CN103502469B - 强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明申请披露了一种强直性脊柱炎易感性的检测方法，所述方法包括检测样品中单核苷酸多态性rs13198903位点上的碱基，该碱基为T时则强直性脊柱炎的易感性显著增加。还披露了相应的试剂盒及其应用。

Description

强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性的检测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明申请涉及一种强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性(SNP)的检测方法、试剂盒及其应用，属于医学检测技术领域。

背景技术

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是脊柱关节病(spondyloarthropathies，SpA)的一种亚型，它主要的临床表现为炎性腰背痛、晨僵、脊柱活动受限等中轴表现，或／和并发外周关节炎、肌腱末端、韧带附着点炎，至疾病晚期，会出现脊柱强直或畸形。以往的研究中认为遗传因素的作用在AS的发病机制中占据了更为重要的作用，既往的基于双胞胎的研究表明，在单卵双生和异卵双生的双胞胎中高的一致的发病率提示遗传因素在AS的发病机制中的作用超过了90％。

在有关AS致病基因的研究过程中，HLA-B27是最早也是被认为与AS的家族聚集性的遗传相关的重要的基因。但在基因风险方面，研究认为HLA-B27在疾病的总的遗传风险大约只占了20-30％，而整个MHC占的比例约是40-50％。MHC又叫主要组织相容性复合体，是存在于脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原的一组紧密连锁的基因群，与免疫应答、免疫调节和移植排斥等有关。研究表明，在单卵双生的双胞胎中，HLA-B27的一致的机率是63％，在双卵双生的双胞胎中HLA-B27的一致的机率是23％。研究还显示：AS患者的HLA-B27阳性的一级亲属患病机率是没有家族史的HLA-B27阳性的个体的6-16倍，这些都提示非HLA-B27的家族性的因素在疾病的发展中也起到重要的作用。

近年来，全基因组关联分析研究越来越广泛地应用于寻找疾病的易感基因，这为研究强直性脊柱炎的发生和发展的机制开辟了全新的思路，通过对全基因组的SNP芯片全扫并分析，寻找与强直性脊柱炎相关的易感SNP，从而探讨强直性脊柱炎的致病或易感基因。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(codingSNP，cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1／5，但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因，cSNP中约有一半为非同义cSNP；此外，SNP也可作为遗传标记，帮助寻找和确定疾病的易感基因。

在2007年，Brown等就根据自制的密集型SNP芯片对大样本的AS患者和健康志愿者对照人群间进行了全扫并验证，同时指出了IL23R和ARTS1这两个基因可能是AS的新易感基因，随后韩国和中国的研究机构对ARTS1基因之进行验证，结果认为ARTS1与AS存在关联；中国的研究机构还对IL-23R进行了验证，结果未发现两者之间存在关联，这提示了不同种群间可能存在着差异。而且上述2007年的Brown的研究中虽然采用密集型SNP芯片，但是该芯片并未对这个基因组都做密集型SNP的全扫，只是针对感兴趣的位置来定制密集型SNP芯片，所以会导致芯片在其它未覆盖到的或SNP标记不够密集全扫的区域出现遗漏。于是在2010年Brown等采用了的Illumina HumHap370芯片对欧洲人种后代的澳大利亚、英国和北美AS患者和健康志愿者对照人群进行全扫并验证，结果除了发现之前研究提出的ARTS1和IL-23R基因可能是AS的易感基因之外，还提示ANTXR也可能与AS相关联，同时还提示了2p15和21q22存在与AS相关联的SNP。

随着芯片技术的迅速发展，Illumina HumHap370芯片之后又出现了新一代的Illumina Human1M-duo芯片、Illumina Human610-Quad芯片和IlluminaOmniExpress芯片提供了更为密集的SNP标记，覆盖的区域更加广泛。考虑上文提到的研究背景，我们设计了以Illumina Human1M-duo芯片、IlluminaHuman610-Quad芯片和Illumina OmniExpress芯片在中国汉族AS患者和健康志愿者对照人群中进行全扫并进行关联分析，即全基因组关联分析研究(GWAS)，以探索是否能发现AS的相关的易感基因。

