CN107099618A

CN107099618A - 一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的lamp引物组合物及其相关应用

Info

Publication number: CN107099618A
Application number: CN201710305262.2A
Authority: CN
Inventors: 方雪恩; 王丽娟; 成引来; 黄皓; 孔继烈
Original assignee: Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Current assignee: Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2017-08-29

Abstract

本发明公开了一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物及其相关应用，提供了一种高灵敏度的、高准确性的用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物，同时将LAMP法的微流控芯片技术应用于性传播泌尿生殖道致病微生物的检测，利用微流控芯片高通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高性传播泌尿生殖道致病微生物的检测速度、通量和灵敏度，大大降低成本，缩短检测时间。

Description

一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物及其相关应用

技术领域

本发明涉及病原体检测和诊断技术领域，尤其涉及一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物及其相关应用。

背景技术

性传播感染(Sexually Transmitted Infections,STI)是世界上最常见的公共卫生问题之一。世界卫生组织目前估计全世界每年新发STI病例2.5亿。在我国，以性传播泌尿生殖道感染(Sexually Transmitted Urogenital infections,STUI)为主要表现的STI逐年增加。随着艾滋病全球性的传播蔓延，目前HIV感染在中国呈现快速增长的趋势。非常值得注意的是，STI可以促进HIV/AIDS的异性间传播。STUI的防治是预防和控制HIV/AIDS的重要环节，已引起人们的高度重视。尤其非淋菌性尿道炎(Nongonococcal Urethritis,NGU),由于病原菌种类多，可单独或混合感染(包括其它STI)，潜伏期长，临床表现差异较大，可引起合并症，治疗效果比淋病差，所以流行甚广，发病率逐年升高。近年来各种报道显示，淋菌性尿道炎发病率下降，而NGU发病率却不断上升，在西方国家和国内部分地区NGU已超过淋病，居STI的首位。80年代美国每年新发生的NGU病例达300-1000万人，其中1.1万名妇女因本病导致不孕而要治疗。

研究已证实淋球菌、解脲脲原体、沙眼衣原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒II(HSV-2)、白念珠菌以及阴道毛滴虫为引起STUI的最常见病原体。其中淋球菌引起淋病，40％-50％的NGU由沙眼衣原体引起，30％的NGU由解脲脲原体为主的支原体所引起，10％-20％的NGU由其它病原体所引起，如白念珠菌、阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒II等。

传统的病因学实验室诊断方法大多耗时长、敏感性低及操作技术要求高。淋球菌实验室检查包括涂片检查、培养检查、抗原检测和基因诊断等。(1)涂片检查：对有大量脓性分泌物的单纯淋球菌性前尿道炎患者，此法阳性率在90％左右，可以初步判断。女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，阳性率仅为50-60％，且有假阳性。(2)培养检查：淋病双球菌培养是目前诊断淋病的金标准，培养阳性率男性80-95％，女性80-90％。(3)抗原检测：敏感性不高，特异性差，受实验人员判断水平的影响较大。(4)基因诊断：包括基因探针诊断和基因扩增检测。探针技术检测淋球菌，虽然比培养方法在灵敏度、特异性和方便上有了很大提高，但仍有一定的局限性。PCR技术的反应出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性。

