CN117757914A - Il5基因中与冠心病相关的snp位点及其应用 - Google Patents
Il5基因中与冠心病相关的snp位点及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117757914A CN117757914A CN202310631295.1A CN202310631295A CN117757914A CN 117757914 A CN117757914 A CN 117757914A CN 202310631295 A CN202310631295 A CN 202310631295A CN 117757914 A CN117757914 A CN 117757914A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- heart disease
- coronary heart
- locus
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 title claims abstract description 84
- 101150015560 IL5 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 37
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 208000033692 susceptibility to 1 coronary heart disease Diseases 0.000 description 5
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 3
- 208000037998 chronic venous disease Diseases 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 1
- 206010003225 Arteriospasm coronary Diseases 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000003890 Coronary Vasospasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150050863 T gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 201000011634 coronary artery vasospasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明属于生物技术研究领域,公开了IL5基因中与冠心病相关的SNP位点及其应用。等位基因在制备冠心病易感性筛查药物中的应用,所述等位基因在IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为C。等位基因在制备冠心病低风险筛查药物中的应用,所述等位基因在IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为T。IL5基因rs2057687位点为T时的检测试剂在制备冠心病低风险的筛查药物中的应用;或,IL5基因rs2057687位点为C时的检测试剂在制备冠心病易感风险的筛查药物中的应用。基因片段在制备防治冠心病药物中的应用,所述基因片段为IL5基因中含有rs2057687位点单核苷酸为T的基因片段。本发明发现了新的冠心病检测位点,同时针对不同等位基因发现了不同的风险等级,对后续冠心病的诊断预防等都提供新的方案。
Description
本申请是申请日为2021-08-08,申请号为202110905130X,发明名称为与冠心病相关的SNP位点及其应用的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术研究领域,尤其涉及IL5基因中与冠心病相关的SNP位点及其应用。
背景技术
冠心病(Coronary artery disease,CAD)是一种由遗传和环境因素共同作用而导致的复杂性心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD),其病理基础是冠状动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)或(和)冠状动脉痉挛,当冠状动脉出现动脉粥样硬化,会造成冠状动脉管腔狭窄或堵塞导致心脏供血不足,因而也称之为缺血性心脏病(Ischemic heartdisease,IHD)。CAD是危害人类健康的十大杀手之一,是世界范围内导致人口死亡的主要原因之一。2016年世界卫生组织WHO统计数据显示,在全球范围内,由IHD导致的死亡率居于首位,对社会造成了巨大的经济和医疗负担并降低了人们的生活质量。2017年中国心血管疾病报告显示,从1995年到2015年,中国CVD患病率处于持续上升阶段。目前国内CVD患病人数已高达2.9亿,其中CAD患者达到1100万。
