CN101503741A

CN101503741A - 用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用

Info

Publication number: CN101503741A
Application number: CNA200910047010XA
Authority: CN
Inventors: 朱旭平; 朱勤玮; 马丽丽
Original assignee: SHANGHAI ZHIJIANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2009-03-04
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2029-03-04
Also published as: CN101503741B

Abstract

本发明涉及宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的辅助诊断试剂盒，公开了一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，包括高危型HPV核酸荧光PCR检测混合液和Taq酶。本发明还公开了上述用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的试剂盒，可以用于检测高危型人乳头瘤病毒，克服了现有技术对人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测的假阳性率高、特异性低和费用昂贵等问题。

Description

用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV)的诊断试剂，具体涉及一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用。

背景技术

HPV是人乳头瘤病毒的英文缩写，是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似。目前已经确定的HPV型别大约有80余种，依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13个型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关。大量的子宫颈癌病因学研究证实，高危型HPV感染是子宫颈癌发生的必要因素。HPV感染持续存在最终导致宫颈癌变，故宫颈癌是可预防的特殊癌症。因此，筛查预警HPV对早期发现宫颈癌极为重要。

HPV不能在体外培养，所以对它的检测严格依赖于其DNA序列分子水平的检查，目前对HPV的检测诊断方法主要有以下几种：

(一)子宫颈细胞抹片及ELISA法

子宫颈细胞抹片检查是传统的HPV检测方法，但其假阴性率高，可达20％～30％。ELISA方法是另一种传统检测方法，由于制备相应型的单抗工作繁琐，只能用于个别亚型的鉴定，到目前为止，此方法已逐渐被取代。

(二)杂交捕获检测法

美国Digene公司的H C-II杂交捕获法检测方法，可以检测高、低危群体的HPV病毒，但这种分类试剂盒，假阳性率高(50％～60％)、特异性低(37％～64％)、且费用昂贵，未能达到一般用家的要求。

(三)PCR检测法

与传统的细胞抹片检查相比，PCR检测灵敏度高，可检测极微量的HPV DNA。但是由于涉及多次扩增，容易有交替污染，以至假阳性率偏高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用。

本发明的技术原理如下：

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。本发明采用Taqman荧光定量PCR原理，设计针对HPV核酸序列型特异性引物，扩增HPV型特异性核酸序列，同时设计Taqman探针，针对HPV型特异性序列，位于上下游引物之间。针对HPV序列的探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。

基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)的试剂盒，包括：高危型HPV核酸荧光PCR检测混合液；其中，高危型HPV核酸荧光PCR检测混合液是指：含有高危型人乳头瘤病毒的上游引物、下游引物、探针、PCR-MIX和H₂O的混合溶液。其中，高危型人乳头瘤病毒特异性引物与特异性探针的浓度可由本领域技术人员根据PCR技术所需的常规条件来确定。

所述PCR-MIX为含有PCR扩增缓冲液、Mg2+和dNTP的混合溶液，可以由Linktech购得，也可自行配制。

所述高危型人乳头瘤病毒包括：HPV16型人乳头瘤病毒、HPV 18型人乳头瘤病毒、HPV 31型人乳头瘤病毒、HPV 33型人乳头瘤病毒、HPV 35型人乳头瘤病毒、HPV 39型人乳头瘤病毒、HPV 45型人乳头瘤病毒、HPV 51型人乳头瘤病毒、HPV 52型人乳头瘤病毒、HPV 56型人乳头瘤病毒、HPV 58型人乳头瘤病毒、HPV 59型人乳头瘤病毒和HPV 68型人乳头瘤病毒。

所述高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液中含有一种或一种以上类型的高危型人乳头瘤病毒特异性引物及相应种类的高危型人乳头瘤病毒特异性探针；其中高危型人乳头瘤病毒特异性引物的序列选自SEQ ID NO：14-39，高危型人乳头瘤病毒特异性探针的序列选自SEQ ID NO：1-13。

