FI118265B - Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi - Google Patents

Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI118265B
FI118265B FI20040052A FI20040052A FI118265B FI 118265 B FI118265 B FI 118265B FI 20040052 A FI20040052 A FI 20040052A FI 20040052 A FI20040052 A FI 20040052A FI 118265 B FI118265 B FI 118265B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
leu
ala
ser
pro
thr
Prior art date
Application number
FI20040052A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20040052A (fi
FI20040052A0 (fi
Inventor
Mia Pirskanen
Tomi-Pekka Tuomainen
Jukka T Salonen
Jani Haarus
Faisel Yunus
Original Assignee
Jurilab Ltd Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jurilab Ltd Oy filed Critical Jurilab Ltd Oy
Priority to FI20040052A priority Critical patent/FI118265B/fi
Publication of FI20040052A0 publication Critical patent/FI20040052A0/fi
Priority to PCT/FI2005/050007 priority patent/WO2005068653A1/en
Priority to US10/586,312 priority patent/US20070299025A1/en
Priority to EP05701762A priority patent/EP1711629A1/en
Publication of FI20040052A publication Critical patent/FI20040052A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118265B publication Critical patent/FI118265B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4721—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1 ’ I
118265
Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi-FÖrfarande för att detektera risken för akut myokardinfarkt eller kranskärls-sjukdom 5 Tämä keksintö koskee menetelmää geneettisen vaihtelun havaitsemiseksi defensiinigeenissä akuutin sydäninfarktin (AMI) ja sepelvaltimotaudin (CHD) riskin tai alttiuden diagnoosia varten kohteella. Esillä oleva keksintö antaa myös käyttöön menetelmän, jossa tunnistetaan kohteen alttius tai riski kehittää AMI tai CHD havainnoimalla geenipolymorfismeja kohteen biologisesta näytteestä ja hankitaan tietoa 10 koskien perhe-ja lääketieteellistä historiaa, seerumi- tai plasma-analyyttejä ja kohteen kliinisiä löydöksiä. Keksintö antaa myös käyttöön monimuuttujamallin, muuttujien yhdistelmän tai algoritmin, joka kuvaa parhaiten AMI:n ja CHD:n todennäköisyyttä.
Keksintö koskee myös testipakkausta ja ohjelmistoa menetelmän suorittamiseksi. Lisäksi keksintö koskee nukleiinihappoa, joka vaikuttaa uuden defensiiniproteiinimuunnoksen 15 tuottamiseen, sekä menetelmää kohteen seulomiseksi sen määrittämiseksi, onko mainittu kohde mainittua muunnos- tai ei-muunnosdefensiiniproteiinia koodaavan geenimuunnoksen kantaja.
KEKSINNÖN ALA ' ΐ 20 , . Esillä oleva keksintö on suunnattu yleisesti menetelmään CHD:njaAMI:n riskin ; • · · .1 .1 arvioimiseksi yksilöllä, kuten ihmisellä. Erityisesti keksintö kohdistuu menetelmään Jossa f
• · · ;S
• · [IL1 käytetään hyväksi sekä geneettistä että fenotyyppistä tietoa sekä kyselylomakkeilla | • · $.
t··’, hankittua tietoa pistemäärän muodostamiseksi pistemäärän antaessa todennäköisyyden 1 * 1 25 kehittää sepelvaltimotauti. Lisäksi keksintö antaa käyttöön testipakkauksen menetelmän * ··»1 ,···. toteuttamiseksi. Testipakkausta voidaan käyttää sepelvaltimotaudin ja AMI:n etiologiaan • · * 1 1 perustuvan diagnoosin määräämiseen hoidon ja ehkäisevien interventioiden, kuten | . ruokavalioneuvojen, kohdistamiseksi sekä kohteen ositukseen kliinisissä kokeissa, jotka ,1 • · · .1·1. testaavat lääkkeitä ja muita interventioita.
··· 30 • · · ♦ »
KEKSINNÖN TAUSTA
• ·
• · · K
· ; 1 Sepelvaltimotauti (CHD) on tärkein kuoleman aiheuttaja kehittyneissä maissa.
• « 1 1 Tavanomaisten kardiovaskulaaristen riskitekijöiden seulonta jättää tunnistamatta yli 50 % 118265 yksilöistä, jotka hakeutuvat hoitoon akuuttien koronaaristen syndroomien tai AMI:n takia.
