CN107760777B - 一种改进型遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变检测试剂盒 - Google Patents

一种改进型遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及测遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变检测试剂盒，通过检测ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9基因编码区及侧翼序列是否存在突变，而诊断该待测个体中遗传性出血性毛细血管扩张症的发生和类型。本发明还涉及一种检测待测个体中是否存在ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9基因编码区及侧翼序列基因突变的试剂盒，从而判断待测个体中是否因具有上述基因突变相关的动静脉畸形、肺动脉高压等疾病。

Description

一种改进型遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变检测 试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及检测遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变的试剂盒。
背景技术
遗传性出血性毛细血管扩张症是一种系统性疾病，平均发病率约为 1/5000-1/800。临床表现为鼻出血，皮肤粘膜毛细血管扩张以及肺脏、肝脏、胃肠道、脑、脊髓等系统的动静脉畸形。该病发病年龄从自幼至几十岁，鼻出血是最常见且最早发现的临床特征。由于发病较晚，各组织的临床特征出现的时间不一致，因此，遗传性出血性毛细血管扩张症发病初期常常被误诊为单纯难治性鼻出血，而内脏动静脉畸形造成的出血往往是危及生命却难以发现的临床病变，因此，目前的临床诊断策略存在一定局限性。
遗传性出血性毛细血管扩张症属于常染色体显性遗传性疾病，男女发病几率均等。目前发现ENG、ACVRL1、SMAD4及BMP9四个基因突变与其发病有关。按照其致病基因及发病机制的不同将遗传性出血性毛细血管扩张症分为四种类型：1)遗传性出血性毛细血管扩张症1型与转化生长因子β (transforming growth factor-beta，TGF-beta)的结合蛋白内皮素(Endoglin， ENG)编码基因突变有关；2)遗传性出血性毛细血管扩张症2型和激酶1样激活素受体(Activin A receptor,type II-like 1；ACVRL1；Activin receptor-likekinase-1,ALK1)基因突变有关；3)合并青少年息肉病的综合征型遗传性出血性毛细血管扩张症和SMAD4基因(SMA-and MAD-related protein 4)突变有关； 4)遗传性出血性毛细血管扩张症5型和骨形成相关蛋白9(Bone morphogenetic protein 9,BMP9,also known asGDF2)有关。遗传学研究发现约80％遗传性出血性毛细血管扩张症和ENG基因和ACVRL1基因突变有关，不同地区，两个基因相关的遗传性出血性毛细血管扩张症患者所占比率不同；约1-2％的遗传性出血性毛细血管扩张症分别和SMAD4基因以及BMP9基因突变有关；四个已知的相关基因可解释约85％的遗传性出血性毛细血管扩张症患者的病因。鉴于此，遗传性出血性毛细血管扩张症的相关基因ENG、ACVRL1、SMAD4及 BMP9的突变筛查可以为多数患者发现分子病因，实现疾病的早期发现，早期诊断，预防严重内脏动静脉畸形致出血的发生。
中国专利申请CN1003555833A公开了一种家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒，其使用34对特异性引物，检测ACVRL1基因、ENG基因、 SMAD4基因编码区突变，在该检测方法中，其PCR反应需分步进行，扩增 ACVRL1基因和ENG基因，及扩增SMAD4基因分为两个反应步骤，方法较为繁琐，且未包含检测BMP9基因的步骤。
发明内容
本发明目的在于提供用于检测ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9基因编码区及侧翼序列突变的试剂盒。
本发明将为遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变的临床和实验室筛查提供方便确实可靠的方法，有利于该病的早期发现和诊断。
使用本发明的试剂盒的检测方法为通过采用试剂盒中提供的特异性的 37对引物进行PCR扩增，所述引物如SEQ ID NO：1-74所示，检测来自于患者的待测样本中是否存在ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9 基因编码区及侧翼序列突变，而判断该患者是否为遗传性出血性毛细血管扩张症患者，并进行分型诊断。
所述试剂盒特异性引物SEQ ID NO:1-74具体信息如下：
表1试剂盒37对特异性引物具体信息
Figure GDA0002829810480000021
Figure GDA0002829810480000031
Figure GDA0002829810480000041
进一步，所述的四个基因核苷酸序列是参考的标准序列：ACVRL1基因，NG_009549.1，NM_000020.2；ENG基因，NG_009551.1，NM_000118.3； BMP9基因，NG_033916.1，NM_016204.2；SMAD4基因，NG_013013.2， NM_005359.5。
本发明所述的遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变检测试剂盒还包括：PCR扩增所用的dNTP混合液、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCL2溶液、去离子水及PCR扩增所用的PCR板。本发明所用试剂均为常规PCR 反应试剂，本试剂盒组分和含量：
Figure GDA0002829810480000051
本试剂盒为1人份检测应用，每人份包含37个PCR反应孔，依次排列，分别包含37对特异引物，可保存在4℃或更低的温度条件下。
本发明还提供了一种检测ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及 BMP9基因编码区及侧翼序列突变的试剂盒。
本发明通过对引物序列的重新设计和优化，提供了一种改进型遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变检测方法，步骤简易，反应条件均一，可以在一次PCR扩增试验中完成1个样本的四个基因的37对特异引物检测，具体步骤如下：
1)从外周血或组织样本提取基因组DNA作为模板，浓度稀释成 50ng/uL；
2)将1uL基因组DNA模板分别加入到含有37对特异引物的37孔 PCR板的PCR反应混合体系中；
3)扩增ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9基因的反应条件均为：
Figure GDA0002829810480000052
4)将PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，证实PCR扩增产物条带符合目的片段长度后进行测序，目的片段长度参见表1。
5)将得到的PCR产物进行直接测序分析，测序所用引物为上述试剂盒中PCR扩增所用的37对特异引物中的正向或反向引物，参加表 1。
6)进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤：
将所得到的序列分别与参考基因ACVRL1基因，NG_009549.1， NM_000020.2；ENG基因，NG_009551.1，NM_000118.3；BMP9 基因，NG_033916.1，NM_016204.2；SMAD4基因，NG_013013.2， NM_005359.5的标准序列进行比对，分析是否存在具有氨基酸改变的变异，剪接位点碱基变异，及编码区及剪接位点区域的插入缺失变异等功能变异。
本发明操作简单，方便快捷，其有益效果为：
1)所述的DNA样品为人全基因组DNA，可以有效的对全基因组的突变进行检测；
2)本发明针对ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9基因四个基因的编码区及侧翼序列，重新设计37对特异性引物PCR扩增及测序引物(表1)，使得PCR扩增体系(表2)和扩增条件实现均一化(图1)，简化实验步骤，可以方便、快捷且有效检测基因突变的存在及变异类型，推测其是否致病。
3)试剂盒灵敏度和特异度俱佳，有利于临床遗传性出血性毛细血管扩张症的诊断。
4)本发明还可用于临床或实验室对于ACVRL1基因、ENG基因、 SMAD4基因及BMP9基因编码区及侧翼序列的检测、筛查及疾病诊断，这四个基因的变异可以和遗传性出血性毛细血管扩张症相关，但不限于此疾病，还可包括：动静脉畸形；肺动脉高压；息肉病等疾病。
附图的简要说明
下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。
图1为本发明方法中PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间；
图2A为本发明方法中，对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置；
图2B PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；从第二泳道至第九泳道所用引物名称依次为ACVRL1-2、ACVRL1-3、ACVRL1-4、ACVRL1-5、ACVRL1-6、ACVRL1-7、ACVRL1-8和ACVRL1-9；
图2C PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；从第二泳道至第九泳道所用引物名称依次为ACVRL1-10、ENG-1、ENG-2、ENG-3、 ENG-4、ENG-5、ENG-6、ENG-7；
图2D PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；从第二泳道至第五泳道所用引物名称依次为ENG-8、ENG-10、ENG-12、ENG-13；
图2E PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；从第二泳道至第九泳道所用引物名称依次为BMP9-2、BMP9-2-1、BMP9-2-2、SMAD4-2、 SMAD4-3、SMAD4-4、SMAD4-5、SMAD4-6,7；
