CN105606691A - 分析样品中的蛋白质或肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析样品中的蛋白质或肽的方法。具体地，所述方法包括：将包括蛋白质或肽的样品与探针接触，所述探针包括逐渐变细为尖端的多孔材料，其中所述探针不需要气动辅助而运作；将电压施加到所述多孔材料，以便在所述材料的尖端处产生电场，以产生所述样品中的蛋白质或肽的离子，所述离子从所述尖端被排出；和分析所排出的离子，从而分析所述样品中的所述蛋白质或肽。

Description

分析样品中的蛋白质或肽的方法
本申请是申请日为2010年4月29日的发明名称为“使用潮湿的多孔材料产生离子”的中国专利申请第201080019239.3号的分案申请。
技术领域
本发明大体上涉及用于对样品进行质谱分析的系统和方法。
背景技术
质谱分析法是一种用于分析化学(尤其是生命科学)的重要研究和应用的非常灵敏的分析法。电喷雾电离(ESI)通常被视作是用于电离溶液相分子的最具特点且最有效的方法。该方法可以简单地分成三个阶段：液滴形成、液滴蒸发和离子形成(加斯克尔·S·J，质谱学报1997(Gaskell,S.J.JournalofMassSpectrometry1997)，32，677-688)。当向流过质谱仪探针的溶液施加强电场时，探针的针尖处会形成泰勒圆锥，从而使小液滴形成的薄雾从此圆锥的尖端喷出。由于游离液滴蒸发和库仑力的存在，因此产生样品分析物的离子。所述离子进入质谱仪，随后进行分析。
ESI存在的问题是，要使用ESI对许多类型的样品进行分析，必须先制备样品。在使用ESI质谱分析法分析样品之前，要对样品进行提取和过滤规程，以提纯所述样品，例如，清除盐和清洁剂。这些规程复杂、耗时且昂贵。此外，提纯过程中使用的试剂可能会干扰随后对所提纯的样品中的目标分析物进行分析。此外，非溶液态的样品在进行ESI分析之前必须溶解和提纯。
近来，已形成常压电离的概念，现在常压电离一族的成员超过二十个，例如，解吸电喷雾电离(DESI)和实时直接分析(DART)。使用质谱分析法进行常压电离可以在不进行过多或甚至不进行任何样品制备和/或预先制备的情况下在常压环境下从凝相样品中电离分析物，从而提供用于对复杂混合物和生物样品进行实时实地分析的溶液。这些常压电离方法引领并延续着质谱分析法在生命科学、环境监测、法医应用和治疗分析方面的革命。然而，上文所述的常压电离技术在分析样品时仍然需要气动辅助、持续的溶剂流和高压电源。
需要可以将样品制备和预处理与对样品进行质谱分析的电离过程相结合使得在分析样品时不需要气动辅助或持续的溶剂流的系统和方法。
发明内容
本发明大体上涉及由流体和固体样品产生离子用于质谱分析的新系统和方法。多孔材料(例如，滤纸)或类似材料可容纳并转移液体；当向这些材料施加高电压时，所述材料的边缘会直接产生离子。所述多孔材料保持与溶剂流分离(即，独立或分开的)。事实上，会将样品点到多孔材料上，或者将多孔材料润湿，然后用多孔材料擦拭含该样品的表面。接着，点到或擦到样品的多孔材料会被润湿并连接到高压电源以产生样品的离子，随后对这些离子进行分析。样品可通过多孔材料输送，而不需要单独的溶剂流。
本发明的装置和方法将样品制备和预处理与对样品进行质谱分析所需的电离过程相结合。本发明的装置和方法可以对基体复杂的原生物样品(例如，生物流体和组织)中的化学物质进行快速直接分析，而无需制备样品。在特定实施例中，本发明的装置和方法可以对干的血点或尿斑进行分析。
本发明的一方面提供一种包括连接到高压电源的多孔材料的质谱探针，其中所述多孔材料与溶剂流分离。示例性多孔材料包括纸，例如，滤纸，或PVDF膜。多孔材料可具有任何形状。在某些实施例中，多孔材料可为三角形。
在某些实施例中，探针进一步包括施加到多孔材料的个别量的溶剂，例如，一滴或多滴液滴。溶剂可为一滴或多滴液滴，而且其量要足够润湿多孔材料。只要向多孔材料施加溶剂，溶剂便可辅助样品通过多孔材料进行输送。溶剂可能含有内标物。溶剂/基材化合物可以区别保留化学性质不同的样品成分。在某些实施例中，溶剂可使盐和基体的效应最小化。在其他实施例中，溶剂包括可对所选的分析物进行在线化学衍生的化学试剂。
本发明的另一方面提供一种用于分析样品材料的系统，其包括：探针，所述探针包括连接到高压电源的多孔材料，其中所述多孔材料保持与溶剂流分开；以及质谱分析仪。所述质谱分析仪可为台式质谱仪或手持式质谱仪类型。示例性质谱分析仪包括四极离子阱质谱仪、直线离子阱质谱仪、圆柱形离子阱质谱仪、离子阱回旋共振质谱仪和轨道阱质谱仪。
本发明的又一方面包括一种用于分析样品的方法，其包括：将样品与多孔材料接触，其中所述多孔材料与溶剂流分开；将高电压施加到多孔材料以产生样品中分析物的离子，所述离子从多孔材料中排出；以及分析所排出的离子。所述方法可进一步包括向多孔材料施加个别量的溶剂，例如，一滴或多滴液滴。在某些实施例中，所述分析涉及提供质谱分析仪以产生样品中分析物的质谱。
在某些实施例中，样品为液体。在其他实施例中，样品为固体。在样品为固体的实施例中，可使用多孔材料擦拭样品表面。可在擦拭了固体样品之前或之后将溶剂施加到多孔材料上。示例性样品包括化学物质或生物物质。
本发明的又一方面提供一种电离样品的方法，其包括向多孔材料施加高电压以产生样品中分析物的离子，其中所述多孔材料与溶剂流保持分开。示例性多孔材料包括纸或PVDF膜。
附图说明
图1A为将样品溶液供给一张纸进行电喷雾电离的图。图1B为将样品溶液预先点到这张纸上随后将一滴溶剂供给这张纸进行电喷雾电离的图。
图2A为使用本发明探针得到的海洛因(浓度：1ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图2B为海洛因(浓度：1ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
图3A为使用本发明探针得到的咖啡因(浓度：10ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图3B为咖啡因(浓度：10ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
图4A为使用本发明探针得到的苯甲酰芽子碱(浓度：10ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图4B为苯甲酰芽子碱(浓度：10ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
图5A为使用本发明探针得到的丝氨酸(浓度：1ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图5B为丝氨酸(浓度：100ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
图6A为使用本发明探针得到的肽类缓激肽2-9(浓度：10ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图6B为肽类缓激肽2-9(浓度：1ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
图7A的MS/MS谱显示可使用“点”方法从全血样品中检测出海洛因。图7B显示没有海洛因的血点的MS/MS谱。