由于强直性脊柱炎是较为常见的疾病，病程缠绵，且易造成残疾，故应争取早期诊断、治疗，尤其对于16-25岁的青年更是如此。为了加强早期诊断强直性脊柱炎，本领域迫切需要寻找出与强直性脊柱炎密切相关的SNP，并设计出检测强直性脊柱炎特异性的方法和试剂盒。

目前为止，对于强直性脊柱炎的诊断，除了从临床症状以及影像学资料来进行辅助判断外，还未有特异性的实验室诊断指标和相应的方法以及试剂盒对该疾病进行特异性诊断的报道。

发明内容

本发明申请即是针对目前在强直性脊柱炎的早期诊断中缺乏特异性的检测方法及相关试剂盒的不足之处，提供一种早期的、特异性强的检测强直性脊柱炎易感性的方法及其试剂盒。

本发明申请经过深入而广泛的研究，通过密集型的全基因组SNP芯片对大样本的强直性脊柱炎患者和健康对照人群进行全基因组关联分析，在国际上首次发现并证明了SNP rs13198903与强直性脊柱炎存在明显相关性(该SNP碱基是T时为风险型，是C时为保护型，P<5×10^-324(OR=43.63)，因此，SNPrs13198903可作为检测强直性脊柱炎易感性的特异性SNP，是强直性脊柱炎早期诊断重要的辅助指标。Rs是reference SNP ID的缩写，ncbi里对所有提交的SNP进行分类考证之后，都会给出一个rs号，也可称作参考SNP，并给出SNP的具体信息，包括前后序列，位置信息，分布频率等。

本发明申请的目的之一是提供一种检测强直性脊柱炎易感性的单核苷酸多态性(SNP)的核苷酸片段，该核苷酸片段在SNP rs13198903位点上，AS患者碱基为T的频率显著高于健康对照，相反，碱基为C的频率则显著低于健康对照，即rs13198903位点上的碱基为T时，强直性脊柱炎的易感性显著增加。

本发明申请的目的之一是提供一种强直性脊柱炎易感性的检测方法，该方法是通过下述方案实现的：从待测样品中得到核苷酸序列，检测位于rs13198903位点上的碱基，该碱基为T时，则强直性脊柱炎的易感性显著增加。

进一步的，所述的待测样品包括血液、体液或组织。

进一步的，所述的方法包括下述的步骤：

1、提取待测样本中的DNA；

2、以该DNA为模板，以针对rs13198903碱基附近的编码区设计PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

3、测出该PCR反应产物的碱基序列组成；

4、确定得到的碱基序列中rs13198903位点上的碱基是否为T。

进一步的，在上述方法中，从待测样品中得到的核苷酸序列的方法还包括荧光定量PCR、变性高效液相色谱、限制性片段长度多态性或连接酶检测或基因测序。

本发明申请的目的之一是提供对上述强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性的检测方法，所述的方法包括如下步骤：

1.引物设计：

使用Primer3.0软件设计rs13198903位点的PCR扩增引物；

2.组织、细胞及血样DNA提取：

使用TIANamp Blood DNA kit血液基因组DNA提取试剂盒或NucleoSpinTissue(MN)提取组织、细胞或血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，质检合格的DNA将浓度调整到50ηg／L，-20℃储存备用；

3.PCR扩增：

采用多重PCR扩增技术，每个反应总体积5μl，包含模板DNA10ηg,，Hotstar Taq0.5U，扩增引物每条0.Spmol，25mM dNTP0.1μl，反应条件为94℃4分钟；94℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃3分钟；4℃∞；

4.PCR产物纯化：

PCR反应产物使用0.5U SAP(shrimp alkaline phosphatase)处理，去除体系中游离的dNTP，反应体系7μl，其中PCR产物5μl，SAP混合液2μl(SAP0.5U，buffer0.17μl)，反应程序37℃20分钟；85℃5分钟；40℃∞；

5.PCR产物测序

将纯化产物用常规的DNA测序方法检测碱基突变，我们是应用生物系统公司(Applied Biosystems，CA，USA)的Terminator v3.1试剂盒在ABI3100(Applied Biosystems，CA，USA)遗传分析仪上测序。将rs13198903位点检出的单碱基进行分析，如果该位点的碱基为T，则强直性脊柱炎的易感性显著增大。

本发明申请的目的之一是提供上述的强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性在制备检测强直性脊柱炎易感性的试剂盒中的应用，所述的单核苷酸多态性是指在rs13198903位点，核苷酸由C变为T。

具体的，所述的应用包括提供检测强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包括：针对rs13198903碱基附近的区域设计的PCR反应引物、DNA聚合酶、去离子水、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、SAP和树脂。

进一步的，所述试剂盒中，PCR反应引物包括正义链引物和反义链引物，其中，正义链引物为tggcgaagttaatccagctt，反义链引物为ttccacctcacctttcagga。

本发明申请的目的之一是提供上述强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性在早期诊断强制性脊柱炎中的应用。

具体的，所述的应用包括从待测样品中得到核苷酸序列，检测位于rs13198903位点上的碱基，该碱基为T时，则强直性脊柱炎的易感性显著增加。

本发明申请的目的之一是提供上述强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性在治疗强制性脊柱炎中的应用。

进一步的，所述的应用包括rs13198903位点上的碱基是T时为风险型，是C时为保护型在强直性脊柱炎治疗中的应用。

进一步的，所述强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性相关的易感或致病基因是在rs13198903位点上的碱基为T。

进一步的，所述的应用包括强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性(SNP)在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。

具体来讲，该应用包括通过干预rs13198903的相关的强直性脊柱炎的易感或致病基因的功能，包括翻译、转录及蛋白质合成的过程，制备成治疗药物，改善患者的骨代谢异常以体内的免疫炎症反应，从而达到治疗目的。

具体实施方式

以下结合具体的实施方式，对本发明申请所述的强直性脊柱炎易感性检测方法及其试剂盒进行描述，目的是为了公众更好的理解本发明申请所述的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在以相同或近似的原理，对所述方法步骤、试剂、反应条件以及对所述试剂盒做出的任何改进，以实现基本相同的效果为目的，则都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。

实施例一

SNP rs13198903与强直性脊柱炎的发病相关性研究一

1.1研究对象

研究中的1837例散发AS病例，主要是2005-2009年于中山大学附属第三医院门诊就诊或住院的AS患者，这些AS患者均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和影像学检查结果诊断的符合1984年纽约修订标准的AS患者。对于每个AS患者，在被告知之该研究目的之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

4231例健康志愿者对照人群则主要包括了广东、安徽和新加坡的华人三个地方的无AS症状或病史的健康志愿者对照人群，这些健康志愿者同样在被告知之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

收集病例时，同时记录好病例和健康志愿者对照人群的基本情况，包括：性别、年龄和籍贯。抽取全血4ml，放于EDTA管，带回实验室提取DNA。另外，除了抽血，风湿病专家还仔细询问并记录下每个AS患者和健康志愿者对照人群的情况，尤其是AS患者时还记录下基本情况(包括：性别、年龄、发病年龄、病程)和临床表型(包括：腊样指、髋关节受累、外周关节炎、炎性腰背痛)。而对于健康志愿者对照人群，则仔细询问既往病史，包括呼吸系统、心血管系统、内分泌系统、血液系统、消化系统、骨骼肌肉系统、神经系统等各个专科的情况，另外重点排除风湿免疫科的病史，询问是否有腰背痛等既往病史。

1.2实验方法和结果

1.2.1DNA的提取

在该研究中，我们使用的是TIANamp Blood DNA kit血液基因组DNA提取试剂盒，从人的外周血样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW，洗脱缓冲液TB、蛋白酶K、吸附柱CB3、收集管(2ml)、1.5mL无菌收集管。

1.2.2.研究采用的密集型的全基因组的SNP芯片

研究采用了Illumina HuamHap610-Quad SNP芯片、Illumina Human1M-duo芯片和Illumina OmniExpress芯片对样本进行全基因组SNP全扫，下面是三种Illumina芯片的简介；

1、Illumina HuamHap610-Quad SNP芯片

该芯片简介：该款芯片在一张芯片上可平行进行4个样品的检测，显著的增加了样本输出信息量，减少了实验操作中的误差。该芯片广泛地采用了HumanHap550芯片的内容，以及额外增加了100,000个遗传标记。Human610-quad涵盖的全基因组信息，对于已知的和新近报道的CNV区域来说都具有权威性。Illumina HuamHap610-Quad SNP芯片的SNPs以约5kb的密度均匀分布在基因组上。针对于基因组中高多态性的CNV区域(片段复制区和无SNP的基因组区域)，Illumina HuamHap610-Quad SNP芯片设计了一些特异的靶标来进行研究。Illumina Human1M-duo芯片。

该芯片中包含了超过一百万个探针信息。该款芯片门包含针对基因SNPs，标签SNPs，拷贝数变化(CNV)，及其他高价值的基因组区域设计探针，同时还增加了一些新的位点，如：增加了疾病相关的SNP位点，灵活的选择一些基因组编码区高密度的SNP位点。

2、Illumina Omni Express芯片

该芯片提供了高样品通量和全面的基因组内容，Omni Express上可容纳12个样品，芯片拷问每个样品的70多万个变异，单张芯片上总共有超过800万个数据点。OmniExpress上的标志物是Illumina的HumanOmni1-Quad内容的一部分，它从国际HapMap计划所有三个阶段中选择的优化SNP标签组合，有了最高的数据质量和最佳内容，包括对拷贝数变异(CNV)应用的全面支持。

1.2.3研究步骤

我们通过上述三种芯片对所有的散发AS病例以及健康志愿者对照进行全基因组SNP分型。然后进行关联分析，分析中对性别、年龄和主成份分析结果的数据分别进行校正，寻找具有统计意义的SNP(s)，即可能与疾病相关的SNP(s)。

1.2.3.1样本准备和基因分型

在从全血样本中提取DNA后，所有的DNA均标准化为50ng／ml的浓缩液。对于高密度SNP芯片分型，我们根据Illumina推荐的操作程序，通过芯片，我们使用大约200ng的DNA进行样本的基因分型，并利用Illumina Beadstudio进行数据读取和基因型转换。数据结果中有272386个SNP是3个芯片都均有覆盖，另外有通过统计学分析后推算出1083964个SNP也用于分析。

1.2.3.2数据分析的质量监控(quality control，QC)

研究对AS病例、健康志愿者对照人群分别进行SNP的质量控制和监控，其中包括可读率(call rate)<95％，次等位基因(MAF，minor allele frequency)<3％，以及不符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HEW，P<10-6)，以尽可能去除分型错误的SNP；在得到全扫的样本的基因型数据之后，我们分析并计算杂合度，取杂合度范围从杂合度平均值(Mean)-3×标准差(SD)到杂合度平均值(Mean)+3×标准差(SD)区间内的样本资料进行统计学分析，不在这区间的样本将移除。不纳入进一步的统计中。然后，我们利用PLINK软件和基于IBS(identical by state)的方法，分别对这些数据进行遗传关系检验；对于那些基于遗传分析的重复或具有亲缘关系的一对标本，我们去除其中一个可读率较低的。我们利用主成份分析(principle component analysis，PCA)方法，以及HapMap数据库中人群数据，检测样本中的人群分层现象，并去除显著离群的样本，最后，再取这几个独立数据的交集。

1.2.3.3统计学分析

对于全扫数据进行的分析，由于存在一定程度的人群离散、分层现象，所有在分析之前，我们首先利用EIGENSTRAT软件对所有样本进行分析即样本的主成分分析(PCA)并得到3个主成份，分析这3个组分之间是否存在样本聚类现象，以明确是否需要将这些样本的群体离散度作为校正的参数；然后，我们在根据这些样本的数据绘制百分位图(Quantile-Quantile plot)，在绘制之前，需要对所有需要校正的因素进行校正，这些因素包括性别、年龄(如果散发病例和健康志愿者对照人群间存在统计学上差异)以及上述PCA分析后如果存在聚类现象的主成份，结果会得到λ_GC值，在分析数据结果时，我们用软件将每个散发病例的等位基因的频率与健康志愿者对照人群的基因频率进行卡方检验，会得到卡方值A，而λ_GC=A_mean/0.456，如果λ_GC越接近1，即表示样本的效力越高，如果出现偏移，则提示可能有两种情况：一种是样本存在分层现象即人群离散较为明显；第二种是存在与疾病风险相关的SNP。

经过上述分析后，如果PCA分析结果提示主成份之间存在分层现象，即存在人群离散度的差异，我们将该存在差异的离散度也作为协变量进行校正，此外我们将年龄和性别(如果散发病例和健康志愿者对照人群间存在差异)作为协变量，利用PLINK软件进行logistic回归分析，寻找与疾病关联的SNP位点。我们用Haploview(v4.1)软件进行分析结果的展示，即SNP染色体位置及其-log10P表示的Manhattan图。

1.2.3.4SNP的推算及连锁不平衡模式分析

对3个芯片中的用于分析的推算SNP是通过IMPUTE2软件(版本号：2.1.0)来完成的，使芯片对染色体的覆盖范围达到最大化。

1.2.4结果

SNP rs13198903在1837例AS和4231例健康志愿者对照中存在明显差异，P值<5×10^-324(OR=43.63)，即与强直性脊柱炎存在明显相关性，该SNP碱基是T时为风险型，C时为保护型。

上述结果表明，36.3Genome Bui1dde人类组基因图谱中的6号染色体的31344157位的SNP rs13198903中，碱基C→T改变，增加了AS的易感性，等位基因型T与AS的发生显著相关。

实施例二

SNP rs13198903与强直性脊柱炎的发病相关性研究二

2.1研究对象

研究中的2205例散发AS病例，主要是2005-2009年于中山大学附属第三医院门诊就诊或住院的AS患者及部分其它医院取得的样本，这些AS患者均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和影像学检查结果诊断的符合1984年纽约修订标准的AS患者。对于每个AS患者，在被告知之该研究目的之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

3702例健康志愿者对照人群则主要来自中山大学附属第三医院及中山大学肿瘤防治中心收集的健康志愿者人群，该人群均为无AS症状或病史的的健康志愿者对照人群，这些健康志愿者同样在被告知之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

2.2实验方法和结果

2.2.1DNA的提取

在该研究中，我们使用的是TIANamp Blood DNA kit血液基因组DNA提取试剂盒从人的外周血样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW，洗脱缓冲液TB、蛋白酶K、吸附柱CB3、收集管(2ml)、1.5mL无菌收集管。

2.2.2研究步骤

2.2.2.1引物设计

用Primer3.0软件进行引物设计，SNP rs13198903的引物信息如下：

2.2.2.2基因组DNA扩增(聚合酶链式反应PCR)：

2.2.2.2.1反应体系如下：

2.2.2.2.2PCR步骤：

在384孔板中每孔加入模板DNA1ul，再加入4ul上述反应体系，将384孔板1000转离心1分钟，混匀后按照下列程序进行扩增：94℃4minutes预变性，94℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟共30个循环，72℃3minutes，4℃冷却。2.2.2.3PCR产物测序分析：将纯化产物用常规的DNA测序方法检测碱基突变。我们应用生物系统公司(Applied Biosystems，CA，USA)的Terminatorv3.1试剂盒在ABI3100(Applied Biosystems，CA，USA)遗传分析仪上测序。

2.2.2.4统计分析

研究对AS病例、健康志愿者对照人群分别进行SNP的质量控制和监控，其中包括可读率(call rate)<95％，次等位基因(MAF，minor allele frequency)<3％，以及不符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HEW，P<10^-6)的样本将不用于进一步分析。通过质量控制后，2，100例患者和3,496例健康对照通过了质量控制，用于进一步的统计分析。利用PLINK软件及R方法对验证的样本及所有的样本进行logistic回归分析，寻找与疾病关联的SNP位点。并用Haploview(v4.1)软件绘制SNP位点所在区域的连锁图。

2.2.3结果

SNP rs13198903在2205例AS和3702例健康志愿者对照中存在明显差异，即与强直性脊柱炎存在明显相关性，该SNP碱基是T时为风险型，C时为保护型。

上述结果表明，36.3Genome Buildde人类组基因图谱中的12号染色体的44061175位的SNP rs13198903中，碱基C→T改变，增加了AS的易感性，等位基因型T与AS的发生显著相关。

