CN105018584A

CN105018584A - 用于K-ras基因突变检测的生物试剂

Info

Publication number: CN105018584A
Application number: CN201410180978.0A
Authority: CN
Inventors: 钟建; 方平科
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明提供了用于K-ras基因突变检测的生物试剂及其制备方法和用于基因突变检测的用途。所述试剂的组分包括：特异性引物、探针、DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物、标准品、阴性质控品和超纯水。所述试剂盒的制备方法包括：确定待测基因片段，根据所述待测基因片段设计并生产引物，设计多对引物与探针组合配对，制备试验标准品并定量，确定实时荧光PCR的反应体系以及扩增条件，进行重复性检测以最终确定反应条件，根据所述反应条件制备试剂盒。采用本发明的试剂盒可通过PCR基因扩增的方法进行K-ras基因突变检测，实现对大肠癌的筛查和临床诊断。本发明的试剂盒用于基因检测的步骤简便、检测效率高、结果可靠。<pb pnum="1" />

Description

用于K-ras基因突变检测的生物试剂

技术领域

本发明涉及分子生物学领域的基因检测技术，尤其涉及用于K-ras基因突变检测的生物试剂、其制备方法以及在基因检测的方面的应用。

背景技术

人类大多数细胞中都表达Ras基因,其家族有3个成员,分别为H-ras、N-ras、K-ras。其中K-ras基因位于人类基因12号染色体P12.1,含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸组成的RAS蛋白，分子量为21kDa，又称p21蛋白。K-ras基因的突变使Ras蛋白一直处于激活状态,影响信号转导途径，使信号传递通道处于持续激活状态，刺激细胞不断地生长或分化，最终导致细胞的恶性转化。K-ras基因突变在胰腺癌、结肠癌和肺癌最为常见,在胰腺癌组织高达90％以上，在肺癌中则以肺腺癌为主,突变率为20％～30％，结直肠癌K-ras基因突变率在各个国家和地区并不相同,在欧美为30％～68％，台湾、新加坡和日本为17％～28％,在中国为14％～43.8％。

K-ras基因状态是很多癌症患者选择治疗方案和预测表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体治疗疗效的一个重要指标。有些单抗是以EGFR为作用靶点，与EGFR高亲和力结合后阻止生长因子的结合，受体活化和随后导致细胞增殖的信号通道传导，在肿瘤治疗中发挥作用。K-ras蛋白是一种鸟嘌呤核苷(GDP/GTP)结合蛋白，具有水解GTP的能力，正常的K-ras蛋白能被来自细胞表面受体接受的信号短暂地激活，从GDP结合形式转变为GTP结合形式。在正常细胞中，K-ras蛋白几乎全部与GDP结合，处于非激活状态。K-ras基因是受上游EGFR信号调控的，K-ras蛋白的12、13和61位点是与GTP酶激活蛋白GAP相互作用，K-ras原癌基因的单位点突变可导致氨基酸替换，K-ras基因突变后，阻断了GAP激活K-ras癌基因GTP酶的作用，使结合于K-ras蛋白的GTP不能被水解，从而使K-ras蛋白处于持续激活状态，不受上游EGFR信号影响，引起细胞癌变，同时EGFR下的信号通路不受阻止，会导致EGFR单克隆抗体治疗效果减弱，肿瘤细胞继续增殖生长。

因此，K-ras基因突变检测是预测抗EGFR抗体治疗疗效的重要指标是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的大肠癌患者，有助于实现肿瘤治疗的个体化，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敏感度高、特异性强、高效快捷的用于K-ras基因突变检测的生物试剂，以用于筛查结肠癌、胰腺癌或肺癌的高危人群，及早预测肿瘤抗EGFR抗体治疗疗效的重要指标，指导临床用药，从而降低治疗风险，减轻患者病痛和经济负担。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于K-ras基因突变检测的生物试剂、其制备方法以及在基因突变检测方面的应用。

一方面，本发明提供了一种K-ras基因突变检测的试剂盒。所述试剂盒的组分包括：特异性引物、荧光探针、DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物、标准品、阴性质控品和超纯水。

其中，引物是由CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP等原料合成。引物和探针是根据K-ras基因的特定片段设计的。

