.6％，回收率为90.6％，总收率为84％。
实施例3
(1)葛根素粗提液的制备
将10g葛根粉加入500g 50％乙醇-水溶液中，于索氏提取器中回流提取浸泡24小时后，冷却至室温，过滤，并减压蒸馏浓缩得30.1g葛根素粗提液，葛根素纯度为30.7％，收率为92.3％。
(3)双水相萃取
取13.6g含葛根素的粗提液、4g PEG 600和2.4g硫酸铵加入锥形瓶中，震荡混合后，置于超声波中超声40分钟后，静置10分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为5000的透析膜中透析26小时后得葛根素水溶液，再于-15℃冷冻干燥18小时得13.3g葛根素粉末，其中葛根素的纯度为95.6％，回收率为93.2％，总收率为86％。
比较例1
(1)葛根素粗提液的制备
将10g葛根粉加入250g 70％乙醇-水溶液中，于索氏提取器中回流提取浸泡12小时后，冷却至室温，过滤，并减压蒸馏浓缩得31.2g葛根素粗提液，葛根素纯度为30.2％，收率为94.3％。葛根素的纯度采用高效液相色谱测量，流动性为50％甲醇-水溶液，流速为1mL/min，柱温为室温。
(2)双水相萃取
取14g含葛根素的粗提液、3g PEG600和3g硫酸铵加入锥形瓶中，震荡混合后，静置20分钟后不分相，需要静置4-6小时，并辅助以离心体系才能完全分层。
通过对比比较例1和实施例1，可以发现，双水相萃取联合超声处理能够加快双水相萃取体系的分相速度，提高产品纯度和收率。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (4)

1.一种双水相萃取-超声波联合分离提纯葛根素的方法，其特征在于，所述分离提纯葛根素的方法包括如下步骤：
(1) 粗提液制备：将葛根粉加入50-70%醇水溶液中回流提取12-24小时后，冷却至室温过滤，再经浓缩得含葛根素的粗提液；
(2) 双水相萃取：向步骤(1)所得含葛根素的粗提液中加入聚乙二醇和无机盐，震荡混合后，置于超声波中超声20-40分钟，再静置10-20分钟，收集上相；
(3) 成品制备：将步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为5000的透析膜中透析20-26小时后得葛根素水溶液，再于-15 ~ -10℃冷冻干燥10-18小时得葛根素粉末；
步骤(2)中所述聚乙二醇的平均分子量为600或1000；
步骤(2)中所述聚乙二醇质量为双水相体系总质量的15-20%，无机盐质量为双水相体系总质量的12-18%，含葛根素的粗提液的质量为双水相体系总质量的64-70%。
2.如权利要求1所述分离提纯葛根素的方法，其特征在于，步骤(1)中所述醇为甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇中的一种。
3.如权利要求1所述分离提纯葛根素的方法，其特征在于，步骤(1)中所述葛根粉与醇水溶液的质量比为1:25~50。
4.如权利要求1所述分离提纯葛根素的方法，其特征在于，步骤(2)中所述无机盐为硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的一种。
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