CN117545999A - 用于检测样品中的至少一种分析物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测样品(112)中的至少一种分析物(110)的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供具有至少一种分析物(110)的至少一个样品(112)；b)将所述样品(112)与具有至少一个表面(120)的微粒(118)一起孵育，由此所述分析物(110)被吸附在所述微粒(118)的所述表面(120)上并且形成分析物‑微粒复合物(122)；c)提供具有至少一个尖端(130)的至少一个纤维片材(128)，并使所述纤维片材(128)的所述尖端(130)与包含所述分析物‑微粒复合物(122)的所述样品(112)接触，由此至少将所述分析物‑微粒复合物(122)吸入所述纤维片材(128)的所述尖端(130)中；d)使所述纤维片材(128)的所述尖端(130)与分析装置的端口接触；e)向所述纤维片材(128)添加萃取溶剂(138)并向所述纤维片材(128)施加电压，由此生成所述分析物(110)的离子并将其从所述纤维片材(128)的所述尖端(130)排出；以及f)用所述分析装置(134)检测所述至少一种分析物(110)。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测样品中的至少一种分析物的方法、样品制备系统和试剂盒。该装置和方法可用于测量分析物的质量或分析物的片段的质量，以达到识别分析物的目的。具体地，该装置和方法可用于诸如蛋白质、肽、寡核苷酸和小分子化合物的生物分子的分析。然而，其他应用也是可行的。
背景技术
纸喷雾电离技术通常利用切割成尖端的纸基材，可以施加目标样品。接下来，可以将喷雾溶剂施加到纸基材上，以促进分析物萃取和电离。最后，可以将高电压施加到纸张上，从而在纸张尖端处产生类似电喷雾的电离事件。尽管纸喷雾在环境技术方面相对较新，但它已经成熟并发展成商业产品。
纸喷雾电离技术自诞生以来已被用于多种临床应用，大量相关文献可以证实这一点。这些应用中的大部分围绕诸如血液、血浆和尿液等生物基质的分析，但也已扩展到其他复杂材料，诸如组织活检、细胞培养基、组织匀浆和细菌菌落。纸喷雾电离技术通常具有临床应用特有的几个优点。使用收集介质的能力，例如干血斑(DBS)纸作为电离介质大大简化了样品的运输和储存。考虑到这些基材的一次性使用性质，它们对于临床医生来说也是一种低成本消耗品。
在Manicke等人的Anal.Chem.2015，87，6212-6219，DOI：10.1021/acs.analchem.5b00884中，描述了一种具有用于生物分析的集成固相萃取的纸喷雾质谱盒的发展。描述了一种具有集成固相萃取(SPE)柱的新型纸喷雾盒。该盒从诸如血浆等复杂样品中进行萃取和预浓缩，以及通过纸喷雾进行样品电离。该盒允许从较大的样品体积中选择性富集目标分子并去除基质，这通过纸喷雾电离显著提高在血浆样品中目标化合物的信号强度。
纸尖端形成的结构可以用作喷雾锥。在US2017/0053788A1中，描述了一种具有顶角为12.5°至45°的三角锥形状的纸锥尖端，以及使用纸锥尖端的纸锥喷雾电离质谱(PCSIMS)方法。纸锥喷雾电离质谱(PCSIMS)方法包括：制备具有三角锥形状的纸锥尖端；将测量样品放入纸锥尖端中并将纸锥尖端定位在质谱仪前面；以及向纸锥尖端添加喷雾溶剂并向其施加电压。
在WO 2013/102670A1中描述了一种用于从绝缘板喷涂液体层的静电喷雾电离方法。该板布置在两个电极之间。提供恒定的高压电源，并使用电路通过在电极之间施加电源对在绝缘板上的液体层的表面进行局部充电和放电。
在WO 00/30167A1中，描述了一种具有悬垂“聚合物”毛细管的MEMS装置，该装置在MEMS电喷雾喷嘴到MS入口或其他宏观仪器的接口方面提供了重要且显著的改进。与之相关的制造方法很容易扩展到包括内置微粒过滤器和在芯片上提供的并使用低温过程制造的厘米长的蛇形微通道。
此外，润湿的多孔材料和聚合物基材料迄今为止已经与分配单元结合使用。
在WO 2010/127059Al中描述了用于样品的质谱分析的系统和方法。在某些实施例中，提供了一种质谱探针，其包括连接到高压源的至少一种多孔材料，其中该多孔材料与溶剂流分离。
此外，使用纸作为用于微生物的采样装置，随后使用纸基电喷雾电离质谱法。具体地，在US2013/0330714A1中描述了用于样品中微生物的质谱分析的系统和方法。
此外，使用预涂滤纸作为固相萃取材料。此方法也可称为涂层刀片喷雾技术。
在Pawliszyn等人的Angew.Chem.Int.Ed.2014，53，14503-14507，DOI：10.1002/Anie.201407057中，描述了一种用于定量在复杂基质中存在的目标分析物的涂层刀片喷雾电离质谱法的发展。涂层刀片喷雾(CBS)是一种基于固相微萃取(SPME)的技术，旨在从复杂基质中快速萃取/净化分析物，并在环境质谱条件下直接解吸/电离。整个分析过程可以在不到3分钟内完成，并且能够达到低皮克每毫升区域的定量限。
在Ouyang等人的Analytical Chemistry，Vol.82，No.6，2463-2471，DOI：10.1021/ac902854g中，描述了纸喷雾电离的发展、表征和应用。纸喷雾被发展为一种用于复杂混合物的质谱分析的直接采样电离方法。分析物的离子是通过向用小体积(＜10μL)溶液润湿的纸三角施加高电压而生成的。样品可以预先加载到纸上，添加润湿溶液，或者使用纸作为揩布从表面转移。
在Badu-Tawiah等人的Mass Spectrometry Reviews，2020，39，336-370，DOI10.1002/mas.21601中，描述了纸喷雾质谱法的新兴趋势，包括微量采样、储存、直接分析和应用。
在US 2009/0090855 A1中描述了一种用于复杂基质的基于磁珠的净化程序。具体地，在US 2009/0090855 A1中，描述了一种通过质谱法，优选地LC-MS/MS制备用于分析的样品的新程序。因此，具有疏水表面的官能化磁性颗粒被用于从复杂液体生物学样品(诸如血浆、血清、全血或溶血血)中萃取低分子量化合物。本发明的方法包括(a)使样品与一定量的具有疏水表面的官能化磁性颗粒接触，(b)孵育样品和颗粒，从而将化合物吸附到疏水表面，(c)通过施加磁场并去除液体来分离颗粒，(d)任选地洗涤颗粒，(e)从颗粒中洗脱化合物。
WO 2012/170301 A1描述了使用润湿多孔材料生成离子的系统和方法。具体地，WO2012/170301 A1描述了一种采样盒。该盒包括：中空壳体，该中空壳体包括经构造成保持固体多孔基材的内部、至少一个入口、出口和电极，其中该壳体经构造成使得入口与容纳在该壳体内的基材流体连通，并且电极与容纳在壳体内的基材接触。
尽管上述的装置具有优点，但仍存在若干技术挑战。
诸如血清、血浆和尿液等生物学样品以及各自的分析物通常大多表现出非常低的生物活性浓度范围。示例性地，雌二醇表现出低至0.5pg/ml的生物活性浓度范围。此外，生物学样品通常包括多种干扰分析的基质组分。为了制备此类生物物质以进行分析方法，需要建立有效的净化程序。对于质谱法，需要一种包括微粒处理和使用不同洗涤/洗脱步骤的自动化方式。分析物从用作净化剂的微粒中洗脱可以导致分析物的稀释。此外，主要由于移液原因，整个洗脱体积不能施加于分析系统。此外，用于质谱法的纸基电离提供了一种替代方法，即使用纸条代替电喷雾电离毛细管作为质谱仪入口和离子发生单元前面的电压/溶剂接口。在纸喷雾电离技术中，由于使用纸的缺点，可以看出样品的净化能力和体积施加技术较差。
待解决的问题
因此，期望提供至少部分地解决上述技术挑战的用于检测样品中的至少一种分析物的方法、样品制备系统和试剂盒。具体地，应提供有效的样品净化程序。
发明内容
此问题通过具有独立权利要求的特征的用于检测样品中的至少一种分析物的方法、样品制备系统和试剂盒得以解决。在从属权利要求中以及整个说明书中，列出了可以以单独方式或以任意组合实现的有利实施例。
如下文所使用的，术语“具有”、“包括”或“包含”或它们的任意语法变化形式以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在此上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指存在一个或多个其他特征的情况。作为实例，表述“A具有B”、“A包括B”和“A包含B”既可以指其中除B之外，A中不存在其他要素的情况(即，其中A由B单独并且唯一地组成的情况)，也可以指其中除B之外，实体A中还存在一个或多个其他要素(诸如要素C、要素C和要素D或甚至其他要素)的情况。
进一步地，应注意，指示特征或要素可存在一次或多于一次的术语“至少一个”、“一个或多个”或类似表述通常在引入相应特征或要素时仅使用一次。在下文中，在大多数情况下，当提及相应的特征或元素时，尽管相应的特征或元素可能只存在一次或多次，但不会重复使用表述“至少一个”或“一个或多个”。
此外，如下文所使用的，术语“优选地”、“更优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与任选特征结合使用，而不限制替代性的可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选特征，并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代性特征来执行。类似地，由“在本发明的一个实施例中”引入的特征或类似表述旨在成为任选特征，而对本发明的替代性实施例没有任何限制、对本发明的范围没有任何限制，并且对将以这种方式引入的特征与本发明的其他任选或非任选特征相组合的可能性也没有任何限制。
在本发明的第一方面，公开了一种用于检测样品中的至少一种分析物的装置。
该方法包括以下步骤，这些步骤可具体地以给定顺序执行。然而，应当注意，不同的顺序也是可能的。此外，还可以一次或重复执行一个或多个方法步骤。此外，可以同时或以及时重叠的方式执行两个或更多个方法步骤。具体地，步骤d)和e)可以同时或以时间上重叠的方式执行。该方法可以包括未列出的其他方法步骤。
所述方法包括以下步骤：
a)提供具有至少一种分析物的至少一个样品；
b)将样品与具有至少一个表面的微粒一起孵育，由此分析物被吸附在微粒的表面上并且形成分析物-微粒复合物；
c)提供具有至少一个尖端的至少一个纤维片材，并使该纤维片材的尖端与包含分析物-微粒复合物的样品接触，由此至少将分析物-微粒复合物吸入纤维片材的尖端中；
d)使纤维片材的尖端与分析装置的端口接触；
e)向纤维片材添加萃取溶剂并向纤维片材施加电压，由此生成分析物的离子并将其从纤维片材的尖端排出；以及
f)用分析装置检测至少一种分析物。
如本文所用，术语“分析物”是一个广义术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于待检测和/或测量的任意化学或生物物质或种类，诸如分子或化合物。具体地，可以检测或测量样品中分析物的存在、不存在、浓度和/或量。具体地，分析物可以为生物分子或大分子。分析物可以选自由以下项组成的组：类固醇，具体地酮类固醇，具体地开酮类固醇；治疗活性物质，具体地抗生素，具体地局部麻醉剂，具体地利多卡因；肽，具体地环孢菌素A；蛋白质；代谢物，具体地核苷酸，具体地5’-单磷酸腺苷；核酸；氨基酸；激素；脂肪酸；脂质；碳水化合物。此外，分析物可以是另一已被生物体内化的分子或物质或此类物质的代谢物或其组合特定修改的分子特征。然而，不同种类的分析物也是可行的。其他物质，特别是具有不同官能团和/或不同性质的分子，例如疏水性和亲水性分子可以用作分析物。样品中分析物的浓度可以在0.01pg/ml至1mg/ml，优选地0.05pg/ml至50μg/ml，最优选地0.1pg/ml至10μg/ml的范围内。然而，其他浓度也是可行的。分析物可具有10Da至10000Da、优选地50Da至3000Da、最优选地100Da至2000Da的摩尔质量。
如本文所用，术语“检测分析物”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于对任意样品中的至少一种分析物的定量和/或定性确定。样品中分析物的定量和/或定性确定可以为检测过程的结果或中间结果，该检测过程可以包括至少一个测量步骤以及其他步骤，诸如至少一个制备步骤和/或至少一个分析步骤。作为检测过程的一部分，可以生成至少一个测量值，具体地关于样品中分析物的存在、不存在、浓度或量的测量值。
如本文所用，术语“样品”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于任意样品，诸如生物学样品(也称为测试样品)、质量控制样品、内标样品。样品可以包括一种或多种目标分析物。样品可以具体地为液体样品，特别是包含至少一种生物材料的液体样品。例如，样品可选自由以下项组成的组：生理流体，包括血液、血清、血浆、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水、粘液、滑膜液、腹膜液、羊水、组织、细胞等。样品可在从相应来源获得时直接使用，或者可经过预处理和/或样品制备工作流程。此外，作为用于检测样品中分析物的方法的一部分，样品可以经历一个或多个处理步骤。因此，样品的至少一种性质，例如样品组成、样品体积、分析物浓度或其他样品性质可能在用于检测分析物的方法期间改变。具体地，作为一个或多个制备步骤的一部分，可以从样品中去除一种或多种组分，诸如样品的化学或生物化合物。具体的样品处理步骤，特别是可以为该方法的步骤b)的一部分，将在下文中进一步更详细地描述。此外，初始液体样品可以经历干燥过程，特别是在作为步骤c)的一部分被吸入纤维片材的尖端之后。作为干燥过程的一部分，样品的部分或全部液体，例如部分或全部溶剂可以蒸发，如下文中进一步详细描述的。
如上所述，在步骤a)中，提供具有至少一种分析物的至少一个样品。如本文所用，术语“提供”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于制作一个或多个所需对象的过程。
如上所述，在该方法的步骤b)中，将样品与具有至少一个表面的微粒一起孵育，由此分析物被吸附在微粒的表面上，并形成分析物-微粒复合物。
如本文所用，术语“微粒”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于微观尺寸的任意颗粒物质。微粒可具有100nm至100μm，具体地200nm至50μm范围内的平均直径。微粒也可称为小珠。微粒可以是球形或球状形状的。然而，从球形或球状形状的轻微衍生可能是可行的。如上所述，微粒具有至少一个表面。如本文所用，术语“表面”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于从外部界定任意物体的整个区域。因此，主体可以具有多个表面。具体地，微粒可以具有被表面包围的芯。表面和芯可以包括不同的材料。此外，表面和芯可以具有不同的性质。示例性地，芯可以是磁性的。当微粒与包含此类分子的样品一起孵育时，表面可以经构造用于捕获分子，例如宽范围的极性至非极性分子。
特别地，微粒可以选自由以下项组成的组：磁性微粒，具体地具有磁芯和改性表面的磁性微粒；二氧化硅微粒，具体地具有二氧化硅芯和改性表面的二氧化硅微粒；三聚氰胺树脂微粒，具体地具有三聚氰胺树脂芯和改性表面的三聚氰胺树脂微粒；聚(苯乙烯)基微粒，具体地具有聚(苯乙烯)芯和改性表面的聚(苯乙烯)基微粒；聚(甲基丙烯酸甲酯)微粒，具体地具有聚(甲基丙烯酸甲酯)芯和改性表面的聚(甲基丙烯酸甲酯)微粒。然而，其他粒子也是可行的。三聚氰胺树脂微粒可以具有500nm至20μm、优选地2μm至4μm、更优选地3μm的平均直径。聚(苯乙烯)基微粒可以具有500nm至50μm、优选地2μm至4μm、更优选地3μm的平均直径。聚(甲基丙烯酸甲酯)微粒可以具有500nm至50μm、优选地2μm至4μm、更优选地3μm的平均直径。磁性微粒的改性表面可以为改性聚(苯乙烯)表面，并且磁性微粒可以具有5μm至50μm、优选地10μm至30μm、最优选地20μm的平均直径。磁性微粒的改性表面可以为二氧化硅表面，并且磁性微粒可以具有100nm至1000nm、优选地200nm至500nm、最优选地300nm的平均直径。二氧化硅微粒的改性表面可以为氰丙基硅烷官能化表面，并且二氧化硅微粒可以具有5μm至100μm、优选地20μm至80μm、最优选地40μm的平均直径。其他尺寸也是可行的。
如本文所用，术语“孵育”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于至少两种物质的混合和/或将至少一种物质添加到另一种物质中。具体地，可以将固体或颗粒物质添加到液体样品和/或与液体样品混合。除了添加和/或混合的过程之外，孵育可以进一步包括称为孵育时间的一段时间。在孵育时间期间，两种物质中的一种可以被吸附在两种物质中的另一种的表面上。在孵育时间期间，可以选择其他条件，诸如温度和/或其他条件，以利于所需的吸附。因此，在步骤b)中，可以将微粒添加到样品并且可以任选地与样品混合。在步骤b)中，可以将样品与微粒一起孵育，孵育时间为1秒至60分钟，优选地1分钟至30分钟，最优选地3分钟至12分钟。然而，其他持续时间也是可行的。
如本文所用，术语“被吸附在表面上”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于形成气体或液体的一部分的原子、离子或分子在固体或颗粒物质的物体的表面处积聚期间的过程的结果。最初可能分布在气体或液体中的原子、离子或分子在吸附过程中可能被固体物质或颗粒物质的表面吸引。
如本文所用，术语“分析物-微粒复合物”是广义的术语且被赋予其对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不应限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于包含至少一种微粒和至少一种分析物，具体地一种微粒和多种分析物的整体。形成复合物的微粒和分析物，具体地分析物，可以可逆地结合。因此，至少在某些条件下，复合物的组分可以离开复合物或从复合物解离。分析物-微粒复合物可以基于微粒与分析物之间的至少一种吸引力形成。特别地，吸引力可以作用在微粒的表面与分析物之间。因此，最初可能分布在样品中、具体地分布在样品的液相中的分析物可能在微粒的表面的吸附过程中积聚。吸引力可以包括范德华力和静电吸引。其他吸引力也是可行的。具体地，作为分析物-微粒复合物形成的一部分，可以在微粒和分析物之间，具体地在微粒的表面与分析物之间形成至少一个化学键。分析物-微粒复合物也可称为载有分析物的微粒。
如上所述，在步骤b)中，将样品与具有至少一个表面的微粒一起孵育，由此分析物被吸附在微粒的表面上并形成分析物-微粒复合物。在本文中，该表述可以被理解为形成多个分析物-微粒复合物。因此，在步骤b)中，样品可以与具有至少一个表面的微粒一起孵育，由此分析物被吸附在微粒的表面上并且形成分析物-微粒复合物。此外，在步骤c)中，可以提供具有至少一个尖端的至少一个纤维片材，并且纤维片材的尖端可与包含分析物-微粒复合物的样品接触，由此至少将分析物-微粒复合物吸入纤维片材的尖端中。
该方法可以进一步包括以下步骤：
b1)从样品的其他组分分离分析物-微粒复合物，具体地分析物-微粒复合物；以及
b2)从分析物-微粒复合物中，具体地从分析物-微粒复合物中去除样品的其他组分。
步骤b1)可以示例性地包括样品的离心。此外，附加地或替代地，步骤b1)可以包括基于磁性的分离。具体地，微粒可以为磁性微粒，并且步骤b1、)可以包括基于磁性的分离。步骤b2)可以具体地包括通过液体处理装置诸如通过移液管去除上清液。
基于磁性的分离可以示例性地包括通过液体处理装置，具体地通过移液管吸入至少分析物-微粒复合物。此后，可以使磁性分离器靠近液体处理装置。示例性地，磁性分离器可以接触液体处理装置的外表面。磁性分离器可以经构造用于将分析物-微粒复合物保持在液体处理装置的内部空间内。因此，样品的残留组分(诸如基质)可以从分析物-微粒复合物中分离并且可以被去除。任选地，可以进行洗涤步骤。为此目的，可用至少一种洗涤溶剂洗涤分析物-微粒复合物，然后通过液体处理装置进一步吸入至少分析物-微粒复合物，并通过磁性分离器将分析物-微粒复合物保持在液体处理装置的内部空间内。此后，纤维片材的尖端可以与分析物-微粒复合物接触，由此至少将分析物-微粒复合物吸入纤维片材的尖端中。为此目的，可以使纤维片材的尖端靠近液体处理装置的尖端。然而，其他基于磁性的分离技术也是可行的。
此外，该方法可包括以下步骤：
b3)洗涤分析物-微粒复合物，具体地分析物-微粒复合物。
具体地，可以用洗涤溶剂洗涤分析物-微粒复合物。洗涤溶剂的组成可以选择为使得分析物保持与微粒结合。洗涤溶剂可以为或可以包含去离子水。此外，洗涤溶剂可以包括水、一种或多种缓冲盐、一种或多种pH调节添加剂和/或一种或多种有机溶剂的混合物。有机溶剂可以选自由以下项组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈。有机溶剂的含量可以为0体积％至10体积％。步骤b3)可以重复至少两次，优选地至少三次。
如本文所用，术语“纤维片材”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于，由多个纤维制成或包括多个纤维并且另外可以具有基本上平坦的形状的任意材料。纤维可以是直接源自活体的天然纤维，或者可以是通过化学合成制造的合成纤维。纤维可以具有超过其宽度至少5倍、至少10倍、或者甚至至少20倍或更大倍数的长度。纤维片材可以选自由以下项组成的组：纤维素，具体地纤维素层析纸，具体地醋酸纤维素膜、玻璃滤膜。然而，其他材料也是可行的。纤维片材可以具体地对有机溶剂、具体地对萃取溶剂稳定。纤维片材可具有10g/m2至3000g/m2、优选地20g/m2至1000g/m2、最优选地80g/m2至700g/m2的克重。然而，其他克重也是可行的。纤维片材可具有细长的形状。具体地，纤维片材可以作为条带被提供。
如本文所用，术语“尖端”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于任意元件，具体地细长元件的尖锐端部。纤维片材的尖端可以具体地具有三角形形状。此外，尖端可以具有5°至90°、优选地20°至80°的尖端角。尖端角可以具体地指三角形的张角。然而，其他形状也可能是可行的。
如上所述，纤维片材的尖端与包含分析物-微粒复合物的样品接触。在本文中，术语“接触”可以具体指其中一个元件与另一元件直接接触的任意过程。因此，两个元件可以彼此接触。示例性地，纤维片材的尖端可以简单地插入包含分析物-微粒复合物的样品中。然而，原则上，其他技术也是可行的。
如上所述，在步骤c)中，至少将分析物-微粒复合物吸入纤维片材的尖端中。因此，任选地，也可以将样品的其他组分吸入纤维片材的尖端中。术语“抽吸”可以具体指将包含分析物-微粒复合物的样品拉入纤维片材中，具体地通过纤维片材的尖端，具体地在特定方向上。
该方法可任选地进一步包括以下步骤：
c1)干燥纤维片材，使得样品的液体蒸发。
步骤c1)可以包括纤维片材的自然干燥，例如露天干燥。此外，附加地或替代地，c1)可以包括在真空下干燥纤维片材。然而，并非绝对需要完全干燥纤维片材。此外，在纤维片材包含洗涤溶剂的残留物的情况下也可以进行步骤f)。在进行步骤d)之前，该方法可以进一步包括纤维片材的储存。具体地，步骤c1)可以在纤维片材被储存之前进行。
如上所述，在步骤d)中，纤维片材的尖端与分析装置的端口接触。在本文中，术语“接触”可以具体指其中一个元件与另一元件接触的任意过程。接触可以指直接接触或间接接触。具体地，纤维片材的尖端可以与分析装置的端口接触，使得发生材料交换，具体地气体交换。因此，示例性地，纤维片材的尖端和分析装置的端口可以彼此接触。示例性地，纤维片材的尖端可以简单地放置在端口的表面上。然而，纤维片材的尖端和分析装置的端口也可以布置成彼此间隔一定距离。具体地，纤维片材的尖端和分析装置的端口可以以0.1cm至5cm的距离，优选地0.2cm至3cm的距离、最优选地0.5cm至2cm的距离布置。此外，纤维片材的尖端和分析装置的端口可以以彼此间隔小于2cm的距离，优选地小于1cm的距离，最优选地小于0.5cm的距离布置。
具体地，纤维片材的尖端可以通过以下程序之一与分析装置的端口接触，该程序选自由以下项组成的组：纤维片材的尖端与分析装置端口直接接触，具体地纤维片材的尖端与分析装置的端口彼此接触；纤维片材的尖端与分析装置的端口间接接触，具体地纤维片材的尖端与分析装置的端口以彼此间隔一定距离布置，优选地0.1cm至5cm的距离，更优选地0.2cm至3cm的距离、最优选地0.5cm至2cm的距离。
如本文所用，术语“分析装置”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于经构造用于对样品或样品的至少一个组分进行至少一次分析测量的装置。作为测量的结果或作为测量的一部分，分析装置可以生成样品和/或至少一个组分的至少一个测量结果特征，具体地关于分析物的至少一种测量结果。特别地，关于分析样品的分析物相关信息可以从分析测量中导出或可以导出。该信息可以例如关于样品中分析物的存在、不存在、浓度或量。特别地，分析装置可以经构造用于检测样品中的分析物。具体地，分析装置可以选自由以下项组成的组：质谱仪；离子迁移装置；质谱仪和离子迁移装置的组合。然而，其他装置也是可行的。
如本文所用，术语“质谱仪”是广义的术语且将被赋予对于本领域普通技术人员普通和惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于经构造用于测量离子的质荷比的任意分析装置。测量结果可以具体地呈现为质谱，例如作为质荷比函数的强度图。
如本文所用，术语“离子迁移装置”是广义术语且被赋予对于本领域普通技术人员普通和惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于任意分析技术，该技术经构造成基于电离分子在载体缓冲气体中的迁移来分离和识别在气相中的电离分子。离子迁移装置可以具体地耦合到质谱仪，具体地为了实现多维分离。离子迁移装置可经构造用于检测离子通过离子迁移谱池的至少一个漂移时间。离子迁移装置也可以被称为一种离子迁移谱装置。
如本文所用，术语“端口”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于经构造用于接收、接受或接触待由分析装置分析的样品的分析装置的任意部件或子单元。
如上所述，在步骤e)中，将萃取溶剂添加到纤维片材。在步骤e)中，可以将萃取溶剂施加到纤维片材上。具体地，可以将萃取溶剂移液到纤维片材上。此外，附加地或替代地，可以将萃取溶剂喷射到纤维片材上。具体地，在步骤e)中，纤维片材可以与毛细管接触，并且经由毛细管向纤维片材提供连续的萃取溶剂流。萃取溶剂的连续流可以具有1μL/min至50μL/min、优选地10μL/min至30μL/min、最优选地20μL/min的流速。具体地，萃取溶剂可以施加在纤维片材的与纤维片材的尖端不同的区域上。萃取溶剂可通过毛细管力朝向纤维片材的尖端移动。纸张材料可以具体地包括前侧和后侧。萃取溶剂可以施加在纸张材料的背面上。
如本文所用，术语“萃取溶剂”是一个广义术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于用于任意分离过程的任意溶剂，该任意分离过程包括一种物质与另一种物质的分离。萃取溶剂可以为有机溶剂或者可以包含有机溶剂。有机溶剂可以选自由以下项组成的组：乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇、四氢呋喃。此外，萃取溶剂可以包含一种或多种添加剂。可以添加高达10％二甲基亚砜或0.1％的甲酸、乙酸、三氟乙酸、氟化铵、氢氧化铵或三乙胺作为添加剂。此外，萃取溶剂可以包含去离子水。萃取溶剂的水含量可以为0％至20％。由于萃取溶剂的高有机物含量，可以确保从微粒中萃取分析物，从而确保分析物从微粒中分离。
此外，如上所述，在步骤e)中，将电压施加到纤维片材，由此生成分析物的离子并将其从纤维片材的尖端排出。分析物的离子可以适用于经由质谱仪的分析。具体地，在步骤e)中，可以施加1kV至10kV、优选地2kV至5kV、最优选地3kV的电压。具体地，经由与至少一个夹子，具体地与至少一个铜夹子接触，将电压施加到纸张材料。夹子可以连接到电压源电源，具体地高压源电源。分析装置的端口可以包括电极，并且当施加电压时可以通过纸张材料产生电场。萃取溶剂可经构造用于从微粒中分离分析物。此外，分析物可以被离子化并且可以从纸张材料的尖端喷射。微粒可以保留在纸张材料上。
分析物-微粒复合物的运输可以通过萃取溶剂和电场发生。
在本发明的另一方面，公开了一种样品制备系统，具体地连续样品制备系统。样品制备系统可以经构造用于进行如上所述或将在下文中进一步详细描述的用于检测至少一种分析物的方法。
如本文所用，术语“样品制备系统”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于经构造成制备样品以将样品用于特殊目的(诸如用于进行分析测量)的任意系统。在样品制备期间，样品的至少一种性质，例如样品组成、样品体积、分析物浓度或其他样品性质可能会改变。如本文所用，术语“连续样品制备系统”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于任意样品制备系统，其经构造用于连续地制备多个样品，优选地在制备之间不停止。
样品制备系统包括：
·至少一个容器，其中该容器经构造用于提供具有至少一种分析物的至少一个样品；
·至少一个液体处理系统，其中该液体处理系统经构造用于将微粒添加到容器，由此分析物被吸附在微粒的表面上并且形成分析物-微粒复合物；
·至少一个保持器，其中该保持器经构造用于保持具有至少一个尖端的至少一个纤维片材，其中该保持器进一步经构造用于使纤维片材的尖端与包含分析物-微粒复合物的样品接触；
·至少一个分析装置，具体地至少一个质谱仪，其中该分析装置经构造用于检测至少一种分析物，其中该分析装置包括至少一个端口；
·至少一个样品更换器，其中该样品更换器经构造用于将保持纤维片材的保持器转移到分析装置的端口，使得纤维片材的尖端与端口接触；
·至少一个电触点，其中该电触点经构造用于向纤维片材施加电压；以及
·至少一种萃取溶剂供应，其中该萃取溶剂供应经构造用于至少一种萃取溶剂润湿纤维片材。
如本文所用，术语“容器”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体地可指但不限于经构造用于接收和保持至少一种物质，具体地至少一种液体物质的任意装置。容器可以具有任意形状。
如本文所用，术语“液体处理系统”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于经构造用于将液体，具体地规定或期望量的液体施加到另一物体的任意装置。液体的量可以是可调节的。液体处理系统可以具体地包括一个或多个移液单元。移液单元可以包括至少一个腔室，该腔室经构造用于保持或接收至少一种液体。移液单元可以经构造用于在腔室上方产生部分真空，并且用于选择性地释放部分真空以抽吸和分配液体。此外，附加地或替代地，液体处理系统可以包括至少一个声学液滴喷射单元。声学液滴喷射单元可以经构造用于使用超声脉冲在没有任何物理接触的情况下移动大量流体。然而，液体处理系统的其他实施例也是可行的。
如本文所用，术语“保持器”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言其普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于可以经构造用于保持，具体地可逆地或可释放地保持元件的任意装置。具体地，纤维片材可以在保持器的至少两个表面之间被压紧。保持器可以具体地是或者可以包括至少一个钳子。然而，其他实施方案也可能是可行的。保持器可具体地构造用于保持具有至少一个尖端的至少一个纤维片材，其中保持器进一步经构造用于使纤维片材的尖端与包含分析物-微粒复合物的样品接触，由此至少将分析物-微粒复合物吸入纤维片材的尖端中。
如本文所用，术语“样品更换器”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于可以经构造用于将元件运输或移动到期望位置的任意装置。具体地，样品更换器可以经构造用于将多个元件连续地移动到期望的位置。样品更换器可以具体地为自动样品更换器。电触点可具体地经构造用于向纤维片材施加电压，由此生成分析物的离子并将其从纤维片材的尖端排出。如本文所用，术语“萃取溶剂供应”是广义的术语且被赋予对于本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于经构造用于向任意物体施加萃取溶剂的任意装置。示例性地，萃取溶剂供应可以为或可以包括至少一个移液单元。此外，萃取溶剂供应可以为或可以包括喷嘴，该喷嘴经构造用于将萃取溶剂喷射到纤维片材上。此外，萃取溶剂供应可以为或可以包括至少一个毛细管，该毛细管经构造用于将萃取溶剂的连续流提供到纤维片材上。其他实施方案也是可行的。
在本发明进一步的方面，公开了一种试剂盒。
如本文所用，术语“试剂盒”是广义的术语且被赋予对本领域普通技术人员而言普通且惯常的含义，并且不限于特殊或自定义的含义。该术语具体可指但不限于一组若干物品，诸如用于进行期望的方法、具体地用于样品制备方法和/或样品分析方法的化学品。具体地，物品可以被提供在壳体中，例如包装。
该试剂盒包括：(i)微粒；(ii)具有至少一个尖端的至少一个纤维片材；以及(iii)至少一种萃取溶剂。关于微粒、纤维片材和萃取溶剂，参考上述描述。
试剂盒可以任选地包括其他元件。其他元件可以选自由以下项组成的组：洗涤溶剂、内标物；辅助试剂，具体地衍生化试剂。
具体地，微粒、纤维片材和萃取溶剂可以包括在壳体中。此外，其他元件也可以包括在壳体中。
与已知方法和装置相比，根据本发明的方法和装置提供了大量的优点。
具体地，微粒工作流程可以在最后的洗涤步骤之后被处理到一定程度，该步骤从载有分析物的微粒中去除不需要的基质。进一步将载有分析物的微粒吸入纤维片材中，具体地吸入膜组织中。纤维片材也可以称为纸纤维过滤器、纤维素纤维过滤器或玻璃纤维过滤器。
令人惊讶的是，载有分析物的微粒，具体地分析物-微粒复合物，在抽吸过程期间仅移动到纤维片材中几毫米。在将载有分析物的微粒吸入纤维片材中之后，可以干燥纤维片材，并且任选地，甚至储存。此外，令人惊讶的是，微粒可能停留在纤维片材上，并且可能不会进入分析装置的端口。
此外，在不使用移液器的情况下进行微粒的萃取。因此，可以节省额外的步骤。此外，需要施加更少的溶剂。因此，降低了进行该方法的成本。
为了分析，可以选择基于支撑微粒喷雾的装置，其中将高电压施加到在尖端前面具有分析物-微粒复合物的干燥纤维片材。可将萃取或电喷雾电离溶剂施加到纤维片材的端部上，该萃取或电喷雾电离溶剂通过毛细管力朝向微粒所在的纤维片材的尖端移动。由于萃取或电喷雾电离溶剂，可以在纤维片材上立即发生非常小体积的微粒的萃取。由于微粒的尺寸，微粒可能会停留在尖端上，并且可能不会离开纤维片材。通过在尖端上具有的高电压，分析物被电离，并且适用于质谱仪。因此，通过使用微粒工作流程，纤维片材可充当制备样品的一次性材料。
任何微粒，例如十八烷基硅烷柱材料、固相萃取盒材料、磁性微粒和DNA/RNA制备粒子可使用到约0.5μm粒径。原则上，较小尺寸的粒子可以迁移通过纸张材料并且不会停留在尖端的前部。
总结并且不排除其他可能的实施例，可以设想以下实施例：
实施例1：一种用于检测样品中的至少一种分析物的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)提供具有至少一种分析物的至少一个样品；
b)将样品与具有至少一个表面的微粒一起孵育，由此分析物被吸附在微粒的表面上并且形成分析物-微粒复合物；
c)提供具有至少一个尖端的至少一个纤维片材，并使该纤维片材的尖端与包含分析物-微粒复合物的样品接触由此至少将分析物-微粒复合物吸入纤维片材的尖端中；
d)使纤维片材的尖端与分析装置的端口接触；
e)向纤维片材添加萃取溶剂并向纤维片材施加电压，由此生成分析物的离子并将其从纤维片材的尖端排出；以及
f)用分析装置检测至少一种分析物。
实施例2：根据前述实施例所述的方法，其中分析装置选自由以下项组成的组：质谱仪；离子迁移装置；质谱仪和离子迁移装置的组合。
实施例3：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤b)中将样品与微粒一起孵育，孵育时间为1秒至60分钟，优选地1分钟至30分钟，最优选地3分钟至12分钟。
实施例4：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：
b1)将分析物-微粒复合物与样品的其他成分分离；以及
b2)从分析物-微粒复合物中去除样品的其他组分。
实施例5：根据前述实施例所述的方法，其中步骤b1)包括样品的离心。
实施例6：根据前述两个实施例中任一项所述的方法，其中微粒为磁性微粒并且其中步骤b1)包括基于磁性的分离。
实施例7：根据前述三个实施例中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：
b3)洗涤分析物-微粒复合物。
实施例8：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：
c1)干燥纤维片材，使得样品的液体蒸发。
实施例9：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在进行步骤d)之前储存纤维片材。
实施例10：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤e)中将萃取溶剂施加到纤维片材上。
实施例11：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，纤维片材与毛细管接触，其中经由毛细管向纤维片材提供连续的萃取溶剂流。
实施例12：根据前述实施例所述的方法，其中萃取溶剂的连续流具有1μL/min至50μL/min，优选地10μL/min至30μL/min，最优选地20μL/min的流速。
实施例13：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，施加1kV至10kV，优选地2kV至5kV，最优选地3kV的电压。
实施例14：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中纤维片材作为条带提供。
实施例15：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中纤维片材选自由以下项组成的组：纤维素，具体地纤维素层析纸，具体地醋酸纤维素膜；玻璃滤膜。
实施例16：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中纤维片材具有10g/m2至3000g/m2，优选地20g/m2至1000g/m2，最优选地80g/m2至700g/m2的克重。
实施例17：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中纤维片材的尖端具有三角形形状。
实施例18：根据前述实施例所述的方法，其中尖端具有5°至90°，优选地20°至80°的尖端角。
实施例19：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中微粒具有100nm至100μm，优选地200nm至50μm的平均直径。
实施例20：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中微粒选自由以下项组成的组：磁性微粒，具体地具有磁芯和改性表面的磁性微粒；二氧化硅微粒，具体地具有二氧化硅芯和改性表面的二氧化硅微粒；三聚氰胺树脂微粒，具体地具有三聚氰胺树脂芯和改性表面的三聚氰胺树脂微粒；聚(苯乙烯)基微粒，具体地具有聚(苯乙烯)芯和改性表面的聚(苯乙烯)基微粒；聚(甲基丙烯酸甲酯)微粒，具体地具有聚(甲基丙烯酸甲酯)芯和改性表面的聚(甲基丙烯酸甲酯)微粒。
实施例21：根据前述实施例所述的方法，其中磁性微粒的改性表面为改性聚(苯乙烯)表面，并且其中磁性微粒具有5μm至50μm，优选地10μm至30μm，最优选地20μm的平均直径。
实施例22：根据前述两个实施例中任一项所述的方法，其中磁性微粒的改性表面为二氧化硅表面，并且其中磁性微粒具有100nm至1000nm，优选地200nm至500nm，最优选地300nm的平均直径。
实施例23：根据前述三个实施例中任一项所述的方法，其中二氧化硅微粒的改性表面为氰丙基硅烷官能化表面，并且其中二氧化硅微粒具有5μm至100μm，优选地20μm至80μm，最优选地40μm的平均直径。
实施例24：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中样品为生物学样品，其中生物学样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、唾液、晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水、组织、细胞。
实施例25：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中分析物可以选自由以下项组成的组：类固醇，具体地酮类固醇，具体地开酮类固醇；治疗活性物质，具体地抗生素，具体地局部麻醉剂，具体地利多卡因；肽，具体地环孢菌素A；蛋白质；代谢物，具体地核苷酸，具体地5’-单磷酸腺苷；核酸；氨基酸；激素；脂肪酸；脂质；碳水化合物。
实施例26：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中样品中分析物的浓度为0.01pg/ml至1mg/ml，优选地0.05pg/ml至50μg/ml，最优选地0.1pg/ml至10μg/ml。
实施例27：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中分析物具有10至10000Da的摩尔质量。
实施例28：根据前述实施例中任一项所述的方法，其中纤维片材的尖端通过以下程序之一与分析装置的端口接触，该程序选自由以下项组成的组：纤维片材的尖端与分析装置端口直接接触，具体地纤维片材的尖端与分析装置的端口彼此接触；纤维片材的尖端与分析装置的端口间接接触，具体地纤维片材的尖端与分析装置的端口以彼此间隔一定距离布置，优选地0.1cm至5cm的距离，更优选地0.2cm至3cm的距离、最优选地0.5cm至2cm的距离。
实施例29：一种样品制备系统，具体地连续样品制备系统，其中该样品制备系统包括：
·至少一个容器，其中该容器经构造用于提供具有至少一种分析物的至少一个样品；
·至少一个液体处理系统，其中该液体处理系统经构造用于将微粒添加到容器，由此分析物被吸附在微粒的表面上并且形成分析物-微粒复合物；
·至少一个保持器，其中该保持器经构造用于保持具有至少一个尖端的至少一个纤维片材，其中该保持器进一步经构造用于使纤维片材的尖端与包含分析物-微粒复合物的样品接触；
·至少一个分析装置，具体地至少一个质谱仪，其中该分析装置经构造用于检测至少一种分析物，其中该分析装置包括至少一个端口；
·至少一个样品更换器，其中该样品更换器经构造用于将保持纤维片材的保持器转移到分析装置的端口，使得纤维片材的尖端与端口接触；
·至少一个电触点，其中该电触点经构造用于向纤维片材施加电压；以及
·至少一种萃取溶剂供应，其中该萃取溶剂供应经构造用于至少一种萃取溶剂润湿纤维片材。
实施例30：一种试剂盒，该试剂盒包含(i)微粒；(ii)具有至少一个尖端的至少一个纤维片材；(iii)至少一种萃取溶剂。
实施例31：根据前述实施例所述的试剂盒，其中微粒、纤维片材和萃取溶剂包括在壳体中。
附图说明
优选地结合从属权利要求，在随后的实施例描述中将更详细地公开其他任选特征和实施例。其中，如技术人员将认识到的，各个任选特征可以按单独的方式以及按任何任意可行的组合来实现。本发明的范围不受优选实施例的限制。在附图中示意性地描绘了实施例。其中，这些附图中相同的附图标记是指相同或功能上相当的元件。
在附图中：
图1A至1H示出了根据本发明的用于检测样品中至少一种分析物的示例性方法；
图2A至2E示出了根据本发明的用于检测样品中至少一种分析物的示例性方法的部分；
图3A至3C以不同视图示出了根据本发明的样品制备系统的示例性实施例；
图4A至4F示出了在小珠A上的利多卡因(图4A)、第二洗涤溶液(图4B)、第一洗涤溶液(图4C)、与小珠A沉淀后的上清液(图4D)、浓度为10μg/mL的利多卡因(图4E)和空白实验(图4F)的全扫描质谱图；
图5示出了从产物离子扫描所得计数的数量的对数应用；
图6A至6C示出了使用不同微粒材料从利多卡因-微粒复合物的表面萃取和电离的利多卡因的全扫描质谱图的相关部分；
图7A至7C示出了与纯4-羟基阿普唑仑(图7A)相比使用不同微粒材料(图7B和7C)从4-羟基阿普唑仑-微粒复合物的表面萃取和电离的4-羟基阿普唑仑的全扫描质谱图的相关部分；
图8A至8B示出了与纯环孢菌素A(图8A)相比，从环孢菌素A-微粒复合物(图8B)的表面萃取和电离的环孢菌素A的全扫描质谱图的相关部分；
图9A至9C示出了使用不同微粒材料(图9A和9B)从5’-单磷酸腺苷-微粒复合物的表面萃取和电离的5’-单磷酸腺苷的全扫描质谱图的相关部分和5’单磷酸腺苷各自的产物离子光谱(图9C)；和
图10A至10B示出了掺入马血清中的利多卡因的全扫描质谱(图10A)和各自的产物离子光谱(图10B)的相关部分。
具体实施方式
图1A至1H示出了用于检测样品112中的至少一种分析物110的示例性方法。
在步骤a)中，如图1A所示，提供具有至少一种分析物110的至少一个样品112。样品112可以具体为包含基质114的生物学样品。具体地，样品112可以提供在容器116中。
此后，可以将微粒118添加到样品112。在步骤b)中，如图1B所示，将样品112与具有至少一个表面120的微粒118一起孵育，由此分析物110被吸附在微粒118的表面120上并且形成分析物-微粒复合物122。分析物-微粒复合物122在图1C中被描绘。
步骤b)可以进一步包括，如图1C所示，将分析物-微粒复合物122与样品112的其他组分124，具体地基质114分离，诸如通过离心或基于磁性的分离。此外，如图1D所示，步骤b)可包括从分析物-微粒复合物122去除样品112的其他组分124。
此外，如图1D所示，步骤b)可以包括分析物-微粒复合物122的洗涤。因此，可以将洗涤溶剂125添加到容器116。
在步骤c)中，如图1E所示，提供具有至少一个尖端130的至少一个纤维片材128。尖端130可以具有10°至30°，具体地20°的尖端角α。
此外，在步骤c)中，如图1F所示，使纤维片材128的尖端130与包含分析物-微粒复合物122的样品112接触，由此至少将分析物-微粒复合物122吸入纤维片材128的尖端130中。为此目的，纤维片材128可至少部分地插入容器116中。
此后，任选地，可以干燥纤维片材128，使得样品112的液体蒸发(未示出)。此外，任选地，纤维片材128可以在进行下面描述的步骤d)之前被储存。
在步骤d)和e)中，如图1G和1H所示，纤维片材128的尖端130连接到分析装置134的端口132。分析装置134具体地可以为质谱仪136。因此，端口132也可称为质谱仪入口140。此外，将萃取溶剂138添加到纤维片材128，并且将电压施加到纤维片材128，由此生成分析物110的离子并将其从纤维片材128的尖端130排出。具体地，经由至少一个夹子139将电压施加到纤维片材128。夹子139可以连接到电压源电源141。萃取溶剂138可以具体地润湿整个纤维片材128。此外，萃取溶剂138可以对微粒118的萃取投加剂量，也可以电离并且也可以朝向端口132加速。如图1H所示，微粒118可停留在纤维片材128的尖端130上。
此后，使用分析装置134检测至少一种分析物110。
图2A至2E示出了根据本发明的用于检测样品112中的至少一种分析物110的示例性方法的部分。
如图2B所示，样品112与具有至少一个表面120的微粒118一起孵育。因此，分析物110被吸附在微粒118的表面120上并且形成分析物-微粒复合物122(如图2B所示)。图2A所示的步骤对应于根据本发明的用于检测至少一种分析物110的方法的步骤b)。此外，如图2B所示，可以提供至少一个液体处理装置160，诸如至少一个移液管162。
在下一步骤中，如图2B所示，至少分析物-微粒复合物122可以通过液体处理装置160吸入。此后，如图2B所示，可以使磁性分离器164靠近液体处理装置160。磁性分离器164可以经构造用于将分析物-微粒复合物122保持在液体处理装置160的内部空间166内。因此，样品112的残留组分(诸如基质114)可以从分析物-微粒复合物122分离并且可以被去除。如图2B所示，样品112的残留组分(诸如基质114)可以收集在容器116中。
此后，任选地，可以进行洗涤步骤。为此目的，可用至少一种洗涤溶剂168洗涤分析物-微粒复合物122，然后通过液体处理装置160，以及通过磁性分离器164将分析物-微粒复合物122保持在液体处理装置160的内部空间166内进一步吸入至少分析物-微粒复合物122。如图2C所示，洗涤溶剂168可收集在容器116中。
在下一步骤中，如图2D所示，提供具有至少一个尖端130的至少一个纤维片材128。此外，如图2E所示，使纤维片材128的尖端130与分析物-微粒复合物122接触，由此至少将分析物-微粒复合物122吸入纤维片材128的尖端130中。为此目的，可以使纤维片材128的尖端130靠近液体处理装置160的尖端170。该步骤对应于根据本发明的用于检测至少一种分析物110的方法的步骤c)。
图3A至3C示出了根据本发明的样品制备系统142的示例性实施例。在不同视图中示意性地描绘了样品制备系统142。具体地，图3A示出了样品制备系统142的一部分的前视图，图3B示出了侧视图，并且图3C示出了俯视图。样品制备系统142具体地可以为自动样品制备系统144。
如图3A所示，样品制备系统142包括至少一个容器116。具体地，样品制备系统可以包括多个容器116。容器116经构造用于提供具有至少一种分析物110的至少一个样品112。此外，样品制备系统142包括至少一个液体处理系统146，诸如至少一个移液单元148。移液单元148经构造用于将微粒118添加到容器116，由此分析物110被吸附在微粒118的表面120上并且形成分析物-微粒复合物122。此外，液体处理系统146可以经构造用于进行其他可选步骤，诸如从分析物-微粒复合物122中去除样品112的其他组分124和/或洗涤分析物-微粒复合物122。
此外，样品制备系统142包括至少一个保持器150。保持器150经构造用于保持具有至少一个尖端130的至少一个纤维片材128。保持器150进一步经构造用于使纤维片材128的尖端130与包含分析物-微粒复合物122的样品112接触。包含分析物-微粒复合物122的样品112可以通过毛细管力被吸到纤维片材128上。
此外，如图3A所示，样品制备系统142包括至少一个样品更换器152。样品更换器152经构造用于将保持纤维片材128的保持器150转移到分析装置134的端132，使得纤维片材128的尖端130与端132接触。样品制备系统142的分析装置134在图3B和3C中进一步详细地描绘。
如图3B所示，样品更换器152可经构造用于将保持纤维片材128的保持器150定位到分析装置134的端口132。也可称为离子块组件154的端口132可经构造用于允许离子进入质谱仪136。质谱仪136包括四极杆与随后的离子捕获、经由离子迁移率进行的等压分离、碰撞室中的碎裂，然后可以是四极杆或飞行时间(ToF)质量分析。其他离子操作技术(像扇形磁区)以及对应单元的不同组合也是可能的。
在图3C中，描绘了电触点156，其可以经构造用于确保与高电压的连接。此外，萃取溶剂供应158在溶剂供应时可确保纤维片材128被萃取溶剂润湿。
实例
以下实例旨在说明本发明。不应将它们解释为对保护范围的限制。
所有测量均在Xevo G2-XS Q-ToF质谱仪(Waters Corp.)上进行，其中安装了改性2D解吸电喷雾电离(DESI)源(Prosolia Inc.)。DESI源的改性涉及用连接到高压源电源的鳄鱼夹替换DESI喷头。通过具有接触纸张材料、具体地纤维片材的后侧的毛细管的注射泵(Harvard Apparatus)引入连续萃取溶剂流。
测试了不同的纸张材料，诸如不同克重等级的纤维素层析纸(87g/m2、185g/m2和700g/m2，Whatman/Cytiva)，以及玻璃过滤膜(64g/m2，Whatman/Cytiva)，尼龙膜(Whatman/Cytiva)，PTFE膜(Whatman/Cytiva)和醋酸纤维素膜(Whatman/Cytiva)。为了进一步测量，使用克重为185g/m2的纤维素基膜基材，其尖端角在60°-90°之间，最佳为80°。
微粒在表面材料以及芯材料方面变化，选择粒子尺寸。因此，使用了两种合成的磁性微粒，具体地磁珠，即‘小珠A’和‘LIAT’，以及来自固相萃取(SPE)盒的市售粒子。小珠A包含磁性内芯和尺寸分布约为20μm的改性聚(苯乙烯)表面。LIAT小珠为较小的粒子，通常用于RNA/DNA纯化，包含磁性内芯和尺寸分布约为300nm的SiO2表面。此外，使用市售的SPE-Cyano(Bakerbond，Avantor Inc.)粒子，其通常已知用于捕获广泛范围的极性至非极性分子。这些SPE-Cyano粒子包含用氰丙基硅烷官能化改性的二氧化硅芯，以及尺寸分布约为40μm。
将所施加的分析物分别溶解在低有机溶剂混合物中，最佳地水和乙腈(H2O/ACN＝90/10)。选择包含不同官能团的治疗或代谢相关分子作为分析物，即利多卡因(Lid)、环孢菌素A(CsA)、4-羟基阿普唑仑(4OHAlp)和5’-单磷酸腺苷(AMP)。在正电离模式下观察到的主要分析物加合物如下：m/z 235.2[Lid+H]+，m/z 298.1[4OHAlp-CN]+，m/z 325.1[4OHAlp+H]+，m/z 1202.8[CsA+H]+，m/z 1224.8[CsA+Na]+，m/z 1240.8[CsA+K]+。在负电离模式下观察到的分析物为m/z 346.0[AMP-H]-。
如下更详细描述的质谱显示了取决于质荷比m/z的相对丰度ra(以％计)。
实例1
作为第一个实例，进行了微粒工作流程。
在孵育期间中，具体地在富集和纯化过程期间，需要在微粒表面上快速、可靠地吸附所需分析物。此外，需要将分析物-颗粒复合物吸入纤维片材的尖端，从而在测量期间提供分析物的快速萃取/解吸。
为了证明分析物-微粒复合物的成功形成，详细检查了将小珠A(40μL水悬浮液)施加于治疗物质利多卡因(10μg/mL，150μL，H2O/ACN＝90/10)的模型工作流程。单个工作步骤如下：将微粒与分析物溶液一起孵育(10分钟)，对微粒进行磁性分离，去除上清液并用水(150μL)洗涤两次，磁性分离并去除中间的洗涤溶液。通过抽吸和干燥将残留的分析物-微粒复合物悬浮液加载到纸张材料的尖端上。将载有微粒的纸张材料引入到端口，具体地电离源，用20μL萃取溶剂(ACN+0.1％FA)预润湿，并通过在纸张材料的背面，具体地背面施加3kV的电压开始测量。20μL/min的连续萃取溶剂流在测量期间保持纸张材料的恒定润湿。
图4A至4F示出了不同的全扫描质谱图。具体地，图4A示出了在小珠A上利多卡因的全扫描质谱图，图4B示出了第二洗涤溶液的全扫描质谱图，图4C示出了第一洗涤溶液的全扫描质谱图，图4D示出了用小珠A沉淀后上清液的全扫描质谱图，图4E示出了浓度为10μg/mL的利多卡因的全扫描质谱图以及图4F示出了空白实验的全扫描质谱图。
如图4F所示的空白实验包括仅在纤维片材上使用萃取溶剂的测量。对于根据图4B至4E的实验，将5μL体积的样品分别直接滴加在纤维片材的尖端上，干燥并使用与之前分析物-小珠复合物相同的设置进行测量。质谱的强度轴被归一化为总体最高信号。另外选择并片段化在m/z 235.2处的质子化分析物信号[Lid+H]+(碰撞能量CE＝20eV)。所得产物离子扫描几乎完全获得在m/z 86.1处的离子片段[CH2N(C2H5)2]+。
图5示出了从m/z 235.2到m/z 86.1(碰撞能量CE＝20eV)的产物离子扫描所得的计数Nc的数量的对数应用。A对应于小珠A上的利多卡因，B对应于第二洗涤溶液，C对应于第一洗涤溶液，D对应于用小珠A沉淀后的上清液。E对应于浓度为10μg/mL的利多卡因，以及F对应于空白实验。因此，在图5中，在小珠A上加载的利多卡因的计数Nc可以与在对数应用中对应的小珠工作流程步骤进行比较。可以清楚地观察到，在小珠消耗步骤之后，保留在上清液中的利多卡因浓度降低了约100个数量级。这证明了分析物-微粒复合物的有利形成。在两个洗涤步骤期间，上清液中利多卡因的浓度进一步降低到几个1000计数的水平。在纸张材料的尖端上抽吸和干燥分析物-微粒复合物并遵循相同的测量条件，导致分析物从微粒表面萃取和电离。
实例2
作为第二个实例，使用了不同的微粒材料。
为了证明本发明的广泛适用性，测试了不同的微粒。这种变化包括微粒以及固体支撑芯材料和表面材料的尺寸。如前所述应用微粒工作流程，使用SPE-Cyano除外，其中微粒的沉淀不是磁性进行的，而是使用台式离心机进行的。
图6A至6C示出了使用不同微粒材料从利多卡因-微粒复合物的表面萃取和电离的利多卡因的全扫描质谱图(m/z 224至251)的相关部分。图6A示出了全扫描质谱图的相关部分，其中使用了LIAT小珠。图6B示出了全扫描质谱图的相关部分，其中使用了SPE-Cyano小珠。图6C示出了全扫描质谱图的相关部分，其中使用了小珠A。具体地，图6A至6C分别示出了在用对应的小珠工作流程富集分析物后，由支撑微粒喷雾产生的在m/z 235.2处利多卡因[Lid+H]+的全扫描质谱图的相关部分。由此，小珠A示出了最佳性能，其次为SPE-Cyano。即使使用通常已知可富集RNA/DNA或带负电/电离分子的LIAT小珠，也示出了利多卡因-LIAT复合物的一定形成和解吸/电离，但正如预期的那样，与小珠A相比，强度较低。还必须补充的是，大量电离分析物(尤其是在使用小珠A时)导致检测器饱和，尤其是在m/z 236.2处高于天然同位素信号的情况下可以观察到这一点。因此，预计实际计数数量甚至高于显示的数量，并进一步支持本文所述方法的良好富集和电离。
实例3
作为第三个例子，应用了不同的分析物。
为了证明本文描述的发明的广泛适用性，测试了另一组分析物，其代表各种化学官能团(例如肽、羟基、卤化物、芳基、杂环或核苷酸)以及正电离和负电离。因此，选择了4-羟基阿普唑仑(4OHAlp)、环孢菌素A(CsA)和5’-单磷酸腺苷(AMP)。如前所述应用所有工作流程，使用SPE-Cyano除外，其中微粒的沉淀不是磁性进行的，而是使用台式离心机进行的。
图7A至7C示出了与纯4-羟基阿普唑仑(图7A)相比，使用不同微粒材料(图7B和7C)从4-羟基阿普拉唑仑-微粒复合物的表面萃取和电离的4-羟基阿普拉唑仑的全扫描质谱图(m/z 50至675)的相关部分。图7A示出了4-羟基阿普唑仑的全扫描质谱图的相关部分，其中在纤维片材上进行5μL 10μg/mL 4OHAlp的直接采样。图7B示出了使用小珠A从4OHAlp-微粒复合物表面萃取并电离的4-羟基阿普唑仑的全扫描质谱图的相关部分。图7C示出了使用SPE-Cyano从4OHAlp-微粒复合物表面萃取并电离的4-羟基阿普唑仑全扫描质谱图的相关部分。具体地，图7A至7C示出了4-羟基阿普唑仑[4OHAlp+H]+在m/z 325.1处的全扫描质谱图的相关部分。有趣的是，SPE-Cyano材料在4OHAlp的富集和解吸方面示出最好的性能。
此外，环孢菌素A被吸附在小珠A上。如前所述应用小珠工作流程。图8A和8B示出了环孢菌素A(CsA)的全扫描质谱图(m/z 1140至1340)的相关部分。图8A和8B示出了与纯环孢菌素A(图7A)相比，从环孢菌素A-微粒复合物(图8B)表面萃取和电离的环孢菌素A的全扫描质谱图的相关部分。图8A示出了CsA的全扫描质谱图的相关部分，其中在纸张材料上进行具有10μL/mL浓度的5μL CsA的直接采样。
图8B示出了使用小珠A从CsA-微粒复合物表面萃取和电离的CsA全扫描质谱图的相关部分。因此，小珠A在CsA富集方面示出良好的结果，也支持随后在测量期间萃取和电离分析物。
与倾向于负电离的分析物的兼容性也将在应用的广泛性方面有益。为此，选择了核苷酸5’-单磷酸腺苷(AMP)，它代表了一种重要的代谢化合物，并且通常还因示出负电离而闻名。在LIAT和小珠A上的AMP(10μg/mL，150μL，H2O/ACN＝90/10)富集是通过如上所述的小珠工作流程获得的。通过抽吸和干燥将残留的分析物-微粒复合物悬浮液各自加载到纸张材料的尖端上。将纸张材料引入到支撑小珠喷雾电离源，用20μL萃取溶剂(ACN+0.1％三丁胺)预润湿，并通过在纸张材料的背面，具体地背面施加2kV的负电压开始测量。20μL/min的连续萃取溶剂流在测量期间保持纸张材料的恒定润湿。
图9A至9C示出了使用不同微粒材料(图9A和9B)从5’单磷酸腺苷-微粒复合物的表面萃取并电离的5’单磷酸腺苷的全扫描质谱图(m/z 20至610)的相关部分以及5’单磷酸腺苷各自的产物离子光谱(图9C)。对于图9A，在负离子模式下使用小珠A从AMP-微粒复合物的表面提取并电离5’单磷酸腺苷。对于图9B，在负离子模式下使用LIAT小珠从AMP-微粒复合物的表面萃取并电离5’-单磷酸腺苷。在m/z 346.0处的负产物离子代表[AMP-H]-，并且图9C示出了在施加25eV的碰撞能量后，此对应阴离子在LIAT小珠上的产物离子扫描，从而产生众所周知的AMP片段。在m/z 167.0、m/z 203.0和m/z 335.0处的两个全扫描质谱图中的其他主要信号可能属于表面活性剂4-磷酸丁酸，其用于制造纤维素基色谱纸，并代表在所有纸基纤维片材中的杂质。与小珠A相比，LIAT上的AMP性能相当好，这也是预期的，因为LIAT小珠专门设计用于捕获带负电或极化的目标分析物。
实例4
作为第四个实例，评估了存在真实基质的情况下的性能。
本发明的一个重要用途为分析物的富集和电离，该分析物存在于具有挑战性的基质中，如全血、血清或尿液。为了将本文描述的方法与真实基质相结合，使用了包含掺有利多卡因(1μg/mL)的150μL马血清的初始分析物溶液。用50μL的30％MeOH预处理溶液，涡旋并孵育10分钟。如前所述使用小珠A的小珠工作流程进行。萃取溶剂包含ACN+0.1％FA，并且通过在纸张材料的背面，具体地背面施加3.5kV的电压，在正电离模式下进行测量。
图10A和10B示出了利多卡因(1μg/mL)的全扫描质谱图(m/z 20至1600)的相关部分。对于图10A，使用小珠-A从利多卡因-微粒复合物表面萃取和电离后，将利多卡因(1μg/mL)掺入马血清中。在图10B中示出了此测量的产物离子扫描。来自富集在小珠A上的马血清的利多卡因的产物离子扫描(m/z 325.2至86.1，CE＝20eV)清楚地证实了存在质子化形式[Lid+H]+的利多卡因。这些结果证明，从具有挑战性的基质(诸如马血清)中成功富集、纯化和电离特定分析物，并且可以通过使用支撑小珠喷雾电离测量对其进行定量。
附图标记列表
110 分析物
112 样品
114 基质
116 血管
118 微粒
120 表面
122 分析物-微粒复合物
124 其他组分
125 洗涤溶剂
126 上清液中
128 纤维片材
130 尖端
132 端口
134 分析装置
136 质谱仪
138 萃取溶剂
139 夹子
140 质谱仪入口
141 电压源电源
142 样品制备系统
144 自动化样品制备系统
146 液体处理系统
148 移液单元
150 保持器
152 样品更换器
154 离子块组件
156 电触点
158 萃取溶剂供应
160 液体处理装置
162 移液
164 磁性分离器
166 内部空间
168 洗涤溶剂
170 尖端
Claims (15)
1.一种用于检测样品(112)中的至少一种分析物(110)的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供具有至少一种分析物(110)的至少一个样品(112)；
b)将所述样品(112)与具有至少一个表面(120)的微粒(118)一起孵育，由此所述分析物(110)被吸附在所述微粒(118)的所述表面(120)上并且形成分析物-微粒复合物(122)；
c)提供具有至少一个尖端(130)的至少一个纤维片材(128)，并使所述纤维片材(128)的所述尖端(130)与包含所述分析物-微粒复合物(122)的所述样品(112)接触，由此至少将所述分析物-微粒复合物(122)吸入所述纤维片材(128)的所述尖端(130)中；
d)使所述纤维片材(128)的所述尖端(130)与分析装置的端口接触；
e)向所述纤维片材(128)添加萃取溶剂(138)并向所述纤维片材(128)施加电压，由此生成所述分析物(110)的离子并将其从所述纤维片材(128)的所述尖端(130)排出；以及
f)用所述分析装置(134)检测所述至少一种分析物(110)。
2.根据前述权利要求所述的方法，其中所述分析装置(134)选自由以下项组成的组：质谱仪(136)；离子迁移装置；质谱仪和离子迁移装置的组合。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
b1)将所述分析物-微粒复合物(122)与所述样品(112)的其他组分(124)分离；以及
b2)从所述分析物-微粒复合物(122)中去除所述样品(112)的所述其他组分(124)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在进行步骤d)之前储存所述纤维片材(128)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，所述纤维片材(128)与毛细管接触，其中将所述萃取溶剂(138)的连续流经由所述毛细管提供给所述纤维片材(128)。
6.根据前述权利要求所述的方法，其中所述萃取溶剂(138)的所述连续流具有1μL/min至50μL/min的流速。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纤维片材(128)选自由以下项组成的组：纤维素；玻璃滤膜。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纤维片材(128)具有10g/m2至3000g/m2，优选地20g/m2至1000g/m2，最优选地80g/m2至700g/m2的克重。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微粒(118)具有100nm至100μm的平均直径。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微粒(118)选自由以下项组成的组：磁性微粒；二氧化硅微粒；三聚氰胺树脂微粒；聚(苯乙烯)基微粒；聚(甲基丙烯酸甲酯)微粒。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品(112)为生物学样品，其中所述生物学样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、唾液、晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水、组织、细胞。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析物(110)选自由以下项组成的组：类固醇；治疗活性物质；肽；代谢物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品(112)中的所述分析物(110)的浓度为0.01pg/ml至1mg/ml。
14.一种样品制备系统(142)，其中所述样品制备系统(142)包括：
·至少一个容器(116)，其中所述容器(116)经构造用于提供具有至少一种分析物(110)的至少一个样品(112)；
·至少一个液体处理系统(146)，其中所述液体处理系统(146)经构造用于将微粒(118)添加到所述容器(116)，由此所述分析物(110)被吸附在所述微粒(118)的表面(120)上并且形成分析物-微粒复合物(122)；
·至少一个保持器(150)，其中所述保持器(150)经构造用于保持具有至少一个尖端(130)的至少一个纤维片材(128)，其中所述保持器(150)进一步经构造用于使所述纤维片材(128)的所述尖端(130)与包含所述分析物-微粒复合物(122)的所述样品(112)接触；
·至少一个分析装置(134)，其中所述分析装置(134)经构造用于检测所述至少一种分析物(110)，其中所述分析装置(134)包括至少一个端口(132)；
·至少一个样品更换器(152)，其中所述样品更换器(152)经构造用于将保持所述纤维片材(128)的所述保持器(150)转移到所述分析装置(134)的所述端口(132)，使得所述纤维片材(128)的所述尖端(130)与所述端口(132)接触；
·至少一个电触点(156)，其中所述电触点(156)经构造用于向所述纤维片材(128)施加电压；以及
·至少一个萃取溶剂供应(158)，其中所述萃取溶剂供应(158)经构造用于利用至少一种萃取溶剂(138)润湿所述纤维片材(128)。
15.一种试剂盒，其包括(i)微粒(118)；(ii)具有至少一个尖端(130)的至少一个纤维片材(128)；(iii)至少一种萃取溶剂(138)。
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