CN103740831B - 一种指导β-受体阻断药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种指导β-受体阻断药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明试剂盒包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包括以下3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如SEQ ID NO.1～NO.11所示；其使用方法包括采集样本并提取核酸的步骤；以提取的核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品的步骤，优点是特异性强、准确度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。

Description

一种指导β-受体阻断药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及多重基因检测试剂盒及其使用方法，尤其是涉及一种指导β-受体阻断药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
β-受体阻断药是五种一线降压药之一，受体阻滞剂是能选择性地与β肾上腺素受体结合、从而拮抗神经递质和儿茶酚胺对β受体的激动作用的一种药物类型。肾上腺素受体分布于大部分交感神经节后纤维所支配的效应器细胞膜上,其受体分为3种类型,即β1受体、β2受体和β3受体。β1受体主要分布于心肌,可激动引起心率和心肌收缩力增加;β2受体存在于支气管和血管平滑肌,可激动引起支气管扩张、血管舒张、内脏平滑肌松弛等;β3受体主要存在于脂肪细胞上,可激动引起脂肪分解。这些效应均可被β受体阻滞剂所阻断和拮抗。研究表明，降压药物的疗效与药物遗传多态性有密切关系，如能在用药前测定病人的基因类型，有目的地选择药物和药物剂量，既可使疾病得到及时有效的治疗、减少不良反应的发生，也能减少医疗费用的支出。
现有的单核苷酸多态性（SNP）检测方法主要为基因芯片法、荧光定量PCR（qPCR）和Sanger测序法。
(1)qPCR检测方法：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点是（1）通量低：不适宜多SNP位点的检测；难以设置内控基因。(2)成本较高：探针标记成本高；若需获得所有相关SNP信息，需进行多个检测试验，叠加成本更加昂贵。
(2)基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测。其优点是：（1）高通量并行检测；（2）操作简便快速：整个检测只需4-8小时基本可以出结果。缺点：1）不同SNP位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制；2）技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3）重复性差，准确性低，易出现假阳性假阴性结果；4）灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5）由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。
（3）Sanger（双脱氧链终止法）测序法：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。其优点是SNP分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，多个SNP位点检测累计价格相对昂贵。
多重SNP位点检测方法基于多重PCR和毛细管电泳（CE）分离技术。采用多重PCR方法，在同一个反应管中同时加入≥1对特异性基因扩增引物及反应内参引物，根据基因扩增片段的大小用毛细管电泳分离分析多个SNP位点及基因型，能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势：
1、高通量：本系统实现单个反应检测30-40个位点。
2、准确性强：采用CE对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；
3、敏感性高，结果重复性好：本系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定性的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度；
4、方法简便，使用经济：本发明提供从试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；
5、灵活性强：可随时根据需求调整检测的靶基因。
6、易于实现自动化。
目前，国内外还没有关于基于多重PCR和CE的多重SNP检测指导β-受体阻断药用药的试剂盒及其使用方法的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于多重SNP检测系统的指导β-受体阻断药用药的引物组合物。
本发明所要解决的技术问题还在于提供包含上述引物组合物的试剂盒及其使用方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术手段是：一种用于指导β-受体阻断药用药的引物组合物，包括以下3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下表1所示：
表1
上述CACNA1C基因上rs1051375片段的A型基因和G型基因的正向扩增引物均为核酸序列SEQ ID NO.1：ACTCGTCCACCGGCTCCAAC；上述LDLR基因上rs688片段的C型基因和T型基因的反向扩增引物均为核酸序列SEQ ID NO.6：CTTGCATCTCGTACGTAAGCC；上述ADRB2基因上rs1042714片段的C型基因和G型基因的反向扩增引物均为核酸序列SEQ ID NO.9：GGCCAGTGAAGTGATGAAGTAG。
一种包括上述引物组合物的用于指导β-受体阻断药用药的多重基因检测试剂盒，还包括PCR反应液和阳性对照品。所述PCR反应液包括以下组分：超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶。
所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.12所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID NO.13所示;所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
所述的阳性对照品为上述3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
上述的指导β-受体阻断药用药的多重基因检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：
（1）采集样本并提取核酸
采集患者口腔拭子或血液样品，从中提取核酸；
（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应
取DNA样品2μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁3.4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶0.6μL，X溶液2μL，超纯水10μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃1分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQID NO.12所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID NO.13所示；所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ IDNO.1～NO.11所示；