沙眼衣原体感染常用的实验室诊断方法包括标本涂片染色直接镜检、沙眼衣原体细胞培养、沙眼衣原体抗原检测、血清学试验和PCR技术。(1)标本涂片染色直接镜检可用于新生儿眼结膜刮片的检查，但它不适宜用于泌尿生殖道沙眼衣原体感染的诊断。(2)细胞培养法是目前检测沙眼衣原体感染最为敏感和特异的方法。但是该方法操作繁琐、费时，设备昂贵，技术性强，且不易进行血清学分型，临床不易推广。(3)抗原检测试验诊断沙眼衣原体的敏感性仅为70-90％，特异性为83-99％，缺点是在低感染率的人群中敏感性差，受实验人员的主观影响大。(4)血清学试验对于诊断无并发症的泌尿生殖道感染价值不大。(5)PCR技术具有很高的敏感性，若引物筛选得当，反应条件适合，操作中严防污染，特异性较好，已被广泛应用于对多种致病微生物的鉴定和检测。支原体感染的实验室检查包括支原体培养、支原体血清学检测和基因诊断等。用细胞培养的方法分离支原体是较特异性的方法，但该方法复杂、花费高、时间长，阻碍了它在临床的推广应用。基因诊断目前只要应用DNA探针及PCR技术。前者敏感性较差，后者具有高度的敏感性和特异性，又有快速和简便等优点。白念珠菌的实验室检查包括直接镜检、染色检查和分离培养。染色检查的阳性率比直接镜检法高。念珠菌培养敏感性和特异性均高，缺点是费时较长。诊断单纯疱疹病毒2型感染，有各种不同的实验室方法。实验室诊断的金标准仍是单纯疱疹病毒2型分离培养法，通过抗体中和实验、DNA杂交实验、酶免疫试验等发发对培养结果作鉴定。这种传统的病原学检测方法敏感性欠佳，费时费力且设备和技术条件要求高。细胞学检查敏感性为40-60％，而且特异性差。酶免疫试验法可直接快速检测单纯疱疹病毒，但敏感性和特异性亦相对较低。目前多种血清学试验用于检查单纯疱疹病毒抗体，但在感染早期检测敏感性低，对临床诊断意义不大，常用于流行病学调查。检查阴道毛滴虫最简单的方法是悬滴法，阳性率可达80-90％。阴道毛滴虫由于费时、操作复杂临床不常用，且临床一般不采用免疫学方法检查。近年来，许多学者将PCR应用于阴道毛滴虫病的检测，并认为该方法诊断滴虫感染敏感而特异。

随着分子生物学技术的发展为性传播泌尿生殖道感染的早期诊断创造了条件，目前应用于临床诊断的主要是PCR技术。包括以PCR为基础衍生出的多种技术：包括反转录PCR(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、RAPD技术、实时荧光定量PCR等。然而，上述检测方法存在检测周期长、检测体系和操作过程比较复杂，难以实行现场检测等问题，且需要专业人员操作。另外，PCR仪价格昂贵，扩增时间较长。因此，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的检测方法。

环介导等温基因扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速、灵敏、特异性强等优点。另外，微流控芯片作为一种病原体分子检测技术具有高通量、快速、准确、可靠的特点，能够实现对组群样品、多目标同时检测，极大的提高了检测效率，且目前尚未有将LAMP法应用于快速检测性传播泌尿生殖道致病微生物的微流控芯片和试剂盒。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物及其相关应用，具体地，本发明的技术方案包括：

第一方面，本发明提供了一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物，包括沙眼衣原体引物组、淋球菌引物组、解脲脲原体引物组、人型支原体引物组、生殖支原体引物组、单纯疱疹病毒2型引物组、白念珠菌引物组、阴道毛滴虫引物组中的任意一组或几组，其中：

所述沙眼衣原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.5所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.6所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.7所示，反向内引物BIP序列如SEQID NO.8所示；

所述淋球菌引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.9所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.10所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.11所示，反向内引物BIP序列如SEQID NO.12所示；

所述解脲脲原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.13所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.14所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.15所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.16所示；

所述人型支原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.17所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.18所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.19所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.20所示；

所述生殖支原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.21所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.22所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.23所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.24所示；

所述单纯疱疹病毒2型引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.25所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.26所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.27所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.28所示；

所述白念珠菌引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.29所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.30所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.31所示，反向内引物BIP序列如SEQID NO.32所示；

所述阴道毛滴虫引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.33所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.34所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.35所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.36所示。

进一步地，本发明的LAMP引物组合物，还包括内参引物组，所述内参引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本发明还提供上述的LAMP引物组合物在制备检测泌尿生殖道致病微生物的试剂或试剂盒的相关应用。

第三个方面，本发明还提供一种检测泌尿生殖道致病微生物的芯片，所述芯片固定有上述的LAMP引物组合物，优选地，所述芯片为恒温扩增微流控芯片。

第四个方面，本发明还提供一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的试剂盒，，所述试剂盒包括上述的LAMP引物组合物；进一步地，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、显色染料；优选地，所述显色染料选自HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝任意一种或几种；更进一步地，所述试剂盒还包括UDG酶和/或dUTP。

本发明最后一方面还包括一种非诊断和治疗目的的检测泌尿生殖道致病微生物的方法，包括步骤：

提取待测样本的核酸，用上述的LAMP引物组合物进行环介导等温扩增，检测扩增产物，确定待测样本是否含有相应引物组对应的泌尿生殖道致病微生物。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明将特异核酸序列与微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫检测微流控芯片及其检测方法。本发明提供的8个引物组能特异性地检测上述8个致病微生物，而且与其他病原微生物无交叉反应，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌。同时，本发明提供的8个引物组对沙眼衣原体DNA、淋球菌DNA、解脲脲原体DNA、人型支原体DNA、生殖支原体DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、白念珠菌DNA、阴道毛滴虫DNA的最低检测限均为5×10²拷贝/μl。

