CN110093459A - 用于快速检测13种高危型hpv的lamp引物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于快速检测13种高危型HPV的LAMP引物组合及应用。LAMP引物组合由序列1至序列68所示的68种DNA分子组成。引物组合可应用于检测待测样本中是否含有高危型HPV，高危型HPV为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种。采用该引物组合检测高危型HPV具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及用于快速检测13种高危型HPV的LAMP引物组合及应用。
背景技术
宫颈癌是严重影响女性健康的妇科肿瘤之一，也是目前唯一病因明确的恶性肿瘤，即持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染。通过HPV的检测，宫颈癌可以真正做到早期发现和预防，还可为疫苗接种提供依据，因此高危型HPV的分型检测已经成为宫颈癌筛查的临床常规检测手段。
目前已知的HPV有150多种，约20种与肿瘤相关。依据发生肿瘤的危险性分为低危型和高危型两大类。高危型HPV包括HPV16(即人乳头瘤病毒16型)、HPV18(即人乳头瘤病毒18型)、HPV31(即人乳头瘤病毒31型)、HPV33(即人乳头瘤病毒33型)、HPV35(即人乳头瘤病毒35型)、HPV39(即人乳头瘤病毒39型)、HPV45(即人乳头瘤病毒45型)、HPV51(即人乳头瘤病毒51型)、HPV52(即人乳头瘤病毒52型)、HPV56(即人乳头瘤病毒56型)、HPV58(即人乳头瘤病毒58型)、HPV59(即人乳头瘤病毒59型)、HPV68(即人乳头瘤病毒68型)等，其中HPV16和HPV18最为严重。现有的HPV检测手段包括HC2捕获法、导流杂交法和荧光定量PCR法，但均具有一定的缺点。HC2捕获法的优势在于不需要PCR扩增，因此不存在样品交叉污染的风险，但是该方法只能区分是否为高危型感染，但是无法确定病毒的具体型别，无法给患者的疫苗接种以及后续治疗提供更有价值的帮助；而且，整个检测时间需要4个多小时，检测体系为国外进口，检测成本也相对较高，在临床的实际可行性相对较差。导流杂交法的优势是通过核酸杂交芯片可以实现病毒的具体分型，不光可以区分15种高危型，还可以区分5种低危型，是目前分型最为全面的检测体系；但该方法的不足在于PCR之后的杂交操作存在气溶胶污染的风险，对检测实验室的要求较高，而且每批最多只能检测15或30例，检测时间也在4个小时左右，在样品较多时会非常费时费力。荧光定量PCR法的优势是采用闭管操作可以避免气溶胶的污染，而且通过荧光探针的设计，可以实现病毒的具体分型，检测时间约为1.5个小时，是目前应用最为广泛的HPV检测技术；该方法的主要不足在于荧光探针的成本相对较高，而且荧光定量PCR仪的技术门槛相对略高，不利于大面积人群的广泛普筛。由此可见，开发一种简捷方便、成本低廉的检测体系，对HPV的分型做出快速、准确、客观的判断，则可以在更广泛的人群之中开展HPV的筛查，真正做到早发现、早治疗，从而杜绝宫颈癌对女性健康所带来的危害。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi T.于2000年开发等温核酸扩增方法，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在60-65℃的等温条件下高效、快速、特异的扩增目的基因。该方法具有简便、快速、准确、灵敏、特异等优势，目前已广泛应用于大规模病原微生物筛查、食品卫生检疫等领域。由于检测成本低廉，对人员和仪器设备的要求较低，非常适合现场的快速检测以及实验条件相对落后的基层单位使用。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
发明内容
本发明的目的是鉴定高危型HPV的。
本发明首先保护一种引物组合，可为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物组HPV16、引物组HPV18、引物组HPV31、引物组HPV33、引物组HPV35、引物组HPV39、引物组HPV45、引物组HPV51、引物组HPV52、引物组HPV56、引物组HPV58、引物组HPV59和引物组HPV68组成；
(a2)包括引物组HPV16、引物组HPV18、引物组HPV31、引物组HPV33、引物组HPV35、引物组HPV39、引物组HPV45、引物组HPV51、引物组HPV52、引物组HPV56、引物组HPV58、引物组HPV59和引物组HPV68；
(a3)引物组HPV16、引物组HPV18、引物组HPV31、引物组HPV33、引物组HPV35、引物组HPV39、引物组HPV45、引物组HPV51、引物组HPV52、引物组HPV56、引物组HPV58、引物组HPV59或引物组HPV68。
引物组HPV16可由引物HPV16-F3、引物HPV16-B3、引物HPV16-FIP、引物HPV16-BIP和引物HPV16-LB组成；
所述引物HPV16-F3的核苷酸序列可如序列表中序列1所示；
引物HPV16-B3的核苷酸序列可如序列表中序列2所示；
引物HPV16-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列3所示；
引物HPV16-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列4所示；
引物HPV16-LB的核苷酸序列可如序列表中序列5所示。
引物组HPV18可由引物HPV18-F3、引物HPV18-B3、引物HPV18-FIP、引物HPV18-BIP、引物HPV18-LB和引物HPV18-LF组成；
引物HPV18-F3的核苷酸序列可如序列表中序列6所示；
引物HPV18-B3的核苷酸序列可如序列表中序列7所示；
引物HPV18-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列8所示；
引物HPV18-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列9所示；
引物HPV18-LB的核苷酸序列可如序列表中序列10所示；
引物HPV18-LF的核苷酸序列可如序列表中序列11所示。
引物组HPV31可由引物HPV31-F3、引物HPV31-B3、引物HPV31-FIP、引物HPV31-BIP和引物HPV31-LF组成；
引物HPV31-F3的核苷酸序列可如序列表中序列12所示；
引物HPV31-B3的核苷酸序列可如序列表中序列13所示；
引物HPV31-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列14所示；
引物HPV31-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列15所示；
引物HPV31-LF的核苷酸序列可如序列表中序列16所示。
引物组HPV33可由引物HPV33-F3、引物HPV33-B3、引物HPV33-FIP、引物HPV33-BIP和引物HPV33-LF组成；
引物HPV33-F3的核苷酸序列可如序列表中序列17所示；
引物HPV33-B3的核苷酸序列可如序列表中序列18所示；
引物HPV33-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列19所示；
引物HPV33-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列20所示；
引物HPV33-LF的核苷酸序列可如序列表中序列21所示。
引物组HPV35可由引物HPV35-F3、引物HPV35-B3、引物HPV35-FIP、引物HPV35-BIP和引物HPV35-LF组成；
引物HPV35-F3的核苷酸序列可如序列表中序列22所示；
引物HPV35-B3的核苷酸序列可如序列表中序列23所示；
引物HPV35-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列24所示；
引物HPV35-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列25所示；
引物HPV35-LF的核苷酸序列可如序列表中序列26所示。
引物组HPV39可由引物HPV39-F3、引物HPV39-B3、引物HPV39-FIP、引物HPV39-BIP、引物HPV39-LB和引物HPV39-LF组成；
引物HPV39-F3的核苷酸序列可如序列表中序列27所示；
引物HPV39-B3的核苷酸序列可如序列表中序列28所示；
引物HPV39-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列29所示；
引物HPV39-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列30所示；
