CN108003217A

CN108003217A - 一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法

Info

Publication number: CN108003217A
Application number: CN201711403318.4A
Authority: CN
Inventors: 佘志刚; 黄锡山; 潘亚宏; 李闯彪; 梅秀丽
Original assignee: Guangzhou Golden Cicadas Technology Co Ltd; National Sun Yat Sen University
Current assignee: Guangzhou Golden Cicadas Technology Co Ltd; Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108003217B

Abstract

本发明属于提取分离技术领域，具体公开了一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法，包括超声波法制备过氧麦角甾醇粗提取物、亲脂溶剂富集、大孔树脂分离纯化、结晶纯化等步骤。本发明采用超声波提取，具有提取温度低、提取时间短、效率高等优点，提高了过氧麦角甾醇的提取效率，还采用了对过氧麦角甾醇吸附效果好的大孔树脂，提高了过氧麦角甾醇的产率。本发明所提供的方法操作简单，制备得到的过氧麦角甾醇纯度高、产率高，工艺稳定性好，生产成本低，适合规模化生产，具有较好的应用前景。

Description

一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法

技术领域

本发明涉及提取分离技术领域，具体地，涉及一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法。

背景技术

蝉虫草是一种食药用真菌，属于虫生真菌，是传统名贵中药材，虫草全株可入药，据现代药理研究发现，蝉虫草主要有免疫调节作用、抗肿瘤作用、镇痛安眠缓解精神压力、促进血液红细胞再生改善血液环境状态、滋补肾亏肾虚、改善糖尿病性视网膜病变等多种药理作用等。

近年来的研究表明，蝉虫草在生物医药领域，尤其功能性保健食品方面也具有很大的开发潜力。文献报道的蝉虫草活性成分主要有多球壳菌素、麦角甾醇及过氧化物、虫草酸、虫草素、腺苷以及多种肽类化合物，如白僵菌素、白僵菌酮、白僵菌酮甲、白僵菌素甲以及白僵菌素乙等，具有重要的药用价值。其中，过氧麦角甾醇属于甾醇类化合物，多发现于真菌菌体中，是近年来食用真菌中发现的具有较广泛生物活性的小分子次级代谢产物，具有抗氧化、抗结核、抗炎、抗动脉粥样硬化及抗癌等多种药理活性，有重要的药用价值。

目前过氧麦角甾醇提纯分离纯化技术的报道较少，且尚未见蝉虫草来源的且能达到95％以上纯度的过氧麦角甾醇提取方法的报道。同时，为充分利用和开发蝉虫草资源在医药、食品等方面可能的应用价值，也需要一种能高效提取蝉虫草过氧麦角甾醇的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术的上述不足，针对过氧麦角甾醇的特性提供了一种合适产业化的工艺，该工艺简单，具有高效、成本低、产率高等特点，能高效提取蝉虫草中的过氧麦角甾醇，得到高纯度的过氧麦角甾醇。

本发明的目的是提供一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法，包括以下步骤：

S1.制备蝉虫草干粉并加入有机溶剂，经超声波提取3～4次，提取液经减压浓缩后得过氧麦角甾醇粗提物；

S2.将S1所得过氧麦角甾醇粗提物经亲脂溶剂富集，浓缩干燥后得过氧麦角甾醇粗提物A；

S3.将S2所得过氧麦角甾醇粗提物A用60～100％乙醇水溶液溶解，经大孔树脂分离后收集70～90％乙醇的过氧麦角甾醇流份，流份合并浓缩干燥，得过氧麦角甾醇提取物B；

S4.将S3所得过氧麦角甾醇粗提物B用乙酸乙酯-石油醚混合溶液水浴加热溶解后，于10～20℃冷却结晶，过滤并洗涤沉淀后即得高纯度过氧麦角甾醇。

本发明采用超声波提取，具有提取温度低、提取时间短、效率高等优点，提高了过氧麦角甾醇的提取效率，S2所得过氧麦角甾醇粗提物A中过氧麦角甾醇的含量为15～30％；采用对过氧麦角甾醇吸附效果好的大孔树脂，提高了过氧麦角甾醇的产率，S3所得过氧麦角甾醇粗提物B中过氧麦角甾醇的含量为70～90％；经S4结晶过滤并洗涤沉淀后得到结晶型过氧麦角甾醇，纯度为99％以上。

优选地，S1中所述蝉虫草干粉为蝉虫草孢梗束干粉。本发明经研究发现蝉虫草的孢梗束部位含有丰富的过氧麦角甾醇化合物，从蝉虫草的孢梗束部位中提取过氧麦角甾醇的总产率为2～5％。

优选地，所述蝉虫草干粉的制备为将蝉虫草干燥后，超微粉碎，过80～120目筛。

由于过氧麦角甾醇为亲脂性化合物，不同的极性溶剂对其溶解度或提取率有着很大影响。本发明选择有机溶剂中的乙醇或甲醇作为极性溶剂，有利于过氧麦角甾醇的溶解度或提取率达最大值。

优选地，S1中所述有机溶剂为50～95％乙醇水溶液或60～100％甲醇水溶液。更优选地，S1中所述有机溶剂为75％乙醇水溶液。

优选地，S1中所述干粉和有机溶剂的质量体积比为1g：1～3mL。

优选地，S1中所述超声波的频率为20～30kHz，时间为0.5～2h/次，温度为60～100℃。更优选地，S1中所述超声波的频率为30kHz，时间为0.5h/次，温度为60℃。

优选地，S1中所述超声波提取次数为3次。

由于过氧麦角甾醇为亲脂性化合物，不同的亲脂溶剂对其溶解度或提取率有着很大影响。本发明选择乙酸乙酯和石油醚作为亲脂溶剂，有利于过氧麦角甾醇的溶解度或提取率达最大值。

优选地，S2中所述亲脂溶剂为体积比50～80％乙酸乙酯和20～50％石油醚的混合物，或体积比60～80％乙酸乙酯和20～40％甲醇的混合物。

更优选地，S2中所述亲脂溶剂为体积比70％乙酸乙酯和30％石油醚的混合物，或体积比70％乙酸乙酯和30％甲醇的混合物。

优选地，S3中所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。本发明选用D101大孔吸附树脂，能选择性地对亲水性组分和亲脂性组分达到最佳分离效果，具有操作简单、成本低的优点。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用超声波提取，具有提取温度低、提取时间短、效率高等优点，提高了过氧麦角甾醇的提取效率，还采用了对过氧麦角甾醇吸附效果好的大孔树脂，提高了过氧麦角甾醇的产率。本发明所提供的方法操作简单，制备得到的过氧麦角甾醇纯度高、产率高，工艺稳定性好，生产成本低，适合规模化生产，具有较好的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、方法1：一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法，包括以下步骤：

(1)制备蝉虫草干粉并加入75％乙醇水溶液，经超声波提取3次，提取液合并后经减压浓缩得过氧麦角甾醇粗提物；所述超声波的频率为30kHz，时间为0.5h/次，温度为60℃；

(2)将步骤(1)所得过氧麦角甾醇粗提物经亲脂溶剂富集，浓缩干燥后得过氧麦角甾醇粗提物A；所述亲脂溶剂由以下体积分数的组分组成：70％乙酸乙酯和30％石油醚；

(3)将步骤(2)所得过氧麦角甾醇粗提物A用70％乙醇水溶液溶解，经D101大孔吸附树脂分离纯化后收集70～90％乙醇的过氧麦角甾醇流份，流份合并浓缩干燥，得过氧麦角甾醇提取物B；

(4)将步骤(3)所得过氧麦角甾醇粗提物B用乙酸乙酯-石油醚混合溶液水浴加热溶解后，于10～20℃冷却结晶，过滤并洗涤沉淀后即得高纯度过氧麦角甾醇。

经测谱鉴定，过氧麦角甾醇的纯度在80～84％范围内。

2、方法2：从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法，包括以下步骤：

(1)制备蝉虫草干粉并加水充分溶解，溶液经乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压蒸干得浸膏；

(2)浸膏加甲醇适量溶解，加入适量D101大孔树脂至糊状，减压浓缩至干。层析柱装柱，以MeOH：H₂O＝1：0～9梯度洗脱，按份收集，得到过氧麦角甾醇。

经测谱鉴定，过氧麦角甾醇的纯度在65～71％范围内。

实施例2蝉虫草不同部位过氧麦角甾醇含量的分析

对蝉虫草不同部位的过氧麦角甾醇的含量进行分析：蝉虫草分为基座、孢梗束以及孢子粉三个部位，取三个部位分别粉碎后，采用超声波法提取3次(在60℃水浴条件下，用75％乙醇水溶液分别进行超声波提取)，将提取液合并后经减压浓缩分别得到基座提取物浸膏、孢梗束提取物浸膏以及孢子粉提取物浸膏，经标准品对照分析各浸膏中过氧麦角甾醇的含量，结果如表1所示，蝉虫草的孢梗束部位含有丰富的过氧麦角甾醇化合物。

表1过氧麦角甾醇在蝉虫草不同部位中的含量

实施例3

一种从蝉虫草的孢梗束中提取过氧麦角甾醇的方法，包括以下步骤：

1、制备孢梗束部位的提取物

将孢梗束粉碎，加入75％乙醇水溶液，经超声波提取3次，所述超声波的频率为30kHz，时间为0.5h/次，温度为60℃，提取液合并后经减压浓缩得到孢梗束提取物浸膏。

经分析该浸膏中过氧麦角甾醇含量达16.5％。

2、亲脂溶剂富集过氧麦角甾醇

将步骤1所得浸膏经亲脂溶剂富集，浓缩干燥后得过氧麦角甾醇粗提物A；所述亲脂溶剂由以下体积分数的组分组成：70％乙酸乙酯和30％石油醚。经分析过氧麦角甾醇粗提物A中过氧麦角甾醇含量26.2％。

3、大孔树脂分离纯化

将步骤2所得过氧麦角甾醇粗提物A用70％乙醇水溶液溶解，利用D101大孔吸附树脂进一步分离纯化，洗脱梯度依次为水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇，收集70～90％乙醇的过氧麦角甾醇流份，流份合并浓缩干燥，得过氧麦角甾醇提取物B。经分析过氧麦角甾醇粗提物B中过氧麦角甾醇含量76.5％。

4、结晶纯化

将步骤3所得过氧麦角甾醇粗提物B用乙酸乙酯-石油醚混合溶液水浴加热溶解后，于10～20℃冷却结晶，过滤并洗涤沉淀后即得到结晶型过氧麦角甾醇。

经测谱鉴定，过氧麦角甾醇的纯度为99％以上。

实施例4提取方法的工艺优化

1、实验方法

(1)正交实验设计

正交实验设计以考察过氧麦角甾醇纯度为指标，实验中选择超声波时间、超声波温度、有机溶剂、亲脂溶剂等四个因素三个水平的考察。得到的过氧麦角甾醇经测谱鉴定其纯度。

表2过氧麦角甾醇提取的正交实验因素表

(2)超声波时间的选取

根据方差分析，超声波时间在低于或高于0.5h时具有显著差异(p＜0.05)。因此，本实验选取超声波时间为0.5、1、2h/次进行正交实验。

(3)超声波温度的选取

选取超声波时间0.5h/次，有机溶剂为75％乙醇水溶液，亲脂溶剂为70％乙酸乙酯和30％石油醚，考察不同超声波温度时，超声波温度为60℃时所得过氧甾醇纯度较高，因此，超声波温度考察60、80、100℃。

(4)有机溶剂的选取

选取超声波时间0.5h/次，超声波温度60℃，亲脂溶剂为70％乙酸乙酯和30％石油醚，考察不同有机溶剂时，有机溶剂为75％乙醇水溶液时所得过氧甾醇纯度较高，因此，有机溶剂考察50、75、90％乙醇水溶液。

(5)亲脂溶剂的选取

选取超声波时间0.5h/次，超声波温度60℃，有机溶剂为75％乙醇水溶液，考察不同亲脂溶剂时，亲脂溶剂为70％乙酸乙酯和30％石油醚时所得过氧甾醇纯度较高，因此，亲脂溶剂考察50％乙酸乙酯和50％石油醚、70％乙酸乙酯和30％石油醚、80％乙酸乙酯和20％石油醚。

2、结果

由正交实验的分析结果显示，影响过氧甾醇纯度最显著的因素是超声波温度，其次为超声波时间、亲脂溶剂、有机溶剂，根据极差分析得到的最优萃取条件组合A₁B₁C₂D₂，即超声波时间为0.5h/次，超声波温度为60℃，有机溶剂为75％乙醇水溶液，亲脂溶剂为70％乙酸乙酯和30％石油醚。在最佳工艺条件下对蝉虫草中的过氧麦角甾醇进行3次提取平行试验，平均过氧麦角甾醇纯度为99％。

Claims

1.一种从蝉虫草中提取过氧麦角甾醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3.将S2所得过氧麦角甾醇粗提物A用60～100%乙醇水溶液溶解，经大孔树脂分离后收集70～90%乙醇的过氧麦角甾醇流份，流份合并浓缩干燥，得过氧麦角甾醇提取物B；

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述蝉虫草干粉为蝉虫草孢梗束干粉。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述蝉虫草干粉的制备为将蝉虫草干燥后，超微粉碎，过80～120目筛。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述有机溶剂为50～95%乙醇水溶液或60～100%甲醇水溶液。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述干粉和有机溶剂的质量体积比为1g：1～3mL。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述超声波的频率为20～30kHz，时间为0.5～2h/次，温度为60～100℃。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述超声波提取次数为3次。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S2中所述亲脂溶剂为体积比50～80%乙酸乙酯和20～50%石油醚的混合物，或体积比60～80%乙酸乙酯和20～40%甲醇的混合物。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，S2中所述亲脂溶剂由以下体积分数的组分组成：70%乙酸乙酯和30%石油醚。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3中所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。