CN113215248B - 一种感音神经性耳聋相关的myo15a基因突变检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种感音神经性耳聋相关的MYO15A基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂以及对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。使用本发明所述试剂盒可以检测患者中存在的MYO15A基因c.5062_5063delCT突变，可用于临床上开展MYO15A基因感音神经性耳聋致病突变的筛查，为分析感音神经性耳聋发生的原因以及产前诊断提供依据。

Description

一种感音神经性耳聋相关的MYO15A基因突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及在临床诊断感音神经性耳聋中应用的MYO15A基因突变位点c.5062_5063delCT(p.Y1689Ffs*8)分型检测试剂盒。

背景技术

MYO15A基因是常见的耳聋致病基因之一，可导致常染色体隐性遗传非综合征型耳聋DFNB3(OMIM 600316)。DFNB3是由Friedman等于1995年在印度尼西亚一个常染色体隐性遗传非综合征型耳聋家族中首次发现，并通过连锁分析首次定位于常染色体17p11.2一段3厘摩的范围，命名为DFNB3基因座位。1998年，在3个无亲缘关系的DFNB3家系中证实MYO15A基因的纯合突变是导致这3个家系致病的原因。

MYO15A基因定位于17p11.2，共66个外显子，编码包含3530个氨基酸的肌球蛋白15。该蛋白结构分为头、颈、尾三个大区域，其中头部包含N末端结构域和负责ATP活性的运动结构域；颈部包含钙调蛋白轻链结合相关的IQ基序；尾部包含两个My TH4(肌球蛋白尾部同源物4)结构域、两个FERM结构域、一个SH3结构域，以及C端亚型Ⅰ和PDZ的结合基序。肌球蛋白15的功能是在细胞内约束细胞支架肌动蛋白纤维并为运动张力的形成提供能量，在毛细胞静纤毛的分化和延长过程中起着关键作用，而该蛋白的功能异常可使毛细胞表面静纤毛之间机械传递机制的中断。由此可见，肌球蛋白15是维持正常听力所必需的。

对于感音神经性耳聋患者MYO15A基因突变的筛查，国内外已经广泛开展，报道的致病突变位点近200个，包括错义突变、框移突变、无义突变及剪接位点突变，主要分布在编码区范围内。由于中东及南亚等国家地区在人口学存在近亲婚配及大家族更为普遍的特点，该地区MYO15A突变引起感音神经性耳聋的研究报道更为多见，并且相比于其他国家及地区，这些地区MYO15A基因突变在感音神经性耳聋中所占的比例也较高。

国内外研究表明MYO15A突变的基因型与听力表型的相关性较为复杂。有文献报道了更多的非先天性双耳重极重度感音神经性耳聋的听力表型，表型特征更为多样化：除了低频区残余听力，还包括听力曲线为下降型的先天性中重度感音神经性聋、全频中重度感音神经性聋、进展性高频下降型重度感音神经性聋以及迟发性、进展性中重度感音神经性聋(发病年龄最迟达14岁)。MYO15A基因的突变种类多样，每个位点变异后对蛋白的功能影响不同，明确新的突变位点致病性及导致表型的严重程度是遗传咨询的基础。

目前尚未见到关于MYO15A基因c.5062_5063delCT(p.Y1689Ffs*8)突变的报道。中国专利CN104099338A中公布了MYO15A基因突变体及其应用，涉及c.IVS25+3G>A、c.8375T>C；中国专利CN112522275A中公布了MYO15A基因突变体及其应用，涉及c.10419_10423delCAGCT、c.8791delT。但遗传性耳聋具有高度的遗传异质性，MYO15A基因序列中发生的每种未知功能的突变是需要对患者进行相应突变的检测，并经过研究验证后才能确定其致病性的。从通过软件分析确定的突变位点中发现具有致病性的突变仍属于技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种感音神经性耳聋相关的MYO15A基因突变检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测MYO15A基因c.5062_5063delCT(p.Y1689Ffs*8)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含人MYO15A基因CDS区(参考序列NM_016239)第5062_5063位所对应的碱基。

优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。

优选的，所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：

MYO15A-F-1:5’-GATAGTGAGGTTGCCACCAGG-3’；

MYO15A-R-1:5’-ATTGGACCTGGCTGTGAATG-3’。

优选的，所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：

MYO15A-F-2:5’-ACACCCGACCTACTATTCACA-3’；

MYO15A-R-2:5’-CCACCATTCTCCCTACTCCTG-3’。

利用上述试剂盒检测MYO15A基因c.5062_5063delCT(p.Y1689Ffs*8)突变的方法，包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用上述PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人MYO15A基因CDS区(参考序列NM_016239)第5062_5063位的碱基进行分型鉴定。

优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列进行比对，确定待测个体对应于人MYO15A基因CDS区(参考序列NM_016239)第5062_5063位的基因型或等位基因类型。

优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型CT/CT、突变杂合型CT/--以及突变纯合型--/--，其中“-”表示相应位点的缺失突变。

上述试剂盒(例如，其中所包含的PCR引物)在感音神经性耳聋病因学分析或感音神经性耳聋产前诊断筛查中的应用。例如，通过对待测样本的MYO15A基因(具体为人MYO15A基因CDS区)进行c.5062_5063delCT突变检测，从而判断患者感音神经性耳聋发生的遗传性原因。其中，MYO15A基因发生c.5062_5063delCT突变为错义突变，导致MYO15A基因编码的第1689位的氨基酸由酪氨酸变成苯丙氨酸(p.Y1689Ffs*8)，终止密码子提前，即开放阅读框发生了改变，使整个蛋白序列不能正常表达。

本发明的有益效果体现在：

本发明所提出的检测MYO15A基因c.5062_5063delCT(p.Y1689Ffs*8)突变的试剂盒可用于快速地检测MYO15A基因特定突变位点，为在感音神经性耳聋患者中开展易感基因筛查提供便利，并且通过检测来自患者的DNA样本中是否存在MYO15A基因c.5062_5063delCT突变或者该位点与其他明确的隐性致病位点的复合杂合突变，可以判断该患者的感音神经性耳聋发生原因，进而为临床诊断提供依据。

本发明所提出的检测MYO15A基因c.5062_5063delCT(p.Y1689Ffs*8)突变的试剂盒可用于产前诊断筛查，明确胎儿是否携带c.5062_5063delCT纯合突变或者该位点与其他明确的隐性致病位点的复合杂合突变，从而降低聋儿的出生率，为社会和家庭减轻负担。

附图说明

图1为MYO15A基因编码区氨基酸的保守性分析：突变位于MYO15A基因CDS区第5062_5063的CT碱基，用方框圈起来的是突变前氨基酸。

图2为PCR反应流程图：标出了反应条件(反应温度和时间)，其中↓表示每个循环降低0.5℃。

图3A为待测个体MYO15A基因测序结果图：突变杂合型序列，箭头所指为突变位点位置。

图3B为待测个体MYO15A基因测序结果图：野生型序列，箭头所指为突变位点位置。

图4为实例1中扩增产物的电泳图谱：左侧泳道为Marker，右侧泳道为扩增的目标片段(309bp)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明应用候选基因筛查的方法对100例非综合征型感音神经性耳聋患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查，在一个非综合征型感音神经性耳聋家系中发现MYO15A基因的c.5062_5063delCT突变。先证者与其妹妹的听力学检测结果是极重度听力损失，CT和MRI结果未显示异常，先证者的姐姐听力正常，先证者的父母亲听力正常。先证者与其妹妹的基因型是c.5062_5063delCT/c.7396-1G>A复合杂合突变，父亲携带c.5062_5063delCT杂合突变，母亲携带c.7396-1G>A杂合突变，先证者姐姐携带c.5062_5063delCT杂合突变，先证者与其妹妹这两位患者为两种突变的携带者，MYO15A基因突变相关的感音神经性耳聋以常染色体隐性遗传的方式传递。在这一家系的患者中MYO15A基因突变与感音神经性耳聋表型共分离。其中MYO15A基因c.7396-1G>A是明确的已知致病突变，必须以纯合突变方式或与其他致病突变组成复合杂合突变方式方可致病。MYO15A基因c.5062_5063delCT为致病突变。目前MYO15A基因已经报道的与感音神经性耳聋相关的突变近200余种，尚无c.5062_5063delCT突变的报道。

上述突变(c.5062_5063delCT)使位于MYO15A基因编码区的碱基发生移码改变，导致编码的第1689位氨基酸由酪氨酸变成苯丙氨酸(野生型MYO15A基因的标准序列可以参考NM_016239)，即开放阅读框发生了改变，使得整个蛋白序列不能正常表达。该序列在各个物种之间是高度保守的(图1)。

检测上述突变(c.5062_5063delCT)可采用多种检测点突变的方法来进行，例如PCR(聚合酶链反应)-测序法、采用标记的MYO15A基因DNA探针杂交法、用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。其中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：

1)采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组DNA；

2)以该DNA为模板，以针对MYO15A基因编码区第5062_5063位碱基附近设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；

3)将得到的PCR扩增产物进行测序分析，将测序所得到的序列与MYO15A基因参考序列(NM_016239)进行比较，确定待测个体MYO15A基因是否存在c.5062_5063delCT突变；

根据以上结果判断待测个体是否为MYO15A基因突变c.5062_5063delCT导致的感音神经性耳聋致病基因携带者(若感音神经性耳聋患者MYO15A基因存在c.5062_5063delCT纯合突变或者同时存在c.5062_5063delCT杂合突变与其他一个明确的感音神经性耳聋隐性致病位点的杂合突变(即复合杂合突变)，则判定该感音神经性耳聋患者的发病的原因为MYO15A基因突变所导致；若胎儿MYO15A基因存在携带c.5062_5063delCT纯合突变的风险，或者同时存在携带c.5062_5063delCT杂合突变与其他一个以上感音神经性耳聋隐性致病位点的杂合突变的风险，则判定该胎儿应进行感音神经性耳聋产前诊断筛查)，从而决定生育前是否需要进行遗传咨询，同时，为通过产前诊断筛查预防聋儿出生提供了准确的依据。

在上述步骤2)中使用的PCR引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计：通常为15～30个碱基，GC含量为45～50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。

上述步骤2)所得到的PCR反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的MYO15A基因核苷酸序列杂交，或与突变的MYO15A基因核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。

根据检测方法的不同，用于检测MYO15A基因c.5062_5063delCT突变的试剂盒中，除了包括PCR反应试剂，还包括检测PCR扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。

试剂盒容器内装有用以检测MYO15A基因c.5062_5063delCT突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于PCR反应试剂，例如，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。

实例1

通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后留取血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用蛋白酶降解法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primer5.0设计引物(扩增目标区域为包含MYO15A基因c.5062_5063位点在内长度为309bp的片段)，以基因组DNA为模板，BIORAD My Cycle热循环仪上进行PCR扩增。PCR扩增产物直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3730DNA测序仪。测序得到的序列与Genbank中的序列(NM_016239)比较，确定是否存在MYO15A基因c.5062_5063delCT突变。具体如下：

(一)待测血样DNA提取与MYO15A基因编码区的PCR扩增

1、待测对象血样DNA的制备

1.1研究对象

对100例散发非综合征型感音神经性耳聋患者和100名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行MYO15A基因的筛查。

散发非综合征型耳聋受试者采集自在西京医院(陕西省西安市)耳鼻咽喉头颈外科门诊做耳聋基因筛查的耳聋患者。听力正常对照是无耳聋家族史的听力正常受试者，对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5～10mL，采集时间是2009年10月。

1.2基因组DNA提取

1.2.1实验前准备及重要注意事项

(1)向蛋白酶K中加入制定用量的Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。

(2)所有离心操作均在室温下完成。

(3)血样的储存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存10天。

1.2.2操作步骤(血液基因组非柱式提取试剂盒；康为世纪)

1)低速离心至血样分层，用移液枪去除上层血清。

2)将全部血细胞转移至5mL离心管中，加入红细胞裂解液至总体积为4mL，上下颠倒混匀20次至沉淀充分分散。

3)6500g离心10min，弃去上清。

4)加入3mL Buffer FG1，涡漩振荡15s，使沉淀充分分散。

5)6500g离心10min，弃去上清，将离心管倒扣在干净的吸水纸上，吸干水分。

6)配制DNA提取液与蛋白酶K的混合液，混合比例为DNA提取液:蛋白酶K＝100:1，混合后涡漩振荡15s充分混匀。

7)向样品中加入配制好的DNA提取液与蛋白酶K的混合液1mL，立即充分涡漩振荡1min，直至溶液无团块。

8)将样品置于65℃水浴锅中温育15min，其间颠倒混匀3次，至样品颜色从红色变成淡绿色，说明蛋白完全消化。

9)向样品中加入2mL异丙醇，颠倒混匀10次至可见白色絮状沉淀。

10)取干净无菌的1.5mL离心管，做好标记，加入500μL预冷的75％乙醇。

11)用干净无菌的1mL移液器tip头挑取步骤9)中的白色絮状沉淀转移至步骤10)中准备好的75％乙醇中，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清。

11)再次加入500μL预冷的75％乙醇，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，吸干。

12)打开管盖，室温干燥15min，至所有液体完全挥发。

13)加入380μL DNA溶解液，置于37℃水浴中温育2h，同时进行振荡使DNA充分溶解。

14)分光光度计定量及检测纯度。

15)-20℃保存DNA。

2、MYO15A基因编码区目标片段的PCR扩增

2.1引物序列

使用Primer5引物设计软件，根据序列NM_016239设计引物，序列合成后用于检测：

上游引物MYO15A-F-1:5’-GATAGTGAGGTTGCCACCAGG-3’

下游引物MYO15A-R-1:5’-ATTGGACCTGGCTGTGAATG-3’

使用上述引物进行PCR扩增所获得的片段大小为309bp。

2.2 PCR反应体系的建立(表1)

表1.MYO15A基因的PCR反应体系

其中，PCR扩增使用天根公司PCR Mix。

反应条件：PCR反应在BIORAD My Cycle热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示。

PCR产物电泳流程：

1)配胶(1％琼脂糖)：称取0.4g琼脂糖，悬浮于40mL 1×TAE中(500mL锥形瓶)。

2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，其间取出混匀。

3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μL，10mg/mL)，摇匀。

4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250mL胶液全部倒入平板，插入梳尺。

5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TAE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

6)加样：用移液器按规定格式加样，最后加入

Plus DNA Marker。

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相。经过电泳后，

Plus DNA Marker(TaKaRa)有8条带可见，片段长度分别是5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，取5μL Marker，其中750bp条带浓度为100ng/5μL，显示亮带，其余条带浓度均为50ng/5μL。PCR产物电泳时取5μL(PCR产物)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与Marker的灰度值的比较判断PCR产物的大小及含量(参见图4)。

(二)MYO15A基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量

PCR扩增产物的纯化(96孔板法)：

1)PCR扩增产物电泳结束后，在365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔中。

2)4000rpm离心1min，加入500μL溶胶液，盖上封口膜，65℃水浴15min，定时。

3)检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μL混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600～800rpm震荡5min。

4)将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

5)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μL 8道电动移液器向每孔移入500μL洗液，盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

6)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μL 8道电动移液器向每孔移取500μL 70％乙醇盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

7)弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm水平震荡5min。

8)离心至1000rpm，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min。

9)2μL样品与6μL 1.4X溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，按照A01-H01的竖向顺序横向点入，中间空出2孔，分别加入1μL、2μL量的Marker，300V电泳11min。

10)将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像。

11)对照纯化前后胶图，根据PCR定量标准在PCR记录表上标注每孔扩增产物纯化后所得测序模板的浓度并稀释至指定浓度，对回收后电泳无条带的样品按照4μL样品+5μL1.4X溴酚蓝再次电泳鉴定。

12)将稀释后上述模板离心2min，离心至4000rpm，标记Lims系统模板状态，确认提交前需要再次核对上述模板状态，确认无误后将上述模板4℃冰箱保存。

(三)纯化的MYO15A基因编码区PCR扩增产物的直接测序

1、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求见表2。

DNA纯度：OD260/OD280＝1.6～2.0。

DNA浓度：PCR产物10ng/μL。

表2.DNA用量

PCR产物长度(bp)	测序反应加入模板量(ng)
		100～200	1～3
200～500	3～10
		500～1000	5～20
1000～2000	10～40
		>2000	40～100

2、测序反应

反应体系为5μL，各种试剂加入量如表3所示。

表3.MYO15A基因PCR扩增产物的测序反应体系

其中，Big-Dye mix为美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的荧光染料。5×GC buffer是美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的缓冲液。

样品放于PCR仪(热循环仪)上，所作反应的过程见表4。

表4.MYO15A基因PCR扩增产物的测序反应过程

反应完的样品要及时从PCR仪(热循环仪)上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

3、测序反应物的纯化和测序

1)向每孔中加入20μL 80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；

2)在每孔中加入30μL 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

3)重复步骤2)再两次；

4)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

5)加入5μL甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

6)上机前95℃变性5min，放置冰上2min，离心后上ABI 3730测序仪。

测序结果如图3A、图3B所示。

(四)检测耳聋相关基因MYO15A突变位点(c.5062_5063delCT)试剂盒及其应用

1、试剂盒的组成

(1)扩增用引物：

上游引物MYO15A-F-1:5’-GATAGTGAGGTTGCCACCAGG-3’

下游引物MYO15A-R-1:5’-ATTGGACCTGGCTGTGAATG-3’

(2)PCR扩增用PCR Mix 2×

(4)dNTP 2.5mM

(5)Big-Dye mix，美国应用生物系统公司(ABI)生产

2、使用方法

主要包括如下步骤：

1)PCR扩增

用PCR引物扩增目的片段，反应条件见图2。

2)PCR产物纯化

PCR产物电泳，凝胶纯化及电泳定量。

3)测序反应及比对

以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在BIORAD My Cycle热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABI 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与正常序列(NM_016239)比较，以确定突变是否存在。

100例患者中，1例感音神经性耳聋患者的MYO15A基因检测发现为c.5062_5063delCT杂合突变。对100名听力正常者的筛查中未发现c.5062_5063delCT突变者。

实例2

扩增引物如下，其他同实例1(扩增目标区域为包含MYO15A基因c.5062_5063位点在内长度为1060bp的片段)：

上游引物MYO15A-F-2:5’-ACACCCGACCTACTATTCACA-3’

下游引物MYO15A-R-2:5’-CCACCATTCTCCCTACTCCTG-3’。

总之，本发明能够从待测样本中检测到MYO15A基因c.5062_5063delCT突变，并明确了该突变的致病性，为判断感音神经性耳聋患者病因、进行遗传咨询及产前诊断奠定了基础。

<110> 中国人民解放军空军军医大学

<120> 一种感音神经性耳聋相关的MYO15A基因突变检测试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> MYO15A-F-1

<400> 1

gatagtgagg ttgccaccag g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> MYO15A-R-1

<400> 2

attggacctg gctgtgaatg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> MYO15A-F-2

<400> 3

acacccgacc tactattcac a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> MYO15A-R-2

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ccaccattct ccctactcct g 21

Claims (7)

1.一种分型检测分子标记的试剂在制备感音神经性耳聋病因学分析试剂盒或感音神经性耳聋产前诊断筛查试剂盒中的应用，其特征在于：所述分子标记为MYO15A基因c.5062_5063delCT突变，该突变为位于NM_016239上MYO15A基因CDS区第5062至5063位的碱基发生缺失。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括检测MYO15A基因c.5062_5063delCT突变的方法，所述方法包括以下步骤：

1）采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2）以步骤1）提取的DNA为模板进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的MYO15A基因CDS区第5062至5063位的碱基进行分型鉴定。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列进行比对，确定待测个体MYO15A基因CDS区第5062至5063位的基因型。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：根据比对确定的基因型包括野生纯合型CT/CT、突变杂合型CT/--以及突变纯合型--/--。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：PCR反应的引物为引物对P1，引物对P1的序列为：

MYO15A-F-1:5’-GATAGTGAGGTTGCCACCAGG-3’；

MYO15A-R-1:5’-ATTGGACCTGGCTGTGAATG-3’。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：PCR反应的引物为引物对P2，引物对P2的序列为：

MYO15A-F-2:5’-ACACCCGACCTACTATTCACA-3’；

MYO15A-R-2:5’-CCACCATTCTCCCTACTCCTG-3’。

7.一种分型检测MYO15A基因突变c.5062_5063delCT的扩增引物在制备感音神经性耳聋病因学分析试剂盒或感音神经性耳聋产前诊断筛查试剂盒中的应用，其特征在于：所述MYO15A基因突变c.5062_5063delCT为位于NM_016239上MYO15A基因CDS区第5062至5063位的碱基发生缺失；

所述扩增引物选自引物对P1或引物对P2，引物对P1的序列为：

MYO15A-F-1:5’-GATAGTGAGGTTGCCACCAGG-3’；

MYO15A-R-1:5’-ATTGGACCTGGCTGTGAATG-3’；

引物对P2的序列为：

MYO15A-F-2:5’-ACACCCGACCTACTATTCACA-3’；

MYO15A-R-2:5’-CCACCATTCTCCCTACTCCTG-3’。

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