KR20120027182A - 습윤된 다공성 재료를 사용하는 이온 생성 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 샘플의 질량 분광 분석 시스템 및 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 고전압 공급원에 연결되어 있으며 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 하나 이상의 다공성 재료를 포함하는 질량 분광측정 프로브를 제공한다.

Description

습윤된 다공성 재료를 사용하는 이온 생성 {ION GENERATION USING WETTED POROUS MATERIAL}

<관련 출원>

본 발명은 2009년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 특허 일련 번호 제61/174,215호, 2009년 9월 29일에 출원된 미국 가출원 특허 일련 번호 제61/246,707호 및 2010년 2월 26일에 출원된 미국 가출원 특허 일련 번호 제61/308,332호를 우선권으로 주장하며, 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 도입된다.

<기술 분야>

본 발명은 일반적으로 샘플의 질량 분광 분석 시스템 및 방법에 관한 것이다.

질량 분광법은 분석 화학, 특히 생명 과학을 위한 중요한 리서치 및 적용분야에 사용되는 매우 민감한 분석 방법이다. 전자분무 이온화법 (ESI)이 일반적으로, 용액 상 중에서 분자를 이온화하는 가장 잘 특징규명되어 있고 가장 효율적인 방법으로 여겨진다. 이 방법은 간단하게 3단계로 나눌 수 있다: 액적 형성, 액적 증발 및 이온 형성 (문헌 [Gaskell, S. J. Journal of Mass Spectrometry 1997, 32, 677-688]). 질량 분광계 프로브를 통해 흐르는 용액에 강한 전기장을 적용하면, 테일러 콘 (Taylor cone)이 프로브의 팁에서 형성되어 그 결과 작은 액적의 미스트가 상기 콘의 팁에서 방출된다. 자유 액적의 증발 및 쿨롱 힘으로 인하여, 샘플 분석대상의 이온이 생성된다. 이온이 질량 분광계로 들어가고 후속하여 분석된다.

ESI에서의 문제는, 여러 유형의 샘플의 분석에 ESI를 사용할 수 있기 전에, 여전히 샘플 조제 단계가 필요하다는 점이다. ESI 질량 분광법으로 샘플을 분석하기 전에, 샘플을 정제하기 위하여, 예를 들어 염 및 세제를 제거하기 위하여 샘플에 추출 및 여과 프로토콜을 수행할 것이다. 이러한 프로토콜은 복잡하고, 시간이 많이 들며 비싸다. 또한, 정제 절차 동안에 사용되는 시약은 정제된 샘플 중의 표적 분석대상의 후속 분석을 방해할 수 있다. 부가적으로, 용액 중에 있지 않은 샘플은 ESI 분석 이전에 정제시켜야 할 뿐만 아니라 용해시켜야 한다.

보다 최근에, 주위 이온화의 개념이 개발되었고, 현재 이러한 주위 이온화 계열에는, 탈착 전자분무 이온화법 (DESI) 및 실시간 직접분석 (DART)과 같은 20가지 초과의 멤버가 있다. 질량 분광법을 통한 주위 이온화는 많은 또는 심지어 어떠한 샘플 조제 및/또는 예비-분리 없이 응축된-상 샘플로부터 주위 환경하에서의 분석대상의 이온화를 가능하게 하여, 복잡한 혼합물 및 생물학적 샘플을 위한 실시간 및 제자리 (in situ) 분석의 솔루션을 제공한다. 이러한 주위 이온화 방법은 생명 과학, 환경 모니터링, 법의학 적용 및 치료적 분석에서 질량 분광법의 혁신을 선도하고 확장시키고 있다. 그러나, 상기한 주위 이온화 기술에는, 샘플의 분석을 위하여 공기역학적 보조, 용매의 연속적 흐름 및 고전압 전력 공급이 여전히 요구된다.

샘플의 분석을 위하여 공기역학적 보조 또는 용매의 연속적 흐름이 요구되지 않는, 샘플의 질량 분석을 위한 샘플 조제 및 전처리와 이온화 절차를 조합할 수 있는 시스템 및 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.

개요

본 발명은 일반적으로 질량 분광 분석을 위한 유체 및 고체 샘플로부터 이온을 생성하는 신규 시스템 및 방법에 관한 것이다. 다공성 재료, 예컨대 여과지 또는 유사한 재료를 사용하여 액체를 보유하고 전달하며, 재료에 고전압 전기를 적용하면 재료의 테두리에서 이온이 직접 생성된다. 다공성 재료는 용매의 흐름으로부터 떨어져 있다 (즉, 분리되어 있거나 연결되어 있지 않음). 대신, 샘플을 다공성 재료 위에 반점으로 찍거나, 다공성 재료를 습윤시키고 이를 사용하여 샘플을 함유하는 표면을 닦아낸다. 반점으로 찍거나 닦아낸 샘플을 지닌 다공성 재료를 그 후 습윤시키고 고전압 공급원에 연결하여 샘플의 이온의 생성하고 이를 후속하여 분석한다. 샘플은 별도의 용매 흐름의 필요없이 다공성 재료를 통해 운반된다.

본 발명의 장치 및 방법은 샘플의 질량 분석에 필요한 샘플 조제 및 전처리와 이온화 절차를 조합한다. 본 발명의 장치 및 방법은, 샘플 조제 없이 복잡한 매트릭스의 원 생물학적 샘플, 예컨대 생체유체 및 조직 중의 화학물의 빠르고 직접적인 분석을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 장치 및 방법은 혈액 또는 소변의 건조된 반점의 분석을 가능하게 한다.

본 발명의 한 측면은, 고전압 공급원에 연결되어 있으며 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 다공성 재료를 포함하는 질량 분광측정 프로브를 제공한다. 예시적 다공성 재료에는 종이, 예를 들어 여과지 또는 PVDF 막이 포함된다. 다공성 재료는 임의의 형태일 수 있다. 특정 실시양태에서, 다공성 재료는 삼각형 절편으로 제공된다.

특정 실시양태에서, 프로브는 또한 다공성 재료에 적용되는 별도의 양의 용매, 예를 들어 액적 또는 액적들을 포함한다. 용매는 액적 또는 액적들로 적용되고, 다공성 재료를 습윤시키기에 충분한 양으로 적용된다. 일단 다공성 재료에 적용되면, 용매는 다공성 재료를 통한 샘플의 운반을 보조할 수 있다. 용매는 내부 표준물을 함유할 수 있다. 용매/기판 조합은 상이한 화학적 특성을 갖는 샘플 성분의 차별적인 체류를 가능하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 용매는 염 및 매트릭스 효과를 최소화시킨다. 다른 실시양태에서, 용매는 선택된 분석대상의 온라인 화학적 유도체화를 가능하게 하는 화학 시약을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 고전압 공급원에 연결되어 있으며 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 다공성 재료를 포함하는 프로브, 및 질량 분석기를 포함하는, 샘플 재료를 분석하기 위한 시스템을 제공한다. 질량 분석기는 탁상용 질량 분광계 또는 핸드헬드 질량 분광계일 수 있다. 예시적 질량 분석기에는 사중극자 이온 트랩, 직선형 이온 트랩, 원통형 이온 트랩, 이온 사이클로트론 공명 트랩 및 오르비트랩이 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면에는, 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 다공성 재료에 샘플을 접촉시키는 단계, 다공성 재료에 고전압을 적용하여 다공성 재료로부터 방출되는 샘플 중의 분석대상의 이온을 생성하는 단계, 및 방출된 이온을 분석하는 단계를 포함하는, 샘플의 분석 방법이 포함된다. 상기 방법에는, 다공성 재료에 별도의 양, 예를 들어 액적 또는 액적들의 용매를 적용하는 단계가 추가로 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분석은 질량 분석기를 제공하여 샘플 중의 분석대상의 질량 스펙트럼을 생성하는 단계를 포함한다.

특정 실시양태에서, 샘플은 액체이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 고체이다. 샘플이 고체인 실시양태에서, 다공성 재료를 사용하여 표면으로부터 샘플을 닦아낼 수 있다. 고체를 닦아내기 전 또는 닦아낸 후에 용매를 다공성 재료에 적용할 수 있다. 예시적 샘플에는 화학 종 또는 생물학 종이 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면에서는 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 다공성 재료에 고전압을 적용하여 샘플 중의 분석대상의 이온을 생성하는 단계를 포함하는 샘플의 이온화 방법이 제공된다. 예시적 다공성 재료에는 종이 또는 PVDF 막이 포함된다.