Tulehdus näyttelee roolia sekä ateroskleroosin kehittymisessä että verisuonen seinän akuutissa aktivaatiossa, jota seuraa paikallinen tromboosi ja vasokonstriktio. Monilla potilailla, joilla on epästabiili angiina ja AMI, on havaittavissa tulehduksen systeemisiä 5 merkkejä. Systeemisten tulehdusmarkkerien käytöllä, kuten C-reaktiivisen proteiinin käytöllä sairauden aktiivisuuden ja lyhyt- ja pitkäkestoisen ennusteen markkerina, näyttää olevan kliinistä arvoa. Siksi akuutti tulehdusreaktio, joka on havaittavissa systeemisesti, on mahdollinen riskitekijä CHD:lie ja AMI:lie.
10 Koska CHD on polygeeninen sairaus, on järkevää olettaa, että geneettisen vaihtelun biokemiallisten reaktioteiden säätelylle tärkeissä mekanismeissa, joilla reaktioteillä on ' rooli ateroskleroosin ja CHD:n kehittymisessä, havaitaan olevan yhteydessä CHD:n patogeneesiin ja terapiaan.
15 Eräs tällä hetkellä tutkituista tulehduksen markkereista on defensiini. Defensiinit ovat pienten, kationisten, antibioottisten peptidien perhe peptidien sisältäessä kuusi kysteiiniä i disulfisidoksessa. Peptidejä on runsaasti ihmisten ja muiden nisäkkäiden fagosyyteissä ja ί ohutsuolen limakalvossa. Ne myötävaikuttavat isännän puolustukseen mikrobeja vastaan ja voivat osallistua kudoksen tulehdukseen ja endokriiniseen säätelyyn infektion aikana 20 (Ganz ja Lehrer 1995, Valore et ai. 1998) ja ovat osa luontaista immuunijärjestelmää (Jia et ai. 2001). Defensiinigeenejä on kaksi luokkaa, aja β, jotka eroavat * * *· " disulfidisidospariutumiseltaan, genomiselta järjestäytymiseltään ja kudosjakautumiseltaan.
• · 1 . * • * « : Niiden laajakirjoisten antimikrobisten ominaisuuksien lisäksi on näyttöä, että β-defensiinit • · toimivat kemokiineinä epäkypsille dendriittisoluille ja muisti-T-soluille ja voivat toimia • * *··;* 25 siten tärkeänä siltana luontaisen ja adaptiivisen immuunijärjestelmän välillä (Jia et ai.
• · * ·;;; 2001, Hoover et ai. 2001).
· • · '4 « · . Defensiinit ovat tavallisesti eristäytyneinä sytoplasman jyväsiin niiden ensisijaisen • · · "! vaikutuskohteen ollessa fagolysosomeissa, vaikka hieman peptidiä vapautuu verenkiertoon * * 30 infektion tai tulehduksen kuluessa. Defensiinejä on havaittu ensisijassa normaalien ja ] ateroskleroottisten valtimoiden sisäkalvosta, huomattavimmin sisäkalvon sileiden lihassolujen yhteydestä immunohistokemian avulla. Defensiinejä havaitaan myös * · * ·.· · väliaineista lähellä ulkopuolista elastista kerrosta ja joistakin periadventitiaalisista suonista.
* · ·.*·; Tämä osoittaa defensiini en läsnäolon ihmisen sepelvaltimoiden seinissä. Defensiinien 3 118265 saostuminen suoniin voi myötävaikuttaa tulehduksen patofysiologisiin seurauksiin niiden isännän puolustuksessa olevan roolin lisäksi (Bamathan et ai. 1997).
β-defensiinipeptidien antimikrobinen aktiivisuus on luonteenomaisesti herkkää suolalle, ja 5 niiden tappaminen vähenee merkittävästi, kun liuosten ionivahvuus lisääntyy (eli NaCl > 50 mM) (Schutte ja McCray 2002).
Kunkin β-defensiinigeenituotteen primäärirakenteelle on tunnusomaista pieni koko, kuuden kysteiinin motiivi, korkea kationinen varaus ja erittäin suuri vaihtelevuus näiden 10 piirteiden lisäksi. Defensiiniproteiinien luonteenomaisin piirre on niiden kuuden kysteiinin motiivi. Kukin β-dcfensiinigeeni koodaa preproproteiinia, jonka koko on välillä 59 - 80 aminohappoa keskimääräisen koon ollessa 65 aminohappoa. Tämä geenituote pilkotaan sen jälkeen kooltaan välillä 36 - 47 aminohappoa olevan kypsän peptidin luomiseksi keskimääräisen koon ollessa 45 aminohappoa (Schutte ja McCray 2002) ja 15 molekyylimassan ollessa 3 - 4 kD (Bensch et ai. 1995).
