实施例1
1、样品提取
根据说明书,使用KingFisher自动提取仪(美国ThermoScientific KingfisherFlex全自动磁珠提取纯化系统)从60份已知结果的生殖道分泌物样本中提取DNA,获得100μL左右的洗脱产物(提取的DNA),用作下一步PCR扩增中的模板。
2、PCR扩增
对每个DNA样本分别使用两对引物进行扩增,其中,HPV的引物:针对HPV L1基因,HPV_RSMY09-LvJJ_F:5’-CGTCCTAAAGGGAATTGATC-3’,HPV_PGMY11-CvJJ_R:5’-CACAAGGCCATAATAATGG-3’;细菌16S V4区引物:F:5’-GCACCTAAYTGGGYDTAAA GNG-3’,R:5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’。
PCR反应体系:
成分 |
体积 |
Q5高保真DNA聚合酶 |
0.25μL |
5X反应缓冲液 |
5μL |
5X GC缓冲液 |
5μL |
dNTP(10mM) |
0.5μL |
正向引物(10uM) |
1μL |
反向引物(10uM) |
1μL |
水 |
11.25μL |
PCR程序:
98℃30s→98℃15s,50℃30s(25-27个循环)→72℃30s→72℃5min→4℃∞
PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-2000PCR仪上运行。
上述引物能够特异性扩增HPV L1基因和细菌16S V4区,并且相互之间不会发生干扰和抑制。扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测(图1),并进行纯化混合。
3、文库的构建及测序
利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行建库。
第一步,利用试剂盒中的End Repair Mix2进行末端修复,即将DNA 5’端突出的碱基切除,3’端缺失的碱基补齐,同时在5’端加上一个磷酸基团,具体步骤如下:
(1)取30ng混好的DNA片段补水至60μL,加入40μL End Repair Mix2;
(2)用枪吹打混匀,并置于PCR仪上30℃孵育30min;
(3)利用BECKMAN AMPure XP beads纯化末端修复体系,最终用17.5μLResuspension buffer洗脱。
第二步,在DNA的3’端加A,即DNA的3’端会单独加上一个A碱基,以防止DNA片段的自连,同时保证DNA与3’端有一个突出T碱基的测序接头相连,具体步骤如下:
(1)向末端修复后的DNA中加入12.5μL A-Tailing Mix;
(2)用枪吹打混匀,并置于PCR仪上孵育,程序如下:37℃,30min;70℃,5min;4℃,5min;4℃,∞。
第三步,加一个有特异性标签的接头,即为了让DNA最终杂交到Flow Cell上,具体步骤如下:
(1)在已加A的体系中,加入2.5μL Resuspension buffer、2.5μL Ligation Mix和2.5μL DNA adapter Index;
(2)用枪吹打混匀,置于PCR仪上,30℃孵育10min;
(3)加入5μL Stop Ligation buffer;
(4)利用BECKMAN AMPure XP beads纯化已加接头的体系。
第四步,通过PCR扩增已经加上接头的DNA片段,然后利用BECKMAN AMPure XPbeads纯化PCR体系。
第五步,通过2%琼脂糖凝胶电泳来对文库做最终的片段选择与纯化。
取1μL文库,在Agilent Bioanalyzer机器上用Agilent High Sensitivity DNAKit对文库做2100质检,合格的文库应该有单一的峰,无接头。
利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上对文库进行定量,合格的文库计算后浓度应在2nM以上。
对合格的文库,在MiSeq机器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)进行2×300bp的双端测序。首先将需要上机的文库(Index不可重复)梯度稀释到2nM,然后按所需数据量比例混样。混好的文库经0.1N NaOH变性成单链进行上机测序。所上文库量的多少可根据实际情况控制在15-18pM之间。
4、结果分析
(1)使用Illumina的BCL2FASTQ算法进行原始数据的过滤,例如版本2.1.2Swarm算法。每簇最丰富的序列被认为是代表性生物序列,并被分配簇中所有读段的计数。每个分类单元的数据库都是通过选择成功测序产生的,扩增单元被多义分类群注释,最大限度地提高了鉴定每个分类单元中扩增子的灵敏度、特异性、精确度和阴性预测值。
(2)将对16S V4区扩增获得的序列与细菌数据库—Ribosomal Database Project中的序列进行对比,从而对样品进行细菌病原菌精确分型。细菌病原菌精确分型包括4种性传播病原微生物(沙眼衣原体、生殖支原体、淋病奈瑟菌和梅毒螺旋体)。由此,确定待测样本中是否存在沙眼衣原体、生殖支原体、淋病奈瑟菌和梅毒螺旋体。实验表明,本发明的检测结果与已知的完全一致,表明本发明方法可以用于精确检测样品中的淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、生殖支原体。
(3)将对HPV L1基因扩增获得的序列与HPV数据库中的序列进行对比,从而对样品进行精确分型,包括12株高危型HPV(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58和HPV59)和5株低危型HPV(HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44)。实验表明,本发明的检测结果与已知的完全一致,表明本发明方法可以用于精确检测样品中是否含有HPV病毒,并可以进一步对其进行准确分型。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市金锐生物科技有限公司
<120> 检测生殖道病原微生物DNA的方法
<130> PIDC4180041
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 1
cgtcctaaag ggaattgatc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2
<400> 2
cacaaggcca taataatgg 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
gcacctaayt gggydtaaag ng 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
tacnvgggta tctaatcc 18
<210> 5
<211> 599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV6
<400> 5
tatgttaaca ccccgagcgg ctctttggtg tcctctgagg cacaattgtt taataagcca 60
tattggctac aaaaagccca gggacataac aatggtattt gttggggtaa tcaactgttt 120
gttactgtgg tagataccac acgcagtacc aacatgacat tatgtgcatc cgtaactaca 180
tcttccacat acaccaattc tgattataaa gagtacatgc gtcatgtgga agagtatgat 240
ttacaattta tttttcaatt atgtagcatt acattgtctg ctgaagtaat ggcctatatt 300
cacacaatga atccctctgt tttggaagac tggaactttg ggttatcgcc tcccccaaat 360
ggtacattag aagataccta taggtatgtg cagtcacagg ccattacctg tcaaaagccc 420
actcctgaaa aggaaaagcc agatccctat aagaacctta gtttttggga ggttaattta 480
aaagaaaagt tttctagtga attggatcag tatcctttgg gacgcaagtt tttgttacaa 540
agtggatata ggggacggtc ctctattcgt acaggtgtta agcgccctgc tgtttccaa 599
<210> 6
<211> 599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV11
<400> 6
catctacata cacctagtgg ctcattggtg tcttcagagg ctcaagcatc tagtcaacca 60
gattggcttc aaaaggctca gggacataac aatggtattt gctggggaaa ccacttgttt 120
gttactgtgg tagataccac acgcagtaca aatatgacac tatgtgcatc tgtgtctaaa 180
tctgctacat acactaattc agattataag gaatacatgc gccatgtgga ggagtttgat 240
ttacagttta tttttcaatt gtgtagcatt acattatctg cagaagtcat ggcctatata 300
cacacaatga atccttctgt tttggaggac tggaactttg gtttatcgcc tccaccaaat 360
ggtacactgg aggatactta tagatatgta cagtcacagg ccattacctg tcagaaaccc 420
acacctgaaa aagaaaaaca ggatccctat aaggatatga gtttttggga ggttaactta 480
aaagaaaagt tttcaagtga attagatcag tttccccttg gacgtaagtt tttattgcaa 540
agtggatatc gaggacggac gtctgctcgt acaggtataa agcgcccagc tctctgtaa 599
<210> 7
<211> 602
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV16
<400> 7
tattttccta cacctagtgg ttctatggtt acctctgatg cccaaatatt caataaacct 60
tattggttac aacgagcaca gggccacaat aatggcattt gttggggtaa ccaactattt 120
gttactgttg ttgatactac acgcagtaca aatatgtcat tatgtgctgc catatctact 180
tcagaaacta catataaaaa tactaacttt aaggagtacc tacgacatgg ggaggaatat 240
gatttacagt ttatttttca actgtgcaaa ataaccttaa ctgcagacgt tatgacatac 300
atacattcta tgaattccac tattttggag gactggaatt ttggtctaca acctccccca 360
ggaggcacac tagaagatac ttataggttt gtaacccagg caattgcttg tcaaaaacat 420
acacctccag cacctaaaga agatgatccc cttaaaaaat acactttttg ggaagtaaat 480
ttaaaggaaa agttttctgc agacctagat cagtttcctt taggacgcaa atttttacta 540
caagcaggat tgaaggccaa accaaaattt acattaggaa aacgaaaagc tacacccacc 600
ac 602
<210> 8
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV18