引物HPV39-LB的核苷酸序列可如序列表中序列31所示；
引物HPV39-LF的核苷酸序列可如序列表中序列32所示。
引物组HPV45可由引物HPV45-F3、引物HPV45-B3、引物HPV45-FIP、引物HPV45-BIP和引物HPV45-LB组成；
引物HPV45-F3的核苷酸序列可如序列表中序列33所示；
引物HPV45-B3的核苷酸序列可如序列表中序列34所示；
引物HPV45-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列35所示；
引物HPV45-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列36所示；
引物HPV45-LB的核苷酸序列可如序列表中序列37所示。
引物组HPV51可由引物HPV51-F3、引物HPV51-B3、引物HPV51-FIP、引物HPV51-BIP、引物HPV51-LB和引物HPV51-LF组成；
引物HPV51-F3的核苷酸序列可如序列表中序列38所示；
引物HPV51-B3的核苷酸序列可如序列表中序列39所示；
引物HPV51-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列40所示；
引物HPV51-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列41所示；
引物HPV51-LB的核苷酸序列可如序列表中序列42所示；
引物HPV51-LF的核苷酸序列可如序列表中序列43所示。
引物组HPV52可由引物HPV52-F3、引物HPV52-B3、引物HPV52-FIP、引物HPV52-BIP和引物HPV52-LF组成；
引物HPV52-F3的核苷酸序列可如序列表中序列44所示；
引物HPV52-B3的核苷酸序列可如序列表中序列45所示；
引物HPV52-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列46所示；
引物HPV52-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列47所示；
引物HPV52-LF的核苷酸序列可如序列表中序列48所示。
引物组HPV56可由引物HPV56-F3、引物HPV56-B3、引物HPV56-FIP、引物HPV56-BIP和引物HPV56-LB组成；
引物HPV56-F3的核苷酸序列可如序列表中序列49所示；
引物HPV56-B3的核苷酸序列可如序列表中序列50所示；
引物HPV56-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列51所示；
引物HPV56-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列52所示；
引物HPV56-LB的核苷酸序列可如序列表中序列53所示。
引物组HPV58可由引物HPV58-F3、引物HPV58-B3、引物HPV58-FIP、引物HPV58-BIP和引物HPV58-LB组成；
引物HPV58-F3的核苷酸序列可如序列表中序列54所示；
引物HPV58-B3的核苷酸序列可如序列表中序列55所示；
引物HPV58-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列56所示；
引物HPV58-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列57所示；
引物HPV58-LB的核苷酸序列可如序列表中序列58所示。
引物组HPV59可由引物HPV59-F3、引物HPV59-B3、引物HPV59-FIP、引物HPV59-BIP和引物HPV59-LB组成；
引物HPV59-F3的核苷酸序列可如序列表中序列59所示；
引物HPV59-B3的核苷酸序列可如序列表中序列60所示；
引物HPV59-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列61所示；
引物HPV59-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列62所示；
引物HPV59-LB的核苷酸序列可如序列表中序列63所示。
引物组HPV68可由引物HPV68-F3、引物HPV68-B3、引物HPV68-FIP、引物HPV68-BIP和引物HPV68-LF组成；
引物HPV68-F3的核苷酸序列可如序列表中序列64所示；
引物HPV68-B3的核苷酸序列可如序列表中序列65所示；
引物HPV68-FIP的核苷酸序列可如序列表中序列66所示；
引物HPV68-BIP的核苷酸序列可如序列表中序列67所示；
引物HPV68-LF的核苷酸序列可如序列表中序列68所示。
所述引物组HPV16中，引物HPV16-F3、引物HPV16-B3、引物HPV16-FIP、引物HPV16-BIP和引物HPV16-LB的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV18中，引物HPV18-F3、引物HPV18-B3、引物HPV18-FIP、引物HPV18-BIP、引物HPV18-LB和引物HPV18-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1:1。
所述引物组HPV31中，引物HPV31-F3、引物HPV31-B3、引物HPV31-FIP、引物HPV31-BIP和引物HPV31-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV33中，引物HPV33-F3、引物HPV33-B3、引物HPV33-FIP、引物HPV33-BIP和引物HPV33-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV35中，引物HPV35-F3、引物HPV35-B3、引物HPV35-FIP、引物HPV35-BIP和引物HPV35-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV39中，引物HPV39-F3、引物HPV39-B3、引物HPV39-FIP、引物HPV39-BIP、引物HPV39-LB和引物HPV39-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1:1。
所述引物组HPV45中，引物HPV45-F3、引物HPV45-B3、引物HPV45-FIP、引物HPV45-BIP和引物HPV45-LB的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV51中，引物HPV51-F3、引物HPV51-B3、引物HPV51-FIP、引物HPV51-BIP、引物HPV51-LB和引物HPV51-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1:1。
所述引物组HPV52中，引物HPV52-F3、引物HPV52-B3、引物HPV52-FIP、引物HPV52-BIP和引物HPV52-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV56中，引物HPV56-F3、引物HPV56-B3、引物HPV56-FIP、引物HPV56-BIP和引物HPV56-LB的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV58中，引物HPV58-F3、引物HPV58-B3、引物HPV58-FIP、引物HPV58-BIP和引物HPV58-LB的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV59中，引物HPV59-F3、引物HPV59-B3、引物HPV59-FIP、引物HPV59-BIP和引物HPV59-LB的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
所述引物组HPV68中，引物HPV68-F3、引物HPV68-B3、引物HPV68-FIP、引物HPV68-BIP和引物HPV68-LF的摩尔比具体可为1:1:1:1:1。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定高危型HPV；
(h2)用于检测待测样本中是否含有高危型HPV。
上述应用中，所述高危型HPV可为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定高危型HPV；
(h2)用于检测待测样本中是否含有高危型HPV。