Ihmisillä on karakterisoitu ainakin kuusi beetadefensiiniä (HBD-1, HBD-2, HBD-3, HBD- Ί 4,1IBD-5, HBD.6). Ihmisen β-defensiini-l (HB D-l) oli ensimmäinen karakterisoituja 1 eristetty β-defensiini sellaisten dialyysiä läpikäyvien potilaiden verensuodoksesta, joilla oli 20 loppuvaiheen munuaissairaus (Lehmann et ai. 2002). HBD-l-geeniä ilmennetään . pääasiallisesti urogenitaalisissa epiteliaalisissa elimissä, kuten munuaisessa, virtsarakossa, * · · % virtsanjohtimessa ja naisen sukupuolielimissä ja ilmennetään vähemmän haimassa, - * * * "··. maksassa ja muissa epiteeleissä. Munuaisessa in situ-hybridisaatio osoittaa, että HBD-l:tä ‘ * * • * · .···. tuotetaan distaalisissa munuaistiehyissä, Henlen lingoissa ja keräävissä tiehyissä. Ihmisen • · 25 virtsa sisältää 10 - 100 pg HBD-1 :tä/l (Zucht et ai. 1998, Ganz 2001).
• · « * • * * • · • · * * *
Ihmisen β-defensiini-l (HBD-1) -geeni kattaa noin 8 kB:tä kromosomista 8p231 (Dork ja : Stuhmiann 1998) ja koostuu kahdesta eksonista, joita erottaa introni, joka on tavallisesti ' • * * : ’ * *: 1,5 kb mutta voi olla niin suuri kuin 16 kb. Käsitelty transkripti vaihtelee pituudeltaan *·· 30 välillä 300 - 400 nukleotidia (nt), ja siinä on 35 nt:n 5'UTR, 200 nt:n avoin lukukehys ja * · 100 nt:n 3'UTR. Ensimmäinen eksoni sisältää 5'UTR:n ja koodaa preproproteiinin johtodomeenia; toinen eksoni koodaa kypsää peptidiä, jossa on kuuden kysteiinin domeeni * * * . (Schutte ja McCray 2002).
• * · « · r : 4 118265
Siten tulehdusmekanismit ovat tärkeitä osallistujia CHD:n patofysiologiaan. Tulehduksen ja isännän vastustuskyvyn käyttökelpoisten markkerien (kuten defensiinien) tunnistaminen, uusien terapeuttisten kohteiden tunnistaminen näihin mekanismeihin puuttumiseksi ja t tulehduksen vastaisten hoitojen tehokkuuden arvioiminen mahdollistaa edistyksen ^ '* 5 kyvyssämme ehkäistä ja hoitaa CHD:tä ja taistella sen komplikaatioita vastaan. 1
KEKSINNÖN YHTEENVETO
Tämän keksinnön mukainen kohde on antaa käyttöön menetelmä kohteen seulomiseen sen 10 arvioimiseksi, onko yksilöllä riski kehittää sydäninfarkti tai sepelvaltimotauti, perustuen defensiinigeenin genotyyppiin. Vielä eräs esillä olevan keksinnön mukainen kohde on -i menetelmä AMI:n ja sepelvaltimotaudin riskin tunnistamiseksi havainnoimalla geenipolymorfismeja kohteen biologisesta näytteestä. Tästä menetelmästä hankittu tieto 1 voidaan yhdistää muun yksilöä koskevan tiedon kanssa, esim. tulosten veren mittauksista, 15 kliinisestä tutkimuksesta ja kyselylomakkeista kanssa. Geneettinen tieto sisältää tiedot mutaatioista geeneissä, jotka ovat yhteydessä MI:n ja/tai sepelvaltimotaudin kanssa.
Verimittaukset sisältävät plasman tai seerumin kolesterolin ja korkeatiheyksisen · lipoproteiinikolesterolin määrittämisen. Kyselylomakkeilla kerättävä tieto sisältää tiedon, joka koskee sukupuolta, ikää, perhettä ja lääketieteellistä historiaa, kuten CHD:n ja i 20 diabeteksen perhehistoriaa. Tutkimuksella kerätty kliininen tieto sisältää esim. tiedon koskien pituutta, painoa, lonkan ja vyötärön ympärysmittaa, systolista ja diastolista • · · / / verenpainetta ja sydämen sykettä.
