CN102965427A

CN102965427A - 女性生殖器癌症相关snp位点多重检测方法的建立

Info

Publication number: CN102965427A
Application number: CN 201110257784
Authority: CN
Inventors: 马学军; 刘颖; 张晨
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及正常体检人群的全血和口腔拭子等标本的6个女性生殖器癌症相关SNP位点(包括rs4784227、rs12196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同时检测和分型。具体在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下载SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)侧翼的核苷酸序列，设计各位点适用于T-ARMS-PCR技术的内外特异性引物，对6个SNP位点进行单管多重PCR分型。本发明通过多重嵌合引物PCR技术和毛细管电泳两项改进，克服了常规单管四引物扩增受阻突变体系PCR不能多重检测的缺点，其高通量、简易快速的特点为女性生殖器癌症相关SNP位点的快速分型提供了新的手段，对研究我国女性生殖器癌症相关SNP位点的基因型分布和女性生殖器癌症的预防有重要意义。

Description

女性生殖器癌症相关SNP位点多重检测方法的建立

发明领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及正常体检人群的全血和口腔拭子等标本的6个女性生殖器癌症相关SNP位点(包括rs4784227、rs12196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同时检测和分型。具体在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下载SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)侧翼的核苷酸序列，设计各位点适用于T-ARMS-PCR技术的内外特异性引物，对6个SNP位点进行单管多重PCR分型。本专利通过多重嵌合引物PCR技术和毛细管电泳两项改进，克服了常规单管四引物扩增受阻突变体系PCR不能多重检测的缺点，其高通量、简易快速的特点为女性生殖器癌症相关SNP位点的快速分型提供了新的手段，对研究我国女性生殖器癌症相关SNP位点的基因型分布和女性生殖器癌症的预防有重要意义。

发明背景

在人类基因组序列中，单核苷酸多态性(single nucleotide polymerphisms，SNPs)是最常见的变异。已有研究表明，SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)和rs889312(C＞A)与亚裔女性的乳腺癌易感性相关，rs750749(T＞C)是子宫颈癌易感性相关位点，rs749292(G＞A)是卵巢癌易感性相关位点。对这6个位点快速准确的分型有助于女性生殖器癌症的预防。

在近年来发展出的多种SNP检测技术中，四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplificationrefractory mutation system PCR，T-ARMS-PCR)，或两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pairprimers，PCR-CTPP)因其操作简便、分型快速、费用低廉已被广泛应用。其原理为：针对已知的突变，在突变点的两侧分别设计一对外引物和一对特异性内引物，特异性内引物用来检测突变是否发生，外引物在PCR反应中和特异性内引物分别配对有选择性地扩增突变型与野生型个体基因；通过使外引物距突变点长度不同可以得到不同长度的特异性扩增片段，根据电泳图谱中片段大小和有无，可以判断突变是否发生以及个体的基因型。

目前，T-ARMS-PCR仍以单重检测为主，少数实验室也能实现多重检测(Multiplex-T-ARMS-PCR，M-T-ARMS-PCR)，但其可同时检测的位点数量难以进一步提高，主要受到两个限制：多重扩增的偏向性及琼脂糖电泳的分辨率。本实验通过引入多重嵌合引物PCR技术对T-ARMS-PCR进行了改进，在扩增初期使用特异性嵌合引物(即在特异性引物5’端引入通用序列)扩增，而扩增末期由通用引物引发扩增，从而在保证反应特异性的同时，降低了多重PCR的偏向性。此外应用分辨率较高的毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)替代琼脂糖电泳，建立了单管多重PCR同时检测女性生殖器癌症相关位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)的六位点检测方法。

发明内容

1.在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下载SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)侧翼的核苷酸序列，设计适用于T-ARMS-PCR技术的引物。在内引物的3’端倒数第二位(-2位)引入一个人为错配碱基来提高延伸反应的特异性，并在全部正向引物和反向引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(Tag-F和Tag-R)。使用PrimerPremier 5.0设计的引物序列如表1：

表1

表1 多重T-ARMS-PCR分型所使用的引物信息

注：下划线处为通用引物标签序列(Tag)；阴影部分的是为保证扩增特异性而特别设计的碱基，3’末端是多态位点，-2位是人为错配。

2.建立了如下的检测过程，详见如下：

(1)合成引物：特异性嵌合引物及上下游通用引物标签(Tag-F和Tag-R)由北京六合华大基因科技股份公司合成，PAGE纯化。

(2)外周静脉血标本，采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化)提取；口腔拭子DNA，采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(天根生化)提取。

(3)建立同时检测6个SNP位点的多重T-ARMS-PCR反应体系，并对其特异性进行验证。

具体实施方式

实施方案1：多重PCR扩增

使用Multiplex PCR Kit(QIAGEN)试剂盒。PCR反应体系为20μl，其中全血DNA模板0.5μl，口腔拭子DNA模板2μl，通用引物500nM，其余引物浓度见表1。PCR反应分6步扩增目的片段：第1步：95℃预变性10min；第2步：95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸45s，循环3次；第3步：95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸45s，循环10次；第4步：95℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸45s，循环20次；第5步：95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸45s，循环12次；第6步：72℃延伸5min，4℃保存。每份标本做2个重复。

实施方案2：毛细管电泳分离

采用

system(Qiagen)毛细管电泳系统，DNA high-resolution cartridge(Qiagen)及OH700方法作为分离条件，与QX Alignment Marker 15bp/500bp、QX DNA Size Marker 25-450bp配合使用，经Biocalculator software(Qiagen)软件分析，以对应长度的产物是否存在进行SNP分型。

实施方案3：测序验证

PCR反应体系25μl，其中全血DNA模板0.5μl，口腔拭子DNA模板2μl，Premix ExVersion 2.0(TakKaRa)12.5μl，各位点取不带Tag的外引物各500nM。PCR反应为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸45s，循环45次；72℃延伸5min，4℃保存。将产物进行测序，并将测序结果与M-T-ARMS-PCR电泳结果进行对照。

Claims

1.一种用于同时检测女性生殖器官癌症相关SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)的多重PCR技术，其中包括：用于检测的rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)的型特异性内、外引物。

2.权力要求1所述的多重PCR技术的引物和通用引物包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。

3.权力要求1所述的多重PCR检测技术用于检测包括女性生殖器官癌症相关SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)。

4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括正常体检人群的全血和口腔拭子等标本的6个女性生殖器癌症相关SNP位点(包括rs4784227、rs12196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同时检测和分型。

5.权力要求1所述的同时检测女性生殖器官癌症相关SNP位点rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)的多重PCR技术的反应程序和检测程序。