CN103540682A - 用于人乳头瘤病毒16基因检测的生物试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于人乳头瘤病毒16（HPV16）基因检测的生物试剂盒、其制备方法以及在基因检测方面的应用。本发明的技术方案涉及引物和探针的设计、合成和纯化以及细胞提取液的配置和标准品的制备。所述试剂盒的组分包括：DNA提取液，HPV16PCR反应液，HPV16强阳性质控品和阴性质控品。采用本发明的试剂盒可通过PCR基因扩增的方法进行HPV16基因检测，实现对HPV16的筛查和临床诊断。本发明的试剂盒用于基因检测的步骤简便、检测效率高、结果可靠。

Description

用于人乳头瘤病毒16基因检测的生物试剂

技术领域

本发明涉及分子生物学领域的基因检测技术，尤其涉及用于人乳头瘤病毒16（HPV16）基因检测的生物试剂、其制备方法以及基因的检测方法。

背景技术

人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）是一种最小的DNA（脱氧核糖核酸）病毒。HPV呈球形，直径约为45～55nm，具有嗜上皮性，在人和动物中分布广泛。HPV在自然界中广泛存在，人类感染HPV十分普遍，感染率也很高。综合国外一些报道，在自然人群中HPV感染率从低于1％到高达50％，在性活跃人群中20％～80％以上的人有HPV感染史。

HPV病毒在临床上可分为许多的亚型，而不同亚型的病毒可能导致不同的疾病。另外，根据致病力的程度或危险性大小，可将不同的亚型分为低危和高危两大类，其中HPV高危亚型的感染会引起生殖器癌和子宫颈癌上皮细胞病变。人乳头瘤病毒16（HPV16）属于高危亚型，是宫颈癌的重要致病因素。

目前宫颈癌的筛查主要是基于细胞学的检测方法，有宫颈巴氏（Pap）涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查（TCT）等多种。

宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30%。TCT法会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有特异性强、灵敏度高的检测试剂盒，用于快速检测人乳头瘤病毒16（HPV16）类型。HPV16检测简单易行，标本可由医生采集或患者自取，是对细胞学检测方法的重要补充。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于人乳头瘤病毒16型（HPV16）基因检测的生物试剂、制备方法以及基因检测方法。

一方面，本发明提供了一种用于HPV16基因检测的试剂盒。所述试剂盒的组分包括：引物、探针、Taq聚合酶、10×buffer缓冲液、dNTP、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

其中，合成的引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成。根据HPV的不同分型设计不同引物和探针。

另一方面，本发明还提供了用于HPV16基因检测的试剂盒的制备方法，其包括下述步骤：

1）确定待测基因片段：根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片断；

2）根据所述待测基因片段设计并生产引物和探针，采用多核苷酸合成仪生产所述引物；

3）提取细胞基因组DNA：用DNA提取液提取病人基因组及对照组基因组DNA；

4）确定PCR扩增条件，其包括酶、探针、引物、基因组DNA用量及PCR的扩增条件：不同组合的引物片断，根据实验结果的特异性，敏感性等技术特征，反复试验，同时进行多条所述待测基因片断的检测反应，最终确定包括所述引物、探针最佳浓度及酶的最佳反应条件，其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测；

5）进行重复性检测以进一步确定反应条件：通过大量实验，反复比较实验结果中包括清晰度和灵敏性的因素，最终确定反应条件；

6）根据最终确定的所述反应条件，制备试剂盒，其组分包括：引物、探针、dNTP、10×buffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

又一方面，本发明还提供了采用本发明试剂盒进行HPV16基因检测的方法。

采用本发明的试剂盒进行HPV16基因检测，其中所述试剂盒的组分包括：细胞提取液、引物、探针、dNTP、10×buffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

本发明以用基因组提取试剂盒提取的患者的细胞基因组DNA为模板，用试剂盒提供的引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20μL反应体系，按照特定的比例分别加入，采用PCR基因扩增技术，实现对HPV的基因检测。

具体实验步骤如下：

1）试剂准备：取PCR反应液备用。

2）加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品(包括和强阳性质控品)上清液1μl，8,000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

3）程序编辑：按对应顺序设置阴性质控品、以及未知标本（含阳性质控品），并在样本参数中设置样品名称。设置程序后运行。

本发明的技术关键涉及引物和探针的设计、合成和纯化以及细胞提取液的配置和标准品的制备。

本发明的优点是采用PCR基因扩增的方法检测基因分型，方法设计和流程比较简单；医院的投入比较少，一般医院的设备就可以检测；使用方便，无需特殊仪器和酶切步骤；检测耗时较短；检测效率高，结果可靠、有效，可用于HPV的筛查和临床诊断，具有相当大的市场潜力。

基因扩增是所有DNA分析技术中最灵活和灵敏的手段，本发明以PCR为基础的检测方法是进行HPV DNA检测及分型的最好方法。本发明的试剂盒及其方法可以应用于检测、病毒负荷定量、DNA测序和突变分析，也可以进行多重扩增，同时分析多个DNA序列。

附图说明

有关本发明的上述简要介绍以及下述的详细描述，结合附图会得到更好的理解。

图1描述用试剂盒提取b，c，d三个临床样本的基因组。图中：a表示HPV16阳性对照组，b，c，d分别为三个感染HPV患者的临床样本基因组，e表示阴性对照组。采用HPV16引物16F1，16R1和探针16P1进行PCR，FAM荧光信号检测；结果如图1所示，a显示为标准S型曲线、b，c，d样本的曲线也为S曲线，e显示为直线。因此确定b，c，d患者感染HPV为16亚型。

具体实施方式

在对本发明作进一步描述之前，应当理解本发明并不局限于下述有关发明的具体实施方式。同时也应当理解，本文所使用的术语只是用于针对特定的实施方式进行描述，而不是用来进行限制。

所用DNA合成仪为德国polygen，引物的制备方法是采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

检测中所需要的仪器设备主要有：DNA合成仪，荧光PCR仪等。

本试剂盒检测分析的原理是：按照HPV16病毒镶嵌在人体基因组中，而正常人中没有，因此，当以两种人的基因组为模板进行聚合酶链式反应的扩增时，病人出现病毒的目的条带即S曲线，而正常人不出现条带即无S曲线。用此种方法来检测宫颈癌病人。

实施例1.引物的制备

本例中引物的制备包括以下步骤：

用德国polygenDNA合成仪合成引物和探针，

1）打开仪器和软件。

2）校准试剂选择滑块和校准10个柱子的滑块。

3）开启自动冲洗功能将液体充满各个管子。

4）用CPG填充柱子滑块中的孔。

在合成以前，应将柱子滑块里填充正确的CPG，柱子中填充好的CPG含有对应的3’端的核苷酸，因为仪器合成寡核苷酸的顺序是从3’端到5’端完成的。

注意：加CPG过程中不能突然触击滤膜，否则可能会有泄漏出现。

5）将滑块装到仪器上。

6）合成开始前，输入所需要的序列作为主程序，按开始键开始运行。

7）运行完后，将滑块从设备中卸下来，用戳子的细头端将柱子里的材料和滤膜去除掉。操作人员将柱子滑块附到模型台架上，并安装稳固。用小收集管将CPG收集好，进行下一步处理。

8）将寡核苷酸与CPG分离，通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，用PAGE方法纯化引物，用水稀释完后通过微量紫外分光光度计测定其含量。

NCBI上找到HPV16序列，用primer express软件根据序列设计出引物和探针，再通过NCBI上BLAST比对，发现该引物探针序列是HPV16的特异性序列，因此将其作为检测HPV16的引物和探针。

设计合成引物（16F1和16R1）和探针（16P1）序列见下表：

名称	序列
		16F1	TCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAA
16R1	TGTCCAACTGCAAGTAGTCTGGAT
		16P1	FAM-CACGGATGAATATGTTGCAC-MGB NFQ

实施例2.试剂盒的组建

DNA提取液（500μl/管）2管，HPV16PCR反应液（19μl/管）20管，HPV16强阳性质控品（200μl/管）1管，阴性质控品（150μl/管）1管。其中，上述HPV16PCR反应液中包括，例如，超纯水14.3μl，10×buffer2μl，d NTP0.4μl，引物16F10.4μl，16R10.4μl，探针16P10.4μl。

实施例3.试剂盒的操作及检测结果

在0.2mL的PCR管里面，加入患者模板（50ng/μl），瞬时离心混匀后放入PCR仪中，其中PCR反应体系和反应条件如下：

1）PCR反应体系（20μl）

HPV16PCR反应液18μl，模板2μl；

其中PCR反应液的配置：超纯水14.3μl，10×buffer2μl，d NTP0.4μl，引物16F10.4μl，16R10.4μl，探针16P10.4μl。

2）扩增程序

60°C30s→95°C2min→95°C15s→60°C1min（共40个循环）。

通过本发明实施方式获得针对正常对照组和感染HPV16基因扩增的对照结果（见图1）。

本文中使用的所有技术和科学术语，除非另有定义，具有本发明所属领域的普通技术人员通常能够理解的含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法、装置和材料可以被用于本发明的实施或检测，在此所描述的是优选的方法、装置和材料。

在上述的说明书中针对一些优选实施方式进行了描述，并且为说明的目的而提供了许多细节情况，然而本领域的技术人员应该能够理解到本发明可以有各种各样的变化和更多不同的实施方式，而且本文所描述的细节可以有相当的变化而不会偏离本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.一种用于人乳头瘤病毒16（HPV16）基因检测的试剂盒，其包括DNA提取液，HPV16PCR反应液，HPV16强阳性质控品和阴性质控品，其中：

所述HPV16PCR反应液包括超纯水，缓冲液，dNTP，引物16F1和16R1，以及探针16P1；

所述引物16F1的序列为TCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAA，所述引物16R1的序列为TGTCCAACTGCAAGTAGTCTGGAT，所述探针16P1的序列为FAM-CACGGATGAATATGTTGCAC-MGB NFQ。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括：DNA提取液2管；HPV16PCR反应液20管；HPV16强阳性质控品1管；阴性质控品1管。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括：DNA提取液2管，500μl/管；HPV16PCR反应液20管，19μl/管；HPV16强阳性质控品1管，200μl/管；阴性质控品1管，150μl/管；其中，所述HPV16PCR反应液包括超纯水14.3μl，10×buffer缓冲液2μl，d NTP0.4μl，引物16F10.4μl，16R10.4μl，探针16P10.4μl。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成，并且根据HPV的不同分型而设计。

5.用于制备权利要求1所述的试剂盒的方法，其包括下述步骤：

1）确定待测基因片段：根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片断；

2）根据所述待测基因片段设计并生产引物和探针，采用多核苷酸合成仪生产所述引物；

3）提取细胞基因组DNA：用DNA提取液提取病人基因组及对照组基因组DNA；

4）确定PCR扩增条件，其包括酶、探针、引物、基因组DNA用量及PCR的扩增条件：不同组合的引物片断，根据实验结果的特异性，敏感性等技术特征，反复试验，同时进行多条所述待测基因片断的检测反应，最终确定包括所述引物、探针最佳浓度及酶的最佳反应条件，其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测；

5）进行重复性检测以进一步确定反应条件：通过大量实验，反复比较实验结果中包括清晰度和灵敏性的因素，最终确定反应条件；

6）根据最终确定的所述反应条件，制备试剂盒，其组分包括：引物、探针、dNTP、10×buffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

6.采用权利要求1所述的试剂盒进行HPV基因检测的方法，其包括：

以用基因组提取试剂盒提取的患者的细胞基因组DNA为模板，用试剂盒提供的引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20μL反应体系，按照特定的比例分别加入；

采用PCR基因扩增技术，进行PCR反应，实现对HPV的基因检测；

PCR结束后，采用琼脂糖专用电泳仪进行电泳、EB染色、成像并进行基因分型，从而实现对HPV的基因检测。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其中所述PCR反应进一步包括：

在0.2mL的PCR管里面，加入患者模板（50ng/μl），瞬时离心混匀后放入PCR仪中，在设定的PCR反应体系和扩增程序条件下获得针对正常对照组和感染HPV16基因扩增的对照结果。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其中所述PCR反应体系和反应条件包括：

PCR反应体系（20μl），包括：HPV16PCR反应液18μl，模板2μl；其中PCR反应液的配置：超纯水14.3μl，10×buffer2μl，d NTP0.4μl，引物16F10.4μl，16R10.4μl，探针16P10.4μl；

扩增程序，包括：60°C30s→95°C2min→95°C15s→60°C1min（共40个循环）。

Images