实施例三

3.1.1研究对象

研究中的对象是所有实施例1和实施2中的AS人群和健康对照人群，这些AS病例，均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和影像学检查结果诊断的符合1984年纽约修订标准的AS患者。对于每个AS患者，在被告知之该研究目的之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。最终，共计有3937例AS患者和7727例健康志愿者对照纳入该研究。

3.2.2DNA的提取

在对待检测的标本，使用TIANamp Blood DNA kit血液基因组DNA提取试剂盒，从人的外周血样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW，洗脱缓冲液TB、蛋白酶K、吸附柱CB3、收集管(2ml)和1.5mL无菌收集管。

3.2.3实验步骤

我们将经过数据质量控制后的实施例一中的所有AS和健康对照的有关SNPrs13198903的数据提取出来，同时提出经过数据质量控制后的实施例二中的所有AS和健康对照的有关SNP rs13198903的数据；经过整理放入同一数据库进行分析。统计学分析则是利用PLINK软件所有的样本的SNP rs13198903的数据进行logistic回归分析，并且校正了年龄、性别等干扰因素，从而寻找SNP rs13198903的数据与疾病间是否存在关联。

3.3实验结果：

结果SNP rs13198903在AS患者和健康志愿者对照中存在明显差异，即SNPrs13198903位点的碱基与强直性脊柱炎存在明显相关性，该SNP碱基是T时为风险型，C时为保护型。结果与上述两个研究均一致。

实施例四

4.1.1研究对象

所有欲检测是否携带有强直性脊柱炎易感基因的患者及家属。

4.2.2DNA的提取

在对待检测的标本，使用TIANamp Blood DNA kit血液基因组DNA提取试剂盒，从人的外周血样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW，洗脱缓冲液TB、蛋白酶K、吸附柱CB3、收集管(2ml)、1.5mL无菌收集管。

4.2.3实验步骤

4.2.3.1PCR步骤：

在待检测板中每孔加入模板DNA1ul，再加入4ul上述反应体系，1000转离心1分钟，混匀后按照下列程序进行扩增：94℃4minutes预变性，94℃20秒，56℃30秒，60℃1分钟共30个循环，72℃3minutes，4℃冷却。

4.2.3.2质谱分析：

经树脂纯化后，将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10^-9s)强激光激发，用该方法可快捷方便的检测出上述PCR反应产物中SNP的基因型。

4.3实验结果：

检测结果为T时为风险型，检测结果为C时为保护型。

该试剂盒包括：针对rs13198903碱基附近的区域设计的PCR反应引物、DNA聚合酶、去离子水、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、SAP和树脂。其中扩增引物、延伸引物如下表所示：

检测方法步骤如下：

1.引物设计：

使用Primer3.0软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物；

2.组织、细胞及血样DNA提取：

使用TIANamp Blood DNA kit血液基因组DNA提取试剂盒或NucleoSpinTissue(MN)提取组织、细胞或血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，质检合格的DNA将浓度调整到50ηg／L，-20℃储存备用；

3.PCR扩增：

采用多重PCR扩增技术，每个反应总体积5μl，包含模板DNA10ηg,，Hotstar Taq0.5U，扩增引物每条0.5pmol，25mM dNTP0.1μl，反应条件为94℃4分钟；94℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃3分钟；4℃∞；

4.PCR产物测序分析：将纯化产物用常规的DNA测序方法检测碱基突变。我们应用生物系统公司(Applied Biosystems，CA，USA)的Terminatorv3.1试剂盒在ABI3100(Applied Biosystems，CA，USA)遗传分析仪上测序。

5、将rs13198903位点检出的单碱基进行分析，如果该位点的碱基为T，则强直性脊柱炎的患病几率显著增大。

Claims (3)

1.检测强直性脊柱炎易感性的单核苷酸多态性的核苷酸片段在制备检测强直性脊柱炎易感性的试剂盒中的应用，所述的单核苷酸多态性是指在rs13198903位点，核苷酸由C变为T。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒包括：针对rs13198903碱基附近的区域设计的PCR反应引物、DNA聚合酶、去离子水、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、SAP和树脂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒中，PCR反应引物包括正义链引物和反义链引物，其中，正义链引物为tggcgaagttaatccagctt，反义链引物为ttccacctcacctttcagga。