CN108753953A - 一种人dmd基因外显子pcr扩增系统、检测试剂盒及其应用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于人核酸体外检测技术领域，具体为人DMD基因的PCR扩增检测系统及其应用。PCR扩增检测系统包括：引物组、PCR反应母液容器；引物组容器包含引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.52贮存液。本发明在DNA提取情况后，通过PCR反应对人DMD基因26个外显子目的片段同时扩增，进行DMD基因外显子有无缺失突变的判断，通过测序片段的基因序列与Reference Sequence进行比对，最终进行目标序列中有无单碱基突变的判断，以期对人DMD基因全部外显子进行金标准方法探讨分析D型肌营养不良症在分子遗传水平上的发病原因。而且，本方法操作简单，使用仪器设备普及度很高，适合推广使用。
Description
技术领域
本发明属于人核酸体外检测技术领域，具体涉及一种人DMD基因全部的26个外显子PCR扩增系统、检测试剂盒及其应用。
背景技术
Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)和Becker型肌营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)均属于假肥大性肌营养不良症，一种严重的X染色体连锁隐性遗传性神经肌肉疾病，该病系位于X染色体短臂(Xp12)上的抗肌萎缩蛋白dystrophin基因突变导致抗肌萎缩蛋白发生结构和功能的改变所致，发病的主要特征为缓慢进行性加重的对称性肌无力和肌萎缩1-2；DMD发病主要累及男性，发病率约占活产男婴的1/3500，女性为携带者，通常不发病。目前无有效的治愈方法(FDA虽在2016年9月份批准(非完全批准)Sarepta公司的新药Exondys 51，有望成为首个获批治疗DMD的药物，但实际数据表明该药增加肌营养蛋白疗效非常微弱，平均增加正常值0.28％的肌营养蛋白，其完全批准上市前景还有待观察)。
DMD基因是目前已知的人类最大的基因(2.5Mb)，一共含有79个外显子(2.2Mb)，高频率的新突变和异位断裂点的出现或许与其自身庞大而复杂的基因结构相关(图1)。各项研究表明dystrophin基因的突变以片段缺失为主，占整个基因突变的55～65％左右，片段重复约占5～10％，点突变和微小插入/缺失约占30％；突变范围随机且突变类型多样，几乎覆盖所有外显子。研究发现，DMD与BMD是同一基因突变的不同临床表型，据阅读框理论，基因突变如果破坏开放阅读框可导致发病较早、症状较重的DMD，如果基因突变未破坏开放阅读框，则导致症状较轻的BMD。通常，DMD患儿在3～4岁开始出现步态异常、10～12岁逐渐丧失行走能力、18～20岁死于循环和呼吸衰竭；BMD患儿16岁后可以借助轮椅生存，生存期较长，少数甚至可以结婚、生育子女并可生存至60岁以上。
DMD基因内一个或多个外显子缺失占所有突变的50％～70％，大多数缺失位于热点区域(5’端Exon3-Exon19区域和Exon45-Exon53区域)，其他突变包括基因片段重复和点突变。鉴于本病至今无有效的治疗方法，因此高效、准确的DMD致病基因诊断、携带者检测及正确的遗传咨询是预防本病的关键。
目前关于DMD检测方法，国内外基于分子水平主流检测方法有:Sanger测序、多重PCR、DHPLC以及MLPA。
Sanger Sequencing，通过设计DMD基因的79个外显子(涵盖内含子-外显子边界剪切位点点突变)以及DMD上游启动子区域和部分已知的内含子点突变引物，以基因组DNA为模板进行常规PCR，PCR产物经过琼脂糖电泳确认电泳条带后进行一代测序，测序结果进行序列比对，最终确认目标扩增区域是否具有缺失、插入、点突变的发生，该方法目前也是被认定为基因检测领域的金标准。代表机构或实验室：美国Emory University School ofMedicine。
m-PCR，建立在DMD基因全部外显子引物设计基础上，通过对DMD缺失突变热点区域进行位点扩增子长度合理组合，在经过优化的多重PCR体系反应后实现多个外显子扩增子产物在琼脂糖电泳中的迁移。一般多重反应引物数量在10-30个，能保证DMD基因缺失检出率在90％以上。由于多重PCR法只能检测出缺失类型的DMD/BMD，因此应用受到局限，近年来有学者提出将多重PCR技术与其他分子生物学相关技术结合，用于检测DMD/BMD的多种突变类型。如先利用传统多重PCR技术对DMD基因的25个突变位点进行筛查，再对没有发生缺失的样本进行实时定量PCR分析，这种方法在保证较高患病DMD样本检出率的同时也降低了检测成本，具有一定的推广价值。
变性高效液相色谱(Denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)是一种高通量筛选DNA序列变异的新技术，该技术的高准确性和高敏感性在多种基因微小突变及多态性(SNPs)的研究中得到证实，有研究称DHPLC在检测DMD女性携带者方面也是非常有效的方法，通常该技术与缺失/重复突变检测技术相结合或做补充手段，在实际临床检测方面应用较广。代表机构或实验室：美国Transgenomic WAVE Maker系统
探针连接多重扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是一种灵敏度极高的相对定量技术，每个MLPA探针包括2个荧光标记的引物序列和特异性探针序列。在MLPA反应中，只有靶序列与特异性探针序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链。这种连接反应具有高度特异性，即使单碱基的不匹配都会使连接反应无法进行。虽然利用MLPA方法对DMD/BMD患者进行基因诊断是近年来的研究热点，特别是在对于非缺失型患者以及产前诊断的检测中有很大优势，但是由于MLPA检测需要对样本DNA浓度进行精确测量，而且从引物设计到操作对检测技术人员的要求比较高，目前还难以大规模应用于临床的基因诊断。代表机构或实验室：荷兰MRC-Holland。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、效率高、覆盖全的能够对人DMD基因进行突变检测的PCR扩增系统，以及DMD基因突变筛查，辅以肝豆状核变性致病的诊断分析。
本发明第一方面提供了一种对用于人DMD基因26个外显子的PCR扩增系统，所述扩增系统包含以下外显子位点相对应的26对引物：
位点Exon3，相对应的引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；位点Exon4，相对应的引物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；位点Exon5，相对应的引物序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；位点Exon6，相对应的引物序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；位点Exon7，相对应的引物序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；位点Exon8，相对应的引物序列为SEQID No.11和SEQ ID No.12；位点Exon9，相对应的引物序列为SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14；位点Exon10，相对应的引物序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；位点Exon11，相对应的引物序列为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；位点Exon12，相对应的引物序列为SEQ IDNo.19和SEQ ID No.20；位点Exon13，相对应的引物序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；位点Exon14，相对应的引物序列为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；位点Exon15，相对应的引物序列为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；位点Exon16，相对应的引物序列为SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；位点Exon17，相对应的引物序列为SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；位点Exon18，相对应的引物序列为SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；位点Exon19，相对应的引物序列为SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；位点Exon45，相对应的引物序列为SEQ ID No.35和SEQID No.36；位点Exon46，相对应的引物序列为SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；位点Exon47，相对应的引物序列为SEQ ID No.39和SEQ ID No.40；位点Exon48，相对应的引物序列为SEQID No.41和SEQ ID No.42；位点Exon49，相对应的引物序列为SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44；位点Exon50，相对应的引物序列为SEQ ID No.45和SEQ ID No.46；位点Exon51，相对应的引物序列为SEQ ID No.47和SEQ ID No.48；位点Exon52，相对应的引物序列为SEQ IDNo.49和SEQ ID No.50；位点Exon53，相对应的引物序列为SEQ ID No.51和SEQ ID No.52。
上述26对引物覆盖80％以上的DMD基因突变(缺失、重复、碱基突变等)，该26个位点相应的PCR扩增引物信息详见表1。
表1. 26个外显子52条PCR扩增引物信息
本发明所述的PCR扩增系统中，引物由SEQ ID No.1至SEQ ID No.52所示寡核苷酸序列的PCR扩增引物的干粉或溶液组成。所述26对PCR扩增引物的工作液浓度为50～400nmol/L。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述PCR扩增系统在制备对人DMD基因26个外显子检测的试剂盒的用途。
本发明第三方面提供了一种对人DMD基因26个外显子检测的试剂盒，其包含含有本发明第一方面所述PCR扩增系统的引物组合物容器和PCR反应母液容器；其中：
所述引物组合物容器包含序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.52所示的引物的贮存液，贮存液中各引物的浓度为相应引物工作液浓度的2～10倍；
所述PCR反应母液容器内含有进行PCR反应的2～5倍反应浓度的PCR反应母液，PCR反应母液包含酶活为0.5～5U的DNA聚合酶(0.5～5u)、浓度为1～5mmol/L的镁离子、浓度为40～400μmol/L的dNTP及浓度为20～100mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
本发明第四方面提供了一种本发明第三方面所述试剂盒的使用方法，具体如下：
(1)多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：
(2)PCR反应在普通PCR仪进行，PCR反应条件如下：95℃10分钟启动后，94℃30秒、60℃45秒、72℃45秒，共32个循环，然后70℃延伸10分钟，最后4℃保温；
(3)PCR产物取10μL，按常规操作在琼脂糖凝胶电泳仪上进行横向电泳，得到每一个外显子PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
在另一优选例中，所述基因组DNA为人外周血DNA。
本发明第五方面提供了本发明第三方面所述试剂盒在非诊断性进行人DMD基因26个外显子检测中的用途。
本发明的有益效果：
依据本发明，实现了一次PCR反应同时完成所述人DMD基因的26个外显子检测，本研究旨在建立DMD基因外显子突变的检测方法，通过扩增目标外显子片段区域后进行Sanger测序，比对目标区域参考序列进而对基因突变发生与否做出判断，以期从分子水平达到快速诊断的目的，为DMD患者的早发现或早干预提供指导依据。
附图说明
图1为编码dystrophin蛋白的DMD基因，其中A：黑色竖线代表分布于DMD基因上的79个外显子，黑色箭头指示不同组织编码蛋白的启动子区域；B:分别以字母缩写代表：B(脑皮质)、M(肌组织)、P(蒲肯野纤维)、R(视网膜)、B3(脑组织)、S(雪旺氏细胞)和G(肌组织之外的多种器官组织)。
图2为本发明试剂盒检测正常男性样本DMD基因外显子琼脂糖电泳图，电泳显示26个外显子均出现对应PCR片段的目的条带。
图3为本发明试剂盒检测待检样本DMD基因外显子琼脂糖电泳图，电泳显示26个外显子均出现对应PCR片段的目的条带。
图4为DMD基因3号外显子测序结果比对结果，结果显示无突变。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面以正常男性基因组DNA和患病小孩基因组DNA为样本对本检测方法具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
本发明PCR反应体系试剂中的引物组合物所包括的核苷酸序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.52的引物为发明人通过引物设计，由DNA合成公司按照本领域所通用的常规合成方法合成的，然后将其配制为工作浓度50～400nmol/L。
在本实施例中扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳后PCR产物在ABI 3170遗传分析仪上进行测序。所使用其它试剂和材料如内标、电泳缓冲液、POP7、Hi-Di均为本领域技术人员常用的常规材料。
实施例
1：DNA提取后测定OD值及浓度：
DNA按照相关提取试剂盒的操作提取后进行OD值测定，要求：1.6≤OD260/OD280≤2.0，DNA浓度稀释至10.0ng/μL的工作浓度备检。
2：PCR体系配制
按以下体系配制PCR反应体系(总反应体系为20μL)：
在试剂盒中取出引物容器、PCR反应母液容器，按照反应体系进行反应配置。
3：PCR反应
采用ABI 9700 PCR仪进行PCR反应。
PCR条件如下：95℃10分钟启动后，94℃30秒、60℃45秒、72℃45秒，共32个循环，然后72℃延伸10分钟，最后4℃保温。
4：电泳检测
(1)制胶：取1.6g琼脂糖粉末加入80mL TAE(1×)缓冲液中，轻摇混匀后中火煮沸2次，待冷却温度50℃附件加入核酸染料GodView，充分摇匀后倒入事前准备好的胶槽内，插上胶梳静置。
(2)点样：取1μL Loading Buffer加入10μL PCR产物中混匀，全部加到胶孔内。
(3)电泳：将电泳仪设置为恒压稳流状态，电压125V，电泳时间25分钟。
(4)结果：观察电泳条带是否出现各自对应目的片段。
5：测序验证
经过琼脂糖凝胶电泳检测后的电泳条带的确认，对各自DMD基因外显子的PCR产物对应条带进行回收(或PCR产物剩余量)进行一代测序，将测序结果与数据库(NCBI、UCSC)的参考序列进行比对(软件Vector NIT-Align X)，对测序结果有无突变做直观的判断并借助DMD Mutation Database权威数据库对突变位点进行查询，明确突变位点的临床意义。
6：数据分析
经过序列比对及数据库突变信息的查询对待检样本的DMD基因26个外显子进行统计(表2)。
表2.待检样本的DMD基因26个外显子突变信息表
从图2可以看出电泳显示26个外显子均出现对应PCR片段的目的条带。
阴性对照：NTC反应孔的PCR产物电泳通道显示无带，显示该批次PCR实验操作环节未受污染，为正常结果。
阳性对照：POS反应孔的PCR产物电泳通道显示有目的片段大小的电泳条带，显示该批次PCR实验体系有效，为正常结果。
反应组1-26：DMD基因26个外显子反应孔的PCR产物电泳通道显示有各自的片段大小的电泳条带，显示目标扩增区域未出现缺失现象。
M：琼脂糖电泳的Marker，大小标识。
结论：PCR扩增产物的琼脂糖电泳未发现缺失，需进行测序确认。
从图3可以看出电泳显示26个外显子均出现对应PCR片段的目的条带。
阴性对照：NTC反应孔的PCR产物电泳通道显示无带，显示该批次PCR实验操作环节未受污染，为正常结果。
阳性对照：POS反应孔的PCR产物电泳通道显示有目的片段大小的电泳条带，显示该批次PCR实验体系有效，为正常结果。
反应组1-26：DMD基因26个外显子反应孔的PCR产物电泳通道显示有各自的片段大小的电泳条带，显示目标扩增区域未出现缺失现象。
M：琼脂糖电泳的Marker，大小标识。
结论：PCR扩增产物的琼脂糖电泳未发现缺失，需进行测序确认。
本发明所提出的人DMD基因的突变检测方法及应用可在具有PCR仪以及遗传分析的实验室稳定实施，检测时间为4～6小时。同时，本发明所提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构、专业医疗机构用于检测，具备产业化以及推广应用的条件。
本发明已参照其特定的实施例作了描述。对于本领域技术人员而言，依据前面的描述，可能对本发明做各种修改或变换，包括(但不仅限于)：依据各遗传标记扩增片段范围改变检测的分组排布，依据其它的PCR反应母液对PCR扩增条件、引物反应浓度进行优化，以及改变所推荐的反应体系等。很显然，上述修改或变换对于本领域技术人员而言都是可能的，但这些修改和变换并不背离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 上海五色石医学研究股份有限公司
<120> 一种人DMD基因外显子PCR扩增系统、检测试剂盒及其应用的方法
<130> Z001039180051CN
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
gcttaaaaag tctgctaaaa tgttttca 28
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
atagtttgag aactatgttg gaaaaaaaaa 30
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
aatagattca tatacttctt tatgcaagca g 31
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
caaggtagtt ggaattgtgc tgtaa 25
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
tacatacaaa tacttgcaac atttaacaca 30
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
taaacatttt ggcttatgcc ttg 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
cctaccttaa cgtcaaatgg 20
<210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
taattttatt gctaactgtg aagttaatct g 31
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
caacagggga agcataaccc attatga 27
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
tcatgaatta tcttcaaagt gttaatcg 28
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
catagttgca cttttgaaca aatagctag 29
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
aattggctct ttagcttgtg tttcta 26
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
gagtaaagtg attggtggaa aatct 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
atgtaaaagg aatacacaac gctga 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
tattgaaact tgtcatgcat cttgc 25
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
ctgttgttca tcatcctagc ca 22
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
tgttcatttc agctttaacg tga 23
Claims (8)
1.一种用于人DMD基因26个外显子的PCR扩增系统，所述扩增系统包含以下外显子位点相对应的26对PCR扩增引物：
位点Exon3，相对应的引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；
位点Exon4，相对应的引物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
位点Exon5，相对应的引物序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；
位点Exon6，相对应的引物序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；
位点Exon7，相对应的引物序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；
位点Exon8，相对应的引物序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；
位点Exon9，相对应的引物序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；
位点Exon10，相对应的引物序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；
位点Exon11，相对应的引物序列为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；
位点Exon12，相对应的引物序列为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20；
位点Exon13，相对应的引物序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；
位点Exon14，相对应的引物序列为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；
位点Exon15，相对应的引物序列为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；
位点Exon16，相对应的引物序列为SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；
位点Exon17，相对应的引物序列为SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；
位点Exon18，相对应的引物序列为SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；
位点Exon19，相对应的引物序列为SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；
位点Exon45，相对应的引物序列为SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；
位点Exon46，相对应的引物序列为SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；
位点Exon47，相对应的引物序列为SEQ ID No.39和SEQ ID No.40；
位点Exon48，相对应的引物序列为SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；
位点Exon49，相对应的引物序列为SEQ ID No.43和SEQ ID No.44；
位点Exon50，相对应的引物序列为SEQ ID No.45和SEQ ID No.46；
位点Exon51，相对应的引物序列为SEQ ID No.47和SEQ ID No.48；
位点Exon52，相对应的引物序列为SEQ ID No.49和SEQ ID No.50；
位点Exon53，相对应的引物序列为SEQ ID No.51和SEQ ID No.52。
2.如权利要求1所述的PCR扩增系统，其特征在于，所述26对PCR扩增引物的工作液浓度为50～400nmol/L。
3.如权利要求1所述的PCR扩增系统，其特征在于，引物由SEQ ID No.1至SEQ ID No.52所示寡核苷酸序列的PCR扩增引物的干粉或溶液组成。
4.一种对人DMD基因26个外显子检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含含有权利要求1所述PCR扩增系统的引物组合物容器和PCR反应母液容器；其中：
所述引物组合物容器包含序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.52所示的引物的贮存液，贮存液中各引物的浓度为相应引物工作液浓度的2～10倍；
所述PCR反应母液容器内含有进行PCR反应的2～5倍反应浓度的PCR反应母液，PCR反应母液包含酶活为0.5～5U的DNA聚合酶、浓度为1～5mmol/L的镁离子、浓度为40～400μmol/L的dNTP及浓度为20～100mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
5.权利要求4所述试剂盒在非诊断性进行人DMD基因26个外显子检测中的用途。
6.一种如权利要求4所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括步骤：
(1)多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：
(2)PCR反应在普通PCR仪进行，PCR反应条件如下：95℃10分钟启动后，94℃30秒、60℃45秒、72℃45秒，共32个循环，然后72℃延伸10分钟，最后4℃保温；
(3)PCR产物取10μL，按常规操作在琼脂糖凝胶电泳仪上进行横向电泳，得到每一个外显子PCR扩增产物的电泳图谱。
7.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述基因组DNA为人外周血DNA。
8.权利要求1所述PCR扩增系统在制备对人DMD基因26个外显子检测的试剂盒的用途。
Priority Applications (1)
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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