<400> 8
tattctccct ctccaagtgg ctctattgtt acctctgact cccagttgtt taataaacca 60
tattggttac ataaggcaca gggtcataac aatggtgttt gctggcataa tcaattattt 120
gttactgtgg tagataccac tcccagtacc aatttaacaa tatgtgcttc tacacagtct 180
cctgtacctg ggcaatatga tgctaccaaa tttaagcagt atagcagaca tgttgaggaa 240
tatgatttgc agtttatttt tcagttgtgt actattactt taactgcaga tgttatgtcc 300
tatattcata gtatgaatag cagtatttta gaggattgga actttggtgt tccccccccc 360
ccaactacta gtttggtgga tacatatcgt tttgtacaat ctgttgctat tacctgtcaa 420
aaggatgctg caccggctga aaataaggat ccctatgata agttaaagtt ttggaatgtg 480
gatttaaagg aaaagttttc tttagactta gatcaatatc cccttggacg taaatttttg 540
gttcaggctg gattgcgtcg caagcccacc ataggccctc gcaaacgttc tgctccatct 600
gccac 605
<210> 9
<211> 602
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV31
<400> 9
tactttccta cacctagcgg ctccatggtt acttcagatg cacaaatttt taataaacca 60
tattggatgc aacgtgctca gggacacaat aatggtattt gttggggcaa tcagttattt 120
gttactgtgg tagataccac acgtagtacc aatatgtctg tttgtgctgc aattgcaaac 180
agtgatacta catttaaaag tagtaatttt aaagagtatt taagacatgg tgaggaattt 240
gatttacaat ttatatttca gttatgcaaa ataacattat ctgcagacat aatgacatat 300
attcacagta tgaatcctgc tattttggaa gattggaatt ttggattgac cacacctccc 360
tcaggttctt tggaggatac ctataggttt gtcacctcac aggccattac atgtcaaaaa 420
actgcccccc aaaagcccaa ggaagatcca tttaaagatt atgtattttg ggaggttaat 480
ttaaaagaaa agttttctgc agatttagat cagtttccac tgggtcgcaa atttttatta 540
caggcaggat atagggcacg tcctaaattt aaagcaggta aacgtagtgc accctcagca 600
tc 602
<210> 10
<211> 599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV33
<400> 10
ttttttccca ctcctagtgg atcaatggtt acttccgaat ctcagttatt taataagcca 60
tattggctac aacgtgcaca aggtcataat aatggtattt gttggggcaa tcaggtattt 120
gttactgtgg tagataccac tcgcagtact aatatgactt tatgcacaca agtaactagt 180
gacagtacat ataaaaatga aaattttaaa gaatatataa gacatgttga agaatatgat 240
ctacagtttg tttttcaact atgcaaagtt accttaactg cagaagttat gacatatatt 300
catgctatga atccagatat tttagaagat tggcaatttg gtttaacacc tcctccatct 360
gctagtttac aggataccta taggtttgtt acctctcagg ctattacgtg tcaaaaaaca 420
gtacctccaa aggaaaagga agacccctta ggtaaatata cattttggga agtggattta 480
aaggaaaaat tttcagcaga tttagatcag tttcctttgg gacgcaagtt tttattacag 540
gcaggtctta aagcaaaacc taaacttaaa cgtgcagccc ccacatccac ccgcacatc 599
<210> 11
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV35
<400> 11
tattttccta ctcctagtgg ctctatggta acctccgatg cacaaatatt taataaacca 60
tattggttgc aacgtgcaca aggccataat aatggtattt gttggagtaa ccaattgttt 120
gttactgtag ttgatacaac ccgtagtaca aatatgtctg tgtgttctgc tgtgtcttct 180
agtgacagta catataaaaa tgacaatttt aaggaatatt taaggcatgg tgaagaatat 240
gatttacagt ttatttttca gttatgtaaa ataacactaa cagcagatgt tatgacatat 300
attcatagta tgaacccgtc cattttagag gattggaatt ttggccttac accaccgcct 360
tctggtacct tagaggacac atatcgctat gtaacatcac aggctgtaac ttgtcaaaaa 420
cccagtgcac caaaacctaa agatgatcca ttaaaaaatt atactttttg ggaggttgat 480
ttaaaggaaa agttttctgc agacttagat caatttccgt tgggccgtaa atttttgtta 540
caagcaggac taaaggccag gcctaatttt agattaggca agcgtgcagc tccagcatct 600
<210> 12
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV39
<400> 12
tactgcccct ctcccagcgg ttccatggta acctctgatt cccagttatt taataagcct 60
tattggctac ataaggccca gggccacaac aatggtatat gttggcataa tcaattattt 120
cttactgttg tggacactac ccgtagtacc aactttacat tatctacctc tatagagtct 180
tccatacctt ctacatatga tccttctaag tttaaggaat ataccaggca cgtggaggag 240
tatgatttac aatttatatt tcaactgtgt actgtcacat taacaactga tgttatgtct 300
tatattcaca ctatgaattc ctctatattg gacaattgga attttgctgt agctcctcca 360
ccatctgcca gtttggtaga cacttacaga tacctacagt ctgcagccat tacatgtcaa 420
aaggatgctc cagcacctga aaagaaagat ccatatgacg gtctaaagtt ttggaatgtt 480
gacttaaggg aaaagtttag tttggaactt gatcaattcc ctttgggacg taaatttttg 540
ttgcaggcca gggtccgcag gcgccctact ataggtcccc gaaagcggcc tgctgcatcc 600
acttc 605
<210> 13
<211> 599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV42
<400> 13
tattatccta cccctagtgg ttctatggta acatctgatg cacaactatt taataaacca 60
tattggttac aacaagcaca aggacacaat aatggtatat gttggggaaa tcagctattt 120
ttaactgtgg ttgatactac ccgtagtact aacatgactt tgtgtgccac tgcaacatct 180
ggtgatacat atacagctgc taattttaag gaatatttaa gacatgctga agaatatgat 240
gtgcaattta tatttcaatt gtgtaaaata acattaactg ttgaagttat gtcatatata 300
cacaatatga atcctaacat attagaggag tggaatgttg gtgttgcacc accaccttca 360
ggaactttag aagatagtta taggtatgta caatcagaag ctattcgctg tcaggctaag 420
gtaacaacgc cagaaaaaaa ggatccttat tcagactttt ggttttggga ggtaaattta 480
tctgaaaagt tttctactga tttagatcaa tttcctttag gtagaaagtt tttactgcag 540
gccgggttgc gtgcaaggcc taaactgtct gtaggtaaac gaaaggcgtc tacagctaa 599
<210> 14
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV43
<400> 14
tatttttcta cacccagtgg gtctttggtt acttctgatt ctcaattgtt taacaaaccc 60
ttatggatac aaaaggccca gggacataat aatggcattt gttttgggaa tcagttgttt 120
gttacagtgg tagataccac tcgtagtaca aacttaacgt tatgtgcctc tactgaccct 180
actgtgccca gtacatatga caatgcaaag tttaaggaat acctgcggca tgtggaagaa 240
tatgatctgc agtttatatt tcaattatgc ataataacgc taaacccaga ggttatgaca 300
tatattcata ctatggatcc cacattatta gaggactgga attttggtgt gtccccacct 360
gcctctgctt ctttggaaga tacttatcgc tttttgtcta acaaggccat tgcatgtcaa 420
aaaaatgctc ccccaaaaga acgggaggat ccctataaaa agtatacatt ttgggatata 480
aatcttacag aaaagttttc tgcacaactt acccagtttc ccttagggcg caaatttgtt 540
atgcaggcgg gtttgcgtcc caaacctaaa ttaaaaactg taaagcgttc tgcaccatcc 600
tcctc 605
<210> 15
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV44
<400> 15
tactttaata cacccagtgg ttctcttgta tcttctgaaa cccaattatt taataagcct 60
ttttggttgc aaaaggcgca gggccacaat aatggtattt gttggggaaa tcagttattt 120
gttactgttg tagatactac ccgtagtaca aacatgacaa tatgtgctgc cactacacag 180
tcccctccgt ctacatatac tagtgaacaa tataagcaat acatgcgaca tgttgaggag 240
tttgacttac aatttatgtt tcaattatgt agtattacct taacggcgga ggtaatggcc 300
tatcttcata ctatgaatgc tggtatttta gaacagtgga actttgggtt gtcgccgccc 360
ccaaatggta ccttagagga caaatacaga tatgtgcagt cccaggccat tacatgtcaa 420
aagccacccc ctgaaaaggc aaagcaggac ccctatgcaa aattaagttt ttgggaggtg 480
gatcttagag aaaagttttc tagtgagttg gatcaatatc cccttggtag aaaattttta 540
ttacaaacgg gtgtgcaggc ccgttcctct gttcgtgtgg gtaggaaacg tcctgcgtct 600
gcagc 605
<210> 16
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV45
<400> 16
tattcccctt ctcccagtgg ctctattatt acttctgatt ctcaattatt taataagcca 60
tattggttac ataaggccca gggccataac aatggtattt gttggcataa tcagttgttt 120
gttactgtag tggacactac ccgcagtact aatttaacat tatgtgcctc tacacaaaat 180
cctgtgccaa gtacatatga ccctactaag tttaagcagt atagtagaca tgtggaggaa 240
tatgatttac agtttatttt tcagttgtgc actattactt taactgcaga ggttatgtca 300
tatatccata gtatgaatag tagtatatta gaaaattgga attttggtgt ccctccacca 360
cctactacaa gtttggtgga tacatatcgt tttgtgcaat cagttgctgt tacctgtcaa 420
aaggatacta cacctccaga aaagcaggat ccatatgata aattaaagtt ttggactgtt 480
gacctaaagg aaaaattttc ctccgatttg gatcaatatc cccttggtcg aaagttttta 540
gttcaggctg ggttacgtcg taggcctacc ataggacctc gtaagcgtcc tgctgcttcc 600
acgtc 605
<210> 17
<211> 603
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV51
<400> 17
tactctgcta ctcccagtgg gtctatgata acatctgatt ctcaaatttt taataagcct 60
tattggctcc accgtgcgca gggtcacaat aatggcattt gctggaacaa tcagcttttt 120
attacctgtg ttgatactac cagaagtaca aatttaacta ttagcactgc cactgctgcg 180
gtttccccaa catttactcc aagtaacttt aagcaatata ttaggcatgg ggaagagtat 240
gaattgcaat ttatttttca attatgtaaa attactttaa ctacagaggt aatggcttat 300
ttacacacaa tggatcctac cattcttgaa cagtggaatt ttggattaac attacctccg 360
tctgctagtt tggaggatgc atataggttt gttagaaatg cagctactag ctgtcaaaag 420
gacacccctc cacaggctaa gccagatcct ttggccaaat ataaattttg ggatgttgat 480
ttaaaggaac gattttcttt agatttagac caatttgcat tgggtcgcaa gtttttgttg 540
caggttggcg tacaacgcaa gcccagacca ggccttaaac gcccggcctc atcggcatcc 600
tct 603
<210> 18
<211> 599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV52
<400> 18
ttttttccta ctcctagtgg ttctatggta acctcagaat cccaattatt taataaaccg 60
tactggttac aacgtgcgca gggccacaat aatggcatat gttggggcaa tcagttgttt 120
gtcacagttg tggataccac tcgtagcact aacatgactt tatgtgctga ggttaaaaag 180
gaaagcacat ataaaaatga aaattttaag gaataccttc gtcatggcga ggaatttgat 240
ttacaattta tttttcaatt gtgcaaaatt acattaacag ctgatgttat gacatacatt 300
cataagatgg atgccactat tttagaggac tggcaatttg gccttacccc accaccgtct 360
gcatctttgg aggacacata cagatttgtc acttctactg ctataacttg tcaaaaaaac 420
acaccaccta aaggaaagga agatccttta aaggactata tgttttggga ggtggattta 480
aaagaaaagt tttctgcaga tttagatcag tttcctttag gtaggaagtt tttgttacag 540
gcagggctac aggctaggcc caaactaaaa cgccctgcat catcggcccc acgtacctc 599
<210> 19
<211> 598
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV56
<400> 19
atgttgctac gcctagtggg tctatgatta cgtctgaggc acagttattt aataaacctt 60
attggttgca acgtgcccaa ggccataata atggcatttg ctggggtaat caattatttg 120
ttactgtagt agatactact agaagtacta acatgactat tagtactgct acagaacagt 180
taagtaaata tgatgcacga aaaattaatc agtaccttag acatgtggag gaatatgaat 240
tacaatttgt ttttcaatta tgcaaaatta ctttgtctgc agaggttatg gcatatttac 300
ataatatgaa tgctaaccta ctggaggact ggaatattgg gttatccccg ccagtggcca 360
ccagcctaga agataaatat agatatgtta gaagcacagc tataacatgt caacgggaac 420
agccaccaac agaaaaacag gacccattag ctaaatataa attttgggat gttaacttac 480
aggacagttt ttctacagac ctggatcaat ttccactggg tagaaaattt ttaatgcaac 540
tgggcactag gtcaaagcct gctgtagcta cctctaaaaa gcgatctgct cctacctc 598
<210> 20
<211> 599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV58
<400> 20
ttttttccaa ctcctagtgg ctctatagtt acctcagaat cacaattatt taataagcct 60
tattggctac agcgtgcaca aggtcataac aatggcattt gctggggcaa tcagttattt 120
gttaccgtgg ttgataccac tcgtagcact aatatgacat tatgcactga agtaactaag 180
gaaggtacat ataaaaatga taattttaag gaatatgtac gtcatgttga agaatatgac 240
ttacagtttg tttttcagct ttgcaaaatt acactaactg cagagataat gacatatata 300
catactatgg attccaatat tttggaggac tggcaatttg gtttaacacc tcctccgtct 360
gccagtttac aggacacata tagatttgtt acctcccagg ctattacttg ccaaaaaaca 420
gcacccccta aagaaaagga agatccatta aataaatata ctttttggga ggttaactta 480
aaggaaaagt tttctgcaga tctagatcag tttcctttgg gacgaaagtt tttattacaa 540
tcaggcctta aagcaaagcc cagactaaaa cgttcggccc ctactacccg tgcaccatc 599
<210> 21
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV59
<400> 21
tattcccctt ccccaagtgg gtctgtggtt acttctgatt cacaattatt taataaacca 60
tattggctgc acaaggctca gggtttaaac aatggtatat gttggcacaa tcaattgttt 120
ttaacagttg tagatactac tcgcagcacc aatctttctg tgtgtgcttc tactacttct 180
tctattccta atgtatacac acctaccagt tttaaagaat atgccagaca tgtggaggaa 240
tttgatttgc agtttatatt tcaactgtgt aaaataacat taactacaga ggtaatgtca 300
tacattcata atatgaatac cactattttg gaggattgga attttggtgt tacaccacct 360
cctactgcta gtttagttga cacataccgt tttgttcaat ctgctgctgt aacttgtcaa 420
aaggacaccg caccgccagt taaacaggac ccttatgaca aactaaagtt ttggcctgta 480
gatcttaagg aaaggttttc tgcagatctt gatcagtttc ctttgggacg taaattttta 540
ttgcaattag gagctagacc taagcccact ataggcccac gcaaacgtgc agcgcctgcc 600
cctac 605