图8A的MS/MS谱显示可使用“点”方法从原尿样品中检测出海洛因。图8B显示没有海洛因的尿点的MS/MS谱。
图9A的MS谱显示在未进行样品制备的情况下从可乐中检测出咖啡因。图9B的MS谱显示从咖啡粉中检测出咖啡因。可用纸片擦拭咖啡袋的表面来收集咖啡粉。
图10显示在未进行样品制备情况下执行的尿分析的MS谱。图10A的MS谱显示从喝咖啡的人尿中检测出咖啡因。图10B的MS谱显示从未喝咖啡的人尿中未检测出咖啡因。
图11的MS谱显示使用相同参数(～2kV，溶剂：MeOH:H2O＝1:1)对(A)纸三角与(B)PVDF膜进行肽分析(10ppm缓激肽2-9)所产生的差异。
图12显示使用四种植物的切片组织直接得到的植物组织MS谱。(A)洋葱，(B)大葱以及两种不同的叶子(C)和(D)。
图13显示维生素C的MS/MS谱。图13A是在未制备样品的情况下对洋葱的直接分析。图13B使用了标准溶液。
图14A的图显示对纸上干血点的分析；将0.4μL全血直接施加到层析纸的三角形区(通常为高10mm，底长5mm)。用铜夹将纸片固持在LTQ质谱仪(美国中部圣何塞赛默飞世尔科技，(ThermoFisherScientific,SanJose,CA))入口的前端，然后将直流电压(4.5kV)施加到用10μL甲醇/水(1:1v/v)润湿的纸上。
图14B图示伊马替尼(格列卫)的分子结构和0.4μL含有4μg/mL伊马替尼的全血的纸喷雾串联质谱。伊马替尼由MS/MS转变m/z494□m/z394(插图)来表示和量化(插图)。图14C图示掺入了伊马替尼(62.5-44μg/mL)及其同位素伊马替尼-d8(1μg/mL)的全血的定量分析。插图曲线表示低浓度范围。
图15为血管紧张素I溶液的纸喷雾器质谱。插图表示质量范围为630–700的展开图。
图16的质谱显示用本发明探针对动物组织中的激素进行的直接分析。
图17A和图17B的质谱显示对人类前列腺肿瘤组织和正常组织进行的直接分析。
图18为掺入了10μg/mL阿替洛尔的全血的质谱。所得数据是通过将本发明的系统和方法与手持式质谱仪相结合获得的。
图19A到图19F显示从六种不同类型的纸(微孔大小不同的沃特曼滤纸：(a)3μm，(b)4-7μm，(c)8μm，及(d)11μm，(e)玻璃纤维纸和(f)层析纸)中喷射出来的可卡因的质谱。喷雾电压为4.5kV。
图20A所示为表现纸喷雾器的空间分布特征的示意性装置。图20B是一个2D轮廓图，显示探针在相对于质谱仪入口在x-y平面中移动时m/z304的相对强度。图20C的图显示在纸上注入不同浓度或量的可卡因溶液、或用聚四氟乙烯膜密封所述纸时m/z304的信号持续时间。
图21为一组纯化学溶液的MS谱及其相应的MS/MS谱。所述谱分别为(A)丝氨酸、(B)美沙酮、(C)罗红霉素和(D)缓激肽2-9的谱。
图22这组质谱显示对复杂混合物中的化学物质进行的分析和在未进行样品制备的情况下从表面得来的直接分析情况。图22A和图22B为在(A)正模式和(B)负模式下直接在纸上分析得到的可口可乐(可乐)的质谱。图22C为咖啡因的质谱。图22D为苯甲酸钾的质谱。图22E为乙酰磺胺酸钾的质谱。图22F为从尿中检测出的咖啡因的质谱。图22G为在擦拭桌面之后用本发明探针直接从桌面检测出的海洛因的质谱。
图23A显示用于血液分析的本发明探针的图像。在此实施例中，多孔材料为纸。左边的图显示点上全血之前的情况。中间的图显示点上全血之后让血点变干的情况。右边的图显示将甲醇添加到纸之后让其在纸上行进的情况。右边的图显示甲醇与血点相互作用从而让分析物行进到纸尖以用于电离和分析的情况。图23B为全血中的阿替洛尔的质谱。图23C为全血中的海洛因的质谱。
图24图示分析由TLC分开的两种染料亚甲蓝(m/z284)和甲基紫(m/z358.5)。将染料混合物溶液(0.1μl的1mg/mL溶液)施加到层析纸(4cmx0.5cm)上并在进行TLC和纸喷雾MS分析之前弄干。
图25显示本发明探针的不同形状、厚度和角度。图25A显示锐度。图25B显示针尖的角度。图25C显示纸的厚度。图25D显示有多个喷头的装置。图25E显示具有用锋针制得的微喷头的DBS卡。
图26是一组使用圆锥形C4zip-tip吸管尖的直接喷雾得到的人类血清中伊马替尼的质谱。含有伊马替尼的人类血清样品(各为1.5μL)通过多孔C4提取材料三次，接着将3μL甲醇添加到带有4kV正直流电压的zip-tip吸管尖以产生喷雾。图26A图示5μg/mL的MS谱。图26B显示5ng/mL情况下的MS/MS谱。
图27A的图显示本发明探针的不同针尖角。从左到右，针尖角分别为30度、45度、90度、112度、126度。图27B的图显示针尖角对MS信号强度的影响。所有的MS信号已经标准化为使用90度针尖的MS信号。
图28A的图显示本发明的高处理量探针装置。图28B显示从所述装置的单个针尖到质谱仪入口中的喷雾。图28C为一组显示高产量模式下的MS信号强度的质谱。
图29A示意性描绘使用本发明探针直接分析动物组织的规程。图29B到图29D的质谱显示在所述组织中检测出不同化学物质。
图30A显示对普通纸上的干血清点进行的质谱分析。图30B显示对预先添加了甜菜碱醛(BA)氯化物的纸上的干血清点进行的质谱分析。图30C显示对反应产物[M+BA]+(m/z488.6)进行的MS/MS分析。
图31显示用改质(图31A)和未改质的(图31B)的纸板记录的MS/MS谱。
图32的质谱显示可以使用负离子源电位产生离子而对正离子进行质谱分析。
图33A的示意图显示具有量控制瓶和溢流瓶的样品筒的设计。可使用含有化学内标物的可溶解塞子堵住量控制瓶的底部。图33B显示用于将血液样品施加到样品筒上以便由可控血液量在纸上制备出干血点的各个步骤。
图34A和图34B显示用纸从杂货店购买的柠檬皮上擦拭到的农业化肥的质谱。
图35显示多角纸板喷雾器的设计。喷雾角的角度小于其他各角的角度。
图36A和图36B显示使用SU-82010光致抗蚀剂在一张层析纸上制得的喷头。图36C显示含有天冬酰胺混合物的甲醇/水溶液的MS谱。
具体实施方式
本发明描述一种由流体和固体产生离子用于质谱分析的新方法。多孔材料，例如纸(例如，滤纸或层析纸)，或其他类似材料可容纳并转移液体和固体；当向这些材料(图1)施加高电压时，从所述材料边缘会直接产生离子。多孔材料保持与溶剂流(例如，持续的溶剂流)分离(即，独立或分开的)。事实上，会将样品点到多孔材料上，或者将样品从含样品的表面擦拭到多孔材料上。接着，点到或擦拭到多孔材料的样品会连接到高压电源，以产生样品的离子，随后对这些离子进行质谱分析。样品可通过多孔材料输送，而不需要单独的溶剂流。输送分析物不需要气动辅助；而只要向固持在质谱仪前端的多孔材料施加电压即可。
在某些实施例中，多孔材料为任何基于纤维素的材料。在其他实施例中，多孔材料为非金属多孔材料，例如，棉、亚麻羊毛、合成织物或植物组织。在其他实施例中，多孔材料为纸。
纸的优点包括：成本(纸非常便宜)；纸是完全商业化的，且其物理性质和化学性质均可调整；纸可从液体样品中过滤出微粒(细胞和灰尘)；纸容易成形(例如，易于剪、撕或折)；液体可在毛细管作用下在纸上流动(例如，无需外部抽吸作用和/或通电)；以及纸是一次性的。
在某些实施例中，多孔材料与具有适用于喷雾的可眼观角的固体针尖整合在一起。在这些实施例中，所述多孔材料用于过滤、预先浓缩含喷雾分析物的固体型溶剂，并通过毛细管作用传送所述溶剂。