第三代遗传标记是单核苷酸多态性(SNP),它常指基因组中DNA序列上的单个碱基改变。SNP遍布于整个人类基因组中,人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP,人类30亿碱基中共有300万以上的SNP。SNP是目前进行疾病研究最为普遍且有效的遗传标记。近年来利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的热点,且在肿瘤和心脑血管等重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。
虽然通过遗传学研究已经发现了大量的冠心病易感基因,但是这些易感基因仅能解释冠心病28%左右的遗传度,而通过家族聚集性研究和双胞胎研究发现冠心病的遗传度高达40%以上,因此还有相当大的一部分冠心病的遗传基础没有被阐释清楚,关于冠心病的遗传基础以及冠心病的易感基因探究仍需作进一步研究。
发明内容
针对上述问题,本发明提供IL5基因中与冠心病相关的SNP位点及其应用,主要提供了冠心病新的检测位点,以及新的检测试剂。
为了解决上述问题,本发明采用如下技术方案:
IL5基因rs2057687位点在制备冠心病筛查和/或防治药物中的应用。冠心病包括心肌梗死和心绞痛。
IL5基因rs2057687位点的检测试剂在制备冠心病检查筛查药物中的应用。
IL5基因序列为一种较为常见的序列,当IL5基因其他位点单核苷酸发生突变时,不影响本发明所涉及检测位点的保护。
一些方式,IL5基因rs2057687位点的检测试剂包括扩增IL5基因rs2057687位点的引物对或核酸探针。
一些方式,所述扩增IL5基因rs2057687位点包括下述序列的引物对
上游引物序列TTTTCCCATCAGCTCAGGGT,
下游引物序列ATAGTCCCAGTCTGCGTGTG。
与冠心病易感性显著关联的等位基因在制备冠心病检查筛查、防治药物中的应用,所述等位基因在IL5基因rs2057687位点的单核苷酸分别为C。
冠心病低风险性等位基因在制备冠心病检查筛查药物中的应用,所述等位基因在IL5基因rs2069812、IL5基因rs2057687位点的单核苷酸分别为G、T。
冠心病检查筛查药物,包括IL5基因rs2057687位点的检测试剂。
一些方式,包括扩增IL5基因rs2057687位点的引物对;
优选的,所述冠心病检查筛查药物为冠心病易感性检查筛查药物,至少包括IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为C等位基因检测剂之一,或
所述冠心病检查筛查药物为冠心病低风险检查筛查药物,至少包括IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为T等位基因检测剂之一。
一些方式,所述扩增IL5基因rs2057687位点包括下述序列的引物对
上游引物序列TTTTCCCATCAGCTCAGGGT,
下游引物序列ATAGTCCCAGTCTGCGTGTG。
检测冠心病易感性的PCR引物试剂,所述PCR引物试剂包括下述序列的引物对
上游引物序列CCTGCTGCTCATGAACAGAATA,
下游引物序列AGTGACTCTTCCTTGACTCCA;
和/或
上游引物序列TTTTCCCATCAGCTCAGGGT,
下游引物序列ATAGTCCCAGTCTGCGTGTG。
筛选易感冠心病的生物样品的方法:
以待检测生物样品提取核酸样本;
以提取出的核酸样本为模板特异性扩增IL5基因,回收纯化扩增产物,并确定所述扩增产物的核酸序列;
判断前述确定的核酸序列的rs2057687位点单核苷酸是否为C,若是,则待检测生物样品为易感冠心病的生物样品。
基因片段在制备防治冠心病药物中的应用,所述IL5基因中含有rs2057687位点单核苷酸为T的基因片段。通过将基因片段进行替换实现后续治疗或防治复发等目的。
防治冠心病的药物,包括基因载体,所述基因载体含有
能将IL5基因中rs2057687位点单核苷酸C替换为单核苷酸T并表达的基因片段;
基因载体一些表现形式为质粒,腺病毒载体。在不违背科学伦理和相关法律规定的前提下,现有或后续可以用于实现上述目的的手段均应在本发明范围内,其要求是能够载上述基因片段或或与之相近物,并能实现替换,针对基因载体具体型号等不做特别限定。
本发明的有益效果是:
发现了新的冠心病检测位点,同时针对不同等位基因发现了不同的风险等级,对后续冠心病的诊断、防治等都提供新的方案。
附图说明
图1为PCR扩增程序图;
图2为rs2069812分型结果图;
图3为rs2057687分型结果图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步说明:
IL5基因rs2069812位点或IL5基因rs2057687位点在制备冠心病检查筛查和/或防治药物中的应用。
IL5基因rs2069812位点和/或IL5基因rs2057687位点的检测试剂在制备冠心病检查筛查药物中的应用。
一些冠心病高关联性检测情况中,前述所述等位基因在IL5基因rs2069812、所述IL5基因rs2057687位点的单核苷酸分别为A、C;在做低风险筛查时,单核苷酸分别为G、T。
前述一些具体应用方式可参见后续相关说明,凡是没有做特别说明的,即采用现有或后续新出现等同的技术均在本发明范围内。其中作为防治药物使用时,其在药物制备过程中可作为治疗靶点等,或相关含有上述位点的基因片段作为冠心病防治药物制备过程中一些辅助试剂,如生物药物制备过程中作为测试、提取等步骤中应用。
一些方式中,IL5基因rs2069812位点检测试剂包括扩增IL5基因rs2069812位点的引物对,和/或IL5基因rs2057687位点的检测试剂包括扩增IL5基因rs2057687位点的引物对。
一些方式中,所述扩增IL5基因rs2069812位点的引物对包括上游引物5'-CCTGCTGCTCATGAACAGAATA-3',
下游引物5'-AGTGACTCTTCCTTGACTCCA-3';
所述扩增IL5基因rs2057687位点的引物对包括
上游引物5'-TTTTCCCATCAGCTCAGGGT-3',
下游引物5'-ATAGTCCCAGTCTGCGTGTG-3'。
与冠心病易感性关联的等位基因在制备冠心病检查筛查、防治药物中的应用,所述等位基因在IL5基因rs2069812、IL5基因rs2057687位点的单核苷酸分别为A、C。制备防治药物中,主要作为药物研发制备过程中的作用靶点。
冠心病低风险性等位基因在制备冠心病检查筛查药物中的应用,所述等位基因在IL5基因rs2069812、IL5基因rs2057687位点的单核苷酸分别为G、T。但,前述等位基因对冠心病检测也具有一定的参考意义。
冠心病检查筛查药物,包括IL5基因rs2069812位点和/或IL5基因rs2057687位点的检测试剂。
一些方式中,含有扩增IL5基因rs2069812位点的引物对或核酸探针,和/或扩增IL5基因rs2057687位点的引物对或核酸探针;
核酸探针一种方式可采用相近基因检测探针,可行即可,不做特别限定。
优选的,所述冠心病检查筛查药物为冠心病易感(易感表示易患有冠心病,具有中高风险,风险评判标准在一些方式中可参考其他检测手段)检查筛查药物,至少包括IL5基因rs2069812位点的单核苷酸为A等位基因检测剂、IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为C等位基因检测剂之一,或
所述冠心病检查筛查药物为冠心病低风险检查筛查药物,至少包括IL5基因rs2069812位点的单核苷酸为G等位基因检测剂、IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为T等位基因检测剂之一。
一些方式中,所述扩增IL5基因rs2069812位点的引物对包括上游引物5'-CCTGCTGCTCATGAACAGAATA-3',
下游引物5'-AGTGACTCTTCCTTGACTCCA-3';
所述扩增IL5基因rs2057687位点的引物对包括
上游引物5'-TTTTCCCATCAGCTCAGGGT-3',
下游引物5'-ATAGTCCCAGTCTGCGTGTG-3'。
检测冠心病易感性的PCR引物,所述PCR引物至少包括下列一个
在一些检测效果更佳的实施例中,前述引物、探针检测涉及的等位基因IL5基因rs2069812、IL5基因rs2057687位点的单核苷酸分别为A、C。
筛选易感冠心病的生物样品的方法:
以待检测生物样品提取核酸样本;
以提取出的核酸样本为模板特异性扩增IL5基因,回收纯化扩增产物,并确定所述扩增产物的核酸序列;
判断前述确定的核酸序列的rs2069812位点单核苷酸是否为A,若是,则待检测生物样品为易感冠心病的生物样品,和/或
判断前述确定的核酸序列的rs2057687位点单核苷酸是否为C,若是,则待检测生物样品为易感冠心病的生物样品。
基因片段在制备防治冠心病药物中的应用,所述基因片段为IL5基因中含有rs2069812位点单核苷酸为G的基因片段或IL5基因中含有rs2057687位点单核苷酸为T的基因片段。
防治冠心病的药物,包括基因载体,所述基因载体含有
IL5基因rs2069812位点单核苷酸G基因片段(包含等位基因片段),并能替换相应位置IL5基因rs2069812位点单核苷酸A基因片段并表达(核心目的是将单核苷酸A替换为单核苷酸G);或,IL5基因rs2057687位点单核苷酸T基因片段(包含等位基因片段),并能替换相应位置IL5基因rs2057687位点单核苷酸C基因片段并表达(核心目的是将单核苷酸C替换为单核苷酸T);基因载体一些表现形式为质粒,腺病毒载体。比如转录激活因子样效应蛋白核酸酶等都是已经经过实践证明的技术。该基因载体能够将上述两个基因片段中任一导入人体替换缺陷的IL5基因rs2069812位点单核苷酸A或IL5基因rs2057687位点单核苷酸C,从而降低人体患冠心病风险甚至治疗冠心病。通过替换突变基因,使其恢复成正常基因序列实现治疗,起到防、治目的。目前,基因载体优选考虑已知且成熟的,但并不排斥其他具有相近功能载体,当然未来新出现能获得认可的也应当在本发明范围内。
下面结合一些具体的实验做具体说明:
1.人外周血全基因组DNA提取
人外周血全基因组DNA采用康为世纪提供的BloodGen Mini Kit血液基因柱式小量提取试剂盒(CW 2087)进行提取。操作步骤依照试剂盒使用说明书。
2.引物设计
在Ensemble中输入基因IL5后,得到全部的基因序列,显示全部的变异位点,找到各个SNP所在的位置,用Primer和Genetool软件设计引物,得到引物后在UCSC网站上进行电子PCR,PCR结果显示无特殊结构且PCR目的条带单一,则可定制合成引物。本项研究所用引物由天一辉远公司合成制备,每条引物合成4OD的量,分两管分装。
IL5基因位点信息如下表所示:
SNP设计的基因分型引物如下表所示:
3.PCR扩增
扩增体系与程序如下:
扩增体系(25μL):
冠心病易感性基因PCR扩增方法,包括下述步骤
扩增体系构建:将上游引物、下游引物、待测DNA、Taq DNA聚合酶、核酸染料混合,
DNA变性:在90-96℃环境中,双链DNA热作用,氢键断裂形成单链DNA,
退火:在SNP最适Tm环境中,引物与DNA模版结合,形成局部双链,
延伸:70-72℃中,在Taq DNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,从5’端-3’端延伸,合成模版互补DNA链,
DNA变性、退火、延伸循环若干次,最后恢复温度。
扩增程序如图1中所示。其中,rs2069812的最适Tm为55℃,rs2057687的最适Tm为58℃。
4.SNP分型
高分辨率熔解曲线是在实时荧光PCR基础上发展而来的一种新的实时定量技术,通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来进行基因突变扫描和基因分型。若双链DNA片段中存在SNP位点,则在升温过程中,SNP位点会因单个碱基不同而先后解链,因此根据熔解曲线和熔解温度即可判断DNA片段中是否存在SNP。由于不同的SNP位点和基因型都会产生不同的熔解曲线峰形,因此可根据熔解曲线有效地区分不同SNP位点和基因型。根据检测样本的曲线和阳性对照样本的曲线可准确区分野生型、杂合突变、纯和突变,并可用相应软件进行快速分型。将36个(含3个每个SNP的3种基因型样本作为阳性对照样本)PCR扩增产物放入Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪上进行分型检测,读取结果。本次实验所使用的核酸染料为SYTO 9荧光染料,使用的HRM仪器为Rotor-Gene 6000。利用该方法分型可以实现快速,准确的得到样本的分型结果,平均每8分钟可以检测36个样本。本方法的结果得到Sanger测序的验证,所有的阳性样本均被正确的检出,准确性100%。图2为rs2069812的分型结果,图3为rs2057687的分型结果。
实施案例
IL5基因上新发现的两个SNP位点与冠心病易感性相关(病例-对照分析):研究入选1863例中国汉族冠心病人群样本,1920例健康对照人群样本,收集临床资料并采集外周血样本,用康为世纪提供的BloodGen Mini Kit血液基因柱式小量提取试剂盒提取全基因组DNA。
对上述的病例和对照人群的SNP位点rs2057687和rs2069812进行基因分型。得到每个样本基因型后首先对这两个SNP进行哈迪-温伯格平衡检测。
具体分析为:若p表示基因A等位的频率;q表示基因a等位的频率,则基因型AA的频率为p2,基因型Aa的频率为2pq,基因型aa的频率为q2。基因型频率之和应等于1,即p2+2pq+q2=1。在病例和对照的关联分析研究中,所检测的变异需要在对照人群中进行哈迪-温伯格平衡检验,通过该检验的变异说明该变异在所研究的群体中没有发生偏移,能代表整个群体的遗传特征。
符合哈迪-温伯格平衡的位点进一步进行关联分析使用卡方检验各SNP位点的等位基因与病例-对照分组是否相关,具体分析为:卡方检验是以χ2分布为基础的一种常用假设检验方法,它的无效假设H0是指观察频数与期望频数没有差别。该检验的基本思想是:首先在假设H0成立的前提下计算出χ2值,它是指观察频数与理论频数之间的偏离程度。然后根据χ2分布和自由度确定在H0假设成立的情况下得到在当前统计量下或更极端情况下的概率P值。若P值很小,则表示观察频数与理论频数偏离程度很大,应当拒绝H0假设,即认为所研究资料之间存在显著差异;否则就不能拒绝H0假设,即不能认为所研究样本之间存在差异。本项研究中在比较病例组和对照组的临床资料中吸烟比例、男女比例、高血压比例和糖尿病比例的分布差异时用2×2列表卡方检验。在进行SNP位点与冠心病的关联分析时用2×2列表卡方检验SNP等位基因分布在病例组和对照组中是否存在显著差异。在病例-对照关联分析研究中常用Logistic回归来评估基因型与疾病间的独立关系。本项研究中我们的因变量是疾病状态,分为有冠心病和无冠心病两类,自变量包含SNP基因型和冠心病的10项独立危险因素:性别、年龄、高血压、糖尿病、吸烟、BMI及四项血脂。在Logistic回归计算时将10项危险因素当成协变量,SNP的基因型当成自变量,通过SPSS计算后得到各个自变量与疾病关联的P值和OR值及对应的95%置性区间。当基因型计算出的P值小于0.05时,则表明该基因型与疾病独立显著相关,具有统计学意义,当计算出的P值大于0.05时,则表明该基因型与疾病不相关。
结果如下表所示。
表1:IL5上SNP与CAD进行等位基因关联分析结果
注:经分析上述两个SNPs基因型频率在总人群中均符合遗传学哈迪温伯格平衡(P>0.05),认为研究对象具有良好的代表性。OR(95%CI)表示优势比(95%的置信区间),对于疾病发病率而言,不同基因型的OR值即为该基因导致疾病发生相对危险度的估计值,当OR值=1时,表示该因素对疾病的发生不起作用,当OR值大于1时,表示该因素是一个危险因素,当OR值小于1时,表示该因素是一个保护因素;P值表示统计学意义,当P<0.05表示比较的样本有显著差异,Pobs表示没有矫正冠心病的常见的危险因素的P值,Padj表示矫正了冠心病的常见危险因素包括性别,年龄,高血压,糖尿病,吸烟,血脂等之后的P值。
表1的结果表明,在SNP位点rs2057687处的等位基因C与T在病例和对照组间的差异显著(矫正后P<0.05),说明该SNP位点rs2057687处的等位基因C和T与冠心病易感相关,在冠心病人群中在该等位基因处为C的人数明显高于对照组,即判定SNP位点rs2057687处的C为冠心病易感等位基因,T为冠心病低风险等位基因。
同样,在SNP位点rs2069812处的等位基因G与A在病例和对照组间的差异显著(矫正后P<0.05),说明该SNP位点rs2069812处的等位基因G和A与冠心病易感相关,在冠心病人群中在该等位基因处为A的人数明显高于对照组,即判定SNP位点rs2069812处的A为冠心病易感等位基因,G为冠心病低风险等位基因。
本领域的技术人员可以明确,在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下,可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
Claims (7)
1.等位基因在制备冠心病易感性筛查药物中的应用,其特征在于,所述等位基因在IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为C。
2.等位基因在制备冠心病低风险筛查药物中的应用,其特征在于,所述等位基因在IL5基因rs2057687位点的单核苷酸为T。
3.IL5基因rs2057687位点为T时的检测试剂在制备冠心病低风险的筛查药物中的应用;或,IL5基因rs2057687位点为C时的检测试剂在制备冠心病易感的筛查药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,IL5基因rs2057687位点的检测试剂包括扩增IL5基因rs2057687位点的引物对或核酸探针。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,扩增IL5基因rs2057687位点的引物包括
上游引物序列:TTTTCCCATCAGCTCAGGGT,
下游引物序列:ATAGTCCCAGTCTGCGTGTG。
6.基因片段在制备防治冠心病药物中的应用,其特征在于,所述基因片段为IL5基因中含有rs2057687位点单核苷酸为T的基因片段;所述基因片段能能将IL5基因中rs2057687位点单核苷酸C替换为单核苷酸T并表达。
7.筛选易感冠心病生物样品的核酸样本的方法,其特征在于,
以从生物样品中提取出的核酸样本为模板特异性扩增IL5基因,回收纯化扩增产物,并确定所述扩增产物的核酸序列;
判断前述确定的核酸序列的rs2057687位点单核苷酸是否为C,若是,则待检测生物样品为易感冠心病的生物样品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310631295.1A CN117757914A (zh) | 2021-08-08 | 2021-08-08 | Il5基因中与冠心病相关的snp位点及其应用 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110905130.XA CN113637738B (zh) | 2021-08-08 | 2021-08-08 | 与冠心病相关的snp位点及其应用 |
CN202310631295.1A CN117757914A (zh) | 2021-08-08 | 2021-08-08 | Il5基因中与冠心病相关的snp位点及其应用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110905130.XA Division CN113637738B (zh) | 2021-08-08 | 2021-08-08 | 与冠心病相关的snp位点及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117757914A true CN117757914A (zh) | 2024-03-26 |
Family
ID=78419978
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310631295.1A Pending CN117757914A (zh) | 2021-08-08 | 2021-08-08 | Il5基因中与冠心病相关的snp位点及其应用 |
CN202110905130.XA Active CN113637738B (zh) | 2021-08-08 | 2021-08-08 | 与冠心病相关的snp位点及其应用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110905130.XA Active CN113637738B (zh) | 2021-08-08 | 2021-08-08 | 与冠心病相关的snp位点及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN117757914A (zh) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FI118265B (fi) * | 2004-01-15 | 2007-09-14 | Jurilab Ltd Oy | Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi |
WO2005087953A2 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof |
CN102108396B (zh) * | 2009-12-29 | 2013-10-09 | 何青 | Cad及ami易感性诊断试剂盒和snp在其制备中的用途 |
CN103502469B (zh) * | 2011-12-03 | 2015-06-10 | 古洁若 | 强直性脊柱炎易感性单核苷酸多态性的检测方法、试剂盒及其应用 |