上述试剂盒中，所述高危型HPV可为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种检测待测病毒是否为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59或HPV68的方法，可包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：如果采用引物组HPV16可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV16；如果采用引物组HPV18可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV18；如果采用引物组HPV31可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV31；如果采用引物组HPV33可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV33；如果采用引物组HPV35可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV35；如果采用引物组HPV39可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV39；如果采用引物组HPV45可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV45；如果采用引物组HPV51可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV51；如果采用引物组HPV52可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV52；如果采用引物组HPV56可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV56；如果采用引物组HPV58可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV58；如果采用引物组HPV59可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV59；如果采用引物组HPV68可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV68。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有高危型HPV的方法，高危型HPV为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种，可包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用引物组HPV16可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV16；如果采用引物组HPV18可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV18；如果采用引物组HPV31可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV31；如果采用引物组HPV33可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV33；如果采用引物组HPV35可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV35；如果采用引物组HPV39可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV39；如果采用引物组HPV45可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV45；如果采用引物组HPV51可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV51；如果采用引物组HPV52可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV52；如果采用引物组HPV56可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV56；如果采用引物组HPV58可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV58；如果采用引物组HPV59可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV59；如果采用引物组HPV68可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV68。
以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应体系(25μL)为：12.5μL2×酶溶液(RM)、1μL酶溶液(EM)、模板(约10-50ng)、引物混合物，补水至25μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。2×酶溶液(RM)中含有dNTPs、Mg2+等。2×酶溶液(RM)和酶溶液(EM)具体可为Loopamp朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒(LAMP法)中的组件。Loopamp朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒为北京蓝谱生物科技有限公司的产品，货号为SLP206。
上述任一所述方法中，环介导等温扩增的反应体系中外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的浓度均可为10pmol。
上述任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件可为：60-65℃(如60-63℃、63-65℃、60℃、63℃或65℃)恒温1h。
本发明还保护所述引物组合在检测待测病毒是否为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59或HPV68中的应用。
本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有高危型HPV中的应用。
上述任一所述高危型HPV可为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种。
上述任一所述待测样本可为人宫颈组织临床样本。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测13种高危型HPV。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。
本发明提供的引物组合用于检测13种高危型HPV，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
附图说明
图1为实施例1中步骤一的检测结果。
图2为实施例1中步骤二的检测结果。
图3为实施例1中步骤三的检测结果。
图4为实施例1中步骤四的检测结果。
图5为实施例1中步骤五的检测结果。
图6为实施例1中步骤六的检测结果。
图7为实施例1中步骤七的检测结果。
图8为实施例1中步骤八的检测结果。
图9为实施例1中步骤九的检测结果。
图10为实施例1中步骤十的检测结果。
图11为实施例1中步骤十一的检测结果。
图12为实施例1中步骤十二的检测结果。
图13为实施例1中步骤十三的检测结果。
图14为实施例2中准确性实验的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Loopamp浊度仪为日本荣研化学株式会的产品，型号为LA-320C；参数为光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管。
Loopamp朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒(LAMP法)为北京蓝谱生物科技有限公司的产品，货号为SLP206。2×酶溶液(RM)、酶溶液(EM)和阳性对照标准品(作用是验证反应体系是否正常)均为Loopamp朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒(LAMP法)中的组件。
下述实施例中涉及的引物组名称、引物名称和核苷酸序列详见表1。
表1
实施例1、用于检测高危型HPV引物组的筛选和试剂盒的制备
一、用于检测HPV16引物组的筛选
1、设计用于检测HPV16的引物，其中三组引物分别为引物组16-1，引物组16-26和引物组16-74，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV16引物组的具体实施及筛选结果
分别以3例临床检测为HPV16阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2和样本3)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组16-1、引物组16-26或引物组16-74进行环介导等温扩增。
反应体系为25μL，由12.5μL的2×酶溶液(RM)、2μL模板、7μL引物组的水溶液、1μL的酶溶液(EM)和2.5μL无菌超纯水组成。反应体系的引物组水溶液中，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的浓度均为10pmol。
反应条件：65℃1h，80℃5min，4℃保存。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
检测结果见图1(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为空白对照和阳性对照；a、b和c中，3为引物组16-1，4为引物组16-26，5为引物组16-74；d中，3为阳性对照，4为空白对照)。结果表明，引物组16-1的性能优于其它的引物组，3例阳性标本均能顺利检出，检测时间在20-35min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组16-1用于进行后续实验。
二、用于检测HPV18引物组的筛选
1、设计用于检测HPV18的引物，其中三组引物分别为引物组18-6、引物组18-120和引物组18-0，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV18引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV18阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组18-6、引物组18-120或引物组18-0进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图2(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；1为引物组18-6，2为引物组18-120，3为引物组引物组18-0)。结果表明，引物组18-6的性能优于其它的引物组，4例阳性标本检出3例，检测时间在19-35min，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组18-6用于进行后续实验。
三、用于检测HPV31引物组的筛选
1、设计用于检测HPV31的引物，其中四组引物分别为引物组31-0、引物组31-10、引物组31-86和引物组31-102，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV31引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV31阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组31-0、引物组31-10、引物组31-86或引物组31-102进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图3(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a中1-4均为样本1、5-8均为样本2，b中1-4均为样本3、5-8均为样本4，1和5为引物组31-10，2和6为引物组31-86，3和7为引物组31-102，4和8为引物组31-0)。结果表明，引物组31-0的性能优于其它的引物组，4例阳性标本检出3例，检测时间均在30min之内，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组31-0用于进行后续实验。
四、用于检测HPV33引物组的筛选
1、设计用于检测HPV33的引物，其中三组引物分别为引物组33-0、引物组33-33和引物组33-117，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV33引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV33阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组33-0、引物组33-33或引物组33-117进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图4(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；1为引物组33-3，2为引物组33-117，3为引物组引物组33-0)。结果表明，引物组33-0的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在30-35min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组33-0用于进行后续实验。
五、用于检测HPV35引物组的筛选
1、设计用于检测HPV35的引物，其中三组引物分别为引物组35-0、引物组35-12和引物组35-85，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV35引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV35阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组35-0、引物组35-12或引物组35-85进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图5(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；1为引物组35-12，2为引物组35-85，3为引物组35-0)。结果表明，引物组35-85的性能优于其它的引物组，4例阳性标本检出3例，检测时间在25-60min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组35-85用于进行后续实验。
六、用于检测HPV39引物组的筛选
1、设计用于检测HPV39的引物，其中三组引物分别为引物组39-47、引物组39-107和引物组39-125，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV35引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV39阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组39-47、引物组39-107或引物组39-125进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图6(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；5为引物组39-47，6为引物组39-107，7为引物组39-125)。结果表明，引物组39-125的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在15-35min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组39-125用于进行后续实验。
七、用于检测HPV45引物组的筛选
1、设计用于检测HPV45的引物，其中三组引物分别为引物组45-34、引物组45-58和引物组45-117，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV45引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV45阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组45-34、引物组45-58或引物组45-117进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图7(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；3为引物组45-34，4为引物组45-58，5为引物组45-117)。结果表明，引物组45-34的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在35min之内，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组45-34用于进行后续实验。