图2F PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；从第二泳道至第六泳道所用引物名称依次为SMAD4-8、SMAD4-9、SMAD4-10、 SMAD4-11、SMAD4-12；
图2G PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；从第二泳道至第三泳道所用引物名称依次为ENG-14、BMP9-1；
图2H PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；第二泳道引物名称为ENG-9；
图2I PCR扩增产物电泳图：第一泳道为DL2000 Marker；第二泳道引物名称为ENG-11；
图3为本发明方法中具体实施例中ACVRL1基因(ACVRL1-8引物)测序结果，发现外显子8上c.1120C>T(p.Arg374Trp)突变，上方为野生型序列 (正常人序列)，中间为杂合突变序列(家系先证者)，下方为杂合突变序列(先证者同患病儿子的序列)，箭头示突变位点位置。
发明的具体实施方式
本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
引物设计：
中国专利申请CN103555833A针对ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4 基因共设计了34对特异性引物，本发明对其进行如下方面进行改进：
a.其中ENG基因的外显子9共设计了2对引物，这个在本案中做了改进，对ENG基因的外显子9仅通过1对引物进行扩增，节省时间及成本；
b.更正了CN103555833A中表1中对于SMAD4基因的外显子标记的错误；
c.本发明将37对特异引物扩增条件进行了均一化，通过一次扩增可以完成一个样本的检测，节省PCR扩增的步骤，使得一个样本PCR扩增的效率大大提高，较CN103555833A案例节省一半多的时间；而在 CN103555833A中，34对引物PCR扩增的反应条件复杂，需要通过两次扩增才能完成每个样本的检测，且每次扩增时间较本发明所用时间长，具体为：扩增ENG基因和ACVRL1基因的PCR反应条件为95℃预变性5分钟：随后是14个循环，具体如下：95℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；接着是21 个循环：95℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，72℃7分钟；最后4℃0分钟～24小时。扩增SMAD4基因序列PCR反应条件为94℃预变性4分钟：随后是35个循环，具体如下：94℃30秒，55℃45秒，72℃45秒；接着是72℃10 分钟；最后20℃0分钟～24小时。
【实施例1】待测对象血样DNA的制备
1、研究对象
收集到一个传递2代，具有2名临床诊断为遗传性出血性毛细血管扩张症的家系，先证者临床特征为反复鼻出血，舌尖可见毛细血管扩张，明确的家族史，肝脏血管瘤符合遗传性出血性毛细血管扩张症临床特征中三条，临床可以明确诊断；先证者儿子为同患病。在签署知情同意书以后每人采集血样5～10ml。
2、基因组DNA提取
采用酚氯仿抽提法。
第一天
1)抗凝血用PBS作1倍稀释。
2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃～28℃)，上面铺一层 1倍体积已稀释的血液，室温，1000×g,离心20分钟。
3)吸弃上清液，小心吸出中间有核细胞层，转入5ml Ep管中，5000×g, 离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000×g,离心10分钟。
4)将细胞悬于2ml TE缓冲液(10mM Tris.HCl，1mM EDTA，pH8.0) 中，加10％的SDS(十二烷基硫酸)至终浓度0.5％(100μl)，蛋白激酶k 100～ 200μg/ml(10mg/ml)，50℃水浴3～5小时。
5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000×g,离心10分钟。
6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚：氯仿混合物，混匀，5000×g,离心10分钟。
7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿：异戊醇混合物，混匀，5000×g,离心10分钟。
8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。
9)加入2.5倍体积的无水乙醇。
10)-20℃沉淀DNA过夜。
第二天
11)高速离心，10000×g，10分钟，4℃。
12)弃上清液，加入75％乙醇2ml，高速离心10000×g，5分钟。
13)弃上清液，吹干。
14)用TE缓冲液溶解(200μl TE/5ml全血，400TE/10ml全血)。
15)分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。
【实施例2】ACVRL1、ENG、SMAD4及BMP9基因编码区的PCR扩增
1、引物序列
引物为上述的37对特异性引物，序列参加表1。
2、PCR反应体系的建立(表2)
表2 PCR反应体系
Figure GDA0002829810480000091
反应条件：PCR反应在eppendorf公司Mastercycler热循环仪上进行，每个样本进行的37对特异性引物反应条件一致(包括温度和时间)，如图1所示。
【实施例3】PCR扩增产物的纯化和定量
一、PCR产物的纯化——96孔板法
1、向装有PCR产物的96孔板中加入50μl无菌水，混匀。
2、将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。
3、向纯化板中再次加入50μl的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。
4、将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20μl的去离子水，静止15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。
5、保存在-20℃冰箱中。
二、电泳定量
1、样品准备
取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6μl，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用排枪移出PCR产物(2μl)，转移到点样板上、混匀、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。
2、流程
1)配胶(0.8％琼脂糖)：称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5×TBE中 (500ml锥形瓶)。
2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。
3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴 EB(约10μl，10mg/ml),摇匀。
4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。
5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TBE，液面距胶面1至2mm) 的电泳槽中，拔下梳尺。
6)加样：用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。
7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。
8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，进行定量。
定量marker为DL 2000，如图2A所示，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp，DL2000的总浓度是300ng/5μl。电泳时取5μlDL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3μl(PCR产物)+5μl(上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。
【实施例4】纯化的PCR扩增产物的直接测序
一、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求
DNA纯度：OD260/OD280＝1.6～2.0。
DNA浓度：PCR产物10ng/μl。
DNA用量：
PCR产物
Figure GDA0002829810480000101
Figure GDA0002829810480000111
二、测序反应
1、测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。
2、为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。
3、目前的反应体系为5μl，各种试剂加入量如表3所示。
表3 PCR扩增产物的测序反应体系
Figure GDA0002829810480000112
*BigDye 3.1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。
4、样品放于PCR仪上，所作反应的过程见表3。
表4 PCR扩增产物的测序反应过程
Figure GDA0002829810480000113
5、反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。
三、测序反应物的纯化和测序
1、向每孔中加入20μl 80％乙醇，4,000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1,000rpm；
2、在每孔中加入30μl 70％乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；
3、重复第2步的操作；
4、重复第2步的操作；
5、将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；
6、加入5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；
7、上机器前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。
测序图如图3所示。
检测遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变试剂盒及其应用
【实施例5】
1、试剂盒的组成
(1)扩增用引物：
引物为上述的37对特异性引物，序列参加表1。
注：参考基因ACVRL1基因，NG_009549.1，NM_000020.2；ENG基因，NG_009551.1，NM_000118.3；BMP9基因，NG_033916.1，NM_016204.2； SMAD4基因，NG_013013.2，NM_005359.5的标准序列。
(2)PCR扩增用Taq DNA聚合酶2.5U/μl
(3)10×缓冲液(含MgCl2)
(4)dNTP混合液2mM
(5)去离子水
(6)Big-Dye mix
2、使用方法
主要包括如下步骤：
1)PCR扩增
将DNA模板加入预混的PCR扩增试剂盒中，配置PCR扩增体系，反应条件为第一步95℃预变性10分钟，第二步35个循环：95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，第三步72℃延伸5分钟，4℃保存(图1)。
2)PCR产物纯化
将含有PCR产物的MμltiScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MμltiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后转移至另一洁净的96孔板中。
3)测序反应及验证
以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与标准序列比较以确定突变位点是否存在。
在实施例1中的家系，应用上述试剂盒对ACVRL1基因、ENG基因、 BMP9基因及SMAD4基因全编码区及侧翼序列进行检测，测序并分析，发现ACVRL1基因(ACVRL1-8引物)的外显子8上c.1120C>T(p.Arg374Trp) 突变，具体序列图如图3。
具体方法参见实施例1、2、3、4。
【实施例6】试剂盒在遗传性出血性毛细血管扩张症中的检测
1、研究对象
收集临床遗传性出血性毛细血管扩张症家系21例，包括临床明确诊断病例18例，疑似诊断3例。
2、采用试剂盒：
同实施例5中的试剂盒。
3、使用方法：
参考实施例5
在本实施例中应用上述的试剂盒对21例遗传性出血性毛细血管扩张症的先证者进行了ACVRL1基因，ENG基因，SMAD4基因及BMP9基因的全部外显子及侧翼序列的筛查，17例先证者均发现了和疾病相关的基因突变， 81％的患者检测到了基因的突变，具体如下表5：
表5应用试剂盒对21例遗传性出血性毛细血管扩张症先证者检测结果
Figure GDA0002829810480000131
注：HHT,明确诊断为遗传性出血性毛细血管扩张症；Possible HHT,疑似诊断。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
Figure IDA0001086408850000011
Figure IDA0001086408850000021
Figure IDA0001086408850000031
Figure IDA0001086408850000041
Figure IDA0001086408850000051
Figure IDA0001086408850000061
Figure IDA0001086408850000071
Figure IDA0001086408850000081
Figure IDA0001086408850000091
Figure IDA0001086408850000101
Figure IDA0001086408850000111
Figure IDA0001086408850000121
Figure IDA0001086408850000131
Figure IDA0001086408850000141

Claims (3)

1.一种用于检测遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括下述试剂：
检测ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9基因编码区及侧翼序列突变的37对特异性引物；
用于扩增样本DNA的PCR反应试剂；
对PCR扩增产物进行测序的试剂；
其中所述检测ACVRL1基因、ENG基因、SMAD4基因及BMP9基因编码区及侧翼序列突变的37对特异性引物为，引物序列方向为5’至3’：
SEQ ID NO:1，ACATTGCTCTCCACCCTTCA
SEQ ID NO:2，CAGCTTCTCAAGTTCAGCCC
SEQ ID NO:3，AGACGAGAGGGACAGTAGGA
SEQ ID NO:4，AAGAAGATGGGGAGGGAGTG
SEQ ID NO:5，GACTCTGGGATCTAACTGGCA
SEQ ID NO:6，CGGCTCTAATCTCTGGGTGA
SEQ ID NO:7，GAGTGAGGAGCTTGCAGTGA
SEQ ID NO:8，ACCGCCTGTGATTCCAGTAG
SEQ ID NO:9，ACTGGGTTTGGGTCTGGATT
SEQ ID NO:10，GAGGTCTGCAAACTTGAGCC
SEQ ID NO:11，GACCCAGTCCATTCCCTCTC
SEQ ID NO:12，GTGCTAATCATGGTCACCGC
SEQ ID NO:13，CCCTCTCTGTCCCACTGTTT
SEQ ID NO:14，TCTGACTGCAAACCTCCCAG
SEQ ID NO:15，AGAGGGTAGAAAAGGCTCTCC
SEQ ID NO:16，GCCTCAGACACAAGTTCCTG
SEQ ID NO:17，GGCCATCCTCCTCATCTTCT
SEQ ID NO:18，CTCTTTTGCATCCTGTCCCG
SEQ ID NO:19，GCACTTCCTCTACCCGGTT
SEQ ID NO:20，CCCGAGGCTTTCTTTCAACA
SEQ ID NO:21，TGTGATGATGCAGGAAAGCC
SEQ ID NO:22，TAACGAGGACTCAGCCACTG
SEQ ID NO:23，GGAGAGTGGAGTGGAAGCAT
SEQ ID NO:24，AGATGAAAGGGAGAAGCAGGG
SEQ ID NO:25，CAATGGGCTGACTCCACAAA
SEQ ID NO:26，TTGTGGCATGTGAACTGTGG
SEQ ID NO:27，CCACTATCTTTGGCTGTGGG
SEQ ID NO:28，GGGCTTTATAAGGGACCGGA
SEQ ID NO:29，CCTATCCCATAAACCCACACCT
SEQ ID NO:30，TGATTTGTCCTTCAGCTCAGC
SEQ ID NO:31，ACCTATGCCCATACGTGAGG
SEQ ID NO:32，CTCCCATTGTTCCCATGTGC
SEQ ID NO:33，AGAGCCTGAGAATCGCTTGA
SEQ ID NO:34，AACTAAGGCTTGCAGAGGGA
SEQ ID NO:35，GAATGGCTGTGACTTGGGAC
SEQ ID NO:36，CTCTCCCAAACACACCTCCA
SEQ ID NO:37，AAAATGGGCGTATTGGGTGG
SEQ ID NO:38，GGCATTCCAGACACACATGG
SEQ ID NO:39，CATGATGCCTGTTCCTCCC
SEQ ID NO:40，TGGAGTCATGGTGGGAAGAA
SEQ ID NO:41，CTCAGGGGTGGGAACTCTTA
SEQ ID NO:42，CCATGTCCCTTCCTGCAAA
SEQ ID NO:43，TGGAGATGGGATTCAAAGCC
SEQ ID NO:44，AGCCAATAACTGTGGGGATG
SEQ ID NO:45，CTGTGATGAGCCCGTTTGC
SEQ ID NO:46，CCACTGGGTTGAAGGTTCTG
SEQ ID NO:47，CATGCCCTGTGTGTTTGTCA
SEQ ID NO:48，AGCCACGCATTTGAAAGGAA
SEQ ID NO:49，ACTTTAAGGGCTTGGGTGAAAC
SEQ ID NO:50，GTGCAATGATCCAGCTGTCC
SEQ ID NO:51，CATGAACAAGAGAGCGTGCT
SEQ ID NO:52，CTTGCATCCCAACAACCCTC
SEQ ID NO:53，GAGTGTGGGTGCAGGTAGTA
SEQ ID NO:54，AAGATCCTGGGCTTTGGTGT
SEQ ID NO:55，CCAGAGCAATTTCATCTTTTCCC
SEQ ID NO:56，ACCCTGTAGTAGCTTGAAAGGA
SEQ ID NO:57，TGAGTTGGTAGGATTGTGAGGA
SEQ ID NO:58，CGCGGGCTATCTTCCAAATT
SEQ ID NO:59，AATTTGGAAGATAGCCCGCG
SEQ ID NO:60，CTGCCGCTCACACAAACTAA
SEQ ID NO:61，GCTGTTACCGCTGAATAAATGAC
SEQ ID NO:62，TGGGAGCTTAAGAGGCTACTTA
SEQ ID NO:63，CTGATAGGCCATGGGTGAGT
SEQ ID NO:64，ACAGAAAACAAAGCCCTACCAA
SEQ ID NO:65，GCTGTGTGACCATTGACAAGT
SEQ ID NO:66，TGTGCGTTTCAATCACCACT
SEQ ID NO:67，ATCTCCCCTCCCTTTACCCT
SEQ ID NO:68，ACCGACAATTAAGATGGAGTGC
SEQ ID NO:69，ACTACATGCTCCTGACACATAGT
SEQ ID NO:70，TTCCATTCCTTCCACCCAGA
SEQ ID NO:71，TCCAAGCCACCTTTCCTAACT
SEQ ID NO:72，CCCCTTTCTCCTTCATCCCA
SEQ ID NO:73，CCTTAACCAAAAGTGTGCAGC
SEQ ID NO:74，TCCAGTTTCTGTCTGCTAGGA。
2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于用于扩增样本DNA的PCR反应试剂包括：由dNTP混合液、TaqMan聚合酶、PCR缓冲液、MgCL2溶液、去离子水构成的PCR反应体系。
3.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于用于PCR扩增产物进行测序的试剂包括：
1)权利要求1所述的37对特异性引物中的正向或反向引物；
2)测序反应所需用于测序反应的荧光染料及缓冲液。
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