所述高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液选自下列核酸荧光PCR检测混合液中的一种或多种：HPV16型和HPV 56型核酸荧光PCR检测混合液、HPV18型和HPV 45型核酸荧光PCR检测混合液、HPV35型和HPV 59型核酸荧光PCR检测混合液、HPV39型和HPV 51型核酸荧光PCR检测混合液、HPV58型和HPV52型核酸荧光PCR检测混合液、HPV31型核酸荧光检测PCR混合液、HPV33型核酸荧光PCR检测混合液和HPV68型核酸荧光PCR检测混合液。

上述HPV16型和HPV56型核酸荧光PCR检测混合液是指同时含有HPV16型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV16型人乳头瘤病毒特异性探针、HPV56型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV56型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

上述HPV18型和HPV45型核酸荧光PCR检测混合液是指同时含有HPV18型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV18型人乳头瘤病毒特异性探针、HPV45型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV45型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

上述HPV35型和HPV59型核酸荧光PCR检测混合液是指同时含有HPV35型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV35型人乳头瘤病毒特异性探针、HPV59型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV59型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

上述HPV39型和HPV 51型核酸荧光PCR检测混合液是指同时含有HPV39型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV39型人乳头瘤病毒特异性探针、HPV51型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV51型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

上述HPV58型和HPV 52型核酸荧光PCR检测混合液是指同时含有HPV58型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV58型人乳头瘤病毒特异性探针、HPV52型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV52型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

上述HPV31型核酸荧光检测PCR混合液是指含有HPV31型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV31型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

上述HPV33型核酸荧光PCR检测混合液和是指含有HPV33型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV31型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

上述HPV68型核酸荧光PCR检测混合液是指含有HPV68型人乳头瘤病毒特异性引物、HPV31型人乳头瘤病毒特异性探针和PCR-MIX的混合溶液。

优选的，所述高危型人乳头瘤病毒特异性引物为各类型HPV中的HPV L1基因的特异性引物。

更优选的，所述高危型人乳头瘤病毒特异性引物的序列如下：

HPV16-1 5’-ATGTACCAATGTTGCAGTAAATC-3’ SEQ ID NO：14

HPV16-2 5’-TTCACTTTTGTTAGCCTGTAATG-3’ SEQ ID NO：15

HPV56-1 5’-ACGCACTAGTATATTTTATCATGC-3’ SEQ ID NO：16

HPV56-2 5’-GATATGCACTAACTTTGGGAATG-3’ SEQ ID NO：17

HPV18-1 5’-AAGCGTAAACGTGTTCCC-3’ SEQ ID NO：18

HPV18-2 5’-TGCGAGTCACATAATCATCAG-3’ SEQ ID NO：19

HPV45-1 5’-GGTATCCGCATATCAGTATAGG-3’ SEQ ID NO：20

HPV45-2 5’-ACGACCAATTTCCATACCTAC-3’ SEQ ID NO：21

HPV35-1 5’-GATTTCCAGACACATCATTTTATG-3’ SEQ ID NO：22

HPV35-2 5’-ACCACTAATACCTACTCCTAATG-3’ SEQ ID NO：23

HPV59-1 5’-AGTTACCTGATCCCAATAAATTTG-3’ SEQ ID NO：24

HPV59-2 5’-ACTGAGTCCTACCCCTAAAG-3’ SEQ ID NO：25

HPV39-1 5’-GATGATTATGTTACACGCACAG-3’ SEQ ID NO：26

HPV39-2 5’-TGATATGCAGACACCTTTGG-3’ SEQ ID NO：27

HPV51-1 5’-TGAAGCTGAAACAGGTTTTATAC-3’ SEQ ID NO：28

HPV51-2 5’-TTGCATAAGATGAAGACATAGATG-3’ SEQ ID NO：29

HPV58-1 5’-GTCCTCTGCACTCACATAC-3’ SEQ ID NO：30

HPV58-2 5’-ATGGACTAGACATAGATGTTACAG-3’ SEQ ID NO：31

HPV52-1 5’-CCTGTCTCTAAGGTTGTAAGC-3’ SEQ ID NO：32

HPV52-2 5’-AAAATAGGGATGTCCTACTGTTAG-3’ SEQ ID NO：33

HPV31-1 5’-ACAGTAGGCCATCCATATTATTC-3’ SEQ ID NO：34

HPV31-2 5’-ACGAACCCTAAATACCCTATATTG-3’ SEQ ID NO：35

HPV33-1 5’-ATTTAAGTCCTATTGTGCCTTTAG-3’ SEQ ID NO：36

HPV33-2 5’-AGCATAAACATCATACAAACCATC-3’ SEQ ID NO：37

HPV68-1 5’-TTTTACAGATGGCATTGTGG-3’ SEQ ID NO：38

HPV68-2 5’-GTGCGTGTCACATAATCATC-3’ SEQ ID NO：39

优选的，所述高危型人乳头瘤病毒特异性探针为各类型HPV中的HPV L1基因的特异性探针。

更优选的，所述高危型人乳头瘤病毒特异性探针的序列如下：

HPV16 5’-agTcCaTaGcAcCaa-3’ SEQ ID NO：1

HPV56 5’-ttcAcgAttGctTgccg-3’ SEQ 1D NO：2

HPV18 5’-acTcTtGcCaCaGaa-3’ SEQ ID NO：3

HPV45 5’atGcCcAaAcCaAac-3’ SEQ IDNO：4

HPV35 5’-cctGccTccAgcGt tt-3’ SEQ ID NO：5

HPV59 5’-cccGacCgaTttCaaca-3’ SEQ ID NO：6

HPV39 5’-tccTgcTtgCgaCcac-3’ SEQ ID NO：7

HPV51 5’-cccAcaCacAccAcacc-3’ SEQ ID NO：8

HPV58 5’-tccTttGccAccAcacg-3’ SEQ ID NO：9

HPV52 5’-atcGagAacTgcCtgca-3’ SEQ ID NO：10

HPV31 5’-tcCtGaCaCcTtTgg-3’ SEQ ID NO：11

HPV33 5’-ccaCacCgtGccAaatg-3’ SEQ ID NO：12

HPV68 5’-acaAccTtcGccActg-3’ SEQ ID NO：13

所述高危型人乳头瘤病毒特异性探针的两端均设有荧光基团和淬灭基团，优选的，荧光基团选自FAM或VIC，淬灭基团为非荧光淬灭基团。更优选的，所述高危型人乳头瘤病毒特异性核酸探针的3’端使用BHQ1淬灭基团进行标记；其中HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV58和HPV68型人乳头瘤病毒特异性核酸探针的5’端使用FAM荧光基团进行标记，HPV56、HPV45、HPV59、HPV51、HPV52、HPV31和HPV33型人乳头瘤病毒特异性核酸探针的5’端使用VIC荧光基团进行标记。

优选的，上述试剂盒还包括Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV阳性对照品或H₂O。所述高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液、Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV阳性对照品或H₂O分别独立包装。

本发明第二方面，公开了上述用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)样品的核酸裂解处理：将样品洗涤后加入核酸提取液充分混匀，沸水水浴后离心，取上清液作为PCR反应模板；

2)试剂配制：将每种类型的高危型HPV核酸荧光PCR检测混合液中分别加入Taq酶；

3)PCR扩增：在步骤2中制得的混合液中分别加入步骤1中制得的PCR反应模板进行PCR扩增反应，并且分别设置阳性对照组和阴性对照组同时进行PCR扩增反应；

4)通过检测PCR反应体系中荧光信号值来确定样品中HPV的含量，荧光通道检测选用FAM和VIC通道。

上述阳性对照是指以等量的阳性对照品替换样本制得的对照组。

上述阴性对照是指以等量的H2O替换样本制得的对照组。

所述步骤3)中的PCR扩增反应的循环参数设置为：95℃保温2分钟；93℃ 10秒和62℃50秒交替循环40次；单点荧光检测在62℃。

所述步骤4)的检测过程中，以6-15个循环的荧光信号作为基线值，以刚好超过H₂O检测荧光曲线的最高点的值作为阈值点。

上述用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的使用方法，在定性检测高危型人乳头瘤病毒时，如果与高危型HPV病毒核酸荧光PCR检测混合液中Taqman探针一端的荧光基团相对应的检测通道的检测结果为Ct<40，则检测样本为该类型的高危型HPV病毒阳性样本。

当上述检测混合液FAM、VIC通道Ct值≥40，检测样本判定为阴性。

上述样品包括生殖泌尿道分泌物棉拭子及宫颈细胞和组织活检标本等。

本发明采用Taqman荧光PCR法对样品中的高危型HPV进行检测，该检测方法具有如下特点：(1)缩短了检测时间，整个过程所需时间只需2小时左右，操作简便；(2)特异性引物和探针的设计使其结合了PCR的高灵敏性、探针技术的高特异性和光谱技术的高精确定量的优点，其敏感性和特异性均高于其它传统方法，避免了交叉反应；(3)在检测过程中采用闭管体系，以及全自动定量分析，不需要普通定性PCR的后处理，避免了扩增产物污染造成的假阳性结果；(4)Taqman荧光探针经处理后，只有与待测模板完全匹配的结合，才会发生荧光报告基团的切割，产生荧光的消长，因而也避免了引物非特异性扩增而导致假阳性的问题。

本发明采用组合的方式对样品中的高危型HPV进行检测，与现有技术相比，具有如下优点：(1)提高了检测效率。现有的检测技术，均为每种HPV单独检测，由于荧光定量PCR仪上的样品放置孔有限，因此一次试验只能检测几个标本。本发明以组合方式将不同型的HPV混合进行检测，使得每次试验的检测标本数增加，从而提高了检测效率；(2)降低检测成本。

本发明中将不同型的HPV检测液混合，节省了成本，更适合用于临床使用。

附图说明

图1HPV16型和HPV 56型阳性对照品扩增曲线图。

图2HPV18型和HPV 45型阳性对照品扩增曲线图。

图3HPV35型和HPV 59型阳性对照品扩增曲线图。

图4HPV39型和HPV 51型阳性对照品扩增曲线图。

图5HPV58型和HPV 52型阳性对照品扩增曲线图。

图6HPV(31、33、68型)阳性对照品扩增曲线图。

图7标本1扩增曲线图。

图8标本2扩增曲线图。

图9标本3扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实验中仪器原料来源及试剂配方：

原料及试剂厂家

特异性引物 Biosearch

Taq酶 Linktech

Taqman探针 Biosearch

PCR-MIX Linktech

仪器型号厂家

PCR仪 ABI7000 Application Binary Interface

实施例1 人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒检测混合液的制备方法：1、按照如下序列合成寡核苷酸探针：

2、核酸荧光PCR检测混合液的制备：

(1)、HPV16型和HPV 56型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)16型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；人乳头瘤病毒(HPV)56型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCRMIX-20μl/test；去离子水10.4μl/test混匀。

(2)、HPV18型和HPV 45型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)18型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；人乳头瘤病毒(HPV)45型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCRMIX-20μl/test；去离子水10.4μl/test混匀。

(3)、HPV35型和HPV59型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)35型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；人乳头瘤病毒(HPV)59型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCRMIX-20μl/test；去离子水10.4μl/test混匀。

(4)、HPV39型和HPV51型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)39型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；人乳头瘤病毒(HPV)51型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCRMIX-20μl/test；去离子水10.4μl/test混匀。

(5)、HPV58型和HPV52型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)58型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；人乳头瘤病毒(HPV)52型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCRMIX-20μl/test；去离子水10.4μl/test混匀。

(6)、HPV31型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)31型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCR MIX-20μl/test；去离子水13μl/test混匀。

(7)、HPV33型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)33型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCR MIX-20μl/test；去离子水13μl/test混匀。

(8)、HPV68型核酸荧光PCR检测混合液的制备：

将人乳头瘤病毒(HPV)68型上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCR MIX-20μl/test；去离子水13μl/test混匀。

实施例2 人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒的使用：

标本来源：所用标本来自于临床医疗单位。

2.1 检测标本的处理：

标本中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中，13,000rpm离心5分钟。沉淀加无菌生理盐水1ml混匀，13,000rpm离心5分钟，再重复洗涤一次。沉淀直接加入50μl核酸提取液充分混匀，沸水浴10分钟，然后13,000rpm离心5分钟，取上清4μl作为PCR反应模板。

2.2 试剂配制：

(1)取36μl HPV16型和HPV56型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

(2)取36μl HPV18型和HPV45型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

(3)取36μl HPV35型和HPV59型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

(4)取36μl HPV39型和HPV51型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

(5)取36μl HPV58型和HPV52型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

(6)取36μl HPV31型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

(7)取36μl HPV33型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

(8)取36μl HPV68型核酸荧光PCR检测混合液与0.4μlTaq酶，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。

2.3 加样：上述各混合液36μl分别置于薄壁PCR反应管或PCR反应板中，然后将已处理标本、阳性对照品、H₂O 4μl分别加入薄壁PCR反应管或PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，立即进行PCR扩增反应。

2.4PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：95℃保温2分钟；再按93℃×10秒→62℃×50秒，循环40次；单点荧光检测在62℃。反应体系为40μl。荧光通道检测选择：选用FAM和VIC通道。

2.5检测结果：

检测结果

标本1 HPV 52，58型

标本2 HPV 56型

标本3 HPV 16，18，45，56型

HPV 16，56型阳参阳性

HPV 18，45型阳参阳性

HPV 35，59型阳参阳性

HPV 39，51型阳参阳性

HPV 58，52型阳参阳性

HPV 31型阳参阳性

HPV 33型阳参阳性

HPV 68型阳参阳性

检测结果如图1-10中所示。

上述检测结果与临床单位检测结果一致。

实施例3 人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒临床灵敏度和特异性试验：

3.1 标本：临床已进行HPV高危型分型的的标本50个

3.2 标本的处理、试剂配置、加样和PCR扩增同实例1

3.3 检测结果：

50例标本中，人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒检测结果与临床单位检测结果均为阳性42例，人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒灵敏度为97.67％；人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒检测结果与临床单位检测结果均为阴性7例，人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒特异性为100％；人乳头瘤病毒(HPV)高危型分型检测试剂盒准确性为98％。具体试验结果见下表。

检测结果

标本编号临床单位检测结果试剂盒检测结果

1 16 16

2 58 58

3 16 16

4 58 58

5 11、33、68 11、33、68

6 16 16

7 - -

8 52 -

9 58 58

10 16 16

11 33 33

12 59 59

13 52、58 52、58

14 52 52

15 33 33

16 16 16

17 16 16

18 16、31、52 16、31、52

19 - -

20 16、31 16、31

21 - -

22 52 52

23 - -

24 58 58

25 52 52

26 16 16

27 33、52、11 33、52、11

28 16 16

29 - -

30 52 52

31 16、33 16、33

32 58 58

33 16 16

34 16、18、52、58 16、18、52、58

35 31、35、51、59 31、35、51、59

36 16 16

37 45、52、58 45、52、58

38 16 16

39 33 33

40 16 16

41 68 68

42 18、33 18、33

43 33 33

44 56 56

45 16 16

46 16、68 16、68

47 - -

48 - -

49 16、52、58 16、52、58

50 58 58

序列表

<110>上海之江生物科技有限公司

<120>用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用

<130>090003

<160>39

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

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Claims

1.一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，包括：高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液；其中，高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液中含有高危型人乳头瘤病毒特异性引物、高危型人乳头瘤病毒特异性探针、PCR-MIX和H₂O。

2.如权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒包括：HPV16型人乳头瘤病毒、HPV 18型人乳头瘤病毒、HPV 31型人乳头瘤病毒、HPV3 3型人乳头瘤病毒、HPV 35型人乳头瘤病毒、HPV 39型人乳头瘤病毒、HPV 45型人乳头瘤病毒、HPV 51型人乳头瘤病毒、HPV 52型人乳头瘤病毒、HPV 56型人乳头瘤病毒、HPV 58型人乳头瘤病毒、HPV 59型人乳头瘤病毒和HPV 68型人乳头瘤病毒。

3.如权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液中含有一种或一种以上类型的高危型人乳头瘤病毒特异性引物及相应种类的高危型人乳头瘤病毒特异性探针；其中高危型人乳头瘤病毒特异性引物的序列选自SEQ ID NO：14-39，高危型人乳头瘤病毒特异性探针的序列选自SEQ ID NO：1-13。

4.如权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液选自下列核酸荧光PCR检测混合液中的一种或多种：HPV16型和HPV 56型核酸荧光PCR检测混合液、HPV18型和HPV 45型核酸荧光PCR检测混合液、HPV35型和HPV 59型核酸荧光PCR检测混合液、HPV39型和HPV 51型核酸荧光PCR检测混合液、HPV58型和HPV 52型核酸荧光PCR检测混合液、HPV31型核酸荧光检测PCR混合液、HPV33型核酸荧光PCR检测混合液和HPV68型核酸荧光PCR检测混合液。

5.如权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒特异性引物为HPV L1基因的特异性引物。

6.如权利要求5所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述HPV16型和HPV56型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性引物的序列为SEQ ID NO：14-17；HPV18型和HPV 45型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性引物的序列为SEQ ID NO：18-21；HPV35型和HPV 59型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性引物的序列为SEQ ID NO：22-25；HPV39型和HPV 51型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性引物的序列为SEQ ID NO：26-29；HPV58型和HPV 52型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性引物的序列为SEQ ID NO：30-33；HPV31型核酸荧光检测PCR混合液中的特异性引物的序列为SEQ ID NO：34-35；HPV33型核酸荧光PCR检测混合液或HPV68型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性引物的序列为SEQID NO：36-39。

7.如权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒特异性探针为HPV L1基因的特异性探针。

8.如权利要求7所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述HPV16型和HPV 56型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性探针的序列为SEQ ID NO：1-2；HPV18型和HPV 45型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性探针的序列为SEQ ID NO：3-4；HPV35型和HPV 59型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性探针的序列为SEQ ID NO：5-6；HPV39型和HPV51型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性探针的序列为SEQ ID NO：7-8；HPV58型和HPV52型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性探针的序列为SEQ ID NO：9-10；HPV31型核酸荧光检测PCR混合液中的特异性探针的序列为SEQ ID NO：11；HPV33型核酸荧光PCR检测混合液或HPV68型核酸荧光PCR检测混合液中的特异性探针的序列为SEQ IDNO：12-13。

9.如权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒特异性探针的两端均设有荧光基团和淬灭基团。

10.如权利要求9所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FAM或VIC。

11.如权利要求9所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述淬灭基团为非荧光淬灭基团。

12.如权利要求11所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述淬灭基团为BHQ1基团。

13.如权利要求8所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒特异性探针的3’端使用BHQ1淬灭基团进行标记；其中HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV58和HPV68型高危型人乳头瘤病毒特异性探针的5’端使用FAM荧光基团进行标记，HPV56、HPV45、HPV59、HPV51、HPV52、HPV31和HPV33型高危型人乳头瘤病毒特异性探针的5’端使用VIC荧光基团进行标记。

14.如权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV阳性对照品或H₂O。

15.如权利要求14所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液、Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV阳性对照品或H₂O分别独立包装。

16.如权利要求1-15中任一权利要求所述用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1)样品的核酸裂解处理：将样品洗涤后加入核酸提取液混匀，沸水水浴后离心，取上清液作为PCR反应模板；

2)试剂配制：在每种类型的高危型人乳头瘤病毒核酸荧光PCR检测混合液中分别加入Taq酶；

4)检测各个PCR反应体系中的荧光信号值，荧光通道检测选用FAM和VIC通道。

17.如权利要求16所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括：在定性检测高危型人乳头瘤病毒时，如果与高危型HPV病毒核酸荧光PCR检测混合液中Taqman探针相对应的检测通道的检测结果为Ct<40，则检测样本为该类型的高危型HPV病毒阳性样本。

18.如权利要求16所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的循环参数设置为：95℃保温2分钟；93℃ 10秒和62℃ 50秒交替循环40次；单点荧光检测在62℃。