CN108410990B - Igfbp3在制备诊断i型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IGFBP3在制备诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用。本发明通过转录组测序技术筛选到NF1合并脊柱畸形相关标记物IGFBP3，进而探明了IGFBP3在NF1合并脊柱畸形骨愈合缺陷发生发展中的作用，以及其发挥的作用机制，IGFBP3作为NF1合并脊柱畸形新型生物标志物，为指导其临床早期干预及靶向治疗提供了重要理论依据。

Description

IGFBP3在制备诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医学检测技术领域，具体涉及IGFBP3在制备诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用。

背景技术

I型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis type 1，NF1)是一种较为常见的常染色体显性遗传病；不分性别或种族，则全球的发病率1/3000。1882年Frederich vonRecklinghausen首次描述了NF1，1987年NIH发表了正式的诊断标准。遗传学研究发现，I型神经纤维瘤病是由NF1肿瘤抑制基因的突变所致。NF1基因位于第17染色体长臂17q11.2，编码分子量为220kDa的胞浆蛋白——神经纤维素蛋白(neurofibromin)，该蛋白的部分作用为负向调控Ras原癌基因，而Ras是调控细胞生长的重要信号分子。基因突变的患者，体内每个细胞都含有一个突变无功能的NF1拷贝和一个功能正常的NF1拷贝。

NF1型患者易发生中枢和周围神经系统的良、恶性肿瘤，以及其它部位的恶性病变。与NF1相关的肿瘤常见的包括：视觉通路的神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、恶性周围神经鞘瘤、胃肠道间质瘤、乳腺癌、白血病、嗜铬细胞瘤、十二指肠类癌瘤和横纹肌肉瘤。尽管此病的许多临床特征从患者出生后就很明显，但形成肿瘤却需要某些细胞获得性NF1变异，完全丧失基因功能。约有50％的NF1患者并无家族史，此病为自发性基因突变。随着基因检测技术的发展，基因型-表现型的关系已经大量被研究。譬如，NF1基因微缺失的患者表现型更为严重，易在早年就出现神经纤维瘤、平均IQ较低、面部特征异常、发生恶性周围神经鞘瘤的风险增加。

先天性脊柱侧凸(Congenital scoliosis，CS)是一种常见的脊椎疾病，新生儿患病几率为0.5-1‰。CS的临床表现为脊柱侧弯超过10度，这是由于胚胎的发育过程中脊柱畸形(半椎体畸形、分节障碍、蝴蝶椎、并肋等)引起的脊柱纵向生长不平衡导致的。CS可以影响生理和心理的健康，已经成为青少年残疾的一个主要的因素。以往认为，大多数先天性脊柱侧凸是非遗传性的，是胚胎在发育过程中由环境因素引起的。近年来，已有研究表明遗传因素参与了CS的发病机制。以前在动物模型中的基因操作实验表明遗传缺陷导致了脊椎异常。有趣地是，已表明人类基因(例如，DLL3，HES7，MESP2和T)的一些突变参与了CS的过程；然而，这些突变可从表型正常的家族成员那遗传而来。家族内部相同突变导致的不同表型的差异说明了人类CS遗传变异的复杂性。基因与环境的相互作用已被提出用于解释上述现象。

自1983年至今北京协和医院骨科已收集神经纤维瘤病脊柱畸形样本178例，通过多种技术手段，对这些患者的临床信息、影像学资料(完整的X线、MRI和CT)及随访情况进行分析，发现其中非营养不良性脊柱侧凸患者42例(23.6％)，营养不良性脊柱侧凸患者136例(76.4％)。营养不良性脊柱侧凸患者不仅表现脊柱侧凸，而且具有严重的骨骼发育异常，其中有9例出现严重的肋椎关节脱位，肋骨突入椎管。同时营养不良性脊柱侧凸患者矫形手术后易出现融合失败、假关节形成等并发症，发生率高达25(18.4％)，矫形手术失败率远远高于先天性脊柱侧凸患者。

由此可见，I型神经纤维瘤合并脊柱畸形是多系统的综合疾病，尤其以营养不良性I型神经纤维瘤合并脊柱侧凸为代表，此类患者术后易发生骨愈合缺陷，造成矫形手术失败，对患者的身体健康和生活质量造成极大影响。因此，深入探讨营养不良性I型神经纤维瘤合并脊柱侧凸相关的发病机制，发现造成此类患者骨骼愈合缺陷、矫形手术失败的根本性原因，并制定相应的治疗方案介入矫形手术和患者的术后康复，不仅可以推动I型神经纤维瘤合并脊柱畸形这类疾病的基础理论认识，同时相应治疗方案的改进对此类患者临床矫形手术成功率的提高具有十分重要的意义。

鉴于目前还没有与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品早期诊断诊断产品，如能发现相应的标记物和研制相应的诊断试剂盒，将为探索肥胖早期防治的药物靶点提供新的方向，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。

发明内容

本发明的主要目的在于利用转录组测序技术发现一种与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病相关的生物标志物以及提供所述生物标记物在制备I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病诊断产品中的应用。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

发明人通过10例(5&5)NF1合并脊柱畸形患者转录组测序，筛选到新的潜在关键基因—IGFBP3，并通过临床小样本验证其编码蛋白在患者外周血中也是显著下调。

进而本发明提供了所述基因IGFBP3在制备诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用。

优选的，所述IGFBP3在诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中作为标记物的序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

优选的，所述产品为芯片、试剂盒。

进一步地，本发明还提供了一种诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的检测试剂，所述检测试剂包括特异性扩增IGFBP3的引物和说明书。

优选的，所述特异性扩增IGFBP3的引物如SEQ ID NO.2～3。

更进一步地，本发明还提供了一种治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的药物组合物，所述药物组合物包括含有I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的特定靶基因IGFBP3及其衍生物的生物制剂。

优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

还进一步地，本发明提供了一种诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病辅助检测试剂盒，其包括检测样本中IGFBP3基因表达情况的试剂。

优选的，所述试剂盒包括扩增IGFBP3的引物如SEQ ID NO.1～2。

本发明有益效果：

本发明通过转录组测序技术筛选到NF1合并脊柱畸形相关标记物IGFBP3，进而探明了IGFBP3在NF1合并脊柱畸形骨愈合缺陷发生发展中的作用，以及其发挥的作用机制，IGFBP3作为NF1合并脊柱畸形新型生物标志物，为指导其临床早期干预及靶向治疗提供了重要理论依据。

附图说明

图1本发明IGFBP3PCR扩增曲线图；

图2本发明IGFBP3溶解曲线图；

图3本发明IGFBP3基因cDNA在各组中的表达；

图4WB分析各组中IGFBP3蛋白表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中术语解释如下：

本文使用的术语“引物”指存在于纯化的限制性消化物中或合成产生的寡核苷酸，置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即存在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)以及适当的温度和pH时，所述寡核苷酸能作为合成的起始点。引物可以为单链或双链，并且必须具有足够的长度，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度会取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，就诊断应用而言，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含有15-25或更多的核苷酸，尽管也可以含有更少的核苷酸。引物合适长度的确定中涉及的因素为本领域普通技术人员所公知。一般而言，根据本领域熟知的标准方法设计和选择本发明的引物，参阅Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR Primer Design.《PCR Primer，ALaboratory Manual》(Dieffenbach，CW和Dveksler，G.S.编辑)Cold SpringHarborLaboratoryPress，NewYork，133-155。

FPKM(FragmentsPerKilo bases perMillionreads)是每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的reads数目。

实施例1样品的收集和样品资料的整理

获取自2017年1月至2017年12月于我院接受神经纤维素瘤合并脊柱畸形手术或检查的5例患者的外周血和5例相对正常的外周血样本。所有患者术前均未接受化疗或放疗，术前已取得患者的知情同意，并通过伦理委员会审核。

样本处理：将EDTA抗凝全血按1:1比例与Trizol混合，充分混匀后置于1.8ml细胞冻存管中，在液氮中迅速冷却30s后置于-80℃的冰箱保存。

实施例2外周血RNA提取

1、匀浆处理

取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10000rpm离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200ul血液收集的白细胞沉淀加入1ml Trizol。

2、分层

样本加入Trizol后，室温放置5min，使样本充分裂解。

每1ml Trizol加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

3、RNA沉淀

4℃12000rpm离心10-15min。样品会分为3层：黄色有机相，中间层和无色水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550-600ul)转移到新EP管中。注：小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。

在上清中加入等体积事先预冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

4、RNA漂洗

RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。没1ml Trizol加入1ml 75％乙醇。

4℃5000-8000rpm离心1-2min，弃上清；可短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2min晾干沉淀。

5、RNA溶解

沉淀中加入50-100ul RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-80℃保存。

6、RNA完整性及纯度检测

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。RNA样本中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280比值(10mM Tris,ph7.5)在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris,ph7.5溶液中测定出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测定读数可能在1.5-1.9之间，但这并不代表RNA不纯。

浓度：去一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/ul)＝OD260×n(稀释倍数)×40.

实施例3外周血RNA的RNA-seq测序文库构建与质检

1、数据质量评估

cDNA文库的构建及测序，委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。10个样品的测序数据经过测序错误率检查、GC含量分布检查及原始数据过滤，获得后续分析使用的clean reads，数据汇总如表2.1所示。通常认为RNA-seq数据进行不同文库间的基因差异表达分析，库总读段数至少为10M，数据整体GC含量保持在40％-60％，Q30在80％以上则为合理。本次测序所获数据中clean bases占7.2G以上，Q2碱基占95.18％以上，Q3碱基占89.15％以上，GC含量在样本间保持稳定，在54.29％-56.80％之间，说明整体测序质量良好，满足下游分析质量需求。

2、比对结果分析

将10个样品的clean reads用STAR软件比对到参考基因组序列，平均每个样品的比对率达到92.51％以上，Uniquely mapping rate是指比对到基因组单一位置的reads数占总clean reads数的百分比，只有Uniquely mapped reads才能用于表达量统计，本研究中参考基因组单一位点的平均比对率为76.956％。

3、定量结果分析

3.1定量结果说明

本研究一共测了10个血液样本，每个样本平均产出6Gb数据。将测序reads比对到参考基因组并重构转录本之后，根据FPKM表达量计算得到10个样品中所有的基因的表达水平。随后，我们用bowtie将reads比对到基因上，每个样本平均检测到11552个基因。

对每个样本分别进行基因水平或转录本水平定量，再合并得到所有样本的表达矩阵，第一列为基因或转录本ID，其余列为各样本的原始readcount值。

3.2表达水平分布

RNA-seq的基因表达值通常用RPKM或FPKM表示。RPKM用于单端测序，FPKM用于双端测序，先对测序深度进行校正，再对基因或转录本的长度进行校正。

3.3相关性分析

我们要求生物学重复样品间R2至少要大于0.8，否则需要对样品做出合适的解释，或者重新进行实验。根据各样本所有基因的表达值(RPKM或FPKM)，计算组内及组间样本的相关性系数，绘制成热图，可直观显示组间样本差异及组内样本重复情况。样本间相关性系数越高，其表达模式越为接近。

4、差异结果分析

基因差异分析的输入数据为基因定量中得到的原始readcount数据。本研究采用DESeq2软件对正常组及NF1合并脊柱畸形组血液进行对比分析，筛选正常组与NF1合并脊柱畸形组中基因表达量padj值小于0.05的差异表达基因。最终共筛选出780个差异表达基因，包括319个表达上调的基因和461个表达下调的基因，经过聚类分析、GO功能富集和KEGG信号通路功能富集分析，发明人筛选到NF1合并脊柱畸形相关标记物IGFBP3，该基因在NF1合并脊柱畸形病中为下调基因。

实施例4NF1合并脊柱畸形病外周血DNA中IGFBP3基因表达情况

1.实验材料

获取自2018年1月至2018年4月于我院接受NF1合并脊柱畸形手术或检查的5例患者的外周血、5例相对正常的外周血和3例先天性脊柱侧凸的外周血样本。所有患者术前均未接受化疗或放疗，术前已取得患者的知情同意，并通过伦理委员会审核。

样本处理：将EDTA抗凝全血按1:1比例与Trizol混合，充分混匀后置于1.8ml细胞冻存管中，在液氮中迅速冷却30s后置于-80℃的冰箱保存。

2.外周血RNA的提取

参照实施例2。

3.逆转录合成cDNA

3.1第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid Premium Reverse Transcriptase)(Thermo Scientific^TMEP0733)

3.2cDNA第一链合成

(1)在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂：

(2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。

(3)将试管冰浴，再加入下列试剂：

4.0μl 5*RT Buffer

0.5μl Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20U)

1.0μl RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200U)

(4)轻轻混匀后离心3～5s

(5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应

①25℃ 孵育10min

②cDNA合成 50℃30min

③终止反应 85℃5min，处理后，置于冰上放置

(6)将上述溶液-20℃保存。

4.Real-Time PCR

引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_000598.4(IGFBP3)，内参选GAPDH，引物设计后由上海生工公司合成。具体引物序列如下：

表1 Real-Time PCR引物序列

操作过程如下：

(一)反应体系：用Power

Green PCR Master Mix进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃3min预反应，进行45个循环(95℃3s，60℃30s)的扩增反应。

表2 Real-Time PCR反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μl
上游引物(10uM)	0.4μl
		下游引物(10uM)	0.4μl
模板	2μl
		加入灭菌蒸馏水	至20μl

(二)样品Real-Time PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

5.实验结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高，如图1所示。样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增，如图2所示。根据qRT-PCR的相对定量公式，比较IGFBP3基因在NF1合并脊柱畸形病组和对照组中的表达水平。结果如图3显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其IGFBP3基因在NF1合并脊柱畸形病组中的表达水平仅为对照组织的约0.25倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析IGFBP3基因在NF1合并脊柱畸形病低表达的结果。

实施例5 WB方法检测NF1合并脊柱畸形病中IGFBP3蛋白的表达

1、实验材料

同实施例4

样本处理：将非抗凝全血2500rpm/min离心15min，吸出上层血清部分，500ul/管分装至1.5mlEP管中，-80℃保存。

2、利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量

采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(货号：CW2011)，具体步骤见其说明书。

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

(1)蛋白质样品变性:

a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5x)。

b)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

(2)胶板制备:

采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5mL 10％的分离胶，配方如下：

表3分离胶配方

混匀后立即灌胶，然后加lmL蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2mL 5％的浓缩胶，配方如下：

表4浓缩胶配方

组分	用量
		30％丙烯酰胺溶液	0.33mL
Tris-HCl(1.0M，pH6.8)	0.25mL
		10％SDS	0.02mL
10％AP	0.02mL
		TEMED	0.002mL
灭菌ddH<sub>2</sub>O	补充至2mL

混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏水和1x蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。

4、上样及电泳

将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满lx蛋白电泳缓冲液，外槽中lx蛋白电泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

5、蛋白质印迹

5.1、按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。

5.2、预先用转印缓冲液浸泡PVDF膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除浓缩胶，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海棉垫大小相同或与PVDF膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将-PVDF膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的-PVDF膜应对电泳槽的正极。

5.3、封闭：转印结束后将PVDF膜用1xTBS漂洗一次。加入含5％的脱脂奶粉TBS封闭缓冲液，摇床上室温孵育1h；

5.4、一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗(Rabbit Anti-IGFBP3-antibody(-bs-1434R))杂交溶液，置于4℃杂交过夜-；

5.5、回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；

5.6、弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(-Anti-rabbit IgG,HRP-linkedAntibody(#7074))杂交溶液，置于摇床上进行杂交；

5.7、弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；

5.8、ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。

5.9、以Transferrin作为内参进行数据标准化，以正常对照组-血清中中IGFBP3作为参照样本，计算各组中IGFBP3蛋白的相对表达水平。

6、实验结果

NF1合并脊柱畸形与正常对照组和先天性脊柱侧凸组相比，IGFBP3蛋白表达明显降低(P<0.01)具体参见图4所示。

实施例6检测试剂盒的制作

引物：特异扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的在内的核苷酸序列的引物对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；和特异扩增内参基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；

还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCL，2.5mM MgCL₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

为方便使用，该试剂盒还可包含对照：正常人血液样本cDNA序列。

取受检者血液样本，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液样本提取RNA，使用试剂盒中试剂，按照最佳反应体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中正常血液的cDNA作为Real-Time PCR定量检测中的对照cDNA，检测受试者血液中如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相对表达量变化。

此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品，通过最精简和特异的引物对检测基因的表达情况，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高诊断NF1合并脊柱畸形的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> IGFBP3在制备诊断I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用

<130> 18025

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 165

<212> DNA

<213> synthetise

<400> 1

tggaagacac actgaatcac ctgaagttcc tcaatgtgct gagtcccagg ggtgtacaca 60

ttcccaactg tgacaagaag ggattttata agaaaaagca gtgtcgccct tccaaaggca 120

ggaagcgggg cttctgctgg tgtgtggata agtatgggca gcctc 165

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> synthetise

<400> 2

tggaagacac actgaatcac ctg 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> synthetise

<400> 3

gaggctgccc atacttatcc a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> synthetise

<400> 4

tgggtgtgaa ccatgagaag t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> synthetise

<400> 5

tgagtccttc cacgatacca a 21

Claims (2)

1.检测IGFBP3基因表达的试剂在制备诊断I 型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的试剂盒中的应用，所述IGFBP3基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列；

所述检测IGFBP3基因表达水平的试剂包括扩增IGFBP3的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO.2 ~3所示；

所述试剂定量检测外周血样本中IGFBP3基因的表达量，所述IGFBP3基因的表达量下调。

2. 如权利要求1 所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为芯片。

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