八、用于检测HPV51引物组的筛选
1、设计用于检测HPV51的引物，其中三组引物分别为引物组51-47、引物组51-128和引物组51-145，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV51引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV51阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组51-47、引物组51-128或引物组51-145进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图8(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；5为引物组51-47，6为引物组51-128，7为引物组51-145)。结果表明，引物组51-145的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在18-30min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组51-145用于进行后续实验。
九、用于检测HPV52引物组的筛选
1、设计用于检测HPV52的引物，其中三组引物分别为引物组52-3、引物组52-18和引物组52-31，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV52引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV52阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组52-3、引物组52-18或引物组52-31进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图9(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；a、b和c中，2为引物组52-3，3为引物组52-18，4为引物组52-31；d中，1为引物组52-3，2为引物组52-18，3为引物组52-31)。结果表明，引物组52-31的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在34-40min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组52-31用于进行后续实验。
十、用于检测HPV56引物组的筛选
1、设计用于检测HPV56的引物，其中三组引物分别为引物组56-144、引物组56-164和引物组56-0，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV56引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV56阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组56-144、引物组56-164或引物组56-0进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图10(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；1为引物组56-144，2为引物组56-164，3为引物组56-0)。结果表明，引物组56-164的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在40-60min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组56-164用于进行后续实验。
十一、用于检测HPV58引物组的筛选
1、设计用于检测HPV58的引物，其中三组引物分别为引物组58-5、引物组58-57和引物组58-142，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV58引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV58阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组58-5、引物组58-57或引物组58-142进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图11(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；4为引物组58-5，5为引物组58-57，6为引物组58-142)。结果表明，引物组58-57的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在30-50min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组58-57用于进行后续实验。
十二、用于检测HPV59引物组的筛选
1、设计用于检测HPV59的引物，其中三组引物分别为引物组59-0、引物组59-71和引物组59-196，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV59引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV59阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组59-0、引物组59-71或引物组59-196进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图12(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；5为引物组59-71，6为引物组59-196，7为引物组59-0)。结果表明，引物组59-0的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在30-40min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组59-0用于进行后续实验。
十三、用于检测HPV68引物组的筛选
1、设计用于检测HPV68的引物，其中三组引物分别为引物组68-0、引物组68-112和引物组68-139，各个引物组的引物序列详见表1。
2、用于检测HPV68引物组的具体实施及筛选结果
分别以4例临床检测为HPV59阳性的宫颈组织样本(分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4)的DNA(Ct值均小于30，病毒浓度均大于105个拷贝/104个细胞)为模板，采用引物组68-0、引物组68-112或引物组68-139进行环介导等温扩增。
反应体系同步骤一中2的反应体系，两者的不同仅在于引物组不同。
反应条件同步骤一中2的反应条件。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图13(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线；a为样本1；b为样本2；c为样本3；d为样本4；6为引物组68-112，7为引物组68-139，8为引物组68-0)。结果表明，引物组68-0的性能优于其它的引物组，4例阳性标本均能顺利检出，检测时间在30-40min之间，且空白对照不出现非特异扩增。综合检出情况和检出时间，与其它引物组比较后，确定引物组68-0用于进行后续实验。
十四、试剂盒的制备
试剂盒由引物组16-1(以下命名为引物组HPV16)、引物组18-6(以下命名为引物组HPV18)、引物组31-0(以下命名为引物组HPV31)、引物组33-0(以下命名为引物组HPV33)、引物组35-85(以下命名为引物组HPV35)、引物组39-125(以下命名为引物组HPV39)、引物组45-34(以下命名为引物组HPV45)、引物组51-145(以下命名为引物组HPV51)、引物组52-31(以下命名为引物组HPV52)、引物组56-164(以下命名为引物组HPV56)、引物组58-57(以下命名为引物组HPV58)、引物组59-0(以下命名为引物组HPV59)和引物组68-0(以下命名为引物组HPV68)组成。
实施例2、准确性实验
待测样本为967例人宫颈组织临床样本。人宫颈组织临床样本的提供者对实验内容均知情同意。
各例待测样本分别进行如下步骤：
1、采用HPV分型试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司的产品，货号为Z-TD-0324-04)提取待测样本的DNA并检测，确认相应标本的HPV分型。结果表明，967例人宫颈组织临床样本中，阳性样本为766例，阴性样本为201例。其中阳性样本的具体分型结果见表2中第2列。
