CN101921822A - S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法及d-甲硫氨酸分离方法 - Google Patents

S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法及d-甲硫氨酸分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法及D-甲硫氨酸分离方法，该方法是在酵母生产S-腺苷甲硫氨酸过程中，利用廉价DL-甲硫氨酸代替L-甲硫氨酸，而且可将DL-甲硫氨酸中的D-甲硫氨酸分离出来加以利用。本发明优点在于降低发酵法生产S-腺苷甲硫氨酸的成本的同时可以分离得到具有广泛用途的D-甲硫氨酸。

Description

S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法及D-甲硫氨酸分离方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及发酵法生产S-腺苷-L-甲硫氨酸的方法和获得D-甲硫氨酸的方法。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是生物细胞内广泛存在的一种重要小分子，在临床上有许多用途，如治疗肝病、抑郁症、关节炎等多种疾病。
通常的SAM生产方法是微生物发酵法。在酿酒酵母发酵生产SAM中，前体L-甲硫氨酸是主要的成本消耗，占到生产成本的50％以上。由于SAM能治疗多种疾病，所以市场需求量很大，但是受到生产成本的制约，在国内很难实现大规模生产。
DL-甲硫氨酸是一种D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸共同存在的混旋型的甲硫氨酸，其中D型和L型各占一半。由于化学法制备的甲硫氨酸多是混旋型，纯的D型和L型甲硫氨酸都是由混旋型DL-甲硫氨酸分离精制而成，因此纯的D型和L型甲硫氨酸成本是混旋型甲硫氨酸的3倍以上。如果在发酵生产SAM中，能直接用DL-甲硫氨酸作为前体，菌体有选择性地利用L-甲硫氨酸进行转化，使生产成本大大降低，有利于工业化生产。
D-甲硫氨酸是一种重要含硫的有机手性源，主要应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域，在制药行业作为手性合成的手性源。作为一种光学活性的有机酸，在某些手性化合物的不对称合成过程中具有不可替代的作用，目前主要用于生产新型广谱抗生素、D-甲硫氨醇、多肽合成过程的甲硫氨酸保护剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种利用DL-甲硫氨酸来发酵生产SAM的方法。与现有技术相比，该法可有效节约生产成本。
本发明技术方案如下：
酵母菌种子培养液加入初始发酵培养基中，进行培养，发酵12小时后开始流加葡萄糖，维持糖浓度在0.1-2g/L。在菌体生物量干重达5-160g/L后，添加DL-甲硫氨酸，DL-甲硫氨酸的添加量占初始发酵培养基的比例为5-100g/L.在发酵过程中通入0.5-3.5vvm(每升发酵液中每分钟通入的空气升数)的空气，搅拌转速300-900转，控制pH 5.0-6.0，菌体生长过程中产酸由氨水中和，在50-70小时结束发酵，用液相方法测定S-腺苷甲硫氨酸产量。
所述初始发酵培养基组成如下：葡萄糖5％，酵母粉：1.5％，麦芽浸粉：0.5％，磷酸氢二铵：1％，硫酸镁：0.5％，玉米浆：1％，糖蜜：4％，磷酸氢二钾：0.1％，磷酸二氢钾：0.1％，Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+：100ppm，比例为重量百分比。
所述酵母菌为酿酒酵母、麦芽糖假丝酵母或热带假丝酵母。
本发明的另一个目的是提供一种生物法拆分DL-甲硫氨酸中D-甲硫氨酸的方法，即D-甲硫氨酸的分离方法。
酵母菌发酵液用去离子水稀释后，离心除去菌体和固形物，然后取上清液进行活性炭吸附后用苯乙烯系阳离子交换树脂进行吸附，用去离子水洗去杂质，再用盐酸溶液洗脱，调节pH至碱性，再用苯乙烯系阴离子交换树脂再次吸附，并用盐酸溶液洗脱，总收率可达70％以上，其中D型所占比例达99％以上。
有益效果：
本发明的优点是：现行工艺中用L-甲硫氨酸作为前体生产SAM，本发明中，以两倍量的DL-甲硫氨酸代替L-甲硫氨酸，可以获得相当的产量。但是DL-甲硫氨酸的市场价仅相当于L-甲硫氨酸的30％，生产等量的SAM可节约40％的甲硫氨酸成本，这对工业大规模生产来说，节省了一笔不小的费用。同时本发明提供了一种利用微生物拆分手性甲硫氨酸的方法。发酵液上清液经预处理后，可用离子交换树脂进行两步吸附分离D-甲硫氨酸，总收率达75％以上，纯度达99％。
由于通过实验研究确定的酿酒酵母、麦芽糖假丝酵母或热带假丝酵母只能利用L-甲硫氨酸，不能利用D-甲硫氨酸。因此发酵结束后D-甲硫氨酸绝大部分残留在发酵液中，L-甲硫氨酸基本被消耗光。因此我们可以将发酵液中D-甲硫氨酸分离出来，达到了拆分DL-甲硫氨酸中D-甲硫氨酸的目的。
具体实施方式：
具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本发明中S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法及D-甲硫氨酸分离方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实例1：在5L罐中培养酿酒酵母生产SAM中添加50克L-甲硫氨酸
在5L发酵罐中培养酿酒酵母CGMCC2.1450(购于中国工业微生物菌种保藏中心)，3.5L发酵培养基组成为：葡萄糖5％，酵母粉：1.5％，麦芽浸粉：0.5％，磷酸氢二铵：1％，硫酸镁：0.5％，玉米浆：1％，糖蜜：4％，磷酸氢二钾：0.1％，磷酸二氢钾：0.1％，Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+含量均为100ppm的初始发酵培养基，在发酵12小时开始流加70％的葡萄糖。维持糖浓度在1g/L。发酵条件为：接种量15％，发酵温度30℃，空气通入量为3vvm，搅拌转速700转，控制发酵pH为5.4.在发酵生物量干重达100g/L时，开始添加50克L-蛋氨酸。在发酵64小时，S-腺苷蛋氨酸产量达最高值15.25克/L，生物量干重达到178g/L。
实例2：在5L罐中培养酿酒酵母生产SAM中添加100克DL-甲硫氨酸
在5L发酵罐中培养酿酒酵母，所用菌种和发酵培养基如实例1。发酵条件为：接种量15％，发酵温度30℃，空气通入量为3vvm，搅拌转速700转，控制发酵pH为5.4。在发酵12小时开始流加70％的葡萄糖。维持糖浓度在2g/L。在发酵生物量干重达100g/L，开始添加100克DL-甲硫氨酸。发酵64小时，S-腺苷蛋氨酸产量达最高值15.46g/L，生物量干重达180g/L。发酵液中剩余D-甲硫氨酸48克，占发酵液中总甲硫氨酸的99％以上。
实例3：在5L罐中培养麦芽假丝酵母生产SAM中添加100克DL-甲硫氨酸
在5L罐中培养麦芽糖假丝酵母CICC1962，发酵培养基如实例1。优选发酵条件为：接种量10％，发酵温度30℃，空气通入量为1.0vvm，搅拌转速700转，控制发酵pH为6.0。在发酵12小时开始流加70％的葡萄糖。维持糖浓度在0.5g/L。在发酵生物量干重达60g/L，开始添加100克DL-甲硫氨酸。发酵56小时，S-腺苷蛋氨酸产量达7.4g/L，生物量干重达100g/L。发酵液中剩余D-甲硫氨酸46克，占发酵液中总甲硫氨酸的99％以上。
实例4：在5L罐中培养热带假丝酵母生产SAM中添加100克DL-甲硫氨酸
在5L罐中培养热带假丝酵母CICC32828，发酵培养基如实例1。优选发酵条件为：接种量15％，发酵温度30℃，空气通入量为2.0vvm，搅拌转速700转，控制发酵pH为5.5。在发酵12小时开始流加70％的葡萄糖。维持糖浓度在1g/L。在发酵生物量干重达100g/L，开始添加100克DL-甲硫氨酸。发酵59小时，S-腺苷蛋氨酸产量达10.1g/L，生物量干重达100g/L。发酵液中剩余D-甲硫氨酸47克，占发酵液中总甲硫氨酸的99％以上。
实例5：在500L罐中培养酿酒酵母生产SAM中添加10千克DL-甲硫氨酸的中试实验
在500L发酵罐中培养酿酒酵母，所用菌种和发酵培养基如实例1。优选发酵条件为：接种量15％，发酵温度29℃，空气通入量为1.5vvm，搅拌转速500转，控制发酵pH为5.4。在发酵12小时开始流加70％的葡萄糖。维持糖浓度在1.5g/L。在发酵生物量干重达80g/L，开始添加10千克DL-甲硫氨酸。发酵58小时，S-腺苷蛋氨酸产量达最高值11.8g/L，生物量干重达130g/L。发酵液中剩余D-甲硫氨酸4.6千克，占发酵液中总甲硫氨酸的99％以上。
实例6：发酵液中D-甲硫氨酸的拆分方法(1)
取50ml发酵液，用去离子水稀释3倍，8000r/min离心10min除去菌体和固形物，然后取上清先进行活性炭吸附后用苯乙烯系阳离子交换树脂001*7进行吸附，用去离子水洗去杂质，再用盐酸溶液洗脱，调节pH至9.3，再用苯乙烯系阴离子交换树脂D370再次吸附，并用盐酸溶液洗脱，总收率可达70％以上，其中D型所占比例达99％以上。
实例7：发酵液中D-甲硫氨酸的拆分方法(2)
取50ml发酵液，用去离子水稀释3倍，8000r/min离心10min除去菌体和固形物，然后取上清先进行活性炭吸附后用丙烯酸系阳离子交换树脂D018进行吸附，用去离子水洗去杂质，再用氨水洗脱，，调节pH至9.2，，再用苯乙烯系阴离子交换树脂D370再次吸附，并用盐酸溶液洗脱，总收率可达70％以上，其中D型所占比例达99％以上。