所述试剂盒的原理是使用荧光基团标记探针，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，在没有PCR扩增时，由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光；而当PCR扩增时，引物与荧光探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间，利用Taq DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性水解探针，释放荧光基团，由于在空间上与淬灭基团分离则发荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到，边扩增边检测，这样就实现了实时监测，以达到检定K-ras2号外显子的第12和13密码子是否发生突变的目的。

另一方面，本发明还提供了用于K-ras基因突变检测试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

1)确定待测基因片段：根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片段，然后经研发过程中与待检测样本病例相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片段；

2)根据所述待测基因片段设计并生产引物与探针：设计多对引物与探针组合配对；

3)制备试验标准品并定量；

4)确定实时荧光PCR的反应体系，包括引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶、模板浓度，以及扩增条件：使用不同的引物与探针，根据实验结果的特异性、敏感性等技术特征，反复试验，比较实验结果中包括PCR扩增反应的荧光值，Ct值等，优化反应体系，最终确定引物与探针的序列、酶等反应体系与反应条件。其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测；

5)进行重复性检测以进一步确定反应条件：通过大量重复性实验，比较检测结果中关于敏感性、特异性以及准确性的因素，最终确定反应条件；

6)根据最终确定的反应条件，制备试剂盒，其组分包括：引物、探针、dNTP、反应缓冲液、Taq酶、标准品、阴性质控品和超纯水。

另一方面，本发明还提供了采用本发明试剂盒进行K-ras基因突变检测的方法。

采用本发明的试剂盒进行K-ras基因突变检测，其中所述的试剂盒组分包括：引物、探针、dNTP混合物、反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、标准品、阴性质控品和超纯水。

试剂盒根据待测目的基因序列设计了针对突变位点的探针引物组合，并提供了阳性对照样本和内参照样本用于对照实验。从临床肿瘤组织或其石蜡病理切片提取基因组DNA为模板，用试剂盒提供的引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20μl反应体系，按照特定的比例分别加入，进行实时荧光PCR反应，扩增结束后，通过分析探针释放的荧光值，确定样本K-ras基因某个位点是否突变。

本发明的技术关键涉及引物和探针的设计、合成和纯化、反应条件的优化和标准品的制备。

本发明可检测新鲜、冰冻或石蜡包埋病变组织K-ras基因2号外显子的第12和13密码子上的七种突变，检测效率高，敏感度高，特异性强，操作简便快捷；使用方便，无需特殊仪器。可以筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的癌症患者，选择对病人最有效的治疗方法，具有相当大的市场潜力。

附图说明

有关本发明的上述简要介绍以及下述的详细描述，结合附图会得到更好的理解。

图1为针对K-ras基因突变检测不同突变率(50％、10％、1％)10⁶copies质粒标准品的扩增曲线图。a表示50％突变率，b表示10％突变率，c表示1％突变率，e表示阴性对照。采用K-ras引物和探针进行PCR，FAM荧光信号检测，结果如图1所示，a-c显示为标准S型曲线，e显示为直线。

图2为针对K-ras基因突变检测不同浓度(10⁶-10³)的1％突变率质粒的扩增曲线图，A表示10⁶拷贝，B表示10⁵拷贝，C表示10⁴拷贝数，D表示10³拷贝数，E表示阴性对照。，结果如图1所示A-D显示有扩增曲线，E显示为直线。因此，本试剂盒可对低至1％的K-ras基因突变进行检测，检测样本模板DNA量在10³-10⁶拷贝(2-200ng)范围内。

具体实施方式

在对本发明作进一步描述之前，应当理解本发明并不局限于下述有关发明的具体实施方式。同时也应当理解，本文所使用的术语只是针对特定的实施方式进行描述，而不是用来进行限制的。

检测所需的主要设备有：DNA合成仪、荧光定量PCR仪。

实施例1.临床疾病检测突变位点的确定

通过查阅文献，经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的突变检测位点。

K-ras基因突变主要(90％以上)为发生在2号外显子的第12和13密码子上七种单位点突变，七种突变分别为G12S(34G>A),G12R(34G>C),G12C(34G>T),G12D(35G>A),G12A(35G>C),G12V(35G>T)和G13D(38G>A)。本发明主要用于检测K-ras基因这七个突变位点的检测，以作为预测抗EGFR抗体治疗疗效的重要指标。

实施例2.试剂盒的各引物的制备

本试剂盒引物的制备所用DNA合成仪为德国polygen，引物的制备方法是采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

1)打开仪器和软件，校准试剂选择滑块和校准10个柱子的滑块；

2)开启自动冲洗功能将液体充满各个管子，用CPG填充柱子滑块中的孔。在合成以前，应将柱子滑块里填充正确的CPG，预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；

3)将滑块装到仪器上，输入所需要的序列作为主程序，按开始键开始运行。合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′-端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；缩合反应中可能有极少数(少于2％)5′-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉；在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯；

4)运行完后，将滑块从设备中卸下来，用戳子的细头端将柱子里的材料和滤膜去除掉。操作人员将柱子滑块附到模型台架上，并安装稳固。用小收集管将CPG收集好，进行下一步处理。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上；再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去；合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率；通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀；沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量后，根据要求分装。

在本实验中，引物序列如下：

实施例3.KRAS基因突变检测试剂盒的组建

试剂盒的组分包括：通过实施例1所述方法合成的引物、探针、Taq聚合酶、dNTP、10×buffer缓冲液、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

实施例4.试剂盒的操作及检测结果

在本实验中，在0.2mL的PCR管里面，加入样本DNA模板(2-200ng)和PCR反应液，混匀后瞬时离心。其中PCR反应体系如下：

在本实验中，PCR的反应条件如下：

通过本发明实施方式获得针对不同样本的K-ras基因扩增的对照结果(见图1和2)。

本文中使用的所有技术和科学术语，除非另有定义，具有本发明所属领域的普通技术人员通常能够理解的含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法、装置和材料可以被用于本发明的实施或检测，在此所描述的事任选的方法、装置和材料。

在上述的说明书中针对一些优选实施方式进行的描述，并且为说明的目的而提供了许多细节情况，然而本领域的技术人员应该能够理解到本发明可以有各种各样的变化和更多不同的实施方式，而且本文所描述的细节可以有相当的变化而不会偏离本发明的精神和范围内。

Claims

1.一种用于K-ras基因突变检测的生物试剂，包括引物、探针、DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物、标准品、阴性质控品和超纯水，其中，所述引物包括下述引物组合：

2.根据权利要求1所述的生物试剂，其中所述探针包括下述探针序列：

3.根据权利要求1所述的生物试剂，其中所述引物采用多核苷酸合成仪进行合成，其合成步骤包括：

1)开启仪器和软件，校准试剂选择滑块和校准10个柱子的滑块；

2)开启自动冲洗功能将液体充满各个管子，用CPG填充所述滑块中的孔，并确定在合成开始前所述滑块里填充正确的CPG，预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；

3)将所述滑块装到所述仪器上，输入所需要的序列作为主程序，并开始运行进行合成；

4)运行完后，将所述滑块从所述仪器卸下来，去除所述柱子里的材料和滤膜，将所述滑块附到模型台架上并安装稳固，收集CPG进行下一步处理；

经过上述四个步骤，脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上；再以三氯乙酸脱去5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去；合成过程中可观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率；通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀；沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量后，根据要求分装。

4.权利要求1或2所述的试剂的制备方法，其包括下述步骤：

3)制备试验标准品并定量；

4)确定实时荧光PCR的反应体系，包括引物、探针、Taq DNA聚合酶、模板浓度，以及扩增条件：使用不同的引物与探针，根据实验结果的特异性、敏感性等技术特征，反复试验，比较实验结果中包括PCR扩增反应的荧光值，Ct值等，优化反应体系，最终确定引物与探针的序列、酶等反应体系与反应条件；其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测；

根据最终确定的反应条件，制备试剂盒，其组分包括：引物、探针、dNTP、反应缓冲液、Taq酶、标准品、阴性质控品和超纯水。

5.采用权利要求1或2所述的生物试盒进行K-ras基因突变检测的方法，其包括：

从临床肿瘤组织或其石蜡病理切片提取基因组DNA为模板，用所述引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20μl反应体系，按照特定的比例分别加入；

采用PCR基因扩增技术进行实时荧光PCR反应；

PCR结束后，通过分析探针释放的荧光值，确定样本K-ras基因某个位点是否突变。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述PCR反应体系和反应条件包括：PCR反应体系：

PCR反应条件：

从而进行所述PCR反应。