도 1 패널 (A)는 전자분무 이온화를 위해 한 장의 종이에 샘플 용액을 공급하는 도면이다. 도 1 패널 (B)는 전자분무 이온화를 위해 종이 위에 미리 반점으로 찍은 샘플 용액 및 종이에 후속하여 공급되는 용매의 액적의 도면이다.
도 2 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 헤로인 (농도: 1ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼이다. 도 2 패널 (b)는 헤로인 (농도: 1ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼이다.
도 3 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 카페인 (농도: 10ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼이다. 도 3 패널 (b)는 카페인 (농도: 10ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼이다.
도 4 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 벤조일엑고닌 (농도: 10ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼이다. 도 4 패널 (b)는 벤조일엑고닌 (농도: 10ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼이다.
도 5 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 세린 (농도: 1ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼이다. 도 5 패널 (b)는 세린 (농도: 100ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼이다.
도 6 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 펩티드 브래디키닌 2-9 (농도: 10ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼이다. 도 6 패널 (b)는 브래디키닌 2-9 (농도: 1ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼이다.
도 7 패널 (a)는 헤로인을 "반점 (spot)" 방법으로 전혈 샘플로부터 검출할 수 있음을 나타내는 MS/MS 스펙트럼이다. 도 7 패널 (b)는 헤로인이 없는 혈액 반점의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 8 패널 (a) MS/MS 스펙트럼은 "반점" 방법으로 원 소변 샘플로부터 헤로인을 검출할 수 있음을 나타낸다. 도 8 패널 (b)는 헤로인이 없는 소변 반점의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 9 패널 (a)는 샘플 조제 없이 콜라 음료로부터 검출된 카페인을 나타내는 MS 스펙트럼이다. 도 9 패널 (b)는 커피 분말로부터 검출된 카페인을 나타내는 MS 스펙트럼이다. 종이 슬라이스를 사용하여 커피 분말을 커피 봉지로부터 표면을 닦아내어 수집하였다.
도 10은 샘플 조제가 없는 소변 분석의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 10 패널 (a)는 커피를 마신 사람으로부터의 소변에서 카페인이 검출되었음을 나타내는 MS 스펙트럼이다. 도 10 패널 (b)는 커피를 전혀 마시지 않은 사람으로부터의 소변에서 카페인이 검출되지 않았음을 나타내는 MS 스펙트럼이다.
도 11은 동일한 파라미터 (~2kV, 용매: MeOH:H₂O = 1:1)를 사용하여 (a) 종이 삼각형 및 (b) PVDF 막 위에서의 펩티드 분석 (10ppm의 브래디키닌 2-9) 사이의 차이를 나타내는 MS 스펙트럼이다.
도 12는 하기 4가지 식물의 슬라이스된 조직을 사용한 식물 조직의 직접 MS 스펙트럼을 나타낸다. (a) 양파, (b) 파 및 두 상이한 잎 (c) 및 (d).
도 13은 비타민 C의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 13 패널 (a)는 샘플 조제가 없는 양파의 직접 분석이다. 도 13 패널 (b)는 표준 용액을 사용한다.
도 14 패널 (a)는 종이 위의 건조된 혈액 반점 분석을 나타내는 그림이다; 0.4㎕의 전혈을 크로마토그래피 종이의 삼각형 조각 (통상적으로 높이 10mm, 밑변 5mm)에 직접 적용한다. 구리 클립으로 종이 조각을 LTQ 질량 분광계 (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)의 주입구 앞에 고정시키고, 10㎕ 메탄올/물 (1:1 v/v)로 적신 종이에 DC 전압 (4.5kV)을 적용한다. 패널 (b)는 이마티닙 (글리벡 (GLEEVEC))의 분자 구조 및, 4㎍/mL 이마티닙을 함유하는 0.4㎕ 전혈의 종이 분무기 탠덤 질량 스펙트럼을 나타낸다. 이마티닙은 MS/MS 전이 m/z 494 □ m/z 394 (구석에 삽입된 화면)로 확인 및 수량화된다. 패널 (c)는 이마티닙 (62.5-4㎍/mL) 및 그의 동위원소이성질체 이마티닙-d8 (1㎍/mL)이 첨가된 전혈의 정량적 분석을 나타낸다. 구석에 삽입된 플롯은 낮은 농도 범위를 나타낸다.
도 15는 안지오텐신 I 용액의 종이 분무기 질량 스펙트럼이다. 구석에 삽입된 화면은 질량 범위 630-700에 걸친 확장된 화면을 나타낸다.
도 16은 본 발명의 프로브를 통한 동물 조직 중의 호르몬의 직접 분석을 나타내는 질량 스펙트럼이다.
도 17 패널 (a) 및 (b)은 인간 전립선 종양 조직 및 정상 조직의 직접 분석을 나타내는 질량 스펙트럼이다.
도 18은 10㎍/mL 아테놀롤이 첨가된 전혈의 질량 스펙트럼이다. 데이터는 본 발명의 시스템 및 방법과 핸드헬드 질량 분광계를 조합하여 수득되었다.
도 19 패널 (a)-(f)은 6가지 상이한 유형의 종이 (여러 기공 크기의 와트만 (Whatman) 여과지: (a) 3㎛, (b) 4-7㎛, (c) 8㎛ 및 (d) 11㎛, (e) 유리 섬유 종이 및 (f) 크로마토그래피 종이)로부터 분무된 코카인의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 분무전압은 4.5kV이었다.
도 20 패널 (a)는 종이 분무기의 공간 분포를 특징적으로 보여주는 도식적 설비를 나타낸다. 패널 (b)는 질량 분광계의 주입구에 대하여 x-y 평면에서 프로브를 이동시켰을 때 m/z 304의 상대 강도를 나타내는 2D 등고선 플롯이다. 패널 (c)는 코카인 용액을 여러 농도 또는 부피로 종이 위에 적재했을 때 또는 테플론 막으로 밀봉했을 때의 m/z 304의 신호 지속 시간을 나타내는 그래프이다.
도 21은 순수한 화학물 용액 및 그의 상응하는 MS/MS 스펙트럼의 MS 스펙트럼의 집합이다. 스펙트럼은 (a) 세린, (b) 메타돈, (c) 록시트로마이신 및 (d) 브래디키닌 2-9에 대해서 수득하였다.
도 22는 복잡한 혼합물로부터의 화학물 분석 및 샘플 조제 없이 표면으로부터의 직접 분석을 나타내는 질량 스펙트럼의 집합이다. 패널 ((A) 및 (B))은 (A) 포지티브 및 (B) 네거티브 모드 모두로 종이 위에서 직접 분석한 코카-콜라 (COCA-COLA) (콜라 음료)의 질량 스펙트럼이다. 패널 (C)는 카페인의 질량 스펙트럼이다. 패널 (D)는 벤조산칼륨의 질량 스펙트럼이다. 패널 (E)는 아세설팜칼륨의 질량 스펙트럼이다. 패널 (F)은 소변으로부터 검출된 카페인의 질량 스펙트럼이다. 패널 (G)은 탁상위 표면으로부터 본 발명의 프로브로 표면을 닦아낸 후 직접 검출된 헤로인의 질량 스펙트럼이다.
도 23 패널 (a)는 혈액 분석에 사용된 본 발명의 프로브의 이미지를 나타낸다. 본 실시양태에서, 다공성 재료는 종이이다. 왼쪽의 패널은 전혈로 반점을 찍기 전이다. 중간의 패널은 전혈로 반점을 찍고 반점이 마르도록 방치한 후이다. 오른쪽의 패널은 종이에 메탄올을 첨가하고 종이를 통해 퍼져나가도록 방치한 후이다. 오른쪽의 패널은 메탄올이 혈액 반점과 상호작용하여 이온화 및 분석을 위해 분석대상이 종이의 팁까지 퍼지도록 했음을 나타낸다. 패널 (b)는 전혈로부터의 아테놀롤의 질량 스펙트럼이다. 패널 (c)는 전혈로부터의 헤로인의 질량 스펙트럼이다.
도 24는 TLC에 의해 분리된 두 염료 메틸렌 블루 (m/z 284) 및 메틸 바이올렛 (m/z 358.5)의 분석을 나타낸다. 염료 혼합물 용액 (0.1㎕의 1 mg/mL 용액)을 크로마토그래피 종이 (4cm x 0.5cm) 위에 적용하고, TLC 및 종이 분무기 MS 분석 전에 건조시켰다.
도 25는 본 발명의 프로브에 있어서의 여러 형태, 두께 및 각도를 나타낸다. 패널 (A)는 뾰족한 정도를 나타낸다. 패널 (B)는 팁의 각도를 나타낸다. 패널 (C)는 종이의 두께를 나타낸다. 패널 (D)는 다중 분무 팁이 있는 장치를 나타낸다. 패널 (E)는 뾰족한 바늘로 제작한 마이크로 분무팁을 갖는 DBS 카드를 나타낸다.
도 26은 원뿔형의 C4 집 (zip)-팁으로부터의 직접 분무를 이용한 인간 혈장으로부터의 이마티닙의 질량 스펙트럼의 집합이다. 이마티닙을 함유하는 인간 혈장 샘플 (각각 1.5㎕)을 다공성 C4 추출 재료에 3회 통과시킨 후, 3㎕ 메탄올을 집-팁 위에 첨가하고 4kV 포지티브 DC 전압을 적용하여 분무를 생성하였다. 패널 (a)는 5㎍/mL에 대한 MS 스펙트럼을 나타낸다. 패널 (b)는 5ng/mL에 대한 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 27 패널 (A)는 본 발명의 프로브에 있어서 여러 팁 각도를 보여주는 사진이다. 왼쪽에서부터 오른쪽으로 각도는 각각 30, 45, 90, 112, 126°이다. 패널 (B)는 MS 신호 강도에 대한 각도의 효과를 보여주는 그래프이다. 모든 MS 신호는 90° 팁을 사용한 MS 신호로 정규화시켰다.
도 28 패널 (a)는 본 발명의 고속 프로브 장치의 사진이다. 패널 (b)는 장치의 단일 팁으로부터 질량 분광계의 주입구 안으로의 분무를 나타낸다. 패널 (c)는 고속 모드에서의 MS 신호 강도를 나타내는 질량 스펙트럼의 집합이다.
도 29 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 동물 조직의 직접 분석에 대한 프로토콜을 묘사하는 도식이다. 패널 ((b)-(d))은 조직 내에서 검출된 여러 화학물을 나타내는 질량 스펙트럼이다.
도 30 패널 (a)는 백지 위의 건조된 혈장 반점의 질량 스펙트럼 분석을 나타낸다. 패널 (b)는 베타인 알데히드 (BA) 클로라이드를 미리적재한 종이 위의 건조된 혈장 반점의 질량 스펙트럼 분석을 나타낸다. 패널 (c)는 반응 생성물 [M+BA]⁺ (m/z 488.6)의 MS/MS 분석을 나타낸다.
도 31은 개질된 (패널 (a)) 및 개질되지 않은 (패널 (b)) 종이 기판을 사용하여 기록한 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 32는 네거티브 이온 공급원 전위를 사용하여 이온을 생성할 수 있으나, 양으로 하전된 이온이 질량-분석됨을 나타내는 질량 스펙트럼이다.
도 33 패널 (A)는 부피 제어 및 오버플로우 바이알을 갖는 샘플 카트리지의 도안을 나타내는 도식이다. 내부 표준 화학물이 포함된 가용성 플러그를 사용하여 부피 제어 바이알의 하부를 막는다. 패널 (B)는 제어된 부피의 혈액으로부터 종이 위의 건조된 혈액 반점을 제조하기 위해 카트리지 위에 혈액 샘플을 적용하는 단계적인 절차를 나타낸다.
도 34 패널 ((A) 및 (B))은 식료품점에서 구입하고 종이로 닦아낸 레몬 껍질 상에 존재하는 농약의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 35는 다중 코너를 갖는 종이 분무기를 위한 기판의 도안을 나타낸다. 분무를 위해 사용될 코너의 각도는 다른 코너보다 작다
도 36 패널 ((A) 및 (B))은 SU-8 2010 포토레지스트를 사용하여 한 장의 크로마토그래피 종이 위에 제작된 분무팁을 나타낸다. 패널 (C)는 아스파라긴의 혼합물을 함유하는 메탄올/물 용액의 MS 스펙트럼을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

질량 분광 분석을 위해 유체 및 고체로부터 이온을 생성하는 신규한 방법을 기재한다. 다공성 재료, 예컨대 종이 (예를 들어, 여과지 또는 크로마토그래피 종이) 또는 다른 유사한 재료를 사용하여 액체 및 고체를 보유하고 전달하며, 이온은 재료에 고전압 전기를 적용할 경우 재료의 테두리로부터 직접 생성된다 (도 1). 다공성 재료는 용매의 흐름, 예컨대 용매의 연속적 흐름으로부터 떨어져 있다 (즉, 분리되어 있거나 연결되어 있지 않음). 대신, 샘플은 다공성 재료 위에 반점으로 찍거나, 샘플을 포유하는 표면을 다공성 재료상으로 닦아낸다. 그 후, 반점으로 찍거나 닦아낸 샘플을 고전압 공급원에 연결하여 샘플의 이온을 생성시키고 이를 후속하여 질량 분석한다. 샘플은 별도의 용매 흐름의 필요없이 다공성 재료를 통해 운반된다. 분석대상을 운반하기 위하여 공기역학적 보조는 요구되지 않으며, 대신 질량 분광계 앞에 고정시킨 다공성 재료에 전압을 단순히 적용한다.

특정 실시양태에서, 다공성 재료는 임의의 셀룰로스-기재 재료이다. 다른 실시양태에서, 다공성 재료는 비-금속성 다공성 재료, 예컨대 면, 린넨 울, 합성 텍스타일 또는 식물 조직이다. 또 다른 실시양태에서, 다공성 재료는 종이이다. 종이의 장점에는 다음이 포함된다: 비용 (종이는 저렴함); 완전히 상품화되어 있고, 그의 물리적 및 화학적 특성을 조절할 수 있음; 액체 샘플로부터 미립자 (세포 및 더스트)를 여과할 수 있음; 용이하게 성형할 수 있음 (예를 들어, 절단하기, 찢기, 접기가 쉬움); 액체가 그 안으로 모세관 작용으로 흐름 (예를 들어, 외부 펌핑 및/또는 전력 공급 없이); 쓰고 버릴 수 있음.

특정 실시양태에서, 다공성 재료는 분무에 최적화된 육안으로 보이는 각도를 갖는 고체 팁과 함께 통합된다. 이러한 실시양태에서, 다공성 재료는 여과, 예비-농축 및 고체 유형에서 분무하기 위한 분석대상을 함유하는 용매의 위킹 (wicking)에 사용된다.

특정 실시양태에서, 다공성 재료는 여과지이다. 예시적 여과지에는 셀룰로스 여과지, 무회 여과지, 니트로셀룰로스 종이, 유리 미세섬유 여과지 및 폴리에틸렌 종이가 포함된다. 임의의 기공 크기를 갖는 여과지를 사용할 수 있다. 예시적 기공 크기에는 등급 1 (11㎛), 등급 2 (8㎛), 등급 595 (4-7㎛) 및 등급 6 (3㎛)이 포함된다. 기공 크기는 분무 재료 안에서의 액체의 운반에 영향을 줄 뿐만 아니라, 팁에서의 테일러 콘의 형성에도 영향을 줄 수 있다. 최적의 기공 크기는 안정한 테일러 콘을 생성하고 액체 증발을 감소시킬 것이다. 여과지의 기공 크기는 또한 여과에서 중요한 파라미터인데, 즉 종이는 온라인 전처리 장치로서 작용한다. 기공 크기가 낮은 nm 범위인 재생성된 셀룰로스의 시판되는 초미세 여과 막은 1000 Da 만큼 작은 입자까지 유지하도록 고안되었다. 분자량 경계가 1000 Da 내지 100,000 Da 범위인 초미세 여과 막을 구입할 수 있다.

