CN105316350B - 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途，该突变基因与正常EmbB基因相比，具有c.233A>G突变位点；本发明用候选基因筛查的方法，对中国18株耐乙胺丁醇结核菌株中进行检测，首次发现该基因突变位点，在耐乙胺丁醇的结核菌株中EmbB基因突变c.233A>G具有一定的发生频率，因此EmbB基因突变c.233A>G可以作为临床乙胺丁醇耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核分枝杆菌EmbB突变基因，以及用于检测导致结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因EmbB突变c.233A>G的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。
背景技术
人类结核病是由结核分枝杆菌引发的一类传染性很强的疾病，会累及全身多个器官和组织。该病的发生严重影响患者的生活和工作，并给家庭和社会带来了沉重的经济负担。由于发展中国家生活水平和医疗卫生水平低下，结核病在不发达国家的发病率高于发达国家。中国是人口大国，且属于发展中国家，因此结核病的发病率位于世界前列。虽然随着人们生活水平的提高，抗结核药物和卡介苗的应用，结核病的发病率有所降低。但是，结核病的发病率有上升的趋势。2013年，仅肺结核的患者就达到90万人，约占我国主要传染病患者的1/3，单纯肺结核死亡人数为2576人。随着抗生素耐药问题的出现和HIV患者的增多，耐药结核患者也有增多的趋势，且是目前结核病防治的难点和重点之一。有数据显示，HIV患者中，结核的联合感染率高达25%以上，且耐药结核菌株占半数以上。因此，对结核患者，特别是耐药结核患者的快速诊断，将有助于临床对结核患者的治疗方案的选择。
乙胺丁醇常与异烟肼、利福平、吡嗪酰胺一起联合使用治疗结核。该药物可干扰细胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成，抑制细胞壁阿拉伯聚糖层阿拉伯半乳聚糖和脂质阿拉伯甘露聚糖的聚合作用，诱导D-阿拉伯呋喃糖残基的积累。已经证实与结核菌耐EMB相关的最常见突变基因是embB基因，该基因全长3285 bp，编码阿拉伯糖基转移酶主要成分（阿拉伯糖基转移酶编码基因emb操纵子由embA、embB、embC三部分组成）。已有报道表明embB基因的306和406位氨基酸突变，改变了所编码酶的结构，产生耐药。Ramaswamy等通过检测临床耐乙胺丁醇药物菌株的embA基因，发现存在462和913位氨基酸突变。我们在实验中发现了一例乙胺丁醇耐药的患者存在embB基因78位氨基酸的突变。表明embB基因突变的检测可以快速提示乙胺丁醇耐药，从而选择适合患者的治疗药物。
由于多种原因的影响，结核的发病率和死亡率有逐年增多的趋势，特别是耐药结核患者的增多，给国家和家庭的经济都带来了很重的负担，更给患者带来了严重的压力。因此对耐药结核患者有针对性的进行耐药基因检测，会大大缩短药敏实验时间，为结核患者的有效治疗提供强有力的参考价值。乙胺丁醇与其他药物联合应用，会缩短结核患者的治疗周期，是临床常用的抗结核药物之一，因此对EmbB基因c.233A>G进行检测将有助于临床对耐药结核患者的快速诊断和治疗。经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌EmbB突变基因的方法，该结核分枝杆菌EmbB突变基因具有c.233A>G突变位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明另一目的是提供用于检测结核分枝杆菌EmbB突变基因的试剂盒，该试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌EmbB基因c.233A>G突变的试剂。
所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物。
本发明通过检测来自耐乙胺丁醇结核菌株的样本中是否存在EmbB基因的c.233A>G突变，从而判断该患者耐乙胺丁醇药物的耐药分子机制；其中c.233A>G突变位点为EmbB基因的突变，该突变导致EmbB基因第78位的天冬氨酸（Asp）突变为甘氨酸（Gly），这个氨基酸的改变，影响了阿拉伯糖基转移酶的活性，抑制了乙胺丁醇的药效，从而使该菌株产生耐药。
发明人用候选基因筛查的方法，在中国18株耐乙胺丁醇结核菌株中进行检测，在一株耐药结核菌种发现与耐乙胺丁醇相关的EmbB基因新突变c.233A>G，该突变的频率为5.6%，这说明在耐乙胺丁醇的结核菌株中，EmbB基因突变c.233A>G具有一定的发生频率，因此EmbB基因突变c.233A>G可以作为临床异乙胺丁醇耐药菌株耐药分子机制的诊断依据，并且目前，在国际和国内均未见该突变的报道。
本发明用于检测EmbB基因突变c.233A>G的试剂盒，包括用于检测EmbB基因的突变c.233A>G所需的试剂和能选用的用于扩增EmbB基因的试剂和PCR引物。
用于检测EmbB基因c.233A>G突变的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合：
（1）从待检样品中提取DNA的试剂；
（2）用于扩增结核菌样本DNA的EmbB基因c.233A>G突变的PCR引物和相关的PCR反应试剂；
（3）PCR产物纯化试剂；
（4）对PCR产物进行直接测序的试剂。
用于检测EmbB基因突变c.233A>G的试剂盒，所用的PCR引物为：
EmbB-F：5’-TGATTGGCTTTGTGTTGTCG-3’
EmbB-R：5’-GAACACCCCGACAATCTGCG-3’
用于检测EmbB基因突变c.233A>G的试剂盒，所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂及SNP分型检测试剂。
采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下：
（1）采集待测个体的样本，为培养的结核菌样本，提取全基因组DNA；
（2）以提取的DNA为模板，以本发明设计的针对EmbB基因c.233A>G突变的引物进行突变区段DNA序列的扩增，得到相应的PCR扩增产物；
（3）将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与EmbB基因的正常序列进行比对，确定c.233A>G突变是否存在；
（4）根据以上实验结果分析患者是否为EmbB基因突变c.233A>G导致的耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株；
（5）按照正常编码序列阅读框对突变序列进行翻译，进一步确定p.D78G突变的存在。
发明人在收集耐药结核分枝杆菌进行实验的过程中，收集到18株耐乙胺丁醇的结核菌株，在取得患者同意的前提下，对患者感染的结核分枝杆菌进行基因检测。同时，我们还收集了患者的基本信息和临床信息，详细询问了其感染和发病过程，建立了结核分枝杆菌耐药株的样本库。将灭活的结核分枝杆菌冻存于-80℃冰箱。用柱吸附的方法提取结核菌的基因组DNA，保存于-40℃冰箱，每份DNA样本具有对应的患者资料和耐药信息。用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，包括了结核菌EmbB基因104位到548位碱基的DNA片段，用于PCR扩增。PCR扩增产物直接用PCR引物进行正反向测序（测序所用仪器为ABI公司3730型DNA测序仪）。将得到的序列与GenBank中的序列（序列号：KM189805）进行比对，确定EmbB基因突变c.233A>G的存在，按照开放阅读框进行翻译，确定氨基酸突变p.SD78G的存在。
EmbB基因c.233A>G突变的核苷酸和氨基酸序列如下：
EmbB基因c.233A>G突变的核苷酸和氨基酸序列中，用方框标出的是突变的碱基和氨基酸，突变前第78位氨基酸是天冬酰胺，突变后为甘氨酸。该突变位于EmbB基因编码序列的第78位碱基，由野生型的腺嘌呤（A）变为鸟嘌呤（G），该突变使野生型的EmbB蛋白的第78位天冬酰胺突变成甘氨酸，导致EmbB蛋白的功能发生改变，进而引起乙胺丁醇的耐药。EmbB基因突变c.233A>G的检测能够用遗传领域的任意一种点突变检测方法进行，如PCR（聚合酶链反应）-RFLP法（限制性内切酶片段多态性）、PCR-测序法、DNA探针杂交法、位点特异性PCR法、PCR-dHPLC（变性高效液相色谱）、及PCR-SSCP（单链构象多态性）法。
上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。所用探针能是与突变EmbB基因核苷酸序列杂交，也可以有两个探针分别与正常或突变的EmbB基因核苷酸序列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或荧光物质标记。此外，还能够用位点特异的PCR引物、限制性内切酶或单链构象多态性的方法确定突变。
上述方法中使用的PCR引物依据已知的核苷酸序列进行设计，通常长度为18-25个碱基，GC含量在±45-55%，用引物设计软件Primer5和Oligo6设计PCR扩增引物，本发明中设计的PCR扩增引物序列为：
上游引物：5’-TGATTGGCTTTGTGTTGTCG-3’
下游引物：5’-GAACACCCCGACAATCTGCG-3’
本发明提供的检查EmbB基因c.233A>G突变的试剂盒，试剂盒内应装有用于检测EmbB基因c.233A>G突变的试剂，同时提供的是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。如采用PCR-直接测序法检测EmbB基因c.233A>G突变的试剂盒，含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液及测序所需试剂的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性成分，如扩增引物为本发明中所述的一对引物EmbB-F和EmbB-R，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够进行PCR扩增的酶。
本发明的优点在于：
1、试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者EmbB基因的突变位点，从而用于耐乙胺丁醇结核患者的诊断和治疗中；
2、能够用于在结核患者中大规模筛查乙胺丁醇耐药率，为诊断结核分枝杆菌患者的感染菌株是否具有乙胺丁醇耐药性提供服务及参考；
3、为耐乙胺丁醇的结核患者进行基因筛查提供准确和简单的方法；并为将来利用这一突变作为检测靶点针对耐药结核病进行治疗奠定坚实的基础。
附图说明
图1为结核分枝杆菌EmbB基因突变c.233A>G的序列图；
图2为EmbB基因PCR产物电泳检测示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：采集检测样本
收集到18株耐乙胺丁醇结核菌株，临床患者均为肺结核患者，经药敏乙胺丁醇（EMB 5 μg/m）试验检测结果可知，共获取18株耐乙胺丁醇结核菌株。耐乙胺丁醇患者平均年龄为33.8岁。男性患者占比72.22%（13/18），年龄介于15～60岁，平均年龄为33.5岁；女性患者占比27.78%（5/18），年龄介于14～60岁，平均年龄34.8岁。
实施例2：基因组DNA的提取
1、采用一次性接种环刮取结核菌菌培养菌落置于1.5 ml EP管中（尽量不要刮取到培养基）；
2、向菌体沉淀物的离心管中加入500μl细胞悬浮液（先检查是否已加入Lysozyme），使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮结核菌细胞沉淀，37℃温浴30 min每隔5-10min颠倒混匀数次，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，尽量吸净上清；
3、向菌体沉淀中加入225 μl缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；
4、向管中加入10μl蛋白酶K溶液，颠倒混匀；
5、加入25μl裂解缓冲液S，颠倒混匀；57℃水浴放置20 min，其间颠倒混匀数次；
6、加入250μl缓冲液B，振荡5 s充分混匀；
7、加250μl无水乙醇，充分振荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管内壁的水珠；
8、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）12000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
9、向吸附柱中加入500μl缓冲液C，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
10、向吸附柱中加入700μl漂洗液W2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；
11、向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。然后12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，将吸附柱置于一个新的1.5 ml离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
12、将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加135μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中，冻于-40℃，待实验研究使用。
实施例3：PCR扩增，电泳结果
以提取的结核分枝杆菌全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增基因为EmbB基因，所用引物5’-TGATTGGCTTTGTGTTGTCG-3’和5’-GAACACCCCGACAATCTGCG-3’。PCR扩增体系：2×PCR预混液25μL（含rTaq酶，TAKARA），正反向引物各1μM，模板DNA 50 ng，加入21 μL去离子水。
PCR反应条件为：94度变性5分钟，然后35个循环的（94度变性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分钟），最后终末72度延伸7分钟。扩增产物长度为445 bp，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，选用DL2000型号DNA marker作为PCR扩增产物对照，配制胶浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，120伏恒压条件下，电泳20-30分钟。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入EB染液中染色5-10分钟，置于紫外灯下观察电泳条带并进行记录，电泳结果见图2。
实施例4：测序结果
PCR产物送测序公司进行序列测定，测序引物为5’-TGATTGGCTTTGTGTTGTCG-3’，测序后经与结核分枝杆菌标准株序列进行对比，发现突变位点c.233A>G，突变序列见序列表，突变图谱见图1。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tgattggctt tgtgttgtcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gaacaccccg acaatctgcg 20
<210> 3
<211> 3297
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 3
atgacacagt gcgcgagcag acgcaaaagc accccaaatc gggcgatttt gggggctttt 60
gcgtctgctc gcgggacgcg ctgggtggcc accatcgccg ggctgattgg ctttgtgttg 120
tcggtggcga cgccgctgct gcccgtcgtg cagaccaccg cgatgctcga ctggccacag 180
cgggggcaac tgggcagcgt gaccgccccg ctgatctcgc tgacgccggt cggctttacc 240
gccaccgtgc cgtgcgacgt ggtgcgcgcc atgccacccg cgggcggggt ggtgctgggc 300
accgcaccca agcaaggcaa ggacgccaat ttgcaggcgt tgttcgtcgt cgtcagcgcc 360
cagcgcgtgg acgtcaccga ccgcaacgtg gtgatcttgt ccgtgccgcg cgagcaggtg 420
acgtccccgc agtgtcaacg catcgaggtc acctctaccc acgccggcac cttcgccaac 480
ttcgtcgggc tcaaggaccc gtcgggcgcg ccgctgcgca gcggcttccc cgaccccaac 540
ctgcgcccgc agattgtcgg ggtgttcacc gacctgaccg ggcccgcgcc gcccgggctg 600
gcggtctcgg cgaccatcga cacccggttc tccacccggc cgaccacgct gaaactgctg 660
gcgatcatcg gggcgatcgt ggccaccgtc gtcgcactga tcgcgttgtg gcgcctggac 720
cagttggacg ggcggggctc aattgcccag ctcctcctca ggccgttccg gcctgcatcg 780
tcgccgggcg gcatgcgccg gctgattccg gcaagctggc gcaccttcac cctgaccgac 840
gccgtggtga tattcggctt cctgctctgg catgtcatcg gcgcgaattc gtcggacgac 900
ggctacatcc tgggcatggc ccgagtcgcc gaccacgccg gctacatgtc caactatttc 960
cgctggttcg gcagcccgga ggatcccttc ggctggtatt acaacctgct ggcgctgatg 1020
acccatgtca gcgacgccag tctgtggatg cgcctgccag acctggccgc cgggctagtg 1080
tgctggctgc tgctgtcgcg tgaggtgctg ccccgcctcg ggccggcggt ggaggccagc 1140
aaacccgcct actgggcggc ggccatggtc ttgctgaccg cgtggatgcc gttcaacaac 1200
ggcctgcggc cggagggcat catcgcgctc ggctcgctgg tcacctatgt gctgatcgag 1260
cggtccatgc ggtacaaccg gctcacaccg gcggcgctgg ccgtcgttac cgccgcattc 1320
acactgggtg tgcagcccac cggcctgatc gcggtggccg cgctggtggc cggcggccgc 1380
ccgatgctgc ggatcttggt gcgccgtcat cgcctggtcg gcacgttgcc gttggtgtcg 1440
ccgatgctgg ccgccggcac cgtcatcctg accgtggtgt tcgccgacca gaccctgtca 1500
acggtgttgg aagccaccag ggttcgcgcc aaaatcgggc cgagccaggc gtggtatacc 1560
gagaacctgc gttactacta cctcatcctg cccaccgtcg acggttcgct gtcgcggcgc 1620
ttcggctttt tgatcaccgc gctatgcctg ttcaccgcgg tgttcatcat gttgcggcgc 1680
aagcgaattc ccagcgtggc ccgcggaccg gcgtggcggc tgatgggcgt catcttcggc 1740
accatgttct tcctgatgtt cacgcccacc aagtgggtgc accacttcgg gctgttcgcc 1800
gccgtagggg cggcgatggc cgcgctgacg acggtgttgg tatccccatc ggtgctgcgc 1860
tggtcgcgca accggatggc gttcctggcg gcgttattct tcctgctggc gttgtgttgg 1920
gccaccacca acggctggtg gtatgtctcc agctacggtg tgccgttcaa cagcgcgatg 1980
ccgaagatcg acgggatcac agtcagcaca atctttttcg ccctgtttgc gatcgccgcc 2040
ggctatgcgg cctggctgca cttcgcgccc cgcggcgccg gcgaagggcg gctgatccgc 2100
gcgctgacga cagccccggt accgatcgtg gccggtttca tggcggcggt gttcgtcgcg 2160
tccatggtgg ccgggatcgt gcgacagtac ccgacctact ccaacggctg gtccaacgtg 2220
cgggcgtttg tcggcggctg cggactggcc gacgacgtac tcgtcgagcc tgataccaat 2280
gcgggtttca tgaagccgct ggacggcgat tcgggttctt ggggcccctt gggcccgctg 2340
ggtggagtca acccggtcgg cttcacgccc aacggcgtac cggaacacac ggtggccgag 2400
gcgatcgtga tgaaacccaa ccagcccggc accgactacg actgggatgc gccgaccaag 2460
ctgacgagtc ctggcatcaa tggttctacg gtgccgctgc cctatgggct cgatcccgcc 2520
cgggtaccgt tggcaggcac ctacaccacc ggcgcacagc aacagagcac actcgtctcg 2580
gcgtggtatc tcctgcctaa gccggacgac gggcatccgc tggtcgtggt gaccgccgcg 2640
ggcaagatcg ccggcaacag cgtgctgcac gggtacaccc ccgggcagac tgtggtgctc 2700
gaatacgcca tgccgggacc cggagcgctg gtacccgccg ggcggatggt gcccgacgac 2760
ctatacggag agcagcccaa ggcgtggcgc aacctgcgct tcgcccgagc aaagatgccc 2820
gccgatgccg tcgcggtccg ggtggtggcc gaggatctgt cgctgacacc ggaggactgg 2880
atcgcggtga ccccgccgcg ggtaccggac ctgcgctcac tgcaggaata tgtgggctcg 2940
acgcagccgg tgctgctgga ctgggcggtc ggtttggcct tcccgtgcca gcagccgatg 3000
ctgcacgcca atggcatcgc cgaaatcccg aagttccgca tcacaccgga ctactcggct 3060
aagaagctgg acaccgacac gtgggaagac ggcactaacg gcggcctgct cgggatcacc 3120
gacctgttgc tgcgggccca cgtcatggcc acctacctgt cccgcgactg ggcccgcgat 3180
tggggttccc tgcgcaagtt cgacaccctg gtcgatgccc ctcccgccca gctcgagttg 3240
ggcaccgcga cccgcagcgg cctgtggtca ccgggcaaga tccgaattgg tccatag 3297
Claims (3)
1.一种结核分枝杆菌EmbB突变基因，其特征在于：该突变基因具有c.233A>G突变位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌EmbB突变基因在制备用于检测耐乙胺丁醇结核分枝杆菌试剂盒中的应用，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌EmbB基因c.233A>G突变的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物。
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Non-Patent Citations (4)
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| embCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without embB306 mutation;Claudia Plinke et al;《J Antimicrob Chemother》;20101231;第65卷;第1359-1367页 * |
| 河南省耐药结核分枝杆菌embB306密码子突变特征研究;邢进等;《中国卫生检验杂志》;20140831;第24卷(第15期);第2260-2262页 * |
| 浙江省耐药结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变特点研究;朱敏等;《医学研究杂志》;20081231;第37卷(第3期);第26-29页 * |
| 结核分枝杆菌embB基因突变检测的研究进展;刘珍琼;《江西医学检验》;20061231;第24卷(第6期);第555-556页 * |
Also Published As
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