在特定实施例中，多孔材料为滤纸。示例性滤纸包括纤维素滤纸、无灰滤纸、硝化纤维纸、玻璃微纤维滤纸和聚乙烯纸。具有任何微孔大小的滤纸均可使用。示例性微孔大小包括1级(11μm)、2级(8μm)、595级(4-7μm)和6级(3μm)。微孔大小不仅影响喷雾材料内液体的输送，还影响泰勒圆锥尖端的形成。最佳的微孔大小会产生稳定的泰勒圆锥并降低液体蒸发。滤纸的微孔大小还是过滤的重要参数，即，滤纸充当在线预处理装置。可买到的再生纤维素超滤膜的微孔大小处于较低纳米范围，这种超滤膜可用于保留小到1000Da的粒子。可购买到的超滤膜的分子量在1000Da到100,000Da范围内。
本发明的探针适用于只基于使用多孔材料的边缘产生的高电场来产生微米级液滴。在特定实施例中，多孔材料形成可眼观的尖头(例如，三角形的尖头)，以用于产生离子。本发明探针的针尖宽度可以各不相同。在某些实施例中，探针尖端宽度至少约为5μm或更宽、10μm或更宽、50μm或更宽、150μm或更宽、250μm或更宽、350μm或更宽、400μ或更宽、450μm或更宽等等。在特定实施例中，尖端宽度至少为350μm或更宽。在其他实施例中，探针尖端宽度约为400μm。在其他实施例中，本发明探针的形状是三维的，例如，圆锥形。
如上文所述，输送液滴时不需要气动辅助。常压电离分析物是在这些带电液滴的基础上实现的，从而提供简单方便的方法对液相样品进行质谱分析。
将样品溶液直接涂在固持于质谱仪入口前端的多孔材料上，不作任何预处理。然后，通过将高电位施加在潮湿的多孔材料上执行常压电离。在某些实施例中，多孔材料为纸，纸是含有用于传送液体的无数微孔和微孔道的一类多孔材料。所述微孔和微孔道还让纸充当过滤装置，这有利于对被弄脏的或被污染的样品进行分析。
在其他实施例中，多孔材料经过处理以在多孔材料中产生微孔道或增强材料的性质，从而用作本发明的探针。例如，可对纸进行图案化硅烷化处理，以在纸上产生微孔道或结构。例如，此类处理涉及将纸的表面暴露于1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷，从而使纸硅烷化。在其他实施例中，使用软光刻工艺以在多孔材料中产生微孔道或增强材料的性质，从而用作本发明的探针。在其他实施例中，在纸中形成疏水捕集区，以预先浓缩不太亲水的化合物。
可通过使用光刻法、打印法或等离子处理将疏水区图案化到纸上，因此将亲水通道的侧向限制在200～1000μm。见马第尼斯(Martinez)等人(德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed)2007，46，1318-1320)；马第尼斯(Martinez)等人(美国科学院院刊(Proc.NatlAcad.Sci.USA)2008，105，19606-19611)；亚伯(Abe)等人(分析化学(Anal.Chem.)2008，80，6928-6934)；布鲁斯威克斯(Bruzewicz)等人(分析化学(Anal.Chem.)2008，80，3387-3392)；马第尼斯(Martinez)等人(芯片实验室(LabChip)2008，8，2146-2150)；以及李(Li)等人(分析化学(Anal.Chem.)2008，80，9131-9134)，上述内容全文均以引用的方式并入本文中。加到此类纸质装置上的液体样品可通过毛细管作用沿着亲水通道行进。
另一种改质表面的应用为根据化合物与表面和溶液亲和性不同来分离或浓缩化合物。一些化合物最好是在表面上被吸收，而基体中的其他化学物质则保留于水相内。通过水洗可以清除样品基体，而目标化合物仍在表面上。稍后可用其他高亲和性溶剂从表面移取所述目标化合物。重复上述过程有助于脱盐，还有助于浓缩原样品。
本发明的方法和系统使用多孔材料(例如，纸)来保留和输送用于质谱分析的分析物。样品中的分析物以整合方式在多孔材料中预先浓缩、富集和提纯，以在向多孔材料施加高电压后产生离子。在某些实施例中，施加个别量的输送溶液(例如，一滴或几滴液滴)以帮助分析物移动并使之通过多孔材料。在某些实施例中，分析物已在涂到多孔材料的溶液中。在此类实施例中，无需向多孔材料添加额外的溶剂。在其他实施例中，分析物是粉末状样品，易于通过擦拭表面加以收集。本发明的系统和方法可以对植物组织或动物组织或者生物体组织进行分析。
本发明的方法和系统可分析多种多样的小分子，包括肾上腺素、丝氨酸、阿特拉津、美沙酮、罗红霉素、可卡因和血管紧张素I。这些小分子在多种多孔表面上均显示较高质量的质谱和MS/MS子离子质谱(见以下实例)。本发明的方法和系统虑及使用少量溶液，通常是几μL，其中分析物的浓度为0.1μg/mL到10μg/mL(分析物总量为50pg到5ng)，并产生可持续一分钟到几分钟的信号。
本发明的方法和系统还可分析多种多样的生物分子，包括蛋白质和肽。本发明的方法还可分析凝胶中的寡核苷酸。在电泳分离凝胶中的寡核苷酸之后，使用所属领域中已知的方法用多孔材料将一个或若干个目标凝胶带吸干。吸干操作导致凝胶带中的寡核苷酸中至少一些被输送到多孔材料。接着，将所述多孔材料连接到高压电源，寡核苷酸被电离并喷射到质谱仪中用于质谱分析。
本发明的方法和系统可分析复杂混合物，例如，全血或尿。分析血液中的药物或其他化合物的典型程序是一个多步骤过程，用于在分析之前尽量清除干扰物。首先，通过在约1000xg下进行15分钟离心作用使血细胞与血液中的液体部分分离(马斯塔德·J·F(Mustard.J.F.)；肯拉克-拉斯波恩·R·L(Kinlough-Rathbone.R.L.)；帕克汉·M·A(Packham.M.A.)酶学方法(MethodsinEnzymology)；学术出版社，1989)。然后，将内标物掺到所得的血浆中，接着执行液相或固相提取，以尽量清除基体化学物质同时回收几乎所有的分析物(比尔曼·D·L(Buhrman,D.L.)；普莱斯·P·I(Price,P.I.)；鲁迪维兹·P·J(Rudewicz,P.J.)；美国质谱大会杂志(JournaloftheAmericanSocietyforMassSpectrometry)1996，7，1099-1105)。提取相通常通过蒸发溶剂来干燥，接着重新悬浮于用作高效液相色谱法(HPLC)流动相的溶剂中(马图谢夫斯基·B·K(Matuszewski,B.K.)；康斯坦特·M·L(Constanzer,M.L.)；查韦斯-英格·C·M(Chavez-Eng,C.M.)；纽约伊萨卡镇(Ithaca,NewYork)1997年7月23-25；882-889)。最后，样品会在HPLC操作过程中约5-10分钟时分离，然后使用电喷雾电离串联质谱分析法对洗脱液进行分析(霍普夫加特纳·G(Hopfgartner,G.)；勃艮第·E(Bourgogne,E.)质谱学评论(MassSpectrometryReviews)2003，22，195-214)。
本发明的方法和系统避免了上文示范的逐个步骤。本发明的方法和系统以类似的方式分析干血点，但对上述提取流程进行了细微修改。首先，使用一种专门装置从每一点干血点中取出大小相同的血盘。接着，在含有内标物的有机溶剂中提取这些血盘上的物质(查斯·D·H(Chace,D.H.)；卡拉斯·T·A(Kalas,T.A.)；内勒·E·W(Naylor,E.W.)临床化学(ClinicalChemistry)2003，49，1797-1817)。所提取的样品在纸板上变干，接着如本专利申请文件中所述那样进行分析。
以下实例显示本发明的方法和系统可直接检测复杂混合物的个别成分，例如，尿中的咖啡因、人手指上的50pg可卡因、桌面上的100pg海洛因以及完整肾上腺组织中的激素和磷脂，而无需在分析之前制备样品(见以下实例)。本发明的方法和系统可以通过快速连续地检查直接输送到纸的穿刺活检组织部分来执行简单的显像实验。
从溶液中得到的分析物施加到多孔材料以用于检查，而溶液的溶剂成分可用作电喷雾溶剂。在某些实施例中，将分析物(例如，固体或溶液)预先点到多孔材料(例如，纸)上，而且将溶剂施加到所述材料上以溶解所述分析物并将其输送到喷雾中用于质谱分析。
在某些实施例中，将溶剂施加到多孔材料，从而有助于分离/提取和电离。可使用适合进行质谱分析的任何溶剂。在特定实施例中，较佳使用那些也用于电喷雾电离的溶剂。示例性溶剂包括水、甲醇、乙腈和THF的组合。有机质含量(甲醇、乙腈等与水的比例)、pH值和碳酸铵(例如，乙酸铵)可以随着待分析样品的不同而变化。例如，像药品伊马替尼等碱性分子在pH值较低时的提取和电离效率会更高。没有可电离基团但具有若干个羰基的分子(例如，西罗莫司)在溶剂中有铵盐时因为形成了加合物而电离效果更好。
在某些实施例中，采用一种多维度方法。例如，样品可沿着一个维度分离，之后在另一个维度上进行电离。在这些实施例中，可单独对分离和电离进行优化，而且每一阶段可使用不同的溶剂。
在其他实施例中，对溶剂施加电场从而实现在纸上输送分析物。当施加了高电位后，发现分析物在纸上的移动方向与其在溶液中带电形式的极性有关。也可通过将电极置于湿纸上的某处来在纸上完成喷雾前对分析物进行的预先浓缩步骤。将接地电极置于纸尖附近，这样，当湿的多孔材料受到直流电压时便会产生强电场，且带电分析物会受此电场驱动向前行进。也可在开始喷雾之前将特定分析物浓缩于纸的特定部分。
在某些实施例中，向多孔材料施加化学物质以将所述多孔材料的化学性质改质。例如，可施加能够区别保留化学性质不同的样品成分的化学物质。此外，可施加能够使盐和基体的效应最小化的化学物质。在其他实施例中，将酸性化合物或碱性化合物施加到多孔材料，以在将样品点到多孔材料上时调整所述样品的pH值。调整pH值可尤其用于改良对生物流体(例如，血液)进行的分析。此外，可施加能够对所选分析物进行在线化学衍生的化学物质，例如将非极性化合物转化成盐，从而有效地进行电喷雾电离。
在某些实施例中，所施加用以改变多孔材料的化合物为内标物。所述内标物可在溶剂流入期间加入所述材料中并以已知速率释放，从而提供用于定量分析的内标物。在其他实施例中，使用可以在进行质谱分析之前对目标分析物进行预先分离和预先浓缩的化学物质改质所述多孔材料。
在阳离子模式下，喷雾液滴在强照度下是可见的，且其大小与从纳米电喷雾离子源(nESI)中发射出来的液滴相当。
在阴离子模式下，发射电子且可使用气相电子捕获剂(比如苯醌)捕获电子。在不受任何特定理论或作用机制限制的情况下，认为执行电离的是位于多孔材料尖端的高电场，而不是各个流体通道中的电场。
本文中描述的方法具有临床应用所要的特征，这些应用中包括：新生儿筛查、治疗药物监测和组织活检分析。相关程序十分快捷。多孔材料的第二个角色是充当过滤器，例如，在分析全血期间保留血细胞。重要的是，样品可存储在多孔材料上，以后可直接从所存储的多孔材料中进行分析，而无需在分析之前先从多孔材料中输送。本发明的系统可以在开放的实验室环境中执行实验室实验。
以引用方式并入的内容
本发明整篇参考和引用了其他文件，例如，专利、专利申请案、专利公开案、期刊、书籍、论文、网页内容。此类所有文件的全文因此均以引用的方式并入本专利申请文件中。
等效物
本发明的所有内容，包括对本专利申请文件中所引用的科学文献和专利文献的参考让所属领域的技术人员除了理解本专利申请文件中所显示和描述的那些实施例以外，还易于了解本发明的各种修改形式和本发明的许多进一步的实施例。本专利申请文件含有适用于将本发明实践于本发明各实施例及其等效物中的重要信息、例证和指导。
实例
以下实例旨在进一步说明本发明的某些实施例，且不应被解释为限制本发明的范围。本专利申请文件中的实例显示，本发明的质谱探针可电离化学样品和生物样品，用于随后进行质谱分析和检测。一种示例性探针的构造为纸三角，其可通过在纸上施加高电位来产生微米级液滴。分析物从这些带电的液滴中电离出来并被输送到常规质谱仪中。
以下实例显示，大量样品均可在纯态和复杂混合物中通过本发明的探针在常压环境下直接接受分析。结果显示，纸质喷雾器具有以下优点：可在没有鞘气的情况下操作，即，实地分析时几乎不需要辅助设备；生物样品(干的血液、尿)在进行分析之前可在预切割所得的滤纸上存储数月；滤纸可以最小化在许多样品(血细胞、盐和蛋白质)中进行电喷雾或纳米电喷雾时可见的基体效应，并增强复杂样品中的化学物质的MS信号；粉末状的样品易于通过使用纸擦拭其表面来收集，然后直接对样品进行分析；可对纸进行预处理使之含有在定量分析中、溶剂流入期间以已知速率释放的内标物；以及可对纸进行预处理使之含有基体抑制或吸收位，或执行离子交换，或对所选分析物进行在线化学衍生。
大多数分析物是在低至ppb的量(当检查的是溶液时)或在ng到pg的低范围(检查的是固体时)下接受检测的，且检测时间少于一分钟。以下某些实例提供分析干血点的规程，该规程也可用于实地分析全血样品。干血点方法经过论证，也适合用于存储和输送用于血液筛查和其他临床测试的血液样品。
本发明的装置能够进行取样、预先分离、预先浓缩和电离。本发明的方法和系统可以简化将样品引入质谱分析仪所带来的问题。
实例1：构造MS探针
将滤纸剪成长10mm宽5mm的三角形片，并用作喷雾器(图1)。将铜夹连接到纸上，纸面对质谱仪的入口(图1)。将铜夹安装在3D移动台上，以准确调整其位置。向铜夹施加高电压，并由质谱仪控制该高电压以产生分析物离子用于质谱检测。
直接将样品施加到用作样品提纯和预先浓缩装置的纸表面上。滤纸可以让液体样品在毛细管作用和电效应的驱动下移动并通过亲水网，并且将液体样品输送到纸尖。在此输送过程期间可能会发生分离。在向纸表面施加高电压(～4.5kV)时，样品溶液从纸尖喷出并发生电离和MS检测。
所有的实验都是用菲尼根富氏质谱仪(美国中部圣何塞热电公司(ThermoElectron,SanJose,CA))进行的。毛细管入口的典型温度设置在150℃，而在检测海洛因时设置为30℃。透镜电压在用于样品分析时设置在65V，在用于残存物生成实验时设置为240V。使用碰撞诱发式解离(CID)收集串联质谱，以识别所检测样品中的分析物，这尤其可用于复杂混合物和血液样品。
实例2：产生喷雾
可通过在潮湿的纸三角上施加高电位产生喷雾。将一个纸三角置于LTQ的入口前面，纸三角的尖端面向入口，与入口分开3mm或更大。通常，施加10uL样品溶液以将纸三角润湿。所述溶液可润湿或浸透所述纸或在所述纸的表面上形成液体的薄膜层。在纸三角与质谱仪入口之间施加高电位(3-5kV)以产生电场，这样诱使电荷积聚到纸三角尖端的液体上。逐渐增加的库仑力打破液体从而形成带电的液滴，接着溶剂会在液滴从纸尖溅到质谱分析仪期间蒸发。使用纸喷雾器清除溶剂不需要鞘气、加热或任何其他辅助手段。
当液体积聚在纸三角上时，如果用显微镜进行检查就会观察到尖端处的泰勒圆锥。所形成的液滴在强照度下清晰可见。所述泰勒圆锥和可见的喷雾在蒸发和喷射之后片刻便消失。然而，质谱信号的持续时间很长(若干分钟)。这表示，纸三角可在两种质谱分析模式下使用。在第一模式下，液体在纸内输送的速度大于其在纸尖处作为喷雾被消耗的速度，从而在纸尖处形成较大的圆锥并产生液滴。在第二模式下，液体在纸内输送的速度无法跟上喷雾消耗的速度，因此看不到液滴。然而，可以观察到，分析物的电离确实发生了。第一模式提供了ESI，比如质谱，第二模式提供具有APCI谱的一些特征的谱。在后一种情况中，纸三角的作用类似于产生高电场以电离大气中分子的导电针。可以观察到，对于相同的测试样品，在所述条件下，第一模式下的质谱信号比第二模式下的质谱信号约强两个量级。
实例3：探针的考量
探针材料
可测试许多种多孔材料以产生带电的液滴用于质谱分析。所述材料的形状可为具有尖端的三角形，接着将样品溶液施加到所构造的探针上。本专利申请文件中的数据显示，可成功使用任何亲水多孔基材，包括棉纱、织物、植物组织以及不同种类的纸。这些材料的多孔网或微孔道为保留液体提供了足够的空间，而且亲水环境实现了通过毛细管作用进行液体输送。疏水多孔基材还可成功与适当选择的疏水溶剂一起使用。
经过进一步调查，可选择六种可买到的纸，并对所述纸进行定性测试以评估其是否能用于检测分析物。滤纸和层析纸由纤维素制得，而玻璃微纤维滤纸由玻璃微纤维制得。图19显示在这些纸上检测到的可卡因的质谱。玻璃纤维纸的谱(图19E)有所不同，因为其背景强度比其他纸低两个量级，因此无法突显可卡因峰值(m/z,304)。
假设玻璃纤维纸在模式II下使用并抑制了液体的有效产生，因为纸的厚度相对较大(～2mm)。从用于检测可卡因的玻璃纤维纸中撕下一个薄层，使用这个薄层便可证实此假设。在这种情况下，背景强度增加因此可观察到可卡因峰值。所有滤纸均适合用于可卡因检测(图19A到图19D)。层析纸显示的可卡因质谱最清晰且可卡因强度相对较高(图19F)。
探针形状和针尖角
已研究出关于产生液滴的许多种不同形状的探针。多孔材料的较佳形状包括至少一个尖端。可以观察到，尖端可以形成泰勒圆锥。最常使用的探针形状是三角形。如图25A到图25C所示，针尖的锐度、针尖的角度(图27A到图27B)及纸板的厚度会影响喷雾特性。可以将具有多个针尖的管状装置(图25D)充当多针尖喷雾器，其会改良喷雾效率。还可使用锋针刺破表面而在DBS卡上制成一列微喷雾器(图25E)。
实例4：探针与质谱仪入口的配置
将纸三角安装在2D移动台上，以确定质谱信号如何受纸三角与质谱仪入口的相对位置的影响。所述纸三角在y方向上连续移动8cm，在x方向上以每步增加2mm的方式移动3cm(图20A)。将可卡因溶液(1μg/mL，甲醇/水，1:1v/v)持续供到纸表面上。在整体扫面期间持续记录质谱。质子化了的可卡因的峰值强度(m/z,304)的轮廓图是由从质谱中提取的标准化数据形成的(图20B)。所述轮廓图显示，无需为产生液滴而将纸三角放置成与质谱仪入口完全同轴。
另外测试了喷雾持续时间(图20C)。准备纸三角(大小为10mm，5mm)。首先，将10μL具有不同浓度0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的溶液施加到纸三角上。每张纸的喷雾时间只随着浓度的不同而稍有变化。在这之后，在纸三角上施加不同量5uL、10uL和15uL的1ug/mL可卡因溶液。在样品量增加之前，喷雾时间显示出线性响应。
在另一个测试中，用PTFE膜密封纸以防止溶液蒸发，这样可把喷雾时间延长约三倍。这些结果表明，纸喷雾甚至会使用5uL溶液来为数据采集提供足够长的喷雾时间，且信号强度在整个喷雾期间很稳定。
实例5：分离和检测
本发明的探针包括多孔材料，例如纸，其可在用质谱仪进行实地电离之前分离生物流体中的化学物质。在此实例中，用于探针的多孔材料为层析纸。如图24所示，将两种染料的混合物作为单个点施加到纸上。首先，染料通过TLC(薄层色谱法)在纸上分离，接着通过本发明的方法、使用从纸媒介上撕下的纸片和MS分析法检查所分离的染料(图24)。数据显示，可由MS分析法检测出分离的染料(图24)。
层析纸因此可以进行样品收集、分析物分离和分析物电离。这就明显将色谱法与MS分析法的结合进行了简化。层析纸是用于本发明探针的良好材料，因为此类材料具有以下优点：受毛细管作用驱使溶剂移动，且不需要使用注射泵。另一优点是：尽管常规的纳米电喷雾源存在堵塞的严重问题，但层析纸由于其多孔特性而不太可能发生堵塞。因此，作为一种多孔材料，层析纸可用作微孔电喷雾电离源。
实例6：纯化合物：有机药物、氨基酸和肽
如上文所述，本发明的探针和方法为质谱分析法提供一种简单快捷的电离方法。可将不同的化合物点到纸三角上，并将所述纸三角连接到高压电源以产生离子。所有的实验都是用菲尼根富氏质谱仪(美国中部圣何塞热电公司(ThermoElectron,SanJose,CA))进行的。本专利申请文件中的数据显示，多种化学物质均可在溶液相中电离，包括氨基酸、治疗药物、违禁药物及肽。
图2A显示使用本发明探针得到的海洛因(浓度：1ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图2B显示海洛因(浓度：1ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
图3A显示使用本发明探针得到的咖啡因(浓度：10ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图3B显示咖啡因(浓度：10ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。峰值167也存在于具有溶剂而没有咖啡因的空白谱中。
图4A显示使用本发明探针得到的苯甲酰芽子碱(浓度：10ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图4B显示苯甲酰芽子碱(浓度：10ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。
图5A显示使用本发明探针得到的丝氨酸(浓度：1ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图5B显示丝氨酸(浓度：100ppb，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。峰值74和83也存在于具有溶剂而没有丝氨酸的空白谱中。图21A显示使用本发明探针得到的丝氨酸(m/z,106)的MS谱。图21A还显示丝氨酸(m/z,106)的MS/MS谱。
图21B显示使用本发明探针得到的美沙酮(m/z,310)的MS谱。图21B还显示美沙酮(m/z,310)的MS/MS谱图21C显示使用本发明探针得到的罗红霉素(m/z,837)的MS谱。图21B还显示罗红霉素(m/z,837)的MS/MS谱
图6A显示使用本发明探针得到的肽类缓激肽2-9(浓度：10ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS谱。图6B显示肽类缓激肽2-9(浓度：1ppm，量：10μl，溶剂：MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))的MS/MS谱。假定谱中的峰是由经常添加到工业材料中的聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))造成的。图21D显示使用本发明探针得到的缓激肽2-9(m/z,453)的MS谱。图21D还显示缓激肽2-9(m/z,453)的MS/MS谱。图21D进一步显示加合离子[M+H](m/z,904)、[M+2H]2+(m/z,453)、[M+H+Na]2+(m/z,464)以及[M+2Na]2+(m/z,475)。m/z453峰值是通过MS/MS谱确定的双倍带电加合离子。
图11的MS谱显示使用相同参数(～2kV，溶剂：MeOH:H2O＝1:1)对(A)纸片与(B)PVDF膜进行肽分析(10ppm缓激肽2-9)所产生的差异。
本专利申请文件中的数据显示，本发明探针对50到1000以上质/荷范围内的纯化合物检测运行良好。数据进一步显示，大多数化学物质可在低至1ng/mL的情况下接受检测，包括违禁药物，例如海洛因、可卡因和美沙酮。
实例7：复杂混合物
可使用本发明的方法、装置和系统检查复杂混合物，例如尿、血液和可乐。所有的实验都是用菲尼根富氏质谱仪(美国中部圣何塞热电公司(ThermoElectron,SanJose,CA))进行的。
图7A的MS/MS谱显示可使用“点”方法从全血样品中检测出海洛因。将0.4μl含有200ppb海洛因的全血样品施加于三角形纸的中心，以形成1mm2血点。血点干了之后，将10μl溶剂(MeOH/H2O/HOAc(50:49:1,v/v/v))施加到三角形纸的后端。由于存在毛细管效应，因此溶剂会向前移动并溶解血点中的化学物质。最终，当溶剂到达纸尖时发生电喷雾。为证实上文所述的“血点”法的效果，将全血施加于纸上直接进行电喷雾。MS/MS谱显示，未从10μl全血样品中检测出海洛因，即使浓度高达20ppm(图7B)。
图8A的MS/MS谱显示可使用“点”方法从原尿样品中检测出海洛因。将0.4μl含有100ppb海洛因的原尿样品施加于三角形纸的中心上，以形成1mm2尿点。尿点干了之后，将10μl溶剂(MeOH/H2O/HOAc(50:49:1，v/v/v))施加到三角形纸的后端。由于存在毛细管效应，因此溶剂会向前移动并溶解血点中的化学物质。最终，当溶剂到达纸尖时发生电喷雾。为了证明上文所述的“点”方法的效果，将原尿施加于纸上直接进行电喷雾。MS/MS谱显示，浓度为100ppb时10μl原尿样品中仍未检测出海洛因(图8B)。
图9A的MS谱显示在未进行样品制备的情况下从可乐中检测出咖啡因。图9B的MS谱显示从咖啡粉中检测出咖啡因。可用纸三角擦拭咖啡袋的表面来收集咖啡粉。
图22A和图22B显示分别在正模式和负模式下分析得到的可口可乐(可乐)的谱。MS/MS谱中突显的质子化了的咖啡因的峰值(m/z195)在正模式下的质谱中占主导，因为这种饮料中咖啡因的浓度较高(100ug/mL)(图22C)。负模式下的MS/MS谱中突显两种高浓度化合物：苯甲酸钾和乙酰磺胺酸钾(图22D到图22E)。
图22F显示在进行尿收集的2小时之前喝了可口可乐(可乐)的人尿中的咖啡因的谱。尿中通常含有高浓度的尿素，尿素也易于电离。因此，质子化了的尿素[m/z,61]和尿素二聚体[m/z,121]在MS谱中占主导。然而，在所述MS/MS谱中突显质子化了的咖啡因，这表示尿样品中有良好的信噪比。图10显示在未进行样品制备的情况下用于分析的尿的MS谱。图10A为从喝咖啡的人尿中检测出的咖啡因的MS谱。图10B的质谱显示从未喝咖啡的人尿中未检测出咖啡因。
图22G显示通过擦拭样品所收集的海洛因(m/z,370)的MS谱。将含有50ng海洛因的5uL溶液点到1cm2的桌面区域上。将纸三角润湿，并用其擦拭桌面。接着，将纸三角连接到高压电源用于质谱检测。相关数据显示，本发明探针既可用作质谱检测的电离源又可用作质谱检测的取样装置。固体表面上的微量样品完全可通过使用本发明探针擦拭表面来收集。灰尘和其他干扰物也会收集到纸三角上，但此复杂基体中仍可直接检测出海洛因。
实例8：在未提取的情况下用ESI对植物组织进行直接分析
图12显示使用四种植物的切片组织直接得到的植物组织MS谱。(A)洋葱，(B)大葱以及两种不同的叶子(C)和(D)。
图13显示对维生素C进行分析的MS/MS谱，图13A是在未制备样品的情况下对洋葱的直接分析，图13B使用了标准溶液。
实例9：全血和其他生物流体
体液，例如血浆、淋巴、眼泪、唾液和尿，均为复杂混合物，其所含分子具有各种分子量、极性、化学性质和浓度。在许多不同领域，监测体液的特定化学成分很重要，这些领域包括临床诊断、药物研发、法医毒物学、滥用药物检测以及治疗药物监测。血液测试，包括导出液血浆和血清，以及尿测试在临床监测中尤为重要。血液中多种多样的化学物质均会在临床环境中接受例行监测。常见实例包括基础代谢检查，其测量电解质，比如钠和钾以及尿素、葡萄糖和肌酸；以及确定个人患心血管疾病风险的血脂检查，该项检查包括测量总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酸酯。对血液中的化学物质进行的大多数实验室测试实际上是测试血清，血清是通过离心作用与血细胞分离的血液液体成分。因为许多医学诊断测试依赖于比色测定并因此而需要透明流体，所以此步骤是必需的。在离心分离之后，用各种方式对目标分子进行检测，最常用的是免疫测定，例如，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，或者酶活性测定，其中选择特定的酶对目标分子进行的氧化是一种变色反应，例如，测试胆固醇(用胆固醇氧化酶氧化)或葡萄糖(用葡萄糖氧化酶氧化)。制药科学届对以干血点的形式在纸上存储和输送全血样品非常有兴趣(N·史普纳(N.Spooner)等人分析化学(AnalChem.)，2009，81，1557)。对血液中的化学物质进行的大多数测试都是测试液体样品，通常是与液态全血隔离的血清或血浆。液态血或血液成分需要存储、输送和处理，其中存在一些困难。虽然某些测试中必须使用液态血，但在其他测试中可使用已点到表面(通常是纸)上并已变干的血或其他体液。
本发明的探针和方法可在无需进行任何样品制备的情况下分析全血。按照以下步骤制备样品：将0.4μL血液直接施加于纸三角的中心并干燥约1分钟，以形成干血点(图23A)。将10uL甲醇/水(1:1,v/v)施加在纸三角后端附近。在毛细管作用的驱动下，溶液会在纸上行进并将纸完全润湿。然后溶液与干血点相互作用，血中的分析物进入溶液中并被输送到探针的针头发生电离(图23A)。血液样品的分析过程可在约2分钟内完成。
可将不同药物掺入到全血中，且将全血施加到本发明探针，如上文所述。下文描述对不同药物进行检测。
伊马替尼(格列卫)是一种2-苯胺基嘧啶衍生物，经过FDA认证可治疗慢性粒细胞白血病，但只在很小的浓度范围内有效。以治疗范围内的浓度在人类全血中掺入伊马替尼，使所得全血在小的纸三角上沉积以用于分析(图14A)。质子化了的伊马替尼的串联质谱(MS/MS，图14B)(m/z494)显示单个特征的碎片离子。使用此信号并且将已知浓度的伊马替尼-d8添加为内标物来确定全血中伊马替尼的量。相关响应在很大浓度范围内都是线性的，包括整个治疗范围(图14C)。
阿替洛尔是治疗心血管疾病的□阻断剂药物，测试时可通过使用干血点方法评定纸喷雾器来进行全血分析。将阿替洛尔以所要的浓度直接掺入到全血中，并如上文所述将全血样品用于纸喷雾器。质谱显示，干血点中有400pg质子化了的阿替洛尔(0.4uL全血中1ug/mL的阿替洛尔)，且MS/MS谱显示，干血点中即使只有20pg阿替洛尔(0.4uL全血中50ug/mL的阿替洛尔)，质谱仍会将其突显出来(图23B)。
图23C为全血中的海洛因的质谱。本专利申请文件中的数据显示，可使用串联质谱检测出干血点中的200pg海洛因。
还可观察到，纸媒介会充当过滤器的次要角色，从而保留血细胞。重要的是，样品可直接在存储媒介上进行分析，而不需要在分析之前从纸中转移。所有的实验都是在开放的实验室环境下完成的。两个额外的特征表明，所述方法能够扩大质谱仪在基本护理设施中的使用：分析用的血液样品通过针孔吸得而不是用导管；以及使用手持式质谱仪可以让实验轻松进行(图18和下文的实例10)。
实例10：手持式质谱仪
本发明的系统和方法适合于手持式质谱仪。可使用手持式质谱仪(迷你型10，在普渡大学定制)进行纸喷雾。对掺有10μg/mL甲醇的全血进行分析。在血(0.4uL)干(～1分钟)后，将甲醇/水(1:1，10μL)施加到纸上以产生喷雾进行质谱检测(图18)。插图显示，使用串联质谱可轻松识别出全血中的阿替洛尔，即使阿替洛尔的量低至4ng。
实例11：血管紧张素I
图15为血管紧张素I溶液(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu(SEQIDNO:1)，10μL，8μg/mL甲醇/水，1:1,，v/v)在层析纸(喷雾电压4.5kV)上的纸喷雾器质谱。插图表示质量范围为630–700的展开图。质子化了的离子([M+2H]2+)和钠加合离子([M+H+Na]2+、[M+2Na]2+)是主要离子种类。
实例12：水果上的农业化肥
用纸擦拭来收集样品，随后使用本发明探针对该样品进行分析，这一过程可用于对水果上的农业化肥进行快速分析。用甲醇润湿的层析纸(3x3cm)擦拭从杂货店购买的柠檬皮上的10cm2面积。甲醇干了之后，从纸的中心切下一个三角形并通过施加10μL甲醇/水溶液而将该三角形用于纸张喷雾器。所记录的谱(图34A至图34B)显示，原来在柠檬皮上的杀菌剂涕必灵(对于质子化了的分子离子为m/z202且对于钠加合离子为m/z224)已收集到纸上且易于由MS突显，并通过使用MS/MS分析加以确定。还观察到存在另一种杀菌剂抑霉唑(m/z297)。
实例13：肿瘤样品
本发明的系统和方法可分析人类前列腺肿瘤组织和正常组织。肿瘤和邻近的正常组织部分厚15μm且被固定到载玻片上，以便使用解吸电喷雾电离技术(DESI)进行显像研究。可使用一根金属针从载玻片上先移取肿瘤区中的1mm2x15μm的组织，接着移取正常区中的1mm2x15μm的组织，并将这些组织置于纸三角的表面上进行纸喷雾器分析。
将一滴甲醇/水(1:1v:v；10μl)施加到纸上作为溶剂，接着施加4.5kV正直流电压以产生喷雾。例如磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)等磷脂均突显在谱中(图17A和图17B)。m/z798处的[PC(34:1)+K]+峰值在肿瘤组织中明显较高，而与正常组织相比，m/z725处的[SM(34:1)+Na]+峰值、m/z756处的[SM(36:0)+Na]+峰值和m/z804处的[SM(36:4)+Na]+峰值明显较低。
实例14：治疗药物监测
药物的投放取决于运用适当的剂量方针来得到安全有效的结果。此方针在研究药物的药物代谢动力学(PK)和药效动力学(PD)的临床试验期间建立。临床试验使用PK-PD研究来确定标准剂量，所述标准剂量可能是固定的，也可能根据含有体重、体表等变量的配方有所调整。然而，药物暴露(即，药物随时间流传的量)受各种因素的影响，对于不同的患者，这些因素也不相同。例如，个体的代谢速率、血浆蛋白质的类型和含量以及先前条件(例如，肾和/或肝损伤)都会影响体内药物暴露。此外，药物投放以及药疗法也会影响药物暴露。结果，经常难以预测和规定药物投放的最佳方案。
药物暴露过多或暴露不足分别会导致中毒或疗效降低。为解决这些问题，可以使用治疗药物监测(TDM)。TDM是对体内的药物活动程度进行测量，之后对药物剂量或用药时间进行调整，以提高疗效和/或降低毒性。当药物的药物代谢动力学变异相对于治疗窗来说较大时TDM会进行显示，并确定药物暴露与疗效和/或毒性之间的关系。需要TDM的另一原因是活性成分必须能够获得十分精准的测定。免疫测定和液相色谱质谱(LC-MS)是TDM常用的方法。与免疫测定相比，LC-MS具有以下优点：适用范围广、灵敏度高、定量良好、特异性高和处理能力强。本发明探针可结合标准质谱仪提供临床治疗药物监测。可使用纸喷雾器和实验室级LTQ质谱仪分析干血点中的药物伊马替尼(美国是格列卫，欧洲/澳大利亚是基利克，用于治疗慢性粒细胞白血病)。将已知浓度的伊马替尼-d8用作内标物，使用MS/MS谱确定全血中伊马替尼的量(图14C)。相关响应在很大浓度范围内都是线性的，包括整个治疗范围(图14C)。
实例15：高处理量检测
可制造多针尖装置并将其用于高处理量分析(图28A)。所述多针尖装置为全部连接到单个铜带的一组纸三角(图28A)。有电极连接到铜带。将多个样品放于单个纸板上，并使用多针尖探针进行连续分析(图28B和图28C)。每个针尖会预先注入0.2uL含有100ppm样品(可卡因或咖啡因)的甲醇/水，并弄干。接着，所有多针尖装置在移动台上以稳定的速度从左到右移动，且在移动期间从针尖背部向各针尖施加7uL甲醇/水。
为了防止针尖在喷雾期间受到污染，会在两个样品针尖之间留空。图28C显示整个扫描的信号强度。从总强度来看，六个针尖产生了六个各自的高的信号峰值。对于可卡因而言，只在扫描针尖2和针尖6时出现峰值。对于咖啡因而言，最高峰值源于针尖4，这与样品注入顺序一致。
实例16：组织分析
可使用本发明探针对动物组织中的化学物质进行直接分析，如图29A所示。移取小切片组织并将其置于纸三角上。将甲醇/水(1:1v:v；10μl)施加到纸作为溶剂，接着施加4.5kV正直流电压以产生喷雾进行MS分析。可观察到猪肾上腺组织(1mm3，图29B)的质子化了的激素离子。图16的质谱显示用纸喷雾器对动物组织中的激素进行的直接分析。将一小片猪肾上腺组织(1mmx1mmx1mm)置于纸表面上，并施加MeOH/水(1:1v:v；10μl)，随后将电压施加到纸上以产生喷雾。肾上腺素和去甲肾上腺素均突显在谱中；磷脂信号在质谱较高处占主导地位。获得从肿瘤和邻近的正常区中移取的人类前列腺组织(1mm2x15μm)的血脂曲线图(图29C和图29D)。例如磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)等磷脂均突显在谱中。m/z798处的[PC(34:1)+K]+峰值在肿瘤组织中明显更强(图29C)，而与正常组织相比，m/z725处的[SM(34:1)+Na]+峰值、m/z756处的[SM(36:0)+Na]+峰值和m/z804处的[SM(36:4)+Na]+峰值明显较低(图29D)。
实例17：在线衍生
为了分析混合物中电离效率相对较低且浓度相对较低的目标分析物，常常需要进行衍生以提供足够的灵敏度。可通过将试剂添加到喷雾溶液，例如，含有适合于目标分析物的试剂的甲醇/水溶液中来实施在线衍生。如果待用的试剂在纸上是稳定的，则在制造探针时也可将试剂添加到多孔材料上。
