CN106434964A - 用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物 - Google Patents
用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106434964A CN106434964A CN201610997690.1A CN201610997690A CN106434964A CN 106434964 A CN106434964 A CN 106434964A CN 201610997690 A CN201610997690 A CN 201610997690A CN 106434964 A CN106434964 A CN 106434964A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- embb
- mutation
- primer
- pcr
- mycobacterium tuberculosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 6
- 108700030985 Mycobacterium tuberculosis EmbB Proteins 0.000 title abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 6
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 abstract description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 13
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 12
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N pyrazinecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CN=CC=N1 IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[(3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl)oxymethyl]-3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl]oxy-2-(hydroxymethyl)-6-methyloxane-3,5-diol Chemical compound OC1C(OC)C(O)COC1OCC1C(O)C(OC)C(O)C(OC2C(C(CO)OC(C)C2O)O)O1 SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000189 Arabinogalactan Polymers 0.000 description 2
- 239000001904 Arabinogalactan Substances 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 235000019312 arabinogalactan Nutrition 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 229960005206 pyrazinamide Drugs 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 208000036984 extensively drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 1
- 125000003843 furanosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB 233‑F和EmbB 233G‑R是检测EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB 233‑F和EmbB 233A‑R是检测野生型菌株EmbB基因的特异性引物，16S 915‑F和16S 1018‑R为内参引物；本发明引物具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备要求不高，适合于在大规模的临床样本检测中推广应用；对结核分枝杆菌耐药性研究中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明提供了一种用于快速检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物组，属于耐药结核分支杆菌突变技术领域。
背景技术
结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，主要是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染导致。据WHO统计，结核分枝杆菌感染是传染病界的头号杀手，全球现有结核病患者约2000万，其中90%左右为肺结核患者。2014年，儿童约有100万结核病患者，约14万死亡病例。由此可见，结核病的发生和传染对全球社会和经济造成了严重的影响。
近年来由于抗结核药物的长期使用及滥用，导致耐药结核菌的产生。分为单耐药结核、多耐药结核（MDR-TB，Multidrug-resistant TB）和泛耐药结核（XDR-TB，Extensivelydrug-resistant TB），单耐药结核菌指针对单一药物耐受，多耐药结核为至少对异烟肼（Isonicotinic acid hydrazide，INH）、利福平（Rifampicin，RFP）耐药，泛耐药结核为至少对两种主要一线抗结核药物异烟肼、利福平耐药外，还对任何氟喹诺酮类（Quinolones）抗生素产生耐药，以及三种二线抗结核注射药物中的至少一种耐药。目前研究表明，结核分枝杆菌基因突变是其产生耐药性的主要原因。
乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）与异烟肼、利福平、吡嗪酰胺（Pyrazinamide， PZA）等属于一线抗结核药物，常联用治疗结核病。该药物可干扰细胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成，抑制细胞壁阿拉伯聚糖层阿拉伯半乳聚糖和脂质阿拉伯甘露聚糖的聚合作用，诱导D-阿拉伯呋喃糖残基的积累。已经证实结核分枝杆菌EmbB基因突变可导致乙胺丁醇耐药，该基因全长3285 bp，编码阿拉伯糖基转移酶主要成分（阿拉伯糖基转移酶编码基因Emb 操纵子由EmbA、EmbB、EmbC三部分组成）。Brossier等发现EmbB基因的306（A916G、A916T、G918S和G918C）和406（G1217C）位氨基酸突变，改变了所编码酶的结构，由此产生耐药。EmbB基因第78位密码子（A233G）突变是我们新发现的耐乙胺丁醇的突变，之前没有相关报道。
目前市场上已有的结核分枝杆菌耐乙胺丁醇药物突变检测试剂盒所用方法与本发明不同，这些试剂盒均以荧光定量PCR技术或一代测序技术为基础，无论仪器还是试剂，均比普通PCR使用成本高出很多，不适合在常规的实验室及医院中推广使用。等位基因特异PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法操作简便、快速，所需实验器材简单，实验试剂经济，因此该方法被广泛的应用于DNA突变或单核苷酸多态性（SNP）的检测。本发明不仅提供了简便、快速、经济的突变检查方法，还增加了突变的检查范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简易、经济的检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的AS-PCR特异性引物，其中EmbB 233-F EmbB 233G-R是检测EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB 233-F和EmbB 233A-R是检测野生型菌株EmbB基因的特异性引物，16S915-F和16S 1018-R为内参引物，引物序列如下：
；
该方法基于AS-PCR的原理，将检测突变型引物中的反向引物的3′端设计为C，并且在引物3′端第二位引入一个错配碱基（将碱基G突变成碱基A，形成A/C错配），以增强引物对突变DNA模板扩增的特异性，为确定突变是纯合突变或杂合突变，同时用一对检测野生型样本的引物进行检测，将检测野生型引物中的反向引物的3′端第四位引入一个错配碱基（将碱基A突变成碱基G，形成G/T错配）；同时，在结核分枝杆菌16S rRNA的相对保守的区域中的915-1018区段还设计了一对内参引物（见上表，16S 915-F/1018-R），用于监测PCR扩增反应体系是否合适及反应是否正常进行扩增。采用上述2对AS-PCR引物（EmbB 233-F/233G-R和EmbB233-F/233A-R）及一对内参引物对待测标本DNA进行PCR扩增。设计检测突变的引物只能扩增出含有突变的样本，不能扩增出野生型的样本；而设计检测野生型的引物，只能扩增出野生型的样本，不能扩增出含有突变的样本，并且无论样品中是否包含突变，均加入内参引物16S 915-F/1018-R，这样就避免了由于PCR失败而造成的假阴性的检测结果。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据能否扩增出目的片段来实现基因突变简便、快速的检测。
为确定AS-PCR方法检测耐乙胺丁醇突变的特异性和灵敏度，选取14个野生型样本及所有突变型样本进行引物特异性检测，同时对所有突变位点构建了阳性质粒，对不同拷贝数的阳性质粒进行扩增，以确定其灵敏度，并提供本技术检测到的最低水平的突变DNA的技术参数。
本发明利用等位基因特异PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法检测结核分枝杆菌在EmbB233位突变位点，具体步骤如下：
（1）DNA提取：使用试剂盒法从结核分枝杆菌临床分离株中提取基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应；
PCR反应引物：扩增引物序列及产物大小见上表；
PCR反应体系：总体系为20 µL，包含30 ng基因组DNA，10 µL 2×TSINGKETM MasterMix，AS-PCR引物和内参引物中的正反向引物各0.5 µM，余下用dd H2O补齐；
PCR反应程序：95℃，预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，重复35个循环；72℃延伸5 min。
（3） PCR产物检测：取PCR产物2.5 µL在2 %的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统下观察拍照。
（4）灵敏度检测
使用构建成功的阳性质粒作为模板，设置三个梯度（即3000、104和105个拷贝）用以检测出本技术所能检测到的最低水平的突变DNA的技术参数，并且使用106个拷贝作为阳性对照；按照与步骤（2）和（3）相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。
（5）特异性实验
本发明为了验证AS-PCR引物的特异性，随机的选择了14个野生型样本对突变型AS-PCR引物进行测试，并用野生型AS-PCR引物对所有突变型样本进行检测；并且在进行每一个特异性试验中我们都加入了内参；将模板按照与步骤（2）和（3）相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。
本发明与其它现有技术相比，具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备要求不高，适合于在大规模的临床样本检测中推广应用；本发明对于结核分枝杆菌耐药性研究中具有重要意义。
附图说明
图1为本发明方法的灵敏度检测电泳图谱；
图2为本发明方法的特异性实验电泳图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
1、引物设计
基于AS-PCR的原理，将检测突变型引物中的反向引物的3′端设计为C，并且在引物3′端第二位引入一个错配碱基（将碱基G突变成碱基A，形成A/C错配），以增强引物对突变DNA模板扩增的特异性，为确定突变是纯合突变或杂合突变，同时用一对检测野生型样本的引物进行检测，将检测野生型引物中的反向引物的3′端第四位引入一个错配碱基（将碱基A突变成碱基G，形成G/T错配），扩增出大小为151bp的片段；同时，在结核分枝杆菌16S rRNA的相对保守的区域中的915-1018区段还设计了一对内参引物（16S 915-F/1018-R），并且无论样品中是否包含突变，内参引物16S 915-F/1018-R都会扩增出一条104 bp的片段。
2、样本采集
采集经测序证实携带有EmbB233位突变位点的DNA样本和野生型样本。
3、样品基因组DNA提取
使用试剂盒法提取结核杆菌临床分离株基因组DNA。
4、PCR扩增
PCR反应体系：总体系为20 µL，包含30 ng基因组DNA，10 µL 2×TSINGKETM MasterMix，AS-PCR引物和内参引物中的正反向引物各0.5 µM，余下用dd H2O补齐；
PCR反应程序：95℃，预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，重复35个循环；72℃延伸5 min；
5、PCR产物检测
PCR产物检测：取PCR产物2.5 µL在2 %的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳30 min，凝胶成像系统下观察拍照。
6、灵敏度检测
使用构建成功的阳性质粒作为模板，设置三个梯度（即3000、104和105个拷贝）用以检测出本技术所能检测到的最低水平的突变DNA的技术参数，并且使用106个拷贝作为阳性对照。按照与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。
发明方法进行等位基因特异PCR检测结核分枝杆菌EmbB233位突变位点的灵敏度实验的电泳结果（见图1）。
图1中，泳道1、3、5、7、9、11、13和15使用含有突变的质粒作为模板，泳道2、4、6、8、10、12、14和16使用不含突变的质粒作为模板；泳道1、2、5、6、9、10、13和14使用检测野生型引物（即EmbB 233-F/ EmbB 233A-R），泳道3、4、7、8、11、12、15和16使用检测突变型引物（即EmbB 233-F/ EmbB 233G-R）；泳道1-4的阳性质粒拷贝数为3000，泳道5-8的阳性质粒拷贝数为104，泳道9-12的阳性质粒拷贝数为105，泳道13-16的阳性质粒拷贝数为106（即阳性对照）。泳道M为2000 bp的核酸分子量标准，泳道17为阴性对照（用不含结核分枝杆菌DNA的ddH2O作为模板）。
图1中检测野生型的引物只能同野生型样本共同扩增出大小为151bp的条带，同样检测突变型引物只能同含有相应突变型的样本共同扩增出大小为151bp的条带，与预期效果相同。模板拷贝数由低到高时，可以明显的看出条带由微弱到明亮的变化。在3000拷贝数的质粒作为模板时，条带同Marker相比，泳道2可以看到稍弱的条带，而泳道3几乎看不见条带，说明在3000拷贝数的质粒作为模板时，检测突变的引物进行PCR后用琼脂糖凝胶电泳不能有效检测突变，表明检测突变型引物在模板量较少的情况下不能有效工作；在104拷贝数的质粒作为模板时，条带同Marker相比，泳道6可以看到明显的条带，而泳道7可以看到微弱的条带，说明在104拷贝数的质粒作为模板时，此引物进行PCR后用琼脂糖凝胶电泳可以检测突变，但条带微弱；在105拷贝数的质粒作为模板时，条带同Marker相比，泳道10和泳道11均可看到明显的条带，说明在105拷贝数的质粒作为模板时，此引物进行PCR后用琼脂糖凝胶电泳可以检测突变且条带明亮。综上，用于检测EmbB A233G的两对AS-PCR引物检测下线在104个拷贝数。
7、特异性实验
本发明为了验证AS-PCR引物的特异性，随机的选择了14个野生型样本对AS-PCR引物进行测试，并用野生型AS-PCR引物对所有突变型样本进行检测，并且在进行每一个特异性试验中我们都加入了内参；将模板按照与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。
用本发明方法进行等位基因特异PCR检测结核分枝杆菌EmbB233位突变位点的特异性实验的电泳结果（见图2）。图2表示用野生型样本对检测EmbB A233G突变的AS-PCR引物进行测试。
图2中，泳道1-14使用的均为野生型样本；A图使用的是检测野生型的AS-PCR引物（即EmbB 233-F/233A-R），而B图使用的是检测突变型的引物（即EmbB 233-F/233G-R）；泳道M为2000bp的核酸分子量标准，泳道15为阴性对照（用不含结核分枝杆菌DNA的dd H2O作为模板）。
图2-A中，用检测野生型AS-PCR引物EmbB 233-F/233A-R对随机挑选的14个野生型样本进行扩增，均能扩增出明亮且大小为151bp的条带，且内参引物均能扩增出明亮且大小为104bp的条带；图2-B中，用检测突变型AS-PCR引物EmbB 233-F/233G-R对随机挑选的14个野生型样本进行扩增，仅有内参引物所扩增出的条带；由此，可以得出用于检测EmbB A233G的两对AS-PCR引物具有良好的特异性。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 1
gggctgattg gctttgtg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 2
gcacggtggc ggtaaaac 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 3
gcacggtggc ggtagagt 18
<210>4
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<400>4
cgcacaagcg gcggagca 18
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
gccacaaggg aacgcctatc t 21
Claims (1)
1.一种用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物，其中EmbB 233-F和EmbB 233G-R是检测EmbB基因A233G突变的特异性引物，EmbB 233-F和EmbB 233A-R是检测野生型菌株EmbB基因的特异性引物，16S 915-F和16S 1018-R为内参引物，引物序列如下：
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610997690.1A CN106434964A (zh) | 2016-11-14 | 2016-11-14 | 用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610997690.1A CN106434964A (zh) | 2016-11-14 | 2016-11-14 | 用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106434964A true CN106434964A (zh) | 2017-02-22 |
Family
ID=58208051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610997690.1A Pending CN106434964A (zh) | 2016-11-14 | 2016-11-14 | 用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106434964A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105316350A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-02-10 | 昆明理工大学 | 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途 |
-
2016
- 2016-11-14 CN CN201610997690.1A patent/CN106434964A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105316350A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-02-10 | 昆明理工大学 | 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 彭婉婵等: "等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因", 《临床检验杂志》 * |
| 焦伟伟等: "等位基因特异多重PCR快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究", 《标记免疫分析与临床》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3218522B1 (en) | Detection methods based on sequencing | |
| Gazouli et al. | Assessment of mycobacterial, propionibacterial, and human herpesvirus 8 DNA in tissues of Greek patients with sarcoidosis | |
| CN102181575A (zh) | 用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物及方法 | |
| JP2010521156A (ja) | Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 | |
| Kong et al. | secA1 gene sequence polymorphisms for species identification of Nocardia species and recognition of intraspecies genetic diversity | |
| CN102618549B (zh) | Ncstn突变型基因、其鉴定方法和工具 | |
| EP3105324B1 (en) | Ngs systems control and methods involving the same | |
| Gunnell et al. | A multiplex real-time PCR assay for the detection and differentiation of Francisella tularensis subspecies | |
| CN103820439A (zh) | 结核分枝杆菌链霉素耐药相关的新突变位点及其应用 | |
| Malhotra et al. | Rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis by high-resolution melting curve analysis | |
| CN106498069A (zh) | 用于检测耐药结核分枝杆菌KatG基因C906A突变的特异性引物 | |
| Dilworth et al. | Comparison of polymerase chain reaction for IS6110 and Amplicor in the diagnosis of tuberculosis. | |
| WO2008062385A2 (en) | Antiretroviral drug resistance testing | |
| CN103088151A (zh) | 用于乙型肝炎病毒四色荧光定量pcr检测的试剂盒及应用 | |
| CN106434964A (zh) | 用于检测耐药结核分枝杆菌EmbB基因A233G突变的特异性引物 | |
| WO2013078786A1 (zh) | 乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用 | |
| CN114085926A (zh) | Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN104099338A (zh) | Myo15a基因突变体及其应用 | |
| Abanda et al. | Absence of hybridization with the wild-type and mutant rpoB probes in the Genotype MTBDRplus assay detects ‘disputed’rifampicin mutations | |
| CN112538540B (zh) | 用于堪萨斯分枝杆菌检测的试剂盒及系统 | |
| CN112538541B (zh) | 用于胞内分枝杆菌检测的试剂盒及系统 | |
| CN105316350B (zh) | 结核分枝杆菌EmbB突变基因及其用途 | |
| CN112538538B (zh) | 用于脓肿分枝杆菌检测的试剂盒及系统 | |
| CN112538539B (zh) | 用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒及系统 | |
| CN104805186B (zh) | 一种测试玉米品种实质性派生关系的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170222 |