본 발명의 프로브는 단순히, 다공성 재료의 테두리에서 생성되는 높은 전기장을 사용하는 것을 기초로 마이크로미터 규모 액적을 생성하는데 잘 작동한다. 특정 실시양태에서, 다공성 재료는 이온 생성을 위하여, 육안으로 보이는 뾰족한 끝, 예컨대 삼각형의 끝을 갖도록 성형한다. 본 발명의 프로브는 상이한 팁 너비를 가질 것이다. 특정 실시양태에서, 프로브 팁 너비는 최소 약 5㎛ 이상, 최소 약 10㎛ 이상, 최소 약 50㎛ 이상, 최소 약 150㎛ 이상, 최소 약 250㎛ 이상, 최소 약 350㎛ 이상, 최소 약 400㎛ 이상, 최소 약 450㎛ 이상 등이다. 특정 실시양태에서, 팁 너비는 350㎛ 이상이다. 다른 실시양태에서, 프로브 팁 너비는 약 400㎛이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 프로브는 3차원 형태, 예컨대 원뿔 형태를 갖는다.

상기한 바와 같이, 액적을 운반하기 위하여 공기역학적 보조가 요구되지 않는다. 분석대상의 주위 이온화는 이러한 하전된 액적을 기초로 실현되어, 용액상 샘플의 질량 분석을 위한 단순하고 편리한 접근법을 제공한다.

샘플 용액을 어떠한 전처리 없이 질량 분광계의 주입구의 앞에 고정시킨 다공성 재료 위에 직접 적용한다. 그 후, 습윤된 다공성 재료 위에 고전위를 적용함으로써 주위 이온화를 수행한다. 특정 실시양태에서, 다공성 재료는 종이이며, 이는 액체 운반을 위한 다수의 기공 및 미세채널을 갖는 다공성 재료의 유형이다. 기공 및 미세채널은 또한 종이가 여과 장치로서 작용할 수 있게 하며, 이는 물리적으로 더럽거나 오염된 샘플을 분석하는데 유용하다.

다른 실시양태에서, 다공성 재료를 처리하여 다공성 재료 내에 미세채널이 생성되게 하거나 본 발명의 프로브로서 사용하기 위해 재료의 특성을 증강시킨다. 예를 들어, 종이에 패턴화 실란처리 공정을 수행하여 종이 위에 미세채널 또는 구조를 제조할 수 있다. 이러한 공정에는, 예를 들어 종이의 실란처리가 되도록 종이의 표면을 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라히드로옥틸-1-트리클로로실란에 노출시키는 것이 포함된다. 다른 실시양태에서, 연성 리소그래피 공정을 사용하여 다공성 재료 내에 미세채널을 생성하거나 본 발명의 프로브로서 사용하기 위해 재료의 특성을 증강시킨다. 다른 실시양태에서, 덜 친수성인 화합물을 예비-농축시키기 위하여 소수성 트래핑 영역을 종이 안에 생성한다.

소수성 영역은, 측면 치수가 200~1000㎛인 친수성 채널을 정의하기 위하여 포토리소그래피, 인쇄 방법 또는 플라즈마 처리를 사용하여 종이 위에 패턴화할 수 있다. 문헌 [Martinez et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 1318-1320)]; 문헌 [Martinez et al. {Proc. Natl Acad. Sci. USA 2008, 105, 19606-19611)]; 문헌 [Abe et al. {Anal. Chem. 2008, 80, 6928-6934)]; 문헌 [Bruzewicz et al. (Anal. Chem. 2008, 80, 3387-3392)]; 문헌 [Martinez et al. (Lab Chip 2008, 8, 2146-2150)]; 및 문헌 [Li et al. (Anal. Chem. 2008, 80, 9131-9134)]을 참고하며, 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 도입된다. 이러한 종이-기재 장치 위에 적재된 액체 샘플은 모세관 작용에 의해 구동되어 친수성 채널을 따라 이동할 수 있다.

개질된 표면의 또 다른 적용은, 그의 표면과 용액의 상이한 친화성에 따라 화합물을 분리 또는 농축시키는 것이다. 일부 화합물은 바람직하게는 표면 상에 흡수되는 반면, 매트릭스 내의 다른 화학물은 수성상 안에 머무는 것이 선호된다. 세척을 통해, 관심 화합물은 표면 위에 남아있게 하면서 샘플 매트릭스를 제거할 수 있다. 이후 시점에 관심 화합물은 다른 고-친화성 용매로 표면으로부터 제거할 수 있다. 절차를 반복하는 것은 탈염에 도움을 주고, 또한 원래 샘플을 농축시킨다.

본 발명의 방법 및 시스템에는, 질량 스펙트럼 분석을 위한 분석대상을 보유하고 전달하기 위하여 다공성 재료, 예를 들어 종이가 사용된다. 다공성 재료에 고전압을 적용하여 이온을 생성시키기 위하여 통합된 방식으로 샘플 중의 분석대상을 다공성 재료 안에서 예비-농축, 농후화 및 정제한다. 특정 실시양태에서, 별도의 양의 운반 용액 (예를 들어, 액적 또는 여러 액적들)을 적용하여 다공성 재료를 통한 분석대상의 움직임을 보조한다. 특정 실시양태에서, 분석대상은 이미 다공성 재료에 적용되는 용액 중에 있다. 이러한 실시양태에서, 다공성 재료에 부가적인 용매를 첨가할 필요가 없다. 다른 실시양태에서, 분석대상은 표면을 닦아내어 쉽게 수집할 수 있는 분말화 샘플 형태이다. 본 발명의 시스템 및 방법은 식물 또는 동물 조직 또는 살아있는 유기체 내의 조직의 분석을 가능하게 한다.

본 발명의 방법 및 시스템을 에피네프린, 세린, 아트라진, 메타돈, 록시트로마이신, 코카인 및 안지오텐신 I을 비롯한 여러 다양한 작은 분자의 분석에 사용할 수 있다. 이는 모두 여러 다공성 표면으로부터 높은 품질의 질량 및 MS/MS 생성물 이온 스펙트럼 (하기 실시예 참고)을 디스플레이한다. 본 발명의 방법 및 시스템은 분석대상 농도가 0.1 내지 10㎍/mL (분석대상 총량 50pg 내지 5ng) 정도인, 적은 부피의 용액, 통상적으로 수 ㎕를 사용하는 것을 가능하게 하며, 1 내지 수 분 동안 지속되는 신호를 제공한다.

본 발명의 방법 및 시스템은 또한 단백질 및 펩티드를 비롯한 다양한 생체분자의 분석을 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 겔로부터 올리고뉴클레오티드를 분석하기 위해 사용할 수 있다. 겔 안에서의 올리고뉴클레오티드의 전기영동 분리 이후, 관심 밴드 또는 밴드들을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 다공성 재료로 블로팅 한다. 블로팅 결과, 겔 중의 밴드 안의 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 다공성 재료로 이동된다. 그 후, 다공성 재료를 고전압 공급원에 연결하면, 올리고뉴클레오티드가 이온화되고 질량 스펙트럼 분석을 위한 질량 분광계 안으로 분무된다.

본 발명의 방법 및 시스템을 복잡한 혼합물, 예컨대 전혈 또는 소변의 분석을 위해 사용할 수 있다. 혈액 중의 제약 또는 다른 화합물의 분석을 위한 통상적 절차는 분석 전에 가능한 많은 방해요소를 제거하기 위하여 고안된 다단계 절차이다. 먼저, 15분 동안 대략 1000 x g에서 원심분리하여 혈액의 액체 부분으로부터 혈액 세포를 분리한다 (문헌 [Mustard, J. R; Kinlough-Rathbone, R. L.; Packham, M. A. Methods in Enzymology; Academic Press, 1989). 다음, 내부 표준물을 생성된 혈장에 첨가하고, 거의 모든 분석대상을 회수하면서 가능한 많은 매트릭스 화학물을 제거하기 위한 목적으로 액체-액체 또는 고체-상 추출을 수행한다 (문헌 [Buhrman, D. L.; Price, P. I.; Rudewicz, P. J. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 1996, 7, 1099-1105]). 추출된 상은 통상적으로 용매를 증발시켜 건조시킨 후, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 이동상으로 사용되는 용매 중에 재현탁시킨다 (문헌 [Matuszewski, B. K.; Constanzer, M. L.; Chavez-Eng, C. M., Ithaca, New York, Jul 23-25 1997; 882-889]). 마지막으로, 샘플은 대략 5 내지 10 분 동안의 HPLC 시행 동안 분리되고, 용리액을 전자분무 이온화-탠덤 질량 분광법으로 분석한다 (문헌 [Hopfgartner, G; Bourgogne, E. Mass Spectrometry Reviews 2003, 22, 195-214]).

본 발명의 방법 및 시스템은 상기 샘플 워크업 단계를 거치지 않는다. 본 발명의 방법 및 시스템은 추출 절차에 약간의 변경을 가하여 유사한 방식으로 건조된 혈액 반점을 분석한다. 먼저, 특수 장치를 사용하여 각각의 건조된 혈액 반점으로부터 동일한 크기의 디스크를 펀칭해낸다. 그 후, 이러한 디스크 위의 재료를 내부 표준물을 함유하는 유기 용매 중에서 추출해낸다 (문헌 [Chace, D. H.; Kalas, T. A.; Naylor, E. W. Clinical Chemistry 2003, 49, 1797-1817]). 추출된 샘플을 종이 기판 위에서 건조시키고 분석을 본원에 기재한 바와 같이 진행한다.

하기 실시예는 본 발명의 방법 및 시스템이, 분석 전에 샘플 조제의 필요없이, 복잡한 혼합물의 개별 성분, 예컨대 소변 중의 카페인, 인간 손가락 상의 50pg의 코카인, 탁상위 표면 상의 100pg의 헤로인 및 손상시키지 않은 신장 조직 중의 호르몬 및 인지질을 직접적으로 검출할 수 있음을 나타낸다 (하기 실시예 참고). 본 발명의 방법 및 시스템은 종이에 직접 전달된 바늘 생검 조직 조각을 빠르게 연속하여 검사함으로써 간단한 이미지화 실험 수행을 가능하게 한다.

검사를 위하여 용액으로부터의 분석대상을 다공성 재료에 적용하며, 용액의 용매 성분은 전자분무 용매로서 역할을 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분석대상 (예를 들어, 고체 또는 용액)을 다공성 재료, 예를 들어 종이 위에 미리 반점으로 찍고, 용매를 재료에 적용하여 분석대상을 용해시키고 질량 스펙트럼 분석을 위한 분무기 안으로 전달한다.

특정 실시양태에서, 분리/추출 및 이온화를 보조하기 위하여 용매를 다공성 재료에 적용한다. 질량 분광 분석과 호환성인 임의의 용매를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유리한 용매는 전자분무 이온화법에서도 사용되는 용매일 것이다. 예시적 용매에는 물, 메탄올, 아세토니트릴 및 THF의 조합이 포함된다. 유기 함량 (메탄올, 아세토니트릴 등 대 물의 비율), pH 및 휘발성 염 (예를 들어, 암모늄 아세테이트)은 분석되는 샘플에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 약물 이마티닙과 같은 염기성 분자는 낮은 pH에서 보다 효율적으로 추출되고 이온화된다. 시롤리무스와 같은 이온성 기는 없으나 여러 카르보닐기가 있는 분자는 부가 이온 형성에 기인하여 용매 중 암모늄 염이 존재하면 보다 잘 이온화된다.

특정 실시양태에서, 다차원적 접근법이 이루어진다. 예를 들어, 샘플을 한 차원을 따라 분리한 후, 이어 다른 차원에서 이온화시킨다. 이러한 실시양태에서, 분리 및 이온화를 개별적으로 최적화시킬 수 있고, 각각의 상에 대해 상이한 용매를 사용할 수 있다.

다른 실시양태에서, 분석대상을 종이 위로 전달하는 것은 용매와 전기장의 조합으로 수행된다. 고전위의 전기를 적용하면, 종이 위에서의 분석대상의 이동 방향이 용액 중에서 그의 하전된 형태의 극성과 관련되는 것으로 확인된다. 습윤된 종이 위의 한 점에 전극을 놓음으로써 분무하기 전에 분석대상의 예비-농축 또한 종이 위에서 달성할 수 있다. 접지극을 종이 팁 가까이에 놓음으로써, DC 전압을 적용하면 습윤된 다공성 재료를 통해 강한 전기장이 생성되며, 하전된 분석대상은 이러한 전기장 하에서 전방으로 구동된다. 분무가 개시되기 전에 특정 분석대상은 또한 종이의 특정 부분에서 농축될 수 있다.

특정 실시양태에서, 화학물을 다공성 재료에 적용하여 다공성 재료의 화학적 특성을 개질시킨다. 예를 들어, 상이한 화학적 특성을 갖는 샘플 성분의 차별적인 체류를 가능하게 하는 화학물을 적용할 수 있다. 부가적으로, 염 및 매트릭스 효과를 최소화시키는 화학물을 적용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 반점을 찍을 때 산성 또는 염기성 화합물을 다공성 재료에 첨가하여 샘플의 pH를 조정한다. pH 조정은 생물학적 유체, 예컨대 혈액의 개선된 분석을 위해 특히 유용할 수 있다. 부가적으로, 효율적인 전자분무 이온화를 위하여, 예를 들어 비극성 화합물을 염으로 전환하기 위하여, 선택된 분석대상의 온라인 화학적 유도체화를 가능하게 하는 화학물을 적용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 다공성 재료를 개질시키기 위해 적용되는 화학물은 내부 표준물이다. 정량적 분석을 위한 내부 표준물을 제공하기 위하여, 내부 표준물을 재료 안에 도입하고 용매가 흐르는 동안 알고 있는 속도로 방출시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 질량 스펙트럼 분석 이전에 관심 분석대상의 예비-분리 및 예비-농축을 가능하게 하는 화학물로 다공성 재료를 개질시킨다.

분무 액적은 포지티브 이온 모드에서 강한 조명 아래에서 시각화될 수 있고, 크기는 나노-전자분무 이온 공급원 (nESI)으로부터 방출되는 액적의 크기에 필적한다. 네거티브 이온 모드에서, 전자가 방출되고 벤조퀴논과 같은 증기상 전자 포획제를 사용하여 포획할 수 있다. 어떠한 특정 이론 또는 작용의 기작에 제한되지 않으면서, 개별 유체 채널 내의 장이 아니라, 다공성 재료의 팁에서의 높은 전기장이 이온화의 원인이 되는 것으로 생각된다.

본원에 기재되는 방법론은 네오탈 (neotal) 스크리닝, 치료적 약물 모니터링 및 조직 생검 분석을 비롯한 임상적 적용에 있어서 바람직한 특징부를 갖는다. 절차는 간단하고 빠르다. 다공성 재료는 필터로서의 두 번째 역할, 예를 들어 전혈을 분석하는 동안 혈액 세포를 보유하는 역할을 수행한다. 중요하게는, 샘플을 다공성 재료 위에 저장한 후, 분석 전에 다공성 재료로부터 전달시킬 필요없이 이후에 저장된 다공성 재료로부터 직접 분석할 수 있다. 본 발명의 시스템은 개방된 실험실 환경에서 실험실 실험을 수행가능하게 한다.

참고문헌으로서의 도입

본 명세서 전체에 걸쳐 다른 문헌, 예컨대 특허, 특허 출원, 특허 공보, 저널, 책, 논문, 웹 컨텐츠에 대한 참고 및 인용이 이루어졌다. 이러한 모든 문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고문헌으로 본원에 도입된다.

등가물

본원에 나타내어지고 기재된 것에 부가적으로 본 발명의 다양한 변형 및 그의 다수의 추가적 실시양태는, 본원에 인용된 과학적 문헌 및 특허 문헌에 대한 참고를 비롯한 본 문헌의 전체 내용으로부터 당업자에게는 명백할 것이다. 본원의 주제는 본 발명의 다양한 실시양태 및 그의 등가물에서 본 발명의 실행에 적합시킬 수 있는 중요한 정보, 예시 및 안내를 포함한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 추가로 예시하기 위함이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원의 실시예는 본 발명의 질량 분광측정 프로브가 화학적 및 생물학적 샘플을 이온화시킬 수 있고, 후속 질량 분석 및 검출을 가능하게 함을 나타낸다. 예시적 프로브는 종이 삼각형으로 제작되었으며, 이를 사용하여 종이 위에 고전위를 적용함으로써 마이크로미터 규모 액적을 생성시켰다. 분석대상은 이러한 전기적으로 하전된 액적으로부터 이온화되었으며 통상적 질량 분광계 안으로 운반되었다.

하기 실시예는, 순수한 상태 및 복잡한 혼합물 모두에서 광범위한 샘플을 본 발명의 프로브로 주위 환경에서 직접 분석할 수 있음을 나타낸다. 결과는 종이-기재 분무기가 하기 이점을 가지는 것으로 나타났다: 절연 기체 없이 작동함, 즉 제자리 분석을 위해 적은 부대물이 요구됨; 생물학적 샘플 (건조된 혈액, 소변)을 분석 전에 몇 개월 동안 미리 절단한 여과지 위에 저장할 수 있음; 여과지는 다수의 샘플 (혈액 세포, 염 및 단백질)에서 전자분무 또는 나노 전자분무를 사용했을 때 보여지는 매트릭스 효과를 최소화하고 복잡한 샘플 중 화학물의 MS 신호를 증강시킴; 종이 조각을 사용하여 표면을 닦아냄으로써 분말 샘플을 쉽게 수집한 후, 직접적으로 분석함; 정량적 분석에서 용매가 흐르는 동안 알고 있는 속도로 방출되는 내부 표준물을 함유하도록 종이를 전처리할 수 있음; 및 매트릭스 억제 또는 흡수 사이트를 포함하도록 또는 이온 교환을 수행하도록 또는 선택된 분석대상의 온라인 화학적 유도체화가 가능하도록 종이를 전처리할 수 있음.

대부분의 분석대상의 검출은 ppb 수준만큼 낮은 수준으로 (용액으로 검사할 때) 또는 낮은 ng 내지 pg 범위 (고체를 검사할 때)로 달성되며, 검출 시간은 1분 미만이었다. 하기의 특정 실시예는 건조된 혈액 반점을 분석하기 위한 프로토콜을 제공하며, 이는 또한 전혈 샘플의 제자리 분석을 위해 사용할 수 있다. 건조된 혈액 반점 방법은 또한 혈액 스크리닝 및 다른 임상적 시험을 위한 혈액 샘플의 저장 및 운반과 호환성임이 확인되었다.

본 발명의 장치에는 샘플링, 예비-분리, 예비-농축 및 이온화 성능이 통합되어 있다. 본 발명의 방법 및 시스템은 질량 분석기 내로의 샘플 도입의 문제를 단순화시킨다.

실시예 1 : MS 프로브의 제작

여과지를 치수가 길이 10mm 및 너비 5mm인 삼각형 절편으로 절단하고 분무기로 사용하였다 (도 1). 구리 클립을 종이에 부착하고, 종이를 질량 분광계의 주입구를 향하도록 배향시켰다 (도 1). 구리 클립을 그의 위치를 정확하게 조절하기 위하여 3D 이동 스테이지 위에 장착하였다. 고전압을 구리 클립에 적용하고, 질량 검출을 위한 분석대상 이온을 생성하기 위하여 질량 분광계로 제어하였다.

샘플 정제 및 예비-농축 장치로 역할하는 종이 표면에 샘플을 직접 적용하였다. 여과지는 액체 샘플이 모세관 작용 및 전기적 효과에 의해 구동되어 친수성 네트워크를 통해 이동하도록 하고, 이를 종이의 팁으로 운반시킨다. 이러한 운반 절차 동안 분리가 일어날 수 있다. 종이 표면에 고전압 (~4.5kV)이 적용되었을 때 샘플 용액이 팁으로부터 분무되어 그 결과 이온화 및 MS 검출이 일어났다.

모든 실험은 피니건 (Finnigan) LTQ 질량 분광계 (써모 일렉트론 (Thermo Electron), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 수행하였다. 모세관 주입구의 통상적 온도는 150℃로 설정하였으며, 헤로인 검출시에는 30℃로 설정하였다. 렌즈 전압은 샘플 분석을 위해서는 65V, 그리고 생존율 실험을 위해서는 240V로 설정하였다. 시험 샘플, 특히 복잡한 혼합물 및 혈액 샘플 중의 분석대상을 확인하기 위하여 충돌유발분해 (CID)를 이용하여 탠덤 질량 스펙트럼을 수집하였다.

실시예 2: 분무 생성

습윤된 종이 삼각형에 고전위를 적용하여 분무를 생성하였다. 하나의 종이 삼각형을 그의 뾰족한 팁이 LTQ의 주입구를 향하도록 주입구 앞에 3mm 이상 떨어지게 하여 두었다. 통상적으로, 10uL 샘플 용액을 적용하여 종이 삼각형을 습윤시켰다. 용액은 종이를 습윤시키거나 포화시킬 수 있으며, 또는 종이의 표면 위에 액체 필름의 박층을 형성할 수 있다. 고전위 (3-5kV)를 종이 삼각형과 질량 주입구 사이에 적용하여 전기장을 생성하였으며, 이는 종이 삼각형의 팁에 있는 액체에 전하 축적을 유도하였다. 증가하는 쿨롱 힘은 액체를 부수어 하전된 액적을 형성하고, 그 후 액적이 종이 팁에서 질량 분석기로 날아가는 동안 용매가 증발된다. 종이 분무기에는 절연 기체, 가열 또는 용매를 제거하기 위한 임의의 다른 보조수단이 요구되지 않는다.

액체가 종이 삼각형 위에 축적되면, 현미경으로 검사했을 때 테일러 콘이 팁에서 관찰되었다. 형성된 액적은 강한 조명 아래에서 명확하게 가시적이었다. 테일러 콘 및 가시적 분무는 짧은 시간의 증발 및 분무 이후에 사라졌다. 그러나, 질량 신호는 훨씬 더 긴 기간 (수 분) 동안 지속되었다. 이는 종이 삼각형이 질량 분석에 있어서 두 가지 모드로 작용할 수 있음을 드러내었다. 첫 번째 모드에서, 액체는 종이 팁에서 분무로 소비될 수 있는 액체보다 빠른 속도로 종이의 안에서 운반되어, 그 결과 종이 팁에서 큰 콘이 형성되고 액적이 생성되었다. 두 번째 모드에서 종이 안에서의 액체 운반은 분무 소비를 따라갈 정도로 충분히 빠른 속도로 이동할 수 없었으며 액적이 가시적이지 않았다. 그러나, 분석대상의 이온화는 확실히 일어난 것으로 관찰되었다. 첫 번째 모드에서는 질량 스펙트럼과 같은 ESI를 제공하고, 두 번째 모드에서는 APCI 스펙트럼의 일부 특징부를 갖는 스펙트럼을 제공하였다. 후자의 경우, 종이 삼각형은 전도성 바늘과 유사한 역할을 하여 높은 전기장을 생성함으로써 대기 중에서 분자를 이온화시켰다. 시험한 조건하 및 샘플에 있어서 첫 번째 모드에서의 질량 신호가 두 번째 모드의 질량 신호보다 대략 2배 정도 강한 것으로 관찰되었다.

실시예 3: 프로브 고려사항

프로브 재료

질량 분광법을 위한 하전된 액적을 생성하기 위하여 다수의 다공성 재료를 시험하였다. 재료를 뾰족한 팁을 갖는 삼각형으로 만든 후, 샘플 용액을 제작된 프로브에 적용하였다. 여기서의 데이터는 면봉, 텍스타일, 식물 조직 및 또한 다양한 종이를 비롯한 임의의 친수성 및 다공성 기판을 성공적으로 사용할 수 있음을 나타낸다. 이러한 재료의 다공성 네트워크 또는 미세채널은 액체를 보유할 충분한 공간을 제공하였으며, 친수성 환경은 모세관 작용을 통한 액체 운반을 가능하게 하였다. 소수성 및 다공성 기판은 또한 적절하게 선택된 소수성 용매와 함께 성공적으로 사용할 수 있었다.

추가적 조사를 위하여, 분석대상 검출에서의 능력을 평가하기 위해 6종의 시판되는 종이를 선택하고 정성적으로 시험하였다. 여과지 및 크로마토그래피 종이는 셀룰로스로 만들어진 반면, 유리 미세섬유 여과지는 유리 미세섬유로 만들어 졌다. 도 19는 이러한 종이 위에서의 코카인 검출 질량 스펙트럼을 나타낸다. 유리 섬유 종이의 스펙트럼 (도 19 패널 (e))은 배경의 강도가 다른 종이들보다 2배 정도 낮고 코카인 피크 (m/z, 304)가 확인되지 않았기 때문에 독특했다.

이는 유리 섬유 종이가 비교적 두꺼운 두께 (~2mm)로 인하여 모드 II로 작동하고 효율적인 액적 생성을 억제하는 것으로 가정하였다. 이러한 가정은 코카인 검출을 위해 유리 섬유 종이로부터 박리한 박층을 사용하여 증명되었다. 그러한 경우, 배경의 강도가 증가하였고 코카인 피크가 관찰되었다. 모든 여과지가 코카인 검출에 있어서 잘 작용하였다 (도 19 패널 (a)-(d)). 크로마토그래피 종이가 가장 깨끗한 스펙트럼 및 비교적 높은 강도의 코카인을 나타내었다 (도 19 패널 (f)).

프로브 형태 및 팁 각도

액적 생성과 관련하여 여러 다양한 프로브 형태를 조사하였다. 다공성 재료의 바람직한 형태는 적어도 하나의 팁을 포함하였다. 팁은 테일러 콘의 재빠른 형성을 가능하게 함이 관찰되었다. 삼각형의 프로브 형태가 가장 빈번하게 사용되었다. 도 25 패널 ((A)-(C))에 보여지는 바와 같이, 팁의 뾰족한 정도, 팁의 각도 (도 27 패널 (A) 및 (B)) 및 종이 기판의 두께는 분무 특징에 영향을 줄 수 있었다. 다중 팁을 갖는 튜브 형태의 장치는 (도 25 패널 (D)) 다중-팁 분무기로서 작용할 것으로 예상되며, 이는 개선된 분무 효율을 가질 것이다. 표면에 구멍을 내기 위해 뾰족한 바늘을 사용하여 마이크로 분무기의 어레이를 또한 DBS 카드 위에 제작할 수 있다 (도 25 패널 (E)).

실시예 4: 프로브와 질량 분광계의 주입구의 배치

종이 삼각형을 2D 이동 스테이지 위에 장착하여, 종이 삼각형과 질량 분광계 주입구의 상대적 위치에 의해 질량 신호가 어떻게 영향을 받는지 측정하였다. 종이 삼각형을 각 단계마다 2mm 증분으로, 연속적 방식으로 y-방향으로 8cm, x-방향으로 3cm 이동시켰다 (도 20 패널 (a)). 코카인 용액 (1ug/mL, 메탄올/물, 1:1 v/v)을 종이 표면 위에 연속적으로 공급하였다. 질량 스펙트럼을 전체 스캔하는 동안 계속적으로 기록하였다. 양성자화 코카인 (m/z, 304)의 피크 강도의 등고선 플롯을 질량 스펙트럼으로부터 추출한 정규화 데이터로부터 생성하였다 (도 20 패널 (b)). 등고선 플롯은, 액적을 생성하기 위하여 종이 삼각형을 질량 분광계의 주입구와 똑바로 직렬로 놓을 필요는 없었음을 나타낸다.

분무 계속 시간을 또한 시험하였다 (도 20 패널 (c)). 종이 삼각형 (크기 10mm, 5mm)을 제조하였다. 먼저, 10uL 용액을 0.1, 1 및 10ug/mL의 상이한 농도로 종이 삼각형 위에 적용하였다. 각각의 종이에 대한 분무 시간을 농도 차이에 따라 약간씩 달리하였다. 그 후, 1ug/mL 코카인 용액을 5uL, 10uL 및 15uL의 상이한 부피로 종이 삼각형 위에 적용하였다. 분무 시간은 샘플 부피가 증가함에 따라 선형 응답성을 나타내었다.

또 다른 시험에서, 용액의 증발을 방지하기 위하여 종이를 PTFE 막으로 밀봉하였는데, 이는 분무 시간을 약 3배 연장시켰다. 이러한 결과는 심지어 5uL 용액을 사용하여도 종이 분무기가 데이터 획득을 위해 충분히 긴 분무 시간을 제공하며, 신호의 강도가 전체 분무 기간 동안 안정함을 나타낸다.

실시예 5: 분리 및 검출

본 발명의 프로브는, 질량 분광법에 의해 제자리 이온화하기 전에 생물학적 유체 중의 화학물을 둘 다 분리하는 기능을 할 수 있는 다공성 재료, 예컨대 종이를 포함한다. 본 실시예에서, 프로브를 위한 다공성 재료는 크로마토그래피 종이였다. 도 24에 보여지는 바와 같이 두 염료의 혼합물을 종이에 단일 반점으로 적용하였다. 염료를 먼저 종이 위에서 TLC (박층 크로마토그래프)로 분리하고, 종이 매체로부터 절단해낸 종이 절편을 사용하여 본 발명의 방법으로 MS 분석을 사용하여 분리된 염료를 검사하였다 (도 24). 데이터는 분리된 염료가 MS 분석으로 검출되었음을 나타낸다 (도 24).

따라서 크로마토그래피 종이는 샘플 수집, 분석대상 분리 및 분석대상 이온화을 가능하게 했다. 이는 크로마토그래피와 MS 분석의 커플링의 유의한 단순화를 나타낸다. 크로마토그래피 종이는 용매 이동이 모세관 작용에 의해 구동되어 주사기 펌프가 필요하지 않다는 장점을 갖기 때문에 본 발명의 프로브를 위해 우수한 재료이다. 또 다른 장점은, 그의 다중-다공성 특징으로 인하여 통상적 나노전자분무 공급원에서 심각한 문제인 막힘이 일어날 가능성이 적다는 것이다. 따라서, 크로마토그래피 종이 (다중-다공성 재료)를 마이크로다공성 전자분무 이온화법 공급원으로 사용할 수 있다.

실시예 6: 순수한 화합물: 유기 약물, 아미노산 및 펩티드

앞서 기재한 바와 같이, 본 발명의 프로브 및 방법은 질량 분광법을 위한 간단하고 편리한 이온화 방법을 제공한다. 종이 삼각형에 상이한 화합물을 반점으로 찍고 고전압 공급원에 연결하여 이온을 생성하였다. 모든 실험은 피니건 LTQ 질량 분광계 (써모 일렉트론, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 수행하였다. 여기서의 데이터는 아미노산, 치료적 약물, 불법적 약물 및 펩티드를 비롯한 다양한 화학물이 용액 상 중에서 이온화될 수 있음을 나타낸다.

도 2 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 헤로인 (농도: 1ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 2 패널 (b)는 헤로인 (농도: 1ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 3 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 카페인 (농도: 10ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 3 패널 (b)는 카페인 (농도: 10ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 피크 167은 용매는 있고 카페인은 없는 블랭크 스펙트럼에서도 존재한다.

도 4 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 벤조일엑고닌 (농도: 10ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 4 패널 (b)는 벤조일엑고닌 (농도: 10ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 5 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 세린 (농도: 1ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 5 패널 (b)는 세린 (농도: 100ppb, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 피크 74 및 83은 용매는 있고 세린은 없는 블랭크 스펙트럼에서도 존재한다. 도 21 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 세린 (m/z, 106)의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 패널 (a)는 또한 세린 (m/z, 106)의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 21 패널 (b)는 본 발명의 프로브를 사용한 메타돈 (m/z, 310)의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 패널 (b)는 또한 메타돈 (m/z, 310)의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 패널 (c)는 본 발명의 프로브를 사용한 록시트로마이신 (m/z, 837)의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 패널 (b)는 또한 록시트로마이신 (m/z, 837)의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 6 패널 (a)는 본 발명의 프로브를 사용한 펩티드 브래디키닌 2-9 (농도: 10ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 6 패널 (b)는 브래디키닌 2-9 (농도: 1ppm, 부피: 10㎕, 용매: MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼 가운데 혹은 산업에서 재료에 빈번하게 첨가되는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 야기되는 것으로 추측된다. 도 21 패널 (d)는 본 발명의 프로브를 사용한 브래디키닌 2-9 (m/z, 453)의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 패널 (d)는 또한 브래디키닌 2-9 (m/z, 453)의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 패널 (d)는 또한 부가 이온 [M+H] (m/z, 904), [M+2H]²⁺ (m/z, 453), [M+H+Na]²⁺ (m/z, 464) 및 [M+2Na]²⁺ (m/z, 475)을 나타낸다. m/z 453 피크는 MS/MS 스펙트럼으로 확인된 이중 하전된 부가 이온이었다.

도 11은 동일한 파라미터 (~2kV, 용매: MeOH:H₂O = 1:1)를 사용하여 (a) 종이 조각 및 (b) PVDF 막 위에서의 펩티드 분석 (10ppm의 브래디키닌 2-9) 사이의 차이를 나타내는 MS 스펙트럼이다.

여기서의 데이터는 본 발명의 프로브가 순수한 화합물의 검출에 있어서 50에서부터 1000 초과까지의 질량/전하 범위에 걸쳐 잘 작동함을 나타낸다. 데이터는 또한 불법적 약물, 예컨대 헤로인, 코카인 및 메타돈을 비롯한 대부분의 화학물에 있어서 1ng/mL까지 낮은 수준까지 검출이 이루어졌음을 나타낸다.

실시예 7: 복잡한 혼합물

복잡한 혼합물, 예컨대 소변, 혈액 및 콜라 음료를 본 발명의 방법, 장치 및 시스템을 사용하여 검사하였다. 모든 실험은 피니건 LTQ 질량 분광계 (써모 일렉트론, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 수행하였다.

도 7 패널 (a)는 "반점" 방법으로 전혈 샘플로부터 헤로인이 검출되었음을 보이는 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 200ppb 헤로인을 함유하는 0.4㎕의 전혈 샘플을 삼각형 종이의 중앙에 적용하여 1mm² 혈액 반점을 형성하였다. 반점이 건조된 후, 10㎕의 용매 (MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))를 삼각형 종이의 후방 끝에 적용하였다. 모세관 효과로 인하여, 용매는 전방으로 움직이고 혈액 반점 중의 화학물을 용해시켰다. 마지막으로 용매가 종이의 팁에 도달하자 전자분무가 일어났다. 상기 언급한 "혈액 반점" 방법의 유효성을 증명하기 위하여 전자분무를 위한 종이 위에 전혈을 직접 첨가하였다. MS/MS 스펙트럼은 헤로인이, 심지어 농도가 20ppm까지 높을 때에도, 10㎕의 전혈 샘플로부터 검출되지 않았음을 나타내었다 (도 7 패널 (b)).

도 8 패널 (a)는 "반점" 방법으로 원 소변 샘플로부터 헤로인을 검출할 수 있음을 보여주는 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 100ppb 헤로인을 함유하는 0.4㎕의 원 소변 샘플을 삼각형 종이의 중앙에 적용하여 1mm² 소변 반점을 형성한다. 반점이 건조된 후, 10㎕의 용매 (MeOH/H₂O/HOAc (50:49:1, v/v/v))를 삼각형 종이의 후방 끝에 적용하였다. 모세관 효과로 인하여, 용매는 전방으로 움직이고, 혈액 반점 중의 화학물을 용해시켰다. 마지막으로 용매가 종이의 팁에 도달하자 전자분무가 일어났다. 상기 언급한 "반점" 방법의 유효성을 증명하기 위하여 전자분무를 위한 종이 위에 원 소변을 직접 첨가하였다. MS/MS 스펙트럼은 헤로인이, 농도가 100ppb일 때, 10㎕의 원 소변 샘플로부터 검출되지 않았음을 나타내었다 (도 8 패널 (b)).

도 9 패널 (a)는 샘플 조제 없이 콜라 음료로부터 카페인이 검출되었음을 나타내는 MS 스펙트럼이다. 도 9 패널 (b)는 커피 분말로부터 카페인이 검출되었음을 나타내는 MS 스펙트럼이다. 종이 삼각형을 사용하여 커피 분말을 커피 봉지로부터 표면을 닦아내어 수집하였다.

도 22 패널 ((A)-(B))은 각각 포지티브 모드 및 네거티브 모드에서 분석한 코카-콜라 (콜라 음료)의 스펙트럼을 나타낸다. MS/MS 스펙트럼에서 확인된 양성자화 카페인의 피크 (m/z 195)는, 이러한 음료 중 카페인의 높은 농도 (100ug/mL)에 기인하여 포지티브 모드의 질량 스펙트럼에서 우세하였다 (패널 (C)). 두 고농도의 화합물인 벤조산칼륨 및 아세설팜칼륨이 네거티브 모드의 MS/MS 스펙트럼에서 확인되었다 (패널 (D)-(E)).

도 22 패널 (F)는 소변 수집 2시간 전에 코카-콜라 (콜라 음료)를 마신 사람으로부터의 소변 중 카페인의 스펙트럼을 나타낸다. 소변은 통상적으로 요소를 매우 고농도로 함유하며 이는 또한 쉽게 이온화된다. 따라서, 따라서, 양성자화 요소 [m/z, 61] 및 요소 이량체 [m/z, 121]가 MS 스펙트럼에서 우세하였다. 그러나, 양성자화 카페인이 MS/MS 스펙트럼에서 확인되었으며 이는 소변 샘플 중에서 우수한 신호대잡음비를 나타내었다.

도 10은 샘플 조제없이 분석을 위해 취한 소변의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 10 패널 (a)는 커피를 마신 사람으로부터의 소변 중에서 검출된 카페인의 질량 스펙트럼이다. 도 10 패널 (b)는 커피를 전혀 마시지 않은 사람으로부터의 소변 중에서 카페인이 검출되지 않았음을 나타내는 질량 스펙트럼이다.

도 22 패널 (G)는 닦아낸 샘플로서 수집한 헤로인 (m/z, 370)의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 50ng 헤로인을 함유하는 5uL 용액을 탁상위 1cm²의 면적에 반점으로 찍었다. 종이 삼각형을 습윤시키고 탁상위의 표면을 닦아내는데 사용하였다. 그 후, 질량 검출을 위해 종이 삼각형을 고전압 공급원에 연결하였다. 이러한 데이터는 본 발명의 프로브가 이온화 공급원 및 또한 질량 검출을 위한 샘플링 장치로서의 이중 역할을 수행할 수 있음을 나타낸다. 고체 표면 위의 흔적 샘플은 본 발명의 프로브를 사용하여 표면을 닦아냄으로써 간단하게 수집할 수 있었다. 더스트 및 다른 방해요소 또한 종이 삼각형 위에 수집되었으나, 헤로인은 이러한 복잡한 매트릭스로부터 직접 검출될 수 있었다.

실시예 8: 추출 없이 ESI 에 의한 식물 조직 직접 분석

도 12는 네 가지 식물의 슬라이스된 조직을 사용한 식물 조직의 직접 MS 스펙트럼을 나타낸다. (a) 양파, (b) 파 및 두 가지 상이한 잎 (c) 및 (d).

도 13은 (a) 샘플 조제 없이 양파의 직접 분석, (b) 표준 용액을 사용한 비타민 C 분석의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

실시예 9: 전혈 및 다른 생체유체

체액, 예컨대 혈장, 림프액, 눈물, 타액 및 소변은 광범위한 분자량, 극성, 화학적 특성 및 농도를 갖는 분자를 함유하는 복잡한 혼합물이다. 체액의 특정 화학적 성분을 모니터링하는 것은, 임상 진단, 약물 개발, 법의학 독물학, 약물 남용 검출 및 치료적 약물 모니터링을 비롯한 여러 다양한 분야에서 중요하다. 유체 혈장 및 혈장을 포함한 혈액 및 또한 소변에 대한 시험은 임상 모니터링에서 특히 중요하다.

혈액으로부터의 다양한 화학물은 임상 설정에서 루틴하게 모니터링된다. 통상적 예에는 요소, 글루코스 및 크레아틴과 함께 나트륨 및 칼륨과 같은 전해질을 측정하는 기초 대사 패널, 및 총 콜레스테롤, 고밀도 지질단백질 (HDL), 저밀도 지질단백질 (LDL) 및 트리글리세라이드의 측정을 포함하는 개인의 심혈관계 질환의 위험을 확인하기 위한 지질 패널이 포함된다. 혈액 중의 화학물에 대한 대부분의 실험실 시험은 실제로, 원심분리를 사용하여 혈액 세포로부터 분리한 혈액의 액체 성분인 혈장 상에서 수행된다. 많은 의학적 진단 시험이 비색분석법에 의존하고 따라서 광학적으로 투명한 유체가 요구되므로 이러한 단계는 필요하다. 원심분리 후, 관심 분자의 검출은 여러 방식으로 수행되는데, 가장 통상적으로는 면역측정법, 예컨대 효소결합면역흡착검사 (ELISA) 또는 방사면역측정법 (RIA) 또는 선택적 효소에 의한 관심 분자의 산화가 색이 변화하는 반응과 커플링된 효소 측정법으로 수행하며, 예컨대 콜레스테롤 (콜레스테롤 산화효소에 의한 산화) 또는 글루코스 (글루코스 산화효소에 의한 산화)에 대한 시험이 있다.

종이 위의 건조된 혈액 반점으로서 전혈 샘플을 저장 및 운반하는 것에 대해 제약 과학 분야에서 상당한 관심을 갖고 있다 (문헌 [N. Spooner et al. Anal Chem., 2009, 81, 1557]). 혈액 중에서 발견되는 화학물에 대한 대부분의 시험은 액체 샘플, 통상적으로 액체 전혈로부터 단리된 혈장 또는 혈장 상에 수행한다. 액체 혈액 또는 혈액 성분의 요구되는 저장, 운반 및 취급에는 일부 어려움이 있다. 액체 형태의 혈액이 일부 시험에 있어서는 필수이지만, 다른 시험은 표면 (통상적으로 종이) 위에 반점으로 찍고 건조되도록 한 혈액 또는 다른 체액 상에 수행할 수 있다.

본 발명의 프로브 및 방법은 어떠한 샘플 조제도 필요없이 전혈을 분석할 수 있다. 샘플을 하기와 같이 제조하였다. 0.4uL 혈액을 종이 삼각형의 중앙에 직접 적용한 후 약 1분 동안 건조되도록 하여 건조된 혈액 반점을 형성하였다 (도 23 패널 (a)). 10uL 메탄올/물 (1:1, v/v)을 종이 삼각형의 후방 끝 가까이에 적용하였다. 용액은 모세관 작용으로 구동되어 종이를 가로질러 이동하여 그의 깊이 전체를 습윤시켰다. 용액이 건조된 혈액 반점과 상호작용함에 따라, 혈액으로부터의 분석대상이 용액에 진입하고 이온화를 위하여 프로브의 팁으로 운반되었다 (도 23 패널 (a)). 혈액 샘플 분석의 절차는 약 2분 안에 수행되었다.

여러 약물을 전혈에 첨가하고, 상기한 바와 같은 본 발명의 프로브에 혈액을 적용하였다. 여러 약물의 검출은 아래 기재하였다.

만성 골수성 백혈병 치료에 있어서 FDA 승인된 이마티닙 (글리벡)인 2-페닐아미노피리미딘 유도체는 다소 좁은 범위의 농도에 걸쳐서 유효하다. 치료적 범위를 포함한 농도의 이마티닙을 첨가한 인간 전혈을 분석을 위한 작은 종이 삼각형위에 침착시켰다 (도 14, 패널 (a)). 양성자화 이마티닙의 탠덤 질량 스펙트럼 (MS/MS, 도 14 패널 (b)), m/z 494는 단일 특징적 단편 이온을 나타내었다. 전혈 중의 이마티닙의 수량화는 상기 신호 및 내부 표준물로서 첨가한 공지된 농도의 이마티닙-d8에 대한 신호를 사용하여 달성하였다. 상대적 응답성은, 전체 치료적 범위를 비롯한 광범위한 농도에 걸쳐 선형이었다 (도 14 패널 (c)).

심혈관 질환에 사용되는 아테놀롤인 □-블로커 (blocker) 약물을, 건조된 혈액 반점 방법을 사용하여 시험함으로써 전혈 분석을 위한 종이 분무기를 평가하였다. 아테놀롤을 요구되는 농도로 전혈에 첨가하고 혈액 샘플을 종이 분무기에 있어서 상기한 바와 같이 사용하였다. 건조된 혈액 반점 중의 400pg의 양성자화 아테놀롤 (0.4uL 전혈 중 1ug/mL 아테놀롤)이 질량 스펙트럼에 나타났고, MS/MS 스펙트럼은 심지어 20pg의 아테놀롤 (0.4uL 전혈 중 50ug/mL 아테놀롤)도 건조된 혈액 반점 중에서 확인될 수 있는 것으로 나타냈다 (도 23 패널 (b)).

도 23 패널 (c)는 전혈 중의 헤로인의 질량 스펙트럼이다. 여기서의 데이터는 탠덤 질량을 사용하여 건조된 혈액 반점 중의 200pg 헤로인을 검출할 수 있었음을 나타낸다.

종이 매체가 필터로서 혈액 세포를 보유하는 두 번째 역할을 수행하는 것이 또한 관찰되었다. 중요하게는, 샘플을 분석 전에 종이로부터 전달시키는 것이 요구되는 대신에 저장 매체 위에서 직접 분석했다. 모든 실험은 개방된 실험실 환경 안에서 이루어졌다. 하기 두 가지 부가적인 특징부는 상기 방법론이 1차 의료 기관에서의 질량 분광법의 사용을 증가시키는데 기여할 가능성이 있음을 나타내었다: 분석을 위한 혈액 샘플을 캐뉼러가 아닌 핀으로 찔러 취하였고, 실험을 핸드헬드 질량 분광계를 사용하여 용이하게 수행하였다 (하기 도 18 및 실시예 10).

실시예 10: 핸드헬드 질량 분광계

본 발명의 시스템 및 방법은 핸드헬드 질량 분광계와 호환성이었다. 종이 분무는 핸드헬드 질량 분광계 (미니 (Mini) 10, 퍼듀 대학교에서 주문 생산됨)를 사용하여 수행하였다. 10㎍/mL 아테놀롤을 첨가한 전혈의 분석. 혈액 (0.4uL)이 건조된 후 (~1분) 메탄올/물 (1:1; 10㎕)을 종이에 적용하여 질량 검출을 위한 분무를 생성하였다 (도 18). 구석에 삽입된 화면은 아테놀롤 양이 4ng 만큼 적을 때에도 탠덤 질량 스펙트럼을 사용하여 전혈 중에서 아테놀롤을 쉽게 확인할 수 있었음을 나타낸다.