本发明提供的检测性传播泌尿生殖道相关致病微生物的试剂盒，可快速、准确地检测沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、II型单纯疱疹病毒、白念珠菌、阴道毛滴虫，以弥补针对上述致病微生物检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。本发明还可以肉眼可视化判定检测结果，摆脱昂贵的PCR检测仪器，使本发明在科学研究和生产实践中快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作。本发明的检测试剂盒还加入了防污染体系，能有效的防止扩增产物的污染。对于临床而言，能够在1h内获得8种致病微生物指标的检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的检测也可以用于地域性的流行病学调研和疫情监控，以研究性传播泌尿生殖道感染在中国的流行情况。

附图说明

图1为实施例中应用的圆盘式微流控芯片及引物点样池示意图，图中标号非附图标记，而为1-32#反应池；

图2为实施例二中8种性传播泌尿生殖道感染圆盘式微流控芯片检测结果图。其中，1为沙眼衣原体临床样本在1#反应池的检测结果；2为淋球菌临床样本在2#反应池的检测结果；3为解脲脲原体临床样本在3#反应池的检测结果；4为人型支原体临床样本在4#反应池的检测结果；5为内参HBB在5#反应池的检测结果；6-8为阴性对照在6-8#反应池的检测结果；9为生殖衣原体临床样本在9#反应池的检测结果；10为单纯疱疹病毒2型临床样本在10#反应池的检测结果；11为白念珠菌临床样本在11#反应池的检测结果；12为阴道毛滴虫临床样本在12#反应池的检测结果；13为内参HBB在13#反应池的检测结果；14-16为阴性对照在14-16#反应池的肉眼可视化检测结果；17为沙眼衣原体临床样本在17#反应池的检测结果；18为淋球菌临床样本在18#反应池的检测结果；19为解脲脲原体临床样本在19#反应池的检测结果；20为人型支原体临床样本在20#反应池的检测结果；21为内参HBB在21#反应池的检测结果；22-24为阴性对照在22-24#反应池的检测结果；25为生殖衣原体临床样本在25#反应池的检测结果；26为单纯疱疹病毒2型临床样本在26#反应池的检测结果；27为白念珠菌临床样本在27#反应池的检测结果；28为阴道毛滴虫临床样本在28#反应池的检测结果；29为内参HBB在29#反应池的检测结果；30-32为阴性对照在30-32#反应池的肉眼可视化检测结果；

图3为实施例三中以淋病病人的生殖道分泌物样本中粗提核酸作为模板，在以分别固定8种性传播泌尿生殖道感染病原微生物的环介导等温扩增引物的反应池1-4、9-12、17-20以及25-27，内参引物的反应池5、13、21以及29和无固定引物的反应池6-8、14-16、22-24以及30-32进行恒温扩增反应得到肉眼可视化检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物的设计和制备

核糖体DNA序列存在于所有的生物体内，在进化过程中具有相同的起源与功能，可以反映物种间具有可比性的进化史。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。rDNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)是真核细胞rDNA中18S和28S rDNA基因拷贝区之间的一段区域，其中5.8S rDNA位于ITS1、ITS2之间。5.8S rDNA的核苷酸序列保守性很强，而ITS1和ITS2进化较快，但种间同源性非常小，而种内同源性很高，可用于种间的鉴定。单纯疱疹病毒两种型别的基因结构相似，序列同源性达到40％，因此要特异地检测单纯疱疹病毒2型，则需选择一段单纯疱疹病毒2型特异性基因作为靶基因。单纯疱疹病毒的gG基因位于US4基因区，分析单纯疱疹病毒两种型别US4DNA序列表明，它们之间有较大差别，是迄今所知单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型差异最大的区段，因此选择gG基因区作为靶基因。

1.1序列获得：

(1)16S rRNA基因序列的获得：从GeneBank公共数据库分别下载沙眼衣原体16SrRNA基因序列(如SEQ ID NO.38所示)、淋球菌16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.39所示)、解脲脲原体16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.40所示)、人型支原体16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.41所示)、生殖支原体的16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.42所示)。

(2)5.8S rDNA基因序列的获得：从GeneBank公共数据库分别下载白念珠菌的5.8SrDNA基因序列(如SEQ ID NO.44所示)、阴道毛滴虫的5.8S rDNA基因序列(如SEQ ID NO.45所示)。

(3)单纯疱疹病毒2型基因gG基因序列的获得：从GeneBank公共数据库下载HSV-II基因gG的基因序列(如SEQ ID NO.43所示)。

(4)内参HBB基因序列的获得：从GeneBank公共数据库分别下载HBB基因序列(如SEQ ID NO.37所示)。

1.2引物设计

(1)特异性基因引物：将上述从GeneBank公共数据库下载得到的特异基因序列用序列对比软件DNAMAN比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件中，选取F1c和B1c的Tm值相近、F3/B3/F2/B2的Tm值相近，且F1c和B1c的Tm值比F3/B3/F2/B2的Tm值大5℃，5’dG和3’dG的绝对值小于4的DNA序列作为候选引物。

(2)内参HBB引物：将上述从GeneBank公共数据库下载得到的特异基因序列用序列对比软件DNAMAN比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入软件中，选取F1c和B1c的Tm值相近、F3/B3/F2/B2的Tm值相近，且F1c和B1c的Tm值比F3/B3/F2/B2的Tm值大5℃，5’dG和3’dG的绝对值小于4的DNA序列作为候选引物。

(3)引物合成：将下表1中的引物序列委托英潍捷基公司合成，备用。

(4)引物筛选：将合成好的引物溶解并适量稀释后进行引物筛选，最终得到用于制备本发明微流控芯片所需要的特异、灵敏的引物，将筛选好的引物连同反应液一起冷冻干燥在微流控芯片的反应池中。

在本发明的一优选实施例中，筛选好的36条引物如表1所示。其中，编号NO.1-4(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4)的引物序列选自HBB基因的mRNA序列，作为内参用。编号NO.5-8(SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:8)的引物选自沙眼衣原体的16S rRNA基因序列，编号NO.9-12(SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12)的引物选自淋球菌的16S rRNA基因序列，编号NO.13-16(SEQID NO:13-SEQ ID NO:16)的引物选自解脲脲原体的16S rRNA基因序列，编号NO.17-20(SEQID NO:17-SEQ ID NO:20)的引物选自人型支原体的16S rRNA基因序列，编号NO.21-24(SEQID NO:21-SEQ ID NO:24)的引物选自生殖支原体的16S rRNA基因序列，编号NO.25-28(SEQID NO:25-SEQ ID NO:28)的引物选自单纯疱疹病毒2型的gG基因序列，编号NO.29-30(SEQID NO:29-SEQ ID NO:30)的引物选自白念珠菌的5.8S rDNA基因序列，编号NO.31-36(SEQID NO:31-SEQ ID NO:36)的引物选自阴道毛滴虫的5.8S rDNA基因序列，编号

37的引物为阴性对照。

表1：引物组合物中的引物序列

实施例二用于检测泌尿生殖道治病微生物的试剂盒的制备及其使用

本实施例中的沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫、人巨细胞病毒、梅毒、普通变形杆菌、乳酸杆菌、阴道加德纳菌、肠球菌的临床样本以及淋病病人的生殖道分泌物拭子来源于上海市东方医院。

2.1用于检测泌尿生殖道治病微生物的试剂盒的制备

本发明所提供的用于检测泌尿生殖道治病微生物的试剂盒组成如下：

2.1.1恒温扩增缓冲液

恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：12mM dNTPs、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液、150μM HNB。

2.1.2恒温扩增酶溶液

恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：Bst酶1U/μl，UDG酶0.2U/μl。

2.1.3装载有引物对的32反应池圆盘式微流控芯片

所述32反应池圆盘式微流控芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为4X8，示意图如图1所示。

所述4X8反应池圆盘式微流控芯片的1#至32#反应池分别存放上述实施例1的引物对。其中，所述引物对1用于扩增人基因组中管家基因HBB mRNA，由序列表中序列1-4所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池5、反应池13、反应池21以及反应池29；所述引物对2用于扩增沙眼衣原体，由序列表中序列5-8所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池1和反应池17；所述引物对3用于扩增淋球菌，由序列表中序列9-12所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池2和反应池18；所述引物对4用于扩增解脲脲原体，由序列表中序列13-16所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池3和反应池19；所述引物对5用于扩增人型支原体，由序列表中序列17-20所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池4和反应池20；所述引物对6用于扩增生殖支原体，由序列表中序列21-24所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池9和反应池25；所述引物对7用于扩增单纯疱疹病毒2型，由序列表中序列25-28所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池10和反应池26；所述引物对8用于扩增白念珠菌，由序列表中序列29-32所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池11和反应池27；所述引物对9用于扩增阴道毛滴虫，由序列表中序列33-36所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池12和反应池28；所述阴性对照的反应池为6-8、反应池14-16、反应池22-24以及反应池30-32，不包埋任何引物。其中，将引物包埋入圆盘式微流控芯片的方法为：将引物与琼脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物和所述琼脂糖在所述混合液中的终浓度分别为0.2μM和0.1％(质量百分比)；取0.5μl所述混合液点入相应的圆盘式微流控芯片反应池，于洁净超净台内晾干后，冲压抽真空干燥2小时，备用。

2.2用于检测性传播泌尿生殖道治病微生物的试剂盒的使用方法

2.2.1提取基因组

用核酸(DNA)提取试剂盒(玻璃珠法)提取沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫DNA，操作步骤如下：

核酸提取纯化准备

a.加入1ml生理盐水(保证生理盐水能没过无菌拭子取样部位)，将标本管用强力振荡器(如Vortex-Genie)高速振荡2min制成标本悬浮液。

b.取出全部悬浮液放入1.5ml离心管中，12000rpm离心2min后弃上清。

核酸提取纯化步骤

a.向上述1.5ml离心管中加入0.2ml核酸提取液(使用前一定要振荡混匀)以及1管提取固形物(尽量将固形物倒净)，用强力振荡器高速涡旋振荡5min。

b.瞬时离心后100℃干浴5min，然后12000rpm离心2min，上清液用于恒温荧光扩增。

2.2.2反应体系配制

取288μl恒温扩增缓冲液(见2.1.1)、16μl恒温扩增酶溶液(见2.1.2)、上述每种病原体12μl DNA组成的96μl DNA混合体系1混合成400μl反应溶液，旋涡震荡均匀后取80μl反应溶液注入4个1X8加样孔中(2.1.3)，贴封口膜后迅速离心1200rpm/min 15s，3200rpm/min30s。

2.2.3恒温扩增反应与检测

将圆盘式微流控芯片置于干燥箱中，设置37℃反应5min，61℃反应1h。

2.2.4结果判断

结果见图2，固定有沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫、内参的引物组的反应池1和17、反应池2和18、反应池3和19、反应池4和20、反应池9和25、反应池10和26、反应池11和27、反应池12和28、反应池5、13、21和29所对应的颜色为天蓝色，不固定引物的反应池6-8、反应池14-16、反应池22-24以及反应池30-32所对应的颜色为紫罗兰色。说明混合物DNA含有沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫DNA。

结果表明，本发明的检测性传播泌尿生殖道感染相关病原菌的环介导等温扩增的成套引物和试剂可准确的检测沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌和阴道毛滴虫。

实施例三利用恒温扩增微流控芯片检测人的生殖道分泌物拭子样本

3.1采用实施例二中2.1.3的方法，将实施例1中用于检测沙眼衣原体的引物组、用于检测淋球菌的引物组、用于检测解脲脲原体的引物组、用于检测人型支原体的引物组、用于检测生殖支原体的引物组、用于检测单纯疱疹病毒2型的引物组、用于检测白念珠菌的引物组、用于检测阴道毛滴虫的引物组、监控整个反应的内参的引物组中的各个引物分别固定在恒温扩增微流控芯片的反应池1和17、反应池2和18、反应池3和19、反应池4和20、反应池9和25、反应池10和26、反应池11和27、反应池12和28、反应池5、13、21和29；不固定引物的反应池6-8、反应池14-16、反应池22-24以及反应池30-32，作为阴性对照。

3.2将用核酸(DNA)提取试剂(玻璃珠法)(上海速创诊断产品有限公司产品)提取淋病患者的生殖道分泌物样本中的核酸与恒温扩增体系混匀，然后进样至3.1的恒温扩增微流控芯片中，按照37℃5min，61℃1h进行恒温扩增反应。

结果见附图3，固定有淋球菌和内参的引物组的反应池2、反应池5、反应池13、反应池18、反应池21、反应池29所对应的反应池的颜色为天蓝色，固定沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫引物的引物组的反应池1、反应池3、反应池4、反应池9、反应池10、反应池11、反应池12、反应池17、反应池19、反应池20、反应池25、反应池26、反应池27、反应池28所对应的反应池的颜色为紫罗兰色；不固定引物的反应池6-8、反应池14-16、反应池22-24、反应池30-32所对应的反应池的颜色也为紫罗兰色。说明该人的临床生殖道分泌物样本中含有淋球菌，进一步说明该淋病患者的生殖道感染淋球菌。

实施例四：检测恒温扩增微流控芯片的特异性

利用实施例二中2.1制备的恒温扩增微流控芯片进行特异性实验

4.1用核酸(DNA)提取试剂盒(玻璃珠法)(上海速创诊断产品有限公司)提取普通变形杆菌DNA，操作步骤按DNA提取试剂盒自带说明书进行，得到普通变形杆菌DNA。

按照上述方法，将普通变形杆菌分别替换成人巨细胞病毒、梅毒、乳酸杆菌、阴道加德纳菌、肠球菌，其它步骤均不变，分别得到人巨细胞病毒DNA、梅毒DNA、乳酸杆菌DNA、阴道加德纳菌DNA和肠球菌DNA。

4.2将普通变形杆菌DNA、人巨细胞病毒DNA、梅毒DNA、乳酸杆菌DNA、阴道加德纳菌DNA、肠球菌DNA、沙眼衣原体DNA、淋球菌DNA、解脲脲原体DNA、人型支原体DNA、生殖支原体DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、白念珠菌DNA、阴道毛滴虫DNA与扩增体系混匀，然后进样至步骤2.1.3的恒温扩增微流控芯片中，按照37℃5min，61℃1h进行恒温扩增反应。

反应池中所对应的颜色为天蓝色，即为阳性；反应池中所对应的颜色问紫罗兰色，即为阴性。检测结果见下表2。

表2.LAMP特异性检测

结果表明本发明能特异性地检测沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫，而与其他病原微生物无交叉反应，如普通变形杆菌、人巨细胞病毒、梅毒、乳酸杆菌、阴道加德纳菌、肠球菌。

实施例五：检测恒温扩增微流控芯片的灵敏度

利用实施例二中2.1制备的恒温扩增微流控芯片进行灵敏度实验

将实施例二中2.2.2制备的沙眼衣原体DNA、淋球菌DNA、解脲脲原体DNA、人型支原体DNA、生殖支原体DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、白念珠菌DNA、阴道毛滴虫DNA分别稀释后混合得到混合体系2。混合体系2中沙眼衣原体DNA、淋球菌DNA、解脲脲原体DNA、人型支原体DNA、生殖支原体DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、白念珠菌DNA、阴道毛滴虫DNA的浓度均为5×102拷贝/μl，将得到的混合体系2中的DNA命名为混合DNA2。

将混合DNA2与恒温扩增体系混匀，然后进样至步骤3.1的恒温扩增微流控芯片中，按照37℃5min，61℃1h进行恒温扩增反应。

检测结果显示，固定有检测沙眼衣原体、检测淋球菌、检测解脲脲原体、检测人型支原体、检测生殖支原体、检测单纯疱疹病毒2型、检测白念珠菌、检测阴道毛滴虫、检测内参的引物组对应的反应池的颜色为天蓝色，不固定引物的反应池所对应的颜色为紫罗兰色。可见，本发明对沙眼衣原体DNA、淋球菌DNA、解脲脲原体DNA、人型支原体DNA、生殖支原体DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、白念珠菌DNA和阴道毛滴虫DNA的最低检测限均为5x10²拷贝/μl。

通过上述实施例能够知晓，本发明不但提供了一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物，还将特异核酸序列与微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫检测微流控芯片及其检测方法。本发明提供的8个引物组能特异性地检测上述8个致病菌，而且与其他病原微生物无交叉反应，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌。同时，本发明提供的8个引物组对沙眼衣原体DNA、淋球菌DNA、解脲脲原体DNA、人型支原体DNA、生殖支原体DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、白念珠菌DNA、阴道毛滴虫DNA的最低检测限均为5×10²拷贝/μl。

本发明提供的检测性传播泌尿生殖道相关致病菌的试剂盒，可快速、准确地检测沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、II型单纯疱疹病毒、白念珠菌、阴道毛滴虫，以弥补针对上述致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。本发明还可以肉眼可视化判定检测结果，摆脱昂贵的PCR检测仪器，使本发明在科学研究和生产实践中快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作。本发明的检测试剂盒还加入了防污染体系，能有效的防止扩增产物的污染。对于临床而言，能够在1h内获得8种致病菌指标的检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的检测也可以用于地域性的流行病学调研和疫情监控，以研究性传播泌尿生殖道感染在中国的流行情况。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海速创诊断产品有限公司

<120> 一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物及其相关应用

<130> IPI171085

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 1

ccagctacca ttctgctt 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 2

ttagtgatac ttgtgggcc 19

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 3

tgggaggaag ataagaggta tgaacggata aggctggatt attctgag 48

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 4

gcccatcact ttggcaaaga ccaccacttt ctgataggc 39

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 5

gattggccgc caacactg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 6

ccggtgcttc tttacctgg 19

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 7

gtcagacttc cgtccattgc gagactgaga cactgcccag a 41

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 8

gacgccgcgt gtgtgatgaa cagcgggtat taaccgtctt 40

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 9

acgatcagta gcgggtct 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 10

tcttcaggta ccgtcatcgg 20

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 11

ctgctgcctc ccgtaggagt gagaggatga tccgccaca 39

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 12

caagcctgat ccagccatgc cggccttttc ttccctgaca a 41

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 13

cgaaagatta gctaataccg aat 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 14

tgaaaaattc cctactgctg 20

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 15

ctgatacgtc gcaccctcat cgcatgagaa gatgtagaaa gtc 43

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 16

caagtcaatg acgcgtagct cctcccgtag gagtatgg 38

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 17

aagcggtgaa atgcgtaga 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 18

gggtccccgt caattcct 18

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 19

gctttcgtcc ctcagcgtca gggaagaaca ccaaaggcga 40

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 20

gtcggtggag aatcactgac gcgcgagcat actactcagg c 41

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 21

gacctgcaag ggttcgttat 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 22

accttcatcg ttcacgcg 18

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 23

cacgtcattg ccttggtagg ccttgatgag ggtgcgccat a 41

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 24

atgggactga gacacggccc gctccatcaa gctttcgct 39

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 25

acccgactca cctcaaagg 19

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 26

gcacgctagg gtgtgtg 17

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 27

acgaagaggg tgtccagggc ccttggttcc gacgcct 37

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 28

cgtcagcacc gtcatccaca gtctggacca accgccac 38

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 29

atcgatgaag aacgcagc 18

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 30

gatcccgcct taccacta 18

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 31

gacgctcaaa caggcatggc agatattcgt gaatcatc 38

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 32

ttctccctca aaccgctgct ttcaagcaaa cccaag 36

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 33

ttggtactgt ggataggggt 20

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 34

tgcgctgagt cattcatgt 19

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 35

gctggaatta ccgcagctgc tttccaccgt accgaaacct 40

<210> 36

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 36

ccgtagtctg aattggccag cagccatact ctaagcgtcc tg 42

<210> 37

<211> 239

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参HBB基因核酸序列

<400> 37

ccagctacca ttctgctttt attttatggt tgggataagg ctggattatt ctgagtccaa 60

gctaggccct tttgctaatc atgttcatac ctcttatctt cctcccacag ctcctgggca 120

acgtgctggt ctgtgtgctg gcccatcact ttggcaaaga attcacccca ccagtgcagg 180

ctgcctatca gaaagtggtg gctggtgtgg ctaatgccct ggcccacaag tatcactaa 239

<210> 38

<211> 206

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 沙眼衣原体16S rRNA基因序列

<400> 38

gattggccgc caacactggg actgagacac tgcccagact cctacgggag gctgcagtcg 60

agaatctttc gcaatggacg gaagtctgac gaagcgacgc cgcgtgtgtg atgaaggctc 120

tagggttgta aagcactttc gcttgggaat aagagaagac ggttaatacc cgctggattt 180

gagcgtacca ggtaaagaag caccgg 206

<210> 39

<211> 217

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 淋球菌16S rRNA基因序列

<400> 39

acgatcagta gcgggtctga gaggatgatc cgccacactg ggactgagac acggcccaga 60

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg cgcaagcctg atccagccat 120

gccgcgtgtc tgaagaaggc cttcgggttg taaaggactt ttgtcaggga agaaaaggcc 180

gttgccaata tcggcggccg atgacggtac ctgaaga 217

<210> 40

<211> 227

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 解脲脲原体16S rRNA基因序列

<400> 40

cgaaagatta gctaataccg aataataaca tcaatatcgc atgagaagat gtagaaagtc 60

gctctttgtg gcgacgcttt tggatgaggg tgcgacgtat cagatagttg gtgaggtaat 120

ggctcaccaa gtcaatgacg cgtagctgta ctgagaggta gaacagccac aatgggactg 180

agacacggcc catactccta cgggaggcag cagtagggaa tttttca 227

<210> 41

<211> 238

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人型支原体16S rRNA基因序列

<400> 41

aagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccaaagg cgaaggcagc ttactgggtc 60

tatactgacg ctgagggacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 120

cacgccgtaa acgatgatca ttagtcggtg gagaatcact gacgcagcta acgcattaaa 180

tgatccgcct gagtagtatg ctcgcaagag tgaaacttaa aggaattgac ggggaccc 238

<210> 42

<211> 214

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 生殖支原体的16S rRNA基因序列

<400> 42

gacctgcaag ggttcgttat ttgatgaggg tgcgccatat cagctagttg gtagggtaat 60

ggcctaccaa ggcaatgacg tgtagctatg ctgagaagta gaatagccac aatgggactg 120

agacacggcc catactccta cgggaggcag cagtagggaa tttttcacaa tgagcgaaag 180

cttgatggag caatgccgcg tgaacgatga aggt 214

<210> 43

<211> 214

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HSV-II基因gG的基因序列

<400> 43

gacctgcaag ggttcgttat ttgatgaggg tgcgccatat cagctagttg gtagggtaat 60

ggcctaccaa ggcaatgacg tgtagctatg ctgagaagta gaatagccac aatgggactg 120

agacacggcc catactccta cgggaggcag cagtagggaa tttttcacaa tgagcgaaag 180

cttgatggag caatgccgcg tgaacgatga aggt 214

<210> 44

<211> 204

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 白念珠菌的5.8S rDNA基因序列

<400> 44

atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatac gtaatatgaa ttgcagatat tcgtgaatca 60

tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccctct ggtattccgg agggcatgcc tgtttgagcg 120

tcgtttctcc ctcaaaccgc tgggtttggt gttgagcaat acgacttggg tttgcttgaa 180

agacggtagt ggtaaggcgg gatc 204

<210> 45

<211> 225

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 阴道毛滴虫的5.8S rDNA基因序列

<400> 45

ttggtactgt ggataggggt acggttttcc accgtaccga aacctagcag agggccagtc 60

tggtgccagc agctgcggta attccagctc tgcgagtttg ctcccatatt gttgcagtta 120

aaacgcccgt agtctgaatt ggccagcaat ggtcgtacgt atttttacgt tcactgtgaa 180

caaatcagga cgcttagagt atggctacat gaatgactca gcgca 225

Claims

1.一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物，其特征在于，包括沙眼衣原体引物组、淋球菌引物组、解脲脲原体引物组、人型支原体引物组、生殖支原体引物组、单纯疱疹病毒2型引物组、白念珠菌引物组、阴道毛滴虫引物组中的任意一组或几组，其中：

所述沙眼衣原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.5所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.6所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.7所示，反向内引物BIP序列如SEQ IDNO.8所示；

所述淋球菌引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.9所示，反向外引物B3序列如SEQID NO.10所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.11所示，反向内引物BIP序列如SEQ IDNO.12所示；

所述解脲脲原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.13所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.14所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.15所示，反向内引物BIP序列如SEQID NO.16所示；

所述人型支原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.17所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.18所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.19所示，反向内引物BIP序列如SEQID NO.20所示；

所述生殖支原体引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.21所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.22所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.23所示，反向内引物BIP序列如SEQID NO.24所示；

所述阴道毛滴虫引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.33所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.34所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.35所示，反向内引物BIP序列如SEQID NO.36所示。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物，其特征在于，还包括内参引物组，所述内参引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示。

3.如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物在制备检测泌尿生殖道致病微生物的试剂或试剂盒的相关应用。

4.一种检测泌尿生殖道致病微生物的芯片，其特征在于，所述芯片固定有如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物。

5.根据权利要求4所述的一种检测泌尿生殖道致病微生物的芯片，其特征在于，所述芯片为恒温扩增微流控芯片。

6.一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物。

7.根据权利要求6所述的一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的试剂盒，其特征在于，还包括Bst DNA聚合酶、显色染料。

8.根据权利要求7所述的一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的试剂盒，其特征在于，所述显色染料选自HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝任意一种或几种。

9.根据权利要求6所述的一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括UDG酶和/或dUTP。

10.一种非诊断和治疗目的的检测泌尿生殖道致病微生物的方法，其特征在于，包括步骤：

提取待测样本的核酸，用如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物进行环介导等温扩增，检测扩增产物，确定待测样本是否含有相应引物组对应的泌尿生殖道致病微生物。