例如，将5μL含有500ng甜菜碱醛氯化物的甲醇添加到纸三角上并让其变干，从而制得预先添加有衍生试剂用于分析血清中的胆固醇的样品基材。通过甜菜碱醛(BA)与羟基反应进行在线电荷示踪先前已证明可有效识别组织中的胆固醇(吴(Wu)等人，分析化学(AnalChem.)2009，81:7618-7624)。当使用纸三角分析时，将2μL人类血清点到纸上以形成干血点，接着使用纸喷雾电离技术进行分析。将10μLACN/CHCl3(1:1v:v)溶液而不是甲醇/水用于纸喷雾器，以避免甜菜碱醛与甲醇反应。图30A和图30B显示使用空白纸与使用预先添加有试剂的纸三角进行分析的比较。在未使用衍生试剂的情况下，未观察到与胆固醇相关的峰值，例如，质子化了的离子[Chol+H]+(m/z387)、失水[Chol+H-H2O]+(m/z369)和钠加合物[Chol+Na]+(m/z409)(图30A)。在使用衍生试剂的情况下，可在m/z488.6处观察到离子[Chol+BA]+(图30B)。对此离子执行MS/MS分析，观察到一个特征碎片离子m/z369(图30C)。
实例18：使用改质的纸板喷雾器预先浓缩肽
使用光致抗蚀剂对纸表面上的化学物质进行预先浓缩。用SU-8光致抗蚀剂处理层析纸使之呈现疏水性，如先前所述(马第尼斯(Martinez)等人，德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)2007，46:1318-1320)。接着，将5μl缓激肽2-9溶液(纯H2O中100ppm)施加于纸表面上。溶液干了之后，将纸放入水中并水洗10秒。水洗之后，将纸三角固持在MS入口前，然后施加10μl纯MeOH作为溶剂并将电压设置在4.5kV加到纸喷雾器。对未作处理的纸板进行同样的实验以便比较。
图31A显示从用光致抗蚀剂处理的纸中获得的缓激肽2-9的串联MS谱。最强的碎片离子的强度404为5.66E3。图31B显示从未用光致抗蚀剂处理的正常层析纸中获得的缓激肽2-9的串联MS谱。最强的碎片离子的强度404仅为1.41E1。这些数据显示，用光致抗蚀剂处理过的层析纸与肽之间的亲合性比正常层析纸与肽之间的亲合性高得多，因此水洗之后可将更多的肽保留在纸表面上。施加纯甲醇之后，这些保留的肽将被解除吸附并由MS检测出。此方法可用来预先浓缩纸表面上的疏水化学物质，也可清除纸表面的其他亲水材料(例如，盐)。
实例19：极性反转
施加到探针的电压极性不必匹配质谱分析仪中使用的极性。具体而言，可以使用负电位运作本发明探针，而记录的是所得带正电荷离子的质谱。在阴离子模式下，纸喷雾器中产生较大的电子流(或溶剂化电子)。这些电子如果具有适当的能量便可被具有适当电子亲和性的分子捕获，从而产生自由基阴离子。
或者，这些电子可对分析物进行电子电离从而产生自由基阳离子，或者ESI可包括可与分析物进行电荷交换从而产生自由基阳离子的溶剂分子。如果用充足的能量进行此过程，则可能会产生特征碎片离子，但前提是在出现碎片之前自由基阳离子不会因为碰撞而钝化。
在台式LTP上使用甲苯蒸汽完成一项实验，其中在-4.5kV下实施本发明探针并将甲醇:水作为溶剂施加到纸上。记录图32所示的谱。可以看到，产生质子化了的分子的离子/分子反应(m/z93)如所预期在大气压下发生。然而还可看到，在m/z92处出现自由基阳离子，且在m/z91和65处出现其特征碎片。
有趣的是，在甲苯蒸汽源靠近MS入口，即，在纸尖与MS入口之间的放电阴极区中时，更易于产生“EI”碎片离子。这表明，可能是高能电子在“下降”区中进行的直接电子电离至少部分地导致了此现象。
实例20：用于血液分析的样品筒
图33A显示将血液点到将用于质谱分析的多孔纸上的示例性情况。样品筒具有中心量控制瓶以及溢流瓶。可使用塞子(例如，含有固定量的化学内标物的可溶解膜)堵住瓶的底部以控制量。将一滴血液置于瓶中(图33B)。使多余的血液流入溢流瓶来控制瓶中的血液量(图33B)。瓶中的血液随后在底部的膜中溶解，从而将化学内标物混入血液中(图33B)。塞子溶解之后，血液会流到纸板上，最终形成具有可控量的样品和内标物的干血点(图33B)。

Claims (21)

1.一种分析样品中的蛋白质或肽的方法，所述方法包括：
将包括蛋白质或肽的样品与探针接触，所述探针包括逐渐变细为尖端的多孔材料，其中所述探针不需要气动辅助而运作；
将电压施加到所述多孔材料，以便在所述材料的尖端处产生电场，以产生所述样品中的蛋白质或肽的离子，所述离子从所述尖端被排出；和
分析所排出的离子，从而分析所述样品中的所述蛋白质或肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述多孔材料与溶剂流分开。
3.如权利要求2所述的方法，进一步包括向所述多孔材料施加溶剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述溶剂辅助所述样品通过所述多孔材料进行输送。
5.如权利要求3所述的方法，其中，所述溶剂含有内标物。
6.如权利要求3所述的方法，其中，所述溶剂最小化基体的效应。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述多孔材料为纸。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述纸为滤纸。
9.如权利要求1所述的方法，其中，分析包括提供质谱分析仪以产生所述蛋白质或肽的质谱。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述质谱分析仪包括在微型质谱仪中。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述质谱分析仪选自由以下各物组成的群组：四极离子阱、直线离子阱质谱仪、圆柱形离子阱质谱仪、离子阱回旋共振质谱仪、轨道阱质谱仪。
12.一种分析蛋白质或肽的方法，所述方法包括：
将包括蛋白质或肽的体液样品与逐渐变细为尖端的多孔材料接触；
将高电压施加到所述多孔材料，以产生所述体液样品中的蛋白质或肽的离子，所述离子从所述多孔材料的尖端被排出；和
分析所排出的离子，从而分析所述体液样品中的所述蛋白质或肽。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述体液是血液。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述体液是尿。
15.如权利要求12所述的方法，其中，所述体液是唾液。
16.如权利要求12所述的方法，其中，所述多孔材料与溶剂流分开。
17.如权利要求16所述的方法，进一步包括向所述多孔材料施加溶剂。
18.如权利要求12所述的方法，其中，分析包括提供质谱分析仪以产生所述蛋白质或肽的质谱。
19.一种分析样品中的蛋白质或肽的方法，所述方法包括：
获得包括蛋白质或肽的样品；
将包括所述蛋白质或肽的样品与多孔材料接触，而没有任何样品制备步骤；
将高电压施加到所述多孔材料，以产生所述蛋白质或肽的离子，其中所产生的所述离子从所述多孔材料被排出；和
分析所排出的离子，从而分析所述样品中的所述蛋白质或肽。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述样品是体液。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述体液是血液。
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