（3）毛细电泳分离样品
取PCR产物0.1-1μL，上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指导β-受体阻断药用药相关基因的SNP位点的等位基因型。
本发明与现有技术相比，其具有以下有益效果：本发明引物组合物、试剂盒及使用方法基于多重PCR和毛细电泳技术，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分不同的基因，创立了一种同步检测CACNA1C、LDLR、ADRB2三个基因的3个SNP位点上的不同基因型的检测方案，以指导β-受体阻断药的临床用药，本方法优化多重PCR反应体系，对待测DNA样品进行特异性扩增，再用毛细电泳方法分离PCR扩增产物以鉴别不同的基因和基因型，其一天之内可完成192个患者样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；反应内参的使用可用于监测整个反应系统、PCR反应的效率，避免假阴性。
本发明的引物组合物、包含该引物组合物的试剂盒可以指导β-受体阻断药的临床用药，具体如表2所示：
表2.β-受体阻断药用药指导多重基因检测检测靶标位点
综上所述，本发明是基于多重PCR-CE的指导β-受体阻断药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法，本发明同步对3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果；具有灵敏、准确、快速、高通量的技术优势，为临床提供一种优越的低成本的分子诊断方法，有助于β-受体阻断药安全有效地使用。
附图说明
图1为本发明毛细电泳分离样品结果标准图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明一种指导β-受体阻断药用药的多重基因检测试剂盒，使用时采集患者血液或口腔拭子样品提取核酸，以患者核酸为模板进PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1、生产β-受体阻断药用药指导的多重基因检测试剂盒，试剂盒中包括的组份：
1)PCR引物（PCR Primer Mix）
2)25mM氯化镁（MgCl2）
3)DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase）
4)X溶液（Solution X）
5)PCR缓冲液（PCR Buffer）
6)阳性对照（Positive Control）
7)超纯水（ddH2O）
上述PCR引物包括以下3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列参见表1或序列表SEQ ID NO.1～11所示。
所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.12所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID NO.13所示;所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
2、采集样本并提取核酸
采集患者口腔拭子或血液样品并提取核酸。
3、以提取的患者核酸为模板进行PCR反应
1）按以下比例在96孔样品板/八连管上加入试剂和样品（PCR板见表3），并设置一个阳性对照反应：
表3PCR反应试剂和样品混合比例
PCR反应试剂 量/孔
ddH2O 8
25mM MgCl2 3.4
10×PCR缓冲液 2
PCR引物溶液 2
X溶液 2
DNA样品/阳性对照 2
DNA聚合酶 0.6
Total 20μL
注：阳性对照为3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段，用量为1μL/反应。
2）混匀后按以下温度进行热循环反应（见表4）：
表4PCR反应条件
步骤 温度 时间
1 95℃ 1分钟
2 94℃ 30秒钟
3 55℃ 30秒钟
4 70℃ 1分钟
5 N/A 重复2-4步骤34次（共35次）
6 70℃ 1分钟
7 4℃ 持续:直至收取PCR产物
4、毛细电泳分离样品
1）制备CE样品（见表5）：
表5CE样品混合比例
名称 量/孔
上样缓冲液） 38.75μL
DNA大小标准400 0.5μL
PCR产物 0.1-1μL
矿物油 1滴
2）CE分离样品
将样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。
5、结果分析（具体方法见遗传分析仪说明书）
分析本试剂盒的CE检测数据，根据CACNA1C、LDLR和ADRB2特征峰出现的位置和数量，确定基因型。以CACNA1C基因为例：只出现CACNA1C_G（CE片段长度145nt）时，结果为CACNA1C G纯合子；只出现CACNA1C_A（CE片段长度142nt）时，结果为CACNA1C A纯合子；CACNA1C_G峰和CACNA1C_A峰同时出现，结果为CACNA1C杂合子。LDLR和ADRB2基因的结果判定方法与CACNA1C基因相同。
表6.本试剂盒检测的基因位点、反应内参的CE片段长度
注：表6、图1中的CACNA1C、LDLR和ADRB2为检测的基因位点，pcDNA为反应内参。
图1为一个人类DNA样品的检测结果，共出现7个特征峰：CACNA1C_A（142nt）、CACNA1C_G（145nt）、LDLR_C（157nt）、和LDLR_T（160nt）、ADRB2_C（204nt）、ADRB2_G（207nt）、pcDNA（218nt）。分析结果：CACNA1C、LDLR和ADRB2均为杂合子。该图1也可以作为标准图谱，后续测定其它样品的基因型时，可以将遗传分析仪软件获得的图谱与该标准图谱对比，获得指导β-受体阻断药用药相关基因的SNP位点的等位基因型。
实施例2
检测试剂盒特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于指导β-受体阻断药用药的引物组合物，其特征在于，包括以下3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参PcDNA的正反向扩增引物，其核酸序列如下：
2.一种指导β-受体阻断药用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合物、PCR反应液和阳性对照品；所述PCR反应液包括以下组分：超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶；
所述的X溶液包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO.12所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID NO.13所示；所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
3.根据权利要求2所述的一种指导β-受体阻断药用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品为上述3个与β-受体阻断药用药相关基因上的3个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
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