실시예 11 : 안지오텐신 I

도 15는 크로마토그래피 종이 (분무전압, 4.5kV) 상에서의 안지오텐신 I 용액 (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu (SEQ ID NO: 1), 10㎕, 메탄올/물, 1:1, v/v 중 8㎍/mL)의 종이 분무기 질량 스펙트럼이다. 구석에 삽입된 화면은 질량 범위 630-700에 걸친 확장된 화면을 나타낸다. 양성자화 ([M+2H]²⁺) 및 나트륨-부가 이온 ([M+H+Na]²⁺, [M+2Na]²⁺)이 주요 이온성 종이다.

실시예 12: 과일 상의 농약

종이 와이핑을 통한 샘플 수집에 이어 본 발명의 프로브를 사용한 분석을 과일 상의 농약의 빠른 분석에 이용하였다. 메탄올로 습윤시킨 크로마토그래피 종이 (3 x 3cm)를 사용하여 식료품점에서 구입한 레몬의 껍질 상의 10cm² 면적을 와이핑하였다. 메탄올이 건조된 후, 종이의 중앙으로부터 삼각형을 절단해내고 10㎕ 메탄올/물 용액을 적용함으로써 종이 분무기에 사용하였다. 기록된 스펙트럼 (도 34 패널 (A)-(B))은 원래 레몬 껍질 위에 있던 살진균제인 티아벤다졸 (양성자화 분자 이온에 대해 m/z 202 및 나트륨 부가 이온에 대해 m/z 224)이 종이 위에 수집되었고 MS로 쉽게 확인될 수 있었음을 나타내며 MS/MS 분석을 사용하여 확인하였다. 또 다른 살진균제 이마잘릴 (m/z 297) 또한 존재하는 것으로 관찰되었다.

실시예 13: 종양 샘플

본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 인간 전립선 종양 조직 및 정상 조직을 분석하였다. 종양 및 인접 정상 조직 조각의 두께는 15㎛이었고, 탈착 전자분무 이온화법 (DESI)을 사용한 이미지화 연구를 위하여 유리 슬라이드 위에 고정시켰다. 금속 바늘을 사용하여 유리 슬라이드로부터 종양 부위 및 정상 부위로부터의 1mm² x 15㎛ 부피의 조직을 떼어내고 이를 종이 분무 분석을 위한 종이 삼각형의 표면 위에 놓았다.

메탄올/물 (1:1 v:v; 10㎕)의 액적을 용매로서 종이에 첨가한 후, 4.5kV 포지티브 DC 전압을 적용하여 분무를 생성하였다. 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC) 및 스핑코마이엘린 (SM)이 스펙트럼에서 확인되었다 (도 17 패널 (a) 및 (b)). m/z 798에서의 [PC(34:1)+K]⁺의 피크는 종양 조직에서 유의하게 높았고, m/z 725에서의 피크 [SM(34:1)+Na]⁺, m/z 756에서의 [SM(36:0)+Na]⁺ 및 m/z 804에서의 [SM(36:4)+Na]⁺는 정상 조직과 비교하여 유의하게 낮았다.

실시예 14: 치료적 약물 모니터링

약물의 투여는 안전하고 효과적인 결과의 달성을 위하여 적절한 복용 지침을 관리하는 것에 따른다. 이러한 지침은 약물의 약물동태학 (PK) 및 약력학 (PD)을 연구하는 임상 시험 동안 확립된다. 임상 시험은 PK-PD 연구를 사용하여 표준 복용량을 확립하며, 이는 체중, 체표면적 등과 같은 변수를 사용하는 식에 따라 조정되거나 고정될 수 있다. 그러나, 약물 노출, 즉 시간에 걸쳐 순환하는 약물의 양은, 환자에 따라 달라질 수 있는 여러 요인에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 개인의 대사 속도, 혈장 단백질의 유형 및 수준, 및 이미 존재하는 상태, 예컨대 신장 및/또는 간 손상 모두 생체내 (in vivo) 약물의 노출에 영향을 주는 역할을 한다. 또한, 다른 의약과의 조합으로의 약물 투여 또한 노출에 영향을 줄 수 있다. 그 결과, 약물 투여의 최적의 처방 계획을 예측하고 처방하는 것이 종종 어렵다.

약물에 과도 또는 과소 노출되는 것은 각각 독성 효과 또는 감소된 효능을 야기할 수 있다. 이러한 염려를 해결하기 위해서 치료적 약물 모니터링 (TDM)을 사용할 수 있다. TDM은 체내의 활성 약물 수준을 측정한 후, 효능을 증가시키고/시키거나 독성을 감소시키기 위해 약물 복용 또는 스케쥴을 조정하는 것이다. TDM은 약물의 약물동태학에서의 가변성이 치료의 창에 비해 큰 경우, 및 약물 노출과 효능 및/또는 독성 사이에 확립된 관계가 있는 경우 표시된다. TDM에 대한 또 다른 요구사항은 활성 성분에 대한 충분히 정밀하고 정확한 측정법이 이용가능해야만 한다는 것이다. 면역측정법 및 액체 크로마토그래피 질량 분광법 (LC-MS)이 TDM을 위해 통상적으로 사용되는 방법이다. 면역측정법과 비교하여 LC-MS는 넓은 적용가능성, 높은 감도, 우수한 수량화, 높은 특이성 및 빠른 속도를 비롯한 장점을 갖는다. 본 발명의 프로브는 즉석 진단 (point-of-care) 치료적 약물 모니터링을 제공하기 위하여 표준 질량 분광계와 커플링시킬 수 있다.

건조된 혈액 반점 중의 약물 이마티닙 (미국에서는 글리벡 (GLEEVEC)이고 유럽/호주에서는 글리벡 (GLIVEC)임, 만성 골수성 백혈병의 치료를 위함)을 종이 분무기 및 실험실-규모 LTQ 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 전혈 중의 이마티닙의 수량화는 내부 표준물로서 공지된 농도의 이마티닙-d8을 사용하면서 MS/MS 스펙트럼을 사용하여 달성하였다 (도 14 패널 (c)). 상대적 응답성은 전체 치료적 범위를 비롯한 광범위한 농도에 걸쳐 선형이었다 (도 14 패널 (c)).

실시예 15: 고속 검출

고속 분석을 위해 다중-팁 장치를 제작하고 적용하였다 (도 28 패널 (a)). 다중-팁 장치는 단일 구리 스트립에 모두 연결된 종이 삼각형의 집합이었다 (도 28 패널 (a)). 하나의 전극이 구리 스트립에 연결되었다. 다중 샘플을 단일 종이 기판 위에 놓고 다중-팁 프로브를 사용하여 직렬로 분석하였다 (도 28 패널 (b)-(c)). 각각의 팁에 100ppm 샘플 (코카인 또는 카페인)을 함유하는 0.2uL 메탄올/물을 미리 적재하고 건조시켰다. 그 후, 전체 다중-팁 장치를 이동 스테이지 위에서 일정한 속도로 왼쪽에서 오른쪽으로 이동시키고, 이동하는 동안 각각의 팁의 후방 부로부터 7uL 메탄올/물을 적용하였다.

분무하는 동안 오염을 방지하기 위하여, 블랭크를 두 샘플 팁 사이에 삽입하였다. 도 28 패널 (c)는 전체 스캐닝에 대한 신호 강도를 나타낸다. 전체 강도로부터, 6개의 팁은 6개의 개별적으로 높은 신호 피크를 제공하였다. 코카인에 있어서, 피크는 팁 2 및 팁 6을 스캔했을 때만 나타났다. 카페인에 있어서, 가장 높은 피크는 팁 4로부터 나왔으며 이는 샘플 적재 순서와 일치하였다.

실시예 16: 조직 분석

본 발명의 프로브를 사용한 동물 조직 중의 화학물의 직접 분석은 도 29 패널 (a)에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 조직의 작은 조각을 떼내어 종이 삼각형 위에 놓았다. 메탄올/물 (1:1 v:v; 10㎕)을 용매로서 종이에 첨가한 후, 4.5kV 포지티브 DC 전압을 적용하여 MS 분석을 위한 분무를 생성하였다. 양성자화 호르몬 이온이 돼지 부신 조직에서 관찰되었다 (1mm³, 패널 (b)). 도 16은 종이 분무기에 의한 동물 조직 중의 호르몬의 직접 분석을 나타내는 질량 스펙트럼이다. 돼지 부신 조직의 작은 조각 (1mm x 1mm x 1mm)을 종이 표면 위에 놓고, MeOH/물 (1:1 v:v; 10㎕)을 첨가하고 전압을 종이에 적용하여 분무를 생성하였다. 호르몬 에피네프린 및 노르에피네프린이 스펙트럼에서 확인되었으며, 높은 질량에서 스펙트럼은 인지질 신호가 우세하였다.

종양 및 인접 정상 영역에서 떼어낸 인간 전립선 조직 (1mm² x 15㎛, 패널 (c) 및 (d))에 대한 지질 프로파일을 수득하였다. 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC) 및 스핑코마이엘린 (SM)이 스펙트럼에서 확인되었다. m/z 798에서의 [PC(34:1)+K]⁺ 피크는 종양 조직에서 유의하게 더욱 강했고 (패널 (c)), m/z 725에서의 피크 [SM(34:1)+Na]⁺, m/z 756에서의 [SM(36:0)+Na]⁺, 및 m/z 804에서의 [SM(36:4)+Na]⁺는 정상 조직과 비교하여 유의하게 낮았다 (패널 D).

실시예 17: 온라인 유도체화

비교적 낮은 이온화 효율 및 비교적 낮은 혼합물 중 농도를 갖는 표적 분석대상의 분석을 위하여, 적절한 감도를 제공하기 위하여 종종 유도체화가 필요하다. 온라인 유도체화는 분무 용액에 시약을 첨가하여, 예컨대 표적 분석대상에 있어서 적합한 시약을 함유하는 메탄올/물 용액을 첨가하여 시행할 수 있다. 사용될 시약이 종이 위에서 안정하다면, 이는 또한 프로브를 제작할 때 다공성 재료 위에 첨가할 수 있다.

실연해보이기 위해, 500ng 베타인 알데히드 클로라이드를 함유하는 5㎕ 메탄올을 종이 삼각형 위에 첨가하고 건조되도록 두어, 혈장 중의 콜레스테롤의 분석을 위한 유도체화 시약을 미리적재한 샘플 기판을 제작하였다. 히드록실기와의 반응을 통한 베타인 알데히드 (BA)를 이용한 온라인 전하 표식은 조직 중의 콜레스테롤 확인에 있어서 매우 효과적인 것으로 앞서 증명되었다 (문헌 [Wu et al., Anal Chem. 2009, 81 :7618-7624]). 종이 삼각형을 분석에 사용할 경우, 2㎕ 인간 혈장을 종이 위에 반점으로 찍어 건조된 반점을 형성한 후 종이 분무기 이온화를 이용하여 분석하였다. 메탄올/물 대신에 10㎕ ACN/CHC1₃ (1:1 v:v) 용액을 종이 분무기에 사용하여 베타인 알데히드와 메탄올 사이의 반응을 회피하였다.

블랭크와 시약을 미리적재한 종이 삼각형을 사용한 분석 사이의 비교를 도 30 패널 (a) 및 (b)에 나타내었다. 유도체화 시약이 없는 경우에는, 콜레스테롤-관련 피크, 예컨대 양성자화 이온 [Chol+H]⁺ (m/z 387), 물 손실 [Chol+H-H₂O]⁺ (m/z 369) 및 나트륨 부가 이온 [Chol+Na]⁺ (m/z 409)이 관찰되지 않았다 (패널 (a)). 유도체화 시약이 있는 경우에는, 이온 [Chol+BA]⁺이 m/z 488.6에서 관찰되었다 (패널 (b)). 상기 이온에 대해서 MS/MS 분석을 수행하였고, 특징적 단편 이온 m/z 369가 관찰되었다 (패널 (c)).

실시예 18: 개질된 종이 분무기 기판을 사용한 펩티드 예비-농축

포토레지스트 처리를 이용한 종이 표면 위의 화학물의 예비-농축. 앞서 기재된 바와 같이 SU-8 포토레지스트로 처리하여 크로마토그래피 종이에 소수성을 부여하였다 (문헌 [Martinez et al,. Angew Chem Int. Ed., 2007, 46: 1318-1320]). 그 후, 5㎕ 브래디키닌 2-9 용액 (순수한 H₂O 중 100ppm)을 종이 표면 위에 적용하였다. 용액이 건조되면, 종이를 물 속에 넣고 10초 동안 세척하였다. 세척한 후, 종이 삼각형을 MS 주입구 앞에 고정시키고, 10㎕ 순수한 MeOH를 용매로서 적용하고 종이 분무기에 대한 전압을 4.5kV로 설정하였다. 비교를 위해 동일한 실험을 처리하지 않은 종이 기판을 사용하여 수행하였다.

도 31 패널 (a)는 포토레지스트 처리한 종이로부터의 브래디키닌 2-9의 탠덤 MS 스펙트럼을 나타낸다. 가장 강한 단편 이온 404의 강도는 5.66E3이다. 도 31 패널 (b)는 포토레지스트 처리를 하지 않은 보통의 크로마토그래피 종이로부터의 브래디키닌 2-9의 탠덤 MS 스펙트럼을 나타낸다. 가장 강한 단편 이온 404의 강도는 단지 1.41E1이다. 이러한 데이터는 포토레지스트-처리 크로마토그래피 종이와 펩티드 사이의 결합 친화성이 보통 크로마토그래피 종이와 펩티드 사이의 결합 친화성보다 훨씬 높아서, 물로 세척한 후 종이 표면 위에 더 많은 펩티드가 보유될 수 있다는 것을 나타낸다. 순수한 메탄올을 적용하면, 이러한 보유된 펩티드는 탈착되어 MS에 의해 검출될 것이다. 이러한 방법을 사용하여 종이 표면 위에 소수성 화학물을 예비-농축시킬 수 있고, 다른 친수성 재료 (예, 염)를 또한 종이 표면으로부터 제거할 수 있다.

실시예 19: 반전된 극성

프로브에 적용된 전압의 극성이 질량 분석기에 사용된 것과 합치될 필요는 없다. 특히, 본 발명의 프로브를 네거티브 전위를 사용하여 작동하며 생성된 양으로 하전된 이온의 질량 스펙트럼을 기록하는 것이 가능하다. 네거티브 이온 모드에서, 전자 (또는 용매화 전자)의 큰 전류가 종이 분무기 안에서 생성된다. 이러한 전자는, 만약 적합한 에너지의 전자라면, 적절한 전자 친화성을 갖는 분자에 의해 포획되어 라디칼 음이온을 생성할 수 있을 것이다.

대안적으로, 이러한 전자는 라디칼 양이온이 생성되게 하는 분석대상의 전자 이온화의 원인이 될 수 있거나, 대안적으로 ESI에는 마찬가지로 라디칼 양이온이 생성되게 하는 분석대상과 전하 교환을 할 수 있는 용매 분자가 포함될 수 있다. 만약 이러한 공정이 충분한 에너지로 이루어진다면, 단편화가 이루어질 수 있기 전에 라디칼 양이온이 충돌적으로 탈활성화되지 않는다면 특징적 단편 이온이 생성될 수 있을 것이다.

실험은 탁상용 LTP 상에서 톨루엔 증기를 사용하고, 본 발명의 프로브를 -4.5kV에서 전도시키고 메탄올:물을 용매로서 종이에 적용하여 수행하였다. 도 32에 나타내어진 스펙트럼을 기록하였다. 그러나 한가지 주지할 점은 양성자화 분자 (m/z 93)를 제공하기 위한 이온/분자 반응이 예상한대 대기압에서 나타난다는 것이다. 그러나, 다른 한가지 주지할 점은 라디칼 양이온, m/z 92 및 m/z 91 및 65에서의 그의 특징적 단편의 존재이다.

흥미로운 점은 톨루엔 증기의 공급원을 MS 주입구 가까이에 놓는 경우, 즉, 종이 팁과 MS 주입구 사이의 방전의 캐쏘드 부위에 놓는 경우, "EI" 단편 이온이 가장 쉽게 생성되었다는 점이다. 이는 "폴 (fall)" 부위에서의 에너지가 큰 전자에 의한 직접 전자 이온화가 적어도 부분적으로 상기 거동의 원인이 될 수 있음을 제안한다.

실시예 20: 혈액 분석을 위한 카트리지

도 33 패널 (A)는 질량 스펙트럼 분석에 사용될 다공성 재료 위에 혈액을 반점으로 찍는 예시적 경우를 나타낸다. 카트리지는 중앙에 부피를 갖는 바이알 및 오버플로우를 위한 바이알을 가질 수 있다. 플러그, 예컨대 내부 표준 화학물의 설정된 양을 함유하는 가용성 막을 사용하여 부피 제어를 위한 바이알의 하부를 막는다. 혈액 한 방울을 바이알에 넣는다 (패널 (B)). 바이알 내의 혈액의 부피는 오버플로우 바이알 안으로 여분의 혈액을 흘려보냄으로써 제어한다 (패널 (B)). 후속하여 바이알 내의 혈액이 하부의 막 중에 용해되고, 내부 표준 화학물이 혈액 안으로 혼합된다 (패널 (B)). 플러그가 용해되면, 혈액이 종이 기판으로 흐르고, 결국 제어된 양의 샘플 및 내부 표준물을 갖는 건조된 혈액 반점을 형성한다 (패널 (B)).

Claims (47)

1. 고전압 공급원에 연결되어 있으며 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 하나 이상의 다공성 재료를 포함하는 질량 분광측정 프로브.
2. 제1항에 있어서, 다공성 재료가 종이 또는 PVDF 막인 프로브.
3. 제2항에 있어서, 종이가 여과지인 프로브.
4. 제3항에 있어서, 여과지가 삼각형 절편으로 성형된 프로브.
5. 제1항에 있어서, 다공성 재료가 콘 형태를 갖는 프로브.
6. 제1항에 있어서, 다공성 재료가 겔인 프로브.
7. 제1항에 있어서, 다중 팁을 포함하는 프로브.
8. 제7항에 있어서, 분무를 생성하는 팁의 각도가 프로브의 다른 팁 보다 작은 프로브.
9. 제1항에 있어서, 다공성 재료에 적용되는 용매를 추가로 포함하는 프로브.
10. 제9항에 있어서, 용매가 다공성 재료를 통한 샘플의 운반을 보조하는 프로브.
11. 제9항에 있어서, 용매가 내부 표준물을 함유하는 프로브.
12. 제9항에 있어서, 용매가 상이한 화학적 특성을 갖는 샘플 성분의 차별적인 체류를 가능하게 하는 프로브.
13. 제9항에 있어서, 용매가 염 및 매트릭스 효과를 최소화시키는 프로브.
14. 제9항에 있어서, 용매가 선택된 분석대상의 온라인 화학적 유도체화를 가능하게 하는 프로브.
15. 고전압 공급원에 연결되어 있으며 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 하나 이상의 다공성 재료를 포함하는 프로브; 및
    질량 분석기
    를 포함하는 샘플 재료 분석용 시스템.
16. 제15항에 있어서, 다공성 재료가 종이 또는 PVDF 막인 시스템.
17. 제15항에 있어서, 종이가 여과지인 시스템.
18. 제15항에 있어서, 여과지가 삼각형 절편으로 성형된 시스템.
19. 제15항에 있어서, 다공성 재료가 겔인 시스템.
20. 제15항에 있어서, 다공성 재료에 적용되는 용매를 추가로 포함하는 시스템.
21. 제15항에 있어서, 질량 분석기가 질량 분광계 또는 핸드헬드 질량 분광계를 위한 것인 시스템.
22. 제15항에 있어서, 질량 분석기가 사중극자 이온 트랩, 직선형 이온 트랩, 원통형 이온 트랩, 이온 사이클로트론 공명 트랩, 오르비트랩, 비행 시간, 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 및 섹터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
23. 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 하나 이상의 다공성 재료에 샘플을 접촉시키는 단계;
    다공성 재료에 고전압을 적용하여 다공성 재료로부터 방출되는 샘플 중의 분석대상의 이온을 생성하는 단계; 및
    방출된 이온을 분석하는 단계
    를 포함하는 샘플 분석 방법.
24. 제23항에 있어서, 용매를 다공성 재료에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
25. 제23항에 있어서, 샘플이 액체인 방법.
26. 제23항에 있어서, 샘플이 고체인 방법.
27. 제23항에 있어서, 샘플이 화학 종 또는 생물학 종인 방법.
28. 제23항에 있어서, 다공성 재료가 겔이고 샘플이 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드인 방법.
29. 제24항에 있어서, 용매가 다공성 재료를 통한 샘플의 운반을 보조하는 방법.
30. 제24항에 있어서, 용매가 내부 표준물을 포함하는 방법.
31. 제24항에 있어서, 용매가 상이한 화학적 특성을 갖는 샘플 성분의 차별적인 체류를 가능하게 하는 방법.
32. 제24항에 있어서, 용매가 염 및 매트릭스 효과를 최소화시키는 방법.
33. 제24항에 있어서, 용매가 선택된 분석대상의 온라인 화학적 유도체화를 가능하게 하는 방법.
34. 제23항에 있어서, 다공성 재료가 종이 또는 PVDF 막인 방법.
35. 제23항에 있어서, 분석이 질량 분석기를 제공하여 샘플 중의 분석대상의 질량 스펙트럼을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
36. 제23항에 있어서, 고전압에 의해 생성된 전기장이 다공성 재료를 통한 샘플의 운반을 보조하는 방법.
37. 제24항에 있어서, 용매가 다공성 재료의 표면 상부에 얇은 액체 필름을 형성하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 고전압에 의해 생성된 전기장이 얇은 액체 필름 안에서의 분석대상 운반을 보조하는 방법.
39. 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 하나 이상의 다공성 재료에 고전압을 적용하여 샘플 중의 분석대상의 이온을 생성하는 단계를 포함하는 샘플의 이온화 방법.
40. 제39항에 있어서, 다공성 재료가 종이 또는 PVDF 막인 방법.
41. 하나 이상의 다공성 재료 및 고체 재료를 포함하고 고전압 공급원에 연결되어 있으며 용매의 흐름으로부터 떨어져 있는 통합형 기판
    을 포함하는 질량 분광측정 프로브.
42. 제41항에 있어서, 고체 재료가 뾰족한 코너를 포함하는 프로브.
43. 제41항에 있어서, 하나 이상의 다공성 재료가 복수의 다공성 재료인 프로브.
44. 용매의 흐름으로부터 떨어져 있으며 하나 이상의 다공성 재료 및 고체 팁을 포함하는 통합형 기판에 샘플을 접촉시키는 단계;
    통합형 기판에 고전압을 적용하여 통합형 기판으로부터 방출되는 샘플 중의 분석대상의 이온을 생성하는 단계; 및
    방출된 이온을 분석하는 단계
    를 포함하는 샘플의 분석 방법.
45. 제44항에 있어서, 용매를 다공성 재료에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
46. 제45항에 있어서, 용매가 다공성 재료의 표면 상부에 얇은 액체 필름을 형성하는 방법.
47. 제44항에 있어서, 하나 이상의 다공성 재료가 복수의 다공성 재료인 프로브.

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