Claims (5)

1.一种S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法，酵母菌种子培养液加入初始发酵培养基中，发酵12小时后开始流加葡萄糖，维持糖浓度在0.1-2g/L，在50-70小时结束发酵，其特征在于酵母发酵生物量干重达5-160g/L后，补加DL-甲硫氨酸。
2.如权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法，其特征是所述酵母菌为酿酒酵母、麦芽糖假丝酵母或热带假丝酵母。
3.如权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法，其特征是所述DL-甲硫氨酸为消旋型DL-甲硫氨酸。
4.如权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸发酵生产方法，其特征是所述DL-甲硫氨酸添加量占初始发酵培养基的比例为5-100g/L。
5.一种D-甲硫氨酸分离方法，酵母菌种子培养液加入初始发酵培养基中，发酵12小时后开始流加葡萄糖，维持糖浓度在0.1-2g/L，在50-70小时结束发酵，在酵母发酵生物量干重达5-160g/L后，开始补加DL-甲硫氨酸；其特征是酵母菌发酵液用去离子水稀释后，离心除去菌体和固形物，取上清液进行活性炭吸附后用苯乙烯系阳离子交换树脂进行吸附，用去离子水洗去杂质，再用盐酸溶液洗脱，调节pH至碱性，再用苯乙烯系阴离子交换树脂再次吸附，并用盐酸溶液洗脱获得D-甲硫氨酸。 
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