CN104651354B (zh) * | 2015-01-21 | 2017-12-15 | 田小利 | Scml4基因序列及表达改变检测及其在冠心病预测中的应用 |
CN112342292A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-02-09 | 新疆医科大学第一附属医院 | 体外检测SelS基因启动子突变的试剂及其在制备冠心病筛查试剂盒的应用 |
-
2021
- 2021-08-08 CN CN202310631295.1A patent/CN117757914A/zh active Pending
- 2021-08-08 CN CN202110905130.XA patent/CN113637738B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113637738A (zh) | 2021-11-12 |
CN113637738B (zh) | 2023-07-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8906620B2 (en) | Exon grouping analysis | |
AU2017261442B2 (en) | Detection of chromosome interaction relevant to breast cancer | |
WO2024027569A1 (zh) | 一种不依赖于先证者的单体型构建方法 | |
CN106755395B (zh) | Xi型成骨不全致病基因fkbp10的突变位点及其应用 | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
CN113637738B (zh) | 与冠心病相关的snp位点及其应用 | |
CN116769895A (zh) | 与先天性心脏病相关的cyp51a1基因低频错义突变及其应用 | |
CN115948532A (zh) | 基于数字pcr技术的sma检测试剂盒 | |
CN104073548A (zh) | 基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒 | |
KR101992952B1 (ko) | 콜레스테롤 유출능과 관련된 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 | |
JP2006254735A (ja) | 糖尿病疾患感受性遺伝子、及び糖尿病罹患の難易を検出する方法 | |
KR101728023B1 (ko) | Pcr―ldr을 이용한 atp7b 유전자의 돌연변이 검출 | |
CN111041086B (zh) | Rpl13基因先天性心脏病易感snp位点及其应用 | |
JP2005192418A (ja) | 検出すべき特定配列の簡易検出方法 | |
KR101167945B1 (ko) | Atg16l1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법 | |
JP2006254739A (ja) | 糖尿病疾患感受性遺伝子、及び糖尿病罹患の難易を検出する方法 | |
US20070264648A1 (en) | Dna Oligomer, Genetic Marker and Dna Oligomer Set for Prediction of Onset of Side-Effect from Radiation Therapy, and Method for Predicting Onset of Side-Effect | |
CN118048449A (zh) | 利用Forced-PCR-RFLP检测CREG1基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
CN111593117A (zh) | Crybb3基因突变作为马凡综合征诊断标志物的应用 | |
Marian | Molecular approaches for screening of genetic diseases | |
KR101196239B1 (ko) | Tg 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조기폐경 진단용 키트 및 이를 이용한 분석방법 | |
KR101167942B1 (ko) | Alg12 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법 | |
KR101167940B1 (ko) | Fmn2 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법 | |
KR101071081B1 (ko) | Defa4 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법 | |
CN111057769A (zh) | 一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒及其应用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |