CN111893173A

CN111893173A - 检测基因pear1 snp位点的引物、方法和试剂盒

Info

Publication number: CN111893173A
Application number: CN202010708483.6A
Authority: CN
Inventors: 刘赵玲; 牛林梅; 王淑一
Original assignee: FUZHOU ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc
Current assignee: FUZHOU ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2020-11-06

Abstract

本发明提供利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的引物、方法和试剂盒，检测PEAR1基因rs12566888位点多态性，在外周血DNA样本中采用直接测序法筛选出标准品(GG基因型、GT基因型及TT基因型)并对HRM检测结果采用直接测序法进行验证，可用于辅助临床上阿司匹林用药，有助于预防阿司匹林用药期间的各种不良反应的发生。

Description

检测基因PEAR1 SNP位点的引物、方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，涉及一种临床检验用途的基因多态性检测方法和试剂盒及其所使用的引物，通过采用HRM技术，检测患者体内阿司匹林用药相关PEAR1基因的SNP位点rs12566888。

背景技术

阿司匹林是应用较为广泛的药物，除具有解热镇痛和抗炎作用外，还具有抗血小板作用，其作用机制为直接并不可逆地抑制环氧化酶(COX-1和COX-2)，减少前列腺素的合成，抑制血小板合成血栓素A2(TXA2)，从而抑制血小板聚集。阿司匹林也可抑制低浓度胶原、凝血酶、抗原-抗体复合物等所致的血小板聚集和释放反应及自发性聚集，由此发挥预防血栓的作用。临床研究证实，阿司匹林在降低高危型心源性猝死、脑卒中、心肌梗死等患者病症危险性方面具有显著的效果。但仍存在部分患者出现对阿司匹林疗效的不敏感---阿司匹林抵抗。阿司匹林抵抗通常是指阿司匹林不能发挥预期的生物作用或者不能预防栓塞性疾病。这一现象广泛存在于正常健康机体、心脑血管疾病患者以及外周血管病患者中，发生率高达8％～45％。

国内外临床研究表明，阿司匹林抵抗和不良反应与患者基因多态性相关。遗传因素导致的药物反应个体化差异，可以使用基因检测提前发现，判断个体的不良反应风险情况，从而采取个体化的精准用药治疗。

目前科学研究表明阿司匹林抵抗相关基因有：GPIIIaPLA1\PLA2、PEAR1、PTGS1、PAI-1、GP1BA、LTC4S、GSTP1、P2Y1等。

PEAR1(platelet endothelial aggregation receptor 1)基因是近年发现的与血小板聚集密切相关的基因，位于1号染色体，在血小板和内皮细胞均有高度的表达，其编码Ⅰ型膜蛋白，在胞外有多个酪氨酸和脯氨酸残基，在胞内有5个脯氨酸残基和1个NPXY922区域，均为磷酸化酪氨酸的结合位点。该基因可通过调控PI3K/PTEN通路，影响血小板的功能，为非Cox依赖性途径影响血小板聚集。PEAR1基因rs12566888(IVS1-4663G＞T)，是位于PEAR1基因内含子1上的一处突变。Andrew等人的研究发现，PEAR1基因rs12566888的T等位基因可以引起血小板低聚集。Sokol等人的研究表明，PEAR1的单核苷酸多态性rs12566888在有流产史的黏血症患者中有更高的突变率，且PEAR1c.-9-4663G＞T的T等位基因对胎儿流产有保护作用。

目前单核苷酸多态性(SNP)检测常用的技术有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)及直接测序法等。RFLP对设备要求不高，但操作过程复杂，容易产生假阴性错误；AS-PCR对引物设计及PCR反应条件要求较高，容易出现假阳性错误；直接测序法尽管结果准确，但是试验过程繁琐，成本较高。

发明内容

鉴于现有技术中存在的不足，本发明设计了检测目的基因SNP位点用引物序列，采用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting，HRM)检测PEAR1基因rs12566888位点多态性。在外周血DNA样本中采用直接测序法筛选出标准品(GG基因型、GT基因型及TT基因型)并对HRM检测结果采用直接测序法进行验证。本发明通过调整PCR反应体系及反应条件，使扩增效率达到最佳。

本发明提供利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的引物，所述引物的碱基序列为：

PEAR1-HRM-F:CACAGCTTGTAAGACAGAGATAGG；

PEAR1-HRM-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

进一步地，PEAR1-HRM-F与PEAR1-HRM-R的摩尔比为1:1。

进一步地，所述引物还包括用于验证检测结果的一对扩增引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

进一步地，所述引物还包括用于一对测序引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

进一步地，所述引物在制造利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的方法，其步骤为：

(1)提取样本中的DNA；

(2)加入(1)中提取的DNA到反应管中，利用引物PEAR1-HRM-F和PEAR1-HRM-R进行扩增，并确定样本溶解曲线；

(3)将样本溶解曲线与标准品溶解曲线进行比对，确定样本DNA的基因型，其中，引物PEAR1-HRM-F和PEAR1-HRM-R的碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

本发明还提供一种利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的试剂盒，所述试剂盒包括HRM PCR反应液，所述HRM PCR反应液包括一对检测rs12566888位点的引物，所述引物的碱基序列为：

PEAR1-HRM-F:CACAGCTTGTAAGACAGAGATAGG；

PEAR1-HRM-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

进一步地，所述试剂盒还包括标准品和阴性对照品，所述标准品为GG基因型、GT基因型及TT基因型DNA，所述阴性对照品为生理盐水或不加任何物质。

进一步地，所述试剂盒还包括用于验证检测结果的一对扩增引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

进一步地，所述试剂盒还包括测序体系试剂，所述测序体系试剂包括一对测序引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

进一步地，所述测序体系试剂还包括测序纯化液：虾碱性磷酸酶:0.6U、外切酶I:1.2U；125mmol EDTA；无水乙醇；70％乙醇；HIDI；Bigdye Terminator V3.1。

本发明的有益效果：(1)本发明采用HRM技术检测受测者体内PEAR1基因的SNP位点rs12566888，HRM技术是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种实时定量新技术，是一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变；它主要是基于核酸分子物理性质不同来进行检测的，不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置；该技术操作简便，只需在普通PCR体系中加入饱和染料(如EVA Green、LC Green)，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，可避免PCR产物污染而导致的假阳性问题，同时也可提高敏感度，后期的数据分析简单、易懂，结果便于判读；相较于其他检测方法具有高通量、高灵敏度和特异性好、重复性好、操作简单灵活、成本低(每个DNA样本的检测成本可降低至2.5元)、对DNA分子无损害、闭管操作等诸多优点；(2)本发明通过检测受测者体内PEAR1基因的SNP位点rs12566888，辅助临床上阿司匹林用药，有助于预防阿司匹林用药期间的各种不良反应的发生，提高阿司匹林用药科学性，也有利于用药策略的调整，对患者疾病的预后具有重要意义。

附图说明

如图1所示为标准品TT、标准品GT和标准品GG的Normalized Melting曲线。

如图2所示为标准品TT、标准品GT和标准品GG的Difference Melting曲线。

如图3所示为样本#1、#5、#14和标准品的Normalized Melting曲线。

如图4所示为样本#1、#5、#14和标准品的Difference Melting曲线。

如图5所示为部分样本PCR产物电泳图，条带大小为121bp，其中1～20为样本号，Marker为DL2000。

如图6所示为样本#1的测序结果，为GT基因型。

如图7所示为样本#5的测序结果，为GG基因型。

如图8所示为样本#14的测序结果，为TT基因型。

具体实施方式

实施例1

利用HRM技术检测受测者体内PEAR1基因的SNP位点rs12566888的试剂盒，包括：

样本DNA抽提试剂，可自行配置，也可购买现成的试剂盒，比如购买QIAGEN公司的样本DNA抽提试剂盒。

HRM PCR反应液，

标准品和阴性对照品，

其中HRM PCR反应液包括一对检测rs12566888位点的引物(PEAR1-HRM-F和PEAR1-HRM-R)、2×HRM Analysis PreMix(天根生化科技有限公司)和ddH₂O，检测rs12566888位点的引物分别为：

PEAR1-HRM-F:CACAGCTTGTAAGACAGAGATAGG；

PEAR1-HRM-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG；

标准品为GG基因型、GT基因型及TT基因型DNA；阴性对照品：生理盐水或不加任何物质。

为了验证HRM技术检测样本结果，采用直接测序法进行测序，在测序过程中，所使用的试剂包括检测体系PCR反应液和测序体系试剂，其中所述检测体系PCR反应液包括一对PCR扩增引物，所述一对PCR扩增引物的碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

检测体系PCR反应液还包括2*PCR Buffer(TOYOBO公司)、dNTPs(2mM)、KOD FX(1U/μL，来自TOYOBO公司)和ddH₂O。

引物PEAR1-HRM-F、PEAR1-HRM-R和PEAR1-CX-F、PEAR1-CX-R都由杭州擎科生物有限公司合成。

测序体系试剂包括上游测序引物PEAR1-CX-F和下游测序引物PEAR1-CX-R。

测序体系试剂还包括测序纯化液：虾碱性磷酸酶(SAP):0.6U、外切酶I:1.2U；EDTA(125mmol)；无水乙醇；70％乙醇；HIDI(高度去离子甲酰胺)；Bigdye Terminator V3.1(购买自ABI公司)。

实施例2

(1)利用血液/细胞基因组DNA抽提试剂盒(QIAGEN)提取全血基因组DNA，操作流程如下所示：

1)于1.5ml离心管底部加入20μl QIAGEN Protease(或proteinase K)。

2)离心管中加入200μL血浆。

3)加入200μl Buffer AL，振荡15s。(注意：不可将QIAGEN Protease或proteinaseK直接加入到Buffer AL中。若样本量较大，则QIAGEN Protease和Buffer AL按比例增加。)

4)56℃水浴10min，之后短暂离心，以除去离心管盖内沿的液体。

5)加入200μl乙醇(96％～100％)，振荡15s，短暂离心，以去除离心管盖内沿液体。

6)小心将以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp Mini spin column中(不要弄湿边缘)，将离心柱放入2ml收集管中，盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。

7)小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp Mini spin column中(不要弄湿边缘)。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。

8)小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp Mini spin column中(不要弄湿边缘)。盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min。

9)将QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。全速离心1min。

10)将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。小心在QIAamp Mini spin column中加入100μL Buffer AE或蒸馏水。室温下(15-25℃)静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min，将收集管盖好。

11)采用NanoDrop2000检测样本浓度及纯度，将符合标准(A_260/280＝1.80～2.0)的DNA溶液浓度调整至50ng/μL，保存于-20℃备用。

(2)HRM法检测步骤

1)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL，每人份9μL分装：

X＝9μL反应液×(n份样本+1份空白对照+3份标准品)

n为检测样本数。

2)加样：在分装好的PCR反应管中加入1μL步骤(1)中提取的DNA溶液，阴性对照品加1μL生理盐水或不加任何物质，3份标准品分别加入1μL GG基因型、GT基因型及TT基因型DNA。

3)扩增：检测在PCR仪上进行，可用仪器包括ECO^TM(美国Illumina)等。

PCR反应程序如下：

PCR扩增体系配置方法如下：

其中PCR扩增引物，分别为：

PEAR1-HRM-F:CACAGCTTGTAAGACAGAGATAGG；

PEAR1-HRM-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

4)结果判断：将样本溶解曲线与标准品溶解曲线进行比对，按照熔解温度GG基因型＞TT基因型＞GT基因型进行解读，得到结果并进行报告。

(3)直接测序法检测步骤

1)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL，每人份19μL分装：

X＝19μL反应液×(n份样本+1份阴性对照)

n为检测样本数。

2)加样：在分装好的PCR反应管中加入1μL DNA溶液，阴性对照加1μL生理盐水或不加任何物质。

3)扩增：检测在PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。

PCR反应程序如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物PEAR1-CX-F和PEAR1-CX-R的碱基序列分别为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

4)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，30min，凝胶成像系统观察。PCR产物大小为121bp。

5)Sanger测序：

取9μL PCR产物和2μL测序纯化液，按照以下程序进行纯化，并获得纯化产物。

将1μL纯化产物分别与上、下游测序引物PEAR1-CX-F/PEAR1-CX-R按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μL 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μL无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μL 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序为95℃15min；4℃保存。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

6)结果判断：将测序结果与PEAR1基因rs12566888位点参考序列NC_000001.11(PEAR1)进行比对，根据结果进行报告。

实施例3临床样本检测

取待检的临床样本20例，按实施例2所述方法提取DNA溶液、配制试剂并检测。

往检测体系PCR反应液中加入1μL从每份临床样本中提取的DNA溶液。同时做标准品各一份。用荧光PCR仪检测，时间为60分钟。

如图3所示为样本#1、#5、#14和标准品的Normalized Melting曲线。

如图4所示为样本#1、#5、#14和标准品的Difference Melting曲线。

根据HRM结果判读20例筛查样本PEAR1 rs12566888位点基因分型如下表1所示。

表1

实施例4直接测序法验证结果

取实施例3中的临床样本20例，按实施例2所述方法配制试剂并检测。每份样本加入检测体系PCR反应液中1μL。用普通PCR仪扩增并采用Sanger测序法测序。

如图6所示为样本#1的测序结果，为GT基因型。

如图7所示为样本#5的测序结果，为GG基因型。

如图8所示为样本#14的测序结果，为TT基因型。

根据测序分析，20例筛查样本PEAR1 rs12566888位点基因分型如表2所示，基因分型结果与HRM方法判读结果一致。

表2

序列表

<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司

<120> 检测基因PEAR1 SNP位点的引物、方法和试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacagcttgt aagacagaga tagg 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaccctagtt ccttgctcgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaggtctga ggtctgaggt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaccctagtt ccttgctcgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgaggtctga ggtctgaggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaccctagtt ccttgctcgg 20

Claims

1.利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的引物，其特征在于，所述引物的碱基序列为：

PEAR1-HRM-F:CACAGCTTGTAAGACAGAGATAGG；

PEAR1-HRM-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，PEAR1-HRM-F与PEAR1-HRM-R的摩尔比为1:1。

3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括用于验证检测结果的一对扩增引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述引物还包括用于一对测序引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

5.一种利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的方法，其步骤为：

(1)提取样本中的DNA；

(3)将样本溶解曲线与标准品溶解曲线进行比对，确定样本DNA的基因型，其特征在于：引物PEAR1-HRM-F和PEAR1-HRM-R的碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

6.一种利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的试剂盒，所述试剂盒包括HRM PCR反应液，所述HRM PCR反应液包括一对检测rs12566888位点的引物，其特征在于，所述引物的碱基序列为：

PEAR1-HRM-F:CACAGCTTGTAAGACAGAGATAGG；

PEAR1-HRM-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品和阴性对照品，所述标准品为GG基因型、GT基因型及TT基因型DNA，所述阴性对照品为生理盐水或不加任何物质。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于验证检测结果的一对扩增引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序体系试剂，所述测序体系试剂包括一对测序引物，其碱基序列为：

PEAR1-CX-F:TGAGGTCTGAGGTCTGAGGT；

PEAR1-CX-R:AACCCTAGTTCCTTGCTCGG。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述测序体系试剂还包括测序纯化液：虾碱性磷酸酶:0.6U、外切酶I:1.2U；125mmol EDTA；无水乙醇；70％乙醇；HIDI；BigdyeTerminator V3.1。