表2
2、分别以HPV分型试剂盒鉴定的60例HPV16的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV16进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的64例HPV18的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV18进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的54例HPV31的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV31进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的60例HPV33的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV33进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的75例HPV35的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV35进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的55例HPV39的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV39进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的60例HPV45的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV45进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的58例HPV51的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV51进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的55例HPV52的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV52进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的56例HPV35的DNA和15例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV56进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的55例HPV58的DNA和17例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV58进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的55例HPV59的DNA和17例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV59进行环介导等温扩增。分别以HPV分型试剂盒鉴定的55例HPV68的DNA和17例阴性标本的DNA为模板，采用引物组HPV68进行环介导等温扩增。
反应体系为25μL，由12.5μL2×酶溶液(RM)、2μL待测样本的DNA(浓度大于105个拷贝/104个细胞)、7μL引物组的水溶液、1μL酶溶液(EM)和2.5μL无菌超纯水组成。反应体系中，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的浓度均为10pmol。
反应条件：65℃1h，80℃5min，4℃保存。
反应过程中，采用Loopamp浊度仪检测浊度。以时间为横坐标，浊度为纵坐标，绘制浊度变化曲线；然后进行如下判断：如果在60min内浊度变化曲线为“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在60min内浊度变化曲线没有出现“S型”曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
按照上述方法，将模板替换为无菌超纯水，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述方法，将模板替换为阳性对照标准品，其它步骤均不变，作为阳性对照。
部分检测结果见图14(A为反应过程中软件自动生成的柱状图；B为反应过程中软件自动生成的相应的浊度变化曲线，1-6为HPV分型试剂盒鉴定的6例HPV16的DNA，7为阳性对照，8为空白对照)。具体结果见表2中第3列和第4列。具体如下：
HPV分型试剂盒鉴定的60例HPV16中有7例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为88.3％。HPV分型试剂盒鉴定的64例HPV18中有17例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为73.4％。HPV分型试剂盒鉴定的54例HPV31中有3例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为94.4％。HPV分型试剂盒鉴定的60例HPV33中有9例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为85.0％。HPV分型试剂盒鉴定的75例HPV35中有18例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为76.0％。HPV分型试剂盒鉴定的55例HPV39中有5例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为90.9％。HPV分型试剂盒鉴定的60例HPV45中有8例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为86.7％。HPV分型试剂盒鉴定的58例HPV51中有4例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为93.1％。HPV分型试剂盒鉴定的55例HPV52中有3例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为94.5％。HPV分型试剂盒鉴定的56个HPV35中有15例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为75.0％。HPV分型试剂盒鉴定的55个HPV58中有6例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为89.1％。HPV分型试剂盒鉴定的55个HPV59中有10例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为81.8％。HPV分型试剂盒鉴定的55个HPV68中有11例在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；符合率为80.0％。HPV分型试剂盒鉴定的201例阴性样本和阴性对照在60min内浊度变化曲线均没有出现“S型”曲线；阴性符合率(特异性)为100％。HPV分型试剂盒鉴定的766例阳性样本中有650例和阳性对照在60min内浊度变化曲线均为“S型”曲线；阳性符合率(敏感性)为84.9％(650/766×100％＝84.9％)。总体的符合率为88.0％((650+201)/967×100％＝88.0％)。
采用统计学分析HPV分型试剂盒的检测结果和本发明提供的试剂盒的检测结果(Kappa＝0.700，P<0.0001)。结果表明，两种试剂盒的诊断结果一致性较好。由此可见，本发明提供的试剂盒具有较高的准确性。考虑到LAMP方法对于检测条件的要求较低，未来有可能开发成为一种家庭式的自我筛查方法，具有良好的应用前景。
<110> 中国人民解放军总医院第五医学中心
<120> 用于快速检测13种高危型HPV的LAMP引物组合及应用
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<170> PatentIn version 3.5
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<210> 52
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 52
aagggtagca atggtagaga accatagacc cactaggcgt a 41
<210> 53
<211> 24
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<213> Artificial sequence
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ccctccgagt tctgtatatg ttgc 24
<210> 54
<211> 18
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<213> Artificial sequence
<400> 54
aacagatatc ccgcacag 18
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<211> 18
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ccatgtcacc atcctcaa 18
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gtgggaggtt tacagccaat taaacccagg gtctgataac agg 43
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ggtgagcatt ggggtaaagg aatggaggac aatcagtagc 40
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tgttgcctgt aacaataatg cagc 24
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ccagataaca cagtatatga tcctaac 27
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gcaggtacac agccaataat acac 24
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cactgagtcc tacccctaaa ggttgttttt ctcaacgctt ggtctgg 47
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gatgacactg aaaactctca tgtagctttt gctgagtttg tttataatcc acag 54
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gctgttgata ccaaagatac acgtg 25
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ctgcagatgt atatggagac agta 24
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gttaaataac tgggagtctg aggat 25
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agtgtcccct accatgcccc ttttacgtag ggaacagtta tttgct 46
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<400> 67
taagggcact gacatacgtg acagttttcc atagacccac taggcgag 48
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 68
ctctattcca aaaatgccta gca 23
Claims (10)
1.引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物组HPV16、引物组HPV18、引物组HPV31、引物组HPV33、引物组HPV35、引物组HPV39、引物组HPV45、引物组HPV51、引物组HPV52、引物组HPV56、引物组HPV58、引物组HPV59和引物组HPV68组成；
(a2)包括引物组HPV16、引物组HPV18、引物组HPV31、引物组HPV33、引物组HPV35、引物组HPV39、引物组HPV45、引物组HPV51、引物组HPV52、引物组HPV56、引物组HPV58、引物组HPV59和引物组HPV68；
(a3)引物组HPV16、引物组HPV18、引物组HPV31、引物组HPV33、引物组HPV35、引物组HPV39、引物组HPV45、引物组HPV51、引物组HPV52、引物组HPV56、引物组HPV58、引物组HPV59或引物组HPV68；
引物组HPV16由引物HPV16-F3、引物HPV16-B3、引物HPV16-FIP、引物HPV16-BIP和引物HPV16-LB组成；
所述引物HPV16-F3的核苷酸序列如序列表中序列1所示；
引物HPV16-B3的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
引物HPV16-FIP的核苷酸序列如序列表中序列3所示；
引物HPV16-BIP的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
引物HPV16-LB的核苷酸序列如序列表中序列5所示；
引物组HPV18由引物HPV18-F3、引物HPV18-B3、引物HPV18-FIP、引物HPV18-BIP、引物HPV18-LB和引物HPV18-LF组成；
引物HPV18-F3的核苷酸序列如序列表中序列6所示；
引物HPV18-B3的核苷酸序列如序列表中序列7所示；
引物HPV18-FIP的核苷酸序列如序列表中序列8所示；
引物HPV18-BIP的核苷酸序列如序列表中序列9所示；
引物HPV18-LB的核苷酸序列如序列表中序列10所示；
引物HPV18-LF的核苷酸序列如序列表中序列11所示；
引物组HPV31由引物HPV31-F3、引物HPV31-B3、引物HPV31-FIP、引物HPV31-BIP和引物HPV31-LF组成；
引物HPV31-F3的核苷酸序列如序列表中序列12所示；
引物HPV31-B3的核苷酸序列如序列表中序列13所示；
引物HPV31-FIP的核苷酸序列如序列表中序列14所示；
引物HPV31-BIP的核苷酸序列如序列表中序列15所示；
引物HPV31-LF的核苷酸序列如序列表中序列16所示；
引物组HPV33由引物HPV33-F3、引物HPV33-B3、引物HPV33-FIP、引物HPV33-BIP和引物HPV33-LF组成；
引物HPV33-F3的核苷酸序列如序列表中序列17所示；
引物HPV33-B3的核苷酸序列如序列表中序列18所示；
引物HPV33-FIP的核苷酸序列如序列表中序列19所示；
引物HPV33-BIP的核苷酸序列如序列表中序列20所示；
引物HPV33-LF的核苷酸序列如序列表中序列21所示；
引物组HPV35由引物HPV35-F3、引物HPV35-B3、引物HPV35-FIP、引物HPV35-BIP和引物HPV35-LF组成；
引物HPV35-F3的核苷酸序列如序列表中序列22所示；
引物HPV35-B3的核苷酸序列如序列表中序列23所示；
引物HPV35-FIP的核苷酸序列如序列表中序列24所示；
引物HPV35-BIP的核苷酸序列如序列表中序列25所示；
引物HPV35-LF的核苷酸序列如序列表中序列26所示；
引物组HPV39由引物HPV39-F3、引物HPV39-B3、引物HPV39-FIP、引物HPV39-BIP、引物HPV39-LB和引物HPV39-LF组成；
引物HPV39-F3的核苷酸序列如序列表中序列27所示；
引物HPV39-B3的核苷酸序列如序列表中序列28所示；
引物HPV39-FIP的核苷酸序列如序列表中序列29所示；
引物HPV39-BIP的核苷酸序列如序列表中序列30所示；
引物HPV39-LB的核苷酸序列如序列表中序列31所示；
引物HPV39-LF的核苷酸序列如序列表中序列32所示；
引物组HPV45由引物HPV45-F3、引物HPV45-B3、引物HPV45-FIP、引物HPV45-BIP和引物HPV45-LB组成；
引物HPV45-F3的核苷酸序列如序列表中序列33所示；
引物HPV45-B3的核苷酸序列如序列表中序列34所示；
引物HPV45-FIP的核苷酸序列如序列表中序列35所示；
引物HPV45-BIP的核苷酸序列如序列表中序列36所示；
引物HPV45-LB的核苷酸序列如序列表中序列37所示；
引物组HPV51由引物HPV51-F3、引物HPV51-B3、引物HPV51-FIP、引物HPV51-BIP、引物HPV51-LB和引物HPV51-LF组成；
引物HPV51-F3的核苷酸序列如序列表中序列38所示；
引物HPV51-B3的核苷酸序列如序列表中序列39所示；
引物HPV51-FIP的核苷酸序列如序列表中序列40所示；
引物HPV51-BIP的核苷酸序列如序列表中序列41所示；
引物HPV51-LB的核苷酸序列如序列表中序列42所示；
引物HPV51-LF的核苷酸序列如序列表中序列43所示；
引物组HPV52由引物HPV52-F3、引物HPV52-B3、引物HPV52-FIP、引物HPV52-BIP和引物HPV52-LF组成；
引物HPV52-F3的核苷酸序列如序列表中序列44所示；
引物HPV52-B3的核苷酸序列如序列表中序列45所示；
引物HPV52-FIP的核苷酸序列如序列表中序列46所示；
引物HPV52-BIP的核苷酸序列如序列表中序列47所示；
引物HPV52-LF的核苷酸序列如序列表中序列48所示；
引物组HPV56由引物HPV56-F3、引物HPV56-B3、引物HPV56-FIP、引物HPV56-BIP和引物HPV56-LB组成；
引物HPV56-F3的核苷酸序列如序列表中序列49所示；
引物HPV56-B3的核苷酸序列如序列表中序列50所示；
引物HPV56-FIP的核苷酸序列如序列表中序列51所示；
引物HPV56-BIP的核苷酸序列如序列表中序列52所示；
引物HPV56-LB的核苷酸序列如序列表中序列53所示；
引物组HPV58由引物HPV58-F3、引物HPV58-B3、引物HPV58-FIP、引物HPV58-BIP和引物HPV58-LB组成；
引物HPV58-F3的核苷酸序列如序列表中序列54所示；
引物HPV58-B3的核苷酸序列如序列表中序列55所示；
引物HPV58-FIP的核苷酸序列如序列表中序列56所示；
引物HPV58-BIP的核苷酸序列如序列表中序列57所示；
引物HPV58-LB的核苷酸序列如序列表中序列58所示；
引物组HPV59由引物HPV59-F3、引物HPV59-B3、引物HPV59-FIP、引物HPV59-BIP和引物HPV59-LB组成；
引物HPV59-F3的核苷酸序列如序列表中序列59所示；
引物HPV59-B3的核苷酸序列如序列表中序列60所示；
引物HPV59-FIP的核苷酸序列如序列表中序列61所示；
引物HPV59-BIP的核苷酸序列如序列表中序列62所示；
引物HPV59-LB的核苷酸序列如序列表中序列63所示；
引物组HPV68由引物HPV68-F3、引物HPV68-B3、引物HPV68-FIP、引物HPV68-BIP和引物HPV68-LF组成；
引物HPV68-F3的核苷酸序列如序列表中序列64所示；
引物HPV68-B3的核苷酸序列如序列表中序列65所示；
引物HPV68-FIP的核苷酸序列如序列表中序列66所示；
引物HPV68-BIP的核苷酸序列如序列表中序列67所示；
引物HPV68-LF的核苷酸序列如序列表中序列68所示。
2.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定高危型HPV；
(h2)用于检测待测样本中是否含有高危型HPV。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定高危型HPV；
(h2)用于检测待测样本中是否含有高危型HPV。
4.如权利要求2所述的应用或权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述高危型HPV为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种。
5.权利要求3或4所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
6.一种检测待测病毒是否为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59或HPV68的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用引物组HPV16可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV16；
如果采用引物组HPV18可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV18；
如果采用引物组HPV31可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV31；
如果采用引物组HPV33可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV33；
如果采用引物组HPV35可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV35；
如果采用引物组HPV39可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV39；
如果采用引物组HPV45可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV45；
如果采用引物组HPV51可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV51；
如果采用引物组HPV52可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV52；
如果采用引物组HPV56可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV56；
如果采用引物组HPV58可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV58；
如果采用引物组HPV59可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV59；
如果采用引物组HPV68可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为HPV68。
7.一种检测待测样本中是否含有高危型HPV的方法，高危型HPV为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用引物组HPV16可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV16；
如果采用引物组HPV18可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV18；
如果采用引物组HPV31可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV31；
如果采用引物组HPV33可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV33；
如果采用引物组HPV35可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV35；
如果采用引物组HPV39可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV39；
如果采用引物组HPV45可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV45；
如果采用引物组HPV51可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV51；
如果采用引物组HPV52可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV52；
如果采用引物组HPV56可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV56；
如果采用引物组HPV58可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV58；
如果采用引物组HPV59可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV59；
如果采用引物组HPV68可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有HPV68。
8.权利要求1所述引物组合在检测待测病毒是否为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59或HPV68中的应用。
9.权利要求1所述引物组合在检测待测样本中是否含有高危型HPV中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述高危型HPV为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68中的至少一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190806 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |