CN111505135B - 苯乙酮衍生物应用于不饱和脂质分析的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结合光化学衍生和串联质谱分析对脂质双键位置进行结构解析的方法。脂质脂肪链上的双键在254纳米紫外光激发下会与苯乙酮衍生物2’,4’,6’‑三氟苯乙酮(triFAP)或4’‑三氟甲基苯乙酮(FMAP)发生高效的Paternò‑Büchì(PB)反应，形成一对含四元环结构的异构体产物。在串联质谱中，该对异构体产物能产生一对质荷比固定的诊断离子，从而用于碳碳双键位置的确定。对于同时含有多个碳碳双键位置异构体的脂质，利用诊断离子的强度比例，可以直接得出各异构体的相对含量。该方法可与鸟枪法或液相色谱分离相结合，实现对复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析。

Description

苯乙酮衍生物应用于不饱和脂质分析的方法
技术领域
本发明涉及质谱分析技术领域，具体而言，涉及苯乙酮衍生物应用于不饱和脂质分析的方法，更具体地，涉及利用脂质与苯乙酮衍生物经光反应得到的产物在质谱中特征的破碎行为，来对其精细结构进行高通量的质谱检测分析。
背景技术
脂质是细胞膜的重要结构支架，参与多种细胞信号传递和代谢过程，其中一个重要的亚类，不饱和脂质，特征为至少有一个碳碳双键(C＝C)在烷基链上分布。相关研究表明不饱和脂质的分布在分泌途径涉及的相关细胞器中和一些分化结构如神经轴突中呈现规律性变化；且C＝C异构体比例已证实在乳腺癌细胞和T2D型患者的体液中会存在异常变化，是潜在的疾病生物标志物。因此，不饱和脂质的鉴定具有重要意义，而以一种灵敏和高通量的方式精确定位C＝C的位置则是一个挑战。
质谱是一种常见的分析检测手段，其高灵敏度，高选择性以及高通量的特征使得它在脂质组学的应用上受到越来越多的关注。近几年，随着直接进样的“鸟枪法脂质组学”和基于分离的“液相色谱-质谱方法”的发展，脂质的精确结构解析以及精确结构所引起的生物学作用逐渐成为研究的热点。虽然高分辨率质谱法很容易获得脂质分子的精确分子组成，确定脂质的种类，但串联质谱法仍然是脂质深层结构表征最直观确定的手段。为了解决定位C＝C这一问题，多种质谱(MS)方法和化学衍生化策略被设计和发展，如臭氧诱导离解(OzID)、紫外光解离(UVPD)、间氯氧化苯甲酸(m-CPBA)环氧化反应与碰撞诱导解离(CID)-MS/MS等。但是，受仪器修改和复杂性要求的限制，它们在脂质组学中的应用还不十分广泛。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出不饱和脂质分析方法。该方法可与鸟枪法或液相色谱分离相结合，实现对复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析。
发明人前期开发了一种可与串联质谱联用的C＝C特异性修饰方法(PB-MS/MS)。该方法利用丙酮和C＝C之间的Paternò-Büchì反应(PB反应，PB Rxn)实现快速双键衍生，可与鸟枪和液相色谱脂质组学相兼容，并已成功应用于脂肪酸、甘油磷脂和胆固醇酯的分析。实际上，丙酮作为一种常见的溶剂，与质谱仪相容性好，能实现相对较低的检测限。但是，丙酮PB-MS/MS仍存在一些缺陷，如丙酮的NorrishⅠ型裂解产生的化学干扰；受反应转化率限制，小分子量(58Da)标签导致的复杂样品中反应物和产物的重叠。因此，需要开发新的试剂及衍生化方法，来提高PB-MS/MS的应用性。
鉴于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种不饱和脂质分析方法。根据本发明的实施例，该不饱和脂质分析方法包括：(1)配制含2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮的脂质样品溶液；(2)在紫外光作用下，使脂质样品与2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮发生衍生化反应，得到2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物，或4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物；(3)基于所述2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物或所述4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物进行质谱分析，通过所述质谱分析中产生的诊断离子，判断脂质中碳碳双键的位置。
发明人在研究中发现，2’,4’,6’-三氟苯乙酮(简称TriFAP，分子量174)或4’-三氟甲基苯乙酮(简称FMAP，分子量188)可以在紫外光作用下与脂质发生衍生化反应，在质谱中主要表现为反应后一级质谱图会出现+174Da(TriFAP)或+188Da(FMAP)的新峰，转化率大约在35～40％。对检测到的脂质与苯乙酮衍生物的反应物做串联质谱分析，二级谱图中除了脂质本身的碎片外，主要可以看到诊断离子对(质荷比相差142Da或156Da)、失水峰(-18Da)和试剂的中性丢失峰(-174Da或-188Da)，双键位置的诊断主要依赖于诊断离子对。在紫外光激发下，苯乙酮衍生物会与脂质双键反应产生含氧四元环，在质谱的碰撞诱导解离(CID)作用下，含氧四元环会沿着与合成方向相垂直的方向发生裂解，生成新的烯烃结构和羰基结构，质谱图中即可以观察到头基部分含电荷的碎片离子。由于进攻方向的不同，生成的含氧四元环有两种，针对每个双键也就可以观察到一对碎片离子，这一对碎片离子的质荷比存在固定的差值，从而可以用来对双键的位置进行判断。由此，该方法可以实现复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析，为寻找新的生物标记物提供了方向，为未来临床样品的生物诊断提供了更全面的脂质解析。
另外，根据本发明上述实施例的不饱和脂质分析方法还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述脂质样品为不饱和脂质标准品或含有不饱和脂质的复杂生物样品。
在本发明的一些实施例中，所述紫外光的波长为254nm。
在本发明的一些实施例中，所述衍生化反应进行的时间为2～25s。
在本发明的一些实施例中，所述质谱分析中采用碰撞能量为30～45eV。
在本发明的一些实施例中，所述质谱分析中采用仪器为三重四极杆质谱仪或beam-type CID质谱仪。
在本发明的一些实施例中，所述质谱分析的进样方式为鸟枪法、直接进样法或液相色谱-质谱联用法。
在本发明的一些实施例中，所述不饱和脂质分析方法进一步包括：根据所述诊断离子的总强度比与脂质样品中碳碳双键异构体含量比，建立碳碳双键异构体的相对定量曲线。
在本发明的另一方面，本发明提出了上述实施例的不饱和脂质分析方法在分析牛肝提取物中的用途。如前所述，本发明提出的不饱和脂质分析方法可以实现复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析。发明人将该不饱和脂质分析方法应用于牛肝提取物的分析中，通过该结构解析流程，在牛肝脏极性脂质提取物中鉴定了194个不饱和脂质分子，其中包括41对双键异构体。由此可见，不饱和脂质分析方法实现了复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析，为寻找新的生物标记物提供了方向，为未来临床样品的生物诊断提供了更全面的脂质解析。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明一个实施例的用于PB反应的离线微流光反应器装置示意图；
图2a为PC 16:0/18:1(5μM)和2mMtriFAP反应后的一级质谱图；图2b为PC 16:0/18:1反应产物的CID谱图(碰撞能量在40eV左右)；图2c为PC 16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为一级谱中的m/z 934.6；图2d为PC 16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为二级谱中的碎片离子m/z 918.6(B),m/z 760.6(Y),m/z 792.5(R)和m/z 650.5(G)；图2e-h为色谱图中14.5-19.5min对应的CID谱图；
图3a为PC 16:0/18:1(5μM)和2mM FMAP反应后的一级质谱图；图3b为PC 16:0/18:1反应产物的CID谱图(碰撞能量在40eV左右)；图3c为PC 16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为一级谱中的m/z 948.6；图3d为PC 16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为二级谱中的碎片离子m/z 930.6(-H2O),m/z760.6(-R),m/z 806.5(FO)和m/z 650.5(FA)；
图4a为PC 16:0/18:1与triFAP的光反应产物随CID碰撞能量变化碎片离子的分布，图4b为碰撞能量为30eV时的CID谱图；
图5a为等摩尔混合的PC 18:1(Δ9)/18:1(Δ9)和PC 18:1(Δ6)/18:1(Δ6)在与triFAP反应后产物的CID谱图；图5b为诊断离子总强度和PC异构体摩尔比的校准曲线；
图6a为牛肝脏组织极性脂质提取物与丙酮发生光反应后的一级谱图；图6b为牛肝脏组织极性脂质提取物与triFAP发生光反应后的一级谱图；图6c为对未反应的复杂样品进行PIS 184得到的PC分布信息；图6d为阴离子模式下未反应的PC 36:1的醋酸根离子加和物的CID谱图；图6e为正离子模式下PC 36:1经triFAP PB-MS/MS得到的CID谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种不饱和脂质分析方法。根据本发明的实施例，该不饱和脂质分析方法包括：(1)配制含2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮的脂质样品溶液；(2)在紫外光作用下，使脂质样品与2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮发生衍生化反应，得到2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物，或4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物；(3)基于2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物或4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物进行质谱分析，通过质谱分析中产生的诊断离子，判断脂质中碳碳双键的位置。
根据本发明的一些实施例，上述脂质样品可以为不饱和脂质标准品或含有不饱和脂质的复杂生物样品。
根据本发明的一些实施例，上述紫外光的波长为254nm。
根据本发明的一些实施例，上述衍生化反应进行的时间为2～25s，例如2s、5s、10s、15s、20s、25s等。由此，可以进一步提高脂质与苯乙酮衍生物反应的转化率。
根据本发明的一些实施例，上述质谱分析中采用碰撞能量为30～45eV，例如30eV、35eV、40eV、45eV等。发明人在研究中发现，通过采用上述碰撞能量，可以进一步有利于质谱分析中诊断离子的强度达到峰值，如果碰撞能量过高，衍生化产物会破碎成其他离子，对质谱分析造成不利影响。具体的，图4a为PC 16:0/18:1与triFAP的光反应产物随CID碰撞能量变化碎片离子的分布，图4b为碰撞能量为30eV时的CID谱图。在该质谱条件下，方法的检测限在0.5nM左右，且方法同样适用于与醚键相连的双键的位置判定。
根据本发明的一些实施例，上述质谱分析中采用仪器可以为三重四极杆质谱仪或beam-type CID质谱仪，进样方式可以为鸟枪法、直接进样法或液相色谱-质谱联用法。由此，可以进一步有利于实现对不饱和脂质的高灵敏、高通量的结构解析。在一些实施方案中，可以先经过正模式下的中性丢失扫描(NLS)或前去离子扫描(PIS)确定种类，再对检测到的脂质在负离子模式下做CID，确定其脂肪酸链的分布，最后结合正模式下PB反应产物的碎裂得到碳碳双键的位置。
根据本发明的一些实施例，本发明提出的不饱和脂质分析方法进一步包括：根据诊断离子的总强度比与脂质样品中碳碳双键异构体含量比，建立碳碳双键异构体的相对定量曲线。图5a为等摩尔混合的PC 18:1(Δ9)/18:1(Δ9)和PC 18:1(Δ6)/18:1(Δ6)在与triFAP反应后产物的CID谱图；图5b为诊断离子总强度和PC异构体摩尔比的校准曲线。
下面根据本发明的具体实施例，对该不饱和脂质分析方法进行详细描述。根据本发明的实施例，该不饱和脂质分析方法包括：
步骤(1)，参考图1，将脂质提取物溶解在体积比为1:1的乙腈:20mM醋酸铵水溶液中，溶液中另含2％乙醇和2mMtriFAP(或FMAP)。将配制好的溶液在氮气流下除氧5min左右。再对该溶液进行离线PB反应，反应时间在20s左右。反应后的液体加载到钠喷管或小瓶中。
上述步骤(1)中的离线PB反应在微流反应装置下进行。254nm的低压紫外汞灯与熔融石英毛细管(外径：363μm，内径：100μm)平行放置，距离约0.5cm,照射长度约5cm。熔融石英毛细管作为微流反应器，它通过二通与注射器相连，注射器在注射泵的推动下来对样品的流速进行调节，进而调节反应的时间。
步骤(2)，对未反应的脂质溶液进行分析。如果采用钠喷法，将不锈钢丝插入钠喷管的液体中，钠喷管的尖端与质谱的进样小孔对齐；如果采用液相色谱-质谱联用法，则将存有约30μL溶液的小瓶子放置在进样装置中，进行进一步质谱分析。
上述步骤(2)中所用的液相色谱是ExionLC AC system(Sciex)，液相色谱配备一个除气装置，两个泵，一个自动进样器和一个柱温箱。上述样品中的脂质是通过亲水相互作用柱(HILIC)来进行分离的，色谱柱的型号为：150mm×2.1mm,silica spheres,2.7μm(Sigma-Aldrich)。柱温为30℃。流动相A：10mM醋酸铵水溶液，流动相B：含0.2％乙酸的乙腈溶液。流动相梯度为：0-5min:90％to 85％B；5-15min:85％to 70％B；15-20min:70％to70％B；20-21min:70％to 90％B；22-25min:90％to 90％B。流动相的流速为0.2mL/min，每次的进样量为3μL。
上述步骤(2)中用到的质谱仪是Sciex公司的QTRAP 4500。正离子模式下的中性丢失扫描或前驱离子扫描的质谱参数设定为：气帘气30psi；碰撞气high；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压80eV；碰撞能量45eV。负离子模式下对链信息分析时，碰撞能量改为40eV，其余参数和上述一致。
步骤(3)，对步骤(2)中检测到的不饱和脂质进行PB衍生化后CID分析。在正离子模式下对脂质分子的triFAP(或FMAP)反应产物即相对于质子化的脂质+174Da(或188Da)的分子做CID，根据谱图中相差142Da(或156Da)的离子来确定碳碳双键的位置。
上述步骤(3)中质谱参数设定气帘气30psi；碰撞气high；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压80eV；碰撞能量40eV。
在本发明的另一方面，本发明提出了上述实施例的不饱和脂质分析方法在分析牛肝提取物中的用途。如前所述，本发明提出的不饱和脂质分析方法可以实现复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析。发明人将该不饱和脂质分析方法应用于牛肝提取物的分析中，通过该结构解析流程，在牛肝脏极性脂质提取物中鉴定了194个不饱和脂质分子，其中包括41对双键异构体。由此可见，不饱和脂质分析方法实现了复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析，为寻找新的生物标记物提供了方向，为未来临床样品的生物诊断提供了更全面的脂质解析。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1钠喷法分析磷脂酰胆碱标准品PC 16:0/18:1(9Z)脂肪酸链上C＝C的位置
分析样品的制备：5μM PC 16:0/18:1(9Z)溶解在1:1的乙腈:20mM醋酸铵水溶液中，溶液中另含有2mM的triFAP。
质谱分析：
(1)将分析样品PC 16:0/18:1(9Z)在氮气流下除氧5min左右后加载到离线的微流反应装置中。反应时间控制在20s左右，反应后的液体加载到钠喷管中进行质谱检测。
(2)首先对未反应的溶液进行检测，将不锈钢丝插入分析样品的液体中。
(3)在正离子PIS 184模式下，确定脂质种类为磷脂酰胆碱。质谱参数设定为：气帘气10psi；碰撞气high；电压1800V；温度50℃；喷雾气10psi；辅助加热气100psi；去簇电压80eV；碰撞能量45eV。
(4)在负离子模式下对醋酸根加合物m/z 818做CID，可得到低质量端和脂肪酸链相关的m/z 255和m/z 281的峰，即可判断为PC 16:0_18:1。质谱参数设定为：气帘气10psi；碰撞气high；电压1500V；温度50℃；喷雾气10psi；辅助加热气10psi；去簇电压80eV；碰撞能量35eV。
(5)然后，对反应液进行检测，首先在正离子EMS模式下确定是否形成PB反应产物(m/z 934，如图2a所示)，对m/z 934做CID，CID谱图(图2b)中可观察到一对诊断离子m/z650/792，其中，含醛基结构的离子被命名为FA(m/z 650)，含烯烃结构的离子被命名为FO(m/z 792)，即对应于双键的位置，得PC 16:0_18:1(Δ9)。另外，图2c为PC 16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为一级谱中的m/z 934.6；图2d为PC16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为二级谱中的碎片离子m/z918.6(-H2O),m/z 760.6(-R),m/z 792.5(FO)和m/z 650.5(FA)；图2e-h为色谱图中14.5-19.5min对应的CID谱图。质谱参数设定为：气帘气10psi；碰撞气high；电压1800V；温度50℃；喷雾气10psi；辅助加热气10psi；去簇电压80eV；碰撞能量40eV。
实施例2
参照与实施例1相似的方法对PC 16:0/18:1进行质谱分析，区别在于，苯乙酮衍生物采用FMAP。图3a为PC 16:0/18:1(5μM)和2mM FMAP反应后的一级质谱图；图3b为PC 16:0/18:1反应产物的CID谱图(碰撞能量在40eV左右)；图3c为PC 16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为一级谱中的m/z 948.6；图3d为PC 16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为二级谱中的碎片离子m/z 930.6(-H2O),m/z760.6(-R),m/z 806.5(FO)和m/z 650.5(FA)。
实施例3液相色谱-质谱分析牛肝脏脂质提取物中脂质分子的C＝C位置
分析样品的制备：50ppm的牛肝脏脂质提取物溶于甲醇中
质谱分析：
(1)正离子模式下中性丢失扫描141Da，185Da,172Da和260Da分别得到磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酯酰丝氨酸(PS)，磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)的分布信息，前驱离子扫描m/z 184得到PC的分布信息(如图6c)。质谱参数设定为：气帘气30psi；碰撞气high；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压80eV；碰撞能量45eV。液相色谱条件为流动相A：10mM醋酸铵水溶液，流动相B：含0.2％乙酸的乙腈溶液。流动相梯度为：0-5min:90％to 85％B；5-15min:85％to 70％B；15-20min:70％to 70％B；20-21min:70％to 90％B；22-25min:90％to 90％B。流动相的流速为0.2mL/min，每次的进样量为3μL。
(2)在阴离子模式下，对检测到的脂质分子的减氢峰或者醋酸根加合物做CID，质谱参数中碰撞能量改为40eV，其余参数和上述一致。收集CID谱图中低质量端和脂肪酸链相关的离子信息(图6d)。
(3)对检测到的不饱和脂质进行离线PB-LC-MS/MS分析。在正离子模式下对不饱和脂质分子的triFAP(或FMAP)加合产物做CID，根据谱图中m/z 400–m/z 900之间的相差142Da(或156Da)的离子来确定碳碳双键的位置(图6e)。质谱参数设定为：气帘气30psi；碰撞气high；电压4500V；温度400℃；喷雾气30psi；辅助加热气30psi；去簇电压80eV；碰撞能量40eV。另外，以丙酮作为不饱和脂质衍生化反应物，所得一级谱图如图6a，以triFAP作为不饱和脂质衍生化反应物，所得一级谱图如图6b。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种不饱和脂质分析方法，其特征在于，包括：
（1）配制含2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮的脂质样品溶液；
（2）在紫外光作用下，使脂质样品与2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮发生衍生化反应，得到2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物，或4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物；
（3）基于所述2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物或所述4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物进行质谱分析，通过所述质谱分析中产生的诊断离子，判断脂质中碳碳双键的位置。
2.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述脂质样品为不饱和脂质标准品或含有不饱和脂质的复杂生物样品。
3.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述紫外光的波长为254nm。
4.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述衍生化反应进行的时间为2~25 s。
5.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述质谱分析中采用碰撞能量为35~45 eV。
6.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述质谱分析中采用仪器为三重四极杆质谱仪或beam-type CID质谱仪。
7.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述质谱分析方法为直接进样质谱分析法或液相色谱-质谱联用法。
8.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，进一步包括：
根据所述诊断离子的总强度比与脂质样品中碳碳双键异构体含量比，建立碳碳双键异构体的相对定量曲线。
9.权利要求1~8中任一项所述的不饱和脂质分析方法在分析牛肝提取物中的用途。
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