···-* · · * · · · ·**·' . * • · • * !" Tarkemmin sanoen keksintö antaa käyttöön menetelmän geneettisen vaihtelun tai * · 25 polymorfismin, eli mutaation, havainnoimiseksi defensiinigeenissä menetelmän käsittäessä "I! vaiheet: • · • · ··· . i) annetaan käyttöön biologinen näyte, joka on otettu testattavalta kohteelta, • · · • · · * · .....
• · • * • · * * . 30 ii) havainnoidaan defensiinigeenin genotyyppimuunnoksen läsnäolo tai poissaolo biologisessa näytteessä defensiinin genotyyppimuunnoksen läsnäolon osoittaessa • · kardiovaskulaarisen sairauden, kuten CHD:n ja AMI:n, lisääntynyttä riskiä mainitulla *·* kohteella.
* · * · · • * · • · ' 5 118265
Mainittu defensiinigeeni voidaan valita ryhmästä, joka koostuu: beetadefensiini-l:stä, beetadefensiini-129:stä ja alfadefensiini-5 :stä.
Lisäksi geenialleelien kuvio voidaan edelleen määrittää geeneistä, jotka on valittu 5 ryhmästä, joka koostuu: a) alfa-2B-adrenoseptorista, b) apolipoproteiini B:sta ja c) beeta-2-adrenergisestä reseptorista io . .
kardiovaskulaarisen sairauden riskin varmistamiseksi mainitulla kohteella.
KEKSINNÖN MUKAISTEN EDULLISTEN SUORITUSMUOTOJEN YKSITYISKOHTAINEN SELITYS 15
Keksintö käsittää edullisessa suoritusmuodossa defensiinigeenin geneettisten muunnosten arvioinnin tai suuresta muuttujien (mittausten) joukosta olevan tiedon yhdistämisen AMI:n tai CHD:n todennäköisyyden ennustamiseksi. Ennustava tieto sisältää genotyyppien ja haplotyyppien arvioinnin genomi-DNA:ssa ja mahdollisesti haastatteluilla, 20 kyselylomakkeilla, kliinisellä tutkimuksella ja/tai verianalyyttien mittauksilla saatavan tiedon. Tämä ennustava tieto voidaan kerätä missä iässä tahansa. Tämä menetelmä on • · • · · / / sovellettavissa myös keski-ikäisiin henkilöihin.
• · · · ♦ • · · · ·· • * • · !!; AMI:n ja CHD:n ennustamiseen käytetty geneettinen, genotyyppinen ja fenotyyppinen • · “J 25 tieto voi olla yhteydessä lipidin, hiilihydraatin, aminohapon ja muun ravinteen (kuten ) · I ·. raudan ja folaatin) imeytymiseen, varastointiin ja aineenvaihduntaan, lipidin kuljetukseen, • » oksidatiiviseen ja antioksidatiiviseen aineenvaihduntaan, koagulaatioon, fibrinolyysiin, :¾ , verihiutaleiden toimintaan, matriksin proteiineihin ja hajoamiseen, verenpaineeseen, • ♦ · ··♦ .···. valtimon supistumiskykyyn ja supistumiseen, muuhun verisuonten säätelyyn, munuaisten • · · • , 30 toimintaan, keskushermostoon, sydänlihaksen ominaisuuksiin, glukoosin homeostaasiin, Φ · . lihavuuteen, arteriaalisen ja myokardiaalisen solun nekroosiin, apoptoosiin, • · · . proliferaatioon, migraatioon ja adheesioon, tulehdukseen (kuten C-reaktiiviseen • · · * * · *·* proteiiniin), sympaattiseen tonukseen, kuten adrenergisiin reseptoreihin, tai ihmisisännän • · · vastustuskykyyn tulehdusta vastaan, kuten defensiineihin.
118265 6
Lukuisia genotyypitysmenetelmiä on kuvattu alalla nukleiinihappojen analysoimiseksi
spesifisten sekvenssivaihteluiden, esim. SNPiiden, insertioiden ja deleetioiden läsnäolon I
f* suhteen (katsaukseksi katso Syvänen 2001 ja Nedelcheva Kristensen et ai. 2001). Näissä ? 5 menetelmissä potilaalta hankitaan nukleiinihappoa sisältävä näyte (esim. verta, kudosnäytepala tai poskisoluja) ja nukleiinihapoista tunnistetaan ja arvioidaan kiinnostavat sekvenssivaihtelut.
Geeneissä olevia alleelimuunnoksia voidaan erottaa entsymaattisilla menetelmillä 10 (restriktioendonukleaasien, DNA-polymeraasien, ligaasien jne. avulla), elektroforeettisilla 4 menetelmillä [esim. yksijuosteinen konformaatiopolymorfismi (SSCP), heterodupleksianalyysi, fragmenttianalyysi ja DNA-sekvensointi], kiinteäfaasimäärityksillä , (dot hiotit, mikroarrayt, mikrohiukkaset, mikrotiitterilevyt jne.) ja fysikaalisilla menetelmillä [esim. hybridisaatioanalyysi, massaspektrometria ja denaturoiva korkean 15 erotuskyvyn nestekromatografia (DHPLC)]. Useimmissa genotyypitysmäärityksistä käytetään erilaisia polymeraasiketjureaktio (PCR) -sovelluksia sekä lisäämään signaalin suhdetta taustaan että säästämään näytteen nukleiinihappoa ennen alleelierotusta.
Havainnoitavia leimoja (fluorokromit, radioaktiiviset leimat, biotiini, muunnetut nukleotidit, hapteenit jne.) voidaan käyttää tehostamaan alleelimuunnosten visualisoimista. 4 20 Tämä keksintö perustuu periaatteeseen, että suoritetaan yksi tai pieni joukko * * * • · · ,* .* genotyypityksiäja tyypitettävät mutaatiot valitaan niiden kyvyn perusteella ennustaa • · a • · · *11.* AMI:aja/tai CHD:tä. Tästä syystä voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää genomisessa aa • · v III DNA-näytteessä olevien mutaatioiden genotyypittämiseksi. Jos käytetään ei-rinnakkaisia • · 25 menetelmiä, kuten tosiaikaista PCRrää, tyypitykset tehdään peräkkäin. PCR-reaktiot ♦ voidaan limittää tai ne voidaan toteuttaa erikseen peräkkäin tai rinnakkaissa erissä.
• ♦ a a a . Pistemäärä, joka ennustaa MI:n tai CHD:n todennäköisyyttä, voidaan laskea käyttämällä • a a • · a .·**. monimuuttujaelinaikamallia tai logistista regressioyhtälöä seuraavasti: *;*. 30 > Sepelvaltimotaudin todennäköisyys = [1 + e U‘a+^bl*x,h] jossa e on Napierin vakio, X, • a ovat kardiovaskulaariseen sairauteen liittyviä muuttujia, b; ovat näiden muuttujien a a a f | kertoimia logistisessa funktiossa ja a on vakiotermi logistisessa funktiossa. Malli voi » f · ’* lisäksi sisältää minkä tahansa vuorovaikutuksen (tuotteen) tai minkä tahansa muuttujien Xi 7 118265 termejä, esim. bjX;, Algoritmi on kehitetty yhdistämään tieto MI:n yksinkertaisen ennusteen tuottamiseksi riskin prosenttiosuutena 10 vuodessa. Vaihtoehtoisia tilastollisia malleja ovat elinaikamallit, kuten Coxin verrannollisten hasardien malli ja hermostoverkostomallit. : % 5
Siten keksinnön mukainen havainnointimenetelmä voi käsittää lisäksi vaiheen, jossa yhdistetään tieto koskien ikää, sukupuolta, hypertension, diabeteksen ja hyperkolesterolemian perhehistoriaa ja lääketieteellistä historiaa koskien kohteen kardiovaskulaarisia sairauksia tai diabetesta tulosten kanssa, jotka on hankittu menetelmän 10 vaiheesta ii) (katso patenttivaatimus 1) havainnointivaiheesta hankitun osoituksen vahvistamiseksi. Mainittu tieto voi koskea myös perheen hyperkolesterolemiaa, tupakointitilannetta, perheen CHD:tä, kardiovaskulaarisen sairauden historiaa, perheen lihavuutta ja vyötärön ja lonkan ympärysmitan suhdetta (cm/cm).
15 Keksinnön mukainen havainnointimenetelmä voi käsittää lisäksi vaiheen, jossa määritetään veren, seerumin tai plasman kolesteroli, HDL-kolesteroli, LDL-kolesteroli, triglyseridi, apolipoproteiini B ja AI, fibrinogeeni, ferritiini, transferriinireseptori, C-reaktiivinen * proteiini, seerumin tai plasman insuliinikonsentraatio. 1 20 Tulokset edellä kuvatuista menetelmän myöhemmistä vaiheista tekevät mahdolliseksi . , vaiheen, jossa lasketaan kardiovaskulaarisen sairauden todennäköisyys käyttämällä ; • · · .* / logistista regressioyhtälöä seuraavasti: *·· • · · · • * ' • · .···. Kardiovaskulaarisen sairauden todennäköisyys = [1 + e H-a+I(bl*x,))j _l5 jossa e on Napierin * · • · · 25 vakio, Xj ovat kardiovaskulaariseen sairauteen liittyviä muuttujia, bj ovat näiden ···· .*·*. muuttujien kertoimia logistisessa funktiossa ja a on vakiotermi logistisessa funktiossa ja • · ♦ jossa a ja bj määritetään edullisesti väestöstä, jossa menetelmää on määrä käyttää, ja Xi : ·'· valitaan edullisesti muuttujien joukosta, jotka on mitattu väestöstä, jossa menetelmää on ··· :***: määrä käyttää. Edulliset arvot bjille ovat-20:n ja 20:n välillä; ja idle välillä 0 (ei yhtään)- 30 100 000. Xj ovat binäärisiä muuttujia, joilla voi olla arvot 0 (nolla) tai 1 (yksi) tai jotka on • · koodattu 0:ksi (nollaksi) tai l:ksi (yhdeksi). ’ * * *·· * * * • * « ; . Menetelmää voidaan käyttää AMI:n ennustamisessa ja varhaisessa diagnoosissa aikuisilla • · · • · · henkilöillä, kohteiden osituksessa ja valikoimisessa kliinisiin kokeisiin, henkilöiden 8 118265 osituksessa ja valikoimisessa tehostettuihin ehkäiseviin ja parantaviin interventioihin.
Tavoite on vähentää kliinisten lääketutkimusten ja terveydenhoidon kustannuksia.
Koetta voidaan käyttää testaamaan riski kehittää AMI sekä 5 1) terveillä henkilöillä seulonta-ja alttiustestinä että 2) korkean riskin henkilöillä (joilla on esim. CHD:n perhehistoriaa tai kohonnut seerumin kolesteroli tai hypertensio tai diabetes tai näiden jokin yhdistelmä).
Koska tulehdus on AMIrnja muiden CHD:n muotojen aiheuttaja, tulehduksen vastaisia 10 aineita voidaan mahdollisesti käyttää AMIrnja kroonisen CHD:n ehkäisyssä ja hoidossa.
Henkilöt, joilla on heikentynyt isännän vastustuskyky tulehdukselle esim. ihmisen defensiiniprotciinien vähentyneen ilmentämisen tai tuottamisen johdosta, hyötyvät siten defensiiniä tehostavista lääkityksistä, ruokavalioista ja muista terapioista. Yleisemmin, 1 kaikki ihmiset saattaisivat hyötyä defensiinijärjestelmän tehostamisesta AMI-ja CHD- 15 riskinsä vähentymisen ja sitä seuraavan pitkäikäisyyden lisääntymisen kautta. Erityisesti henkilöt, joiden defensiinitasot ovat alentuneet tai joilla on mutaatioita ihmisen defensiinejä koodaavissa geeneissä, hyötyvät tällaisesta hoidosta. Muita ryhmiä tai i henkilöitä, jotka saavat lisääntynyttä hyötyä defensiiniä tehostavista hoidoista, ovat § henkilöt, joilla jo on CHD. Kliininen tutkimus, jossa testataan defensiinin tehostamisen =? 20 vaikutusta defensiinin ilmentämiseen, kehon defensiinitasoihin, ateroskleroosin . etenemiseen ja AMIrnja muiden sepelvaltimotapahtumien esiintymiseen, voidaan toteuttaa • · · kehon defensiinitasoja tehostavilla yhdisteillä ja menetelmillä mainittujen yhdisteiden • · · mittaamiseksi.
• « • ·
• » · V
♦ ··'.·· ...
• · 9 Φ · _ 25 Koska defensiinit ovat välttämättömiä CHDrtäja AMIra vastaan suojaamisessa, ···· . * * *. lääkitykset, ruokavalio- j a muut hoidot, j otka vähentävät ihmisen defensiinin tasoj a tai ··· aktiivisuutta, aiheuttavat haitallisia reaktioita noissa henkilöissä. Haitallisten reaktioiden • ;*: todennäköisyys on suurinta henkilöillä, joilla jo on alentuneet defensiinin tasot tai • · · ;***: aktiivisuudet.
• · · 30 ····· • *
Tarkemmin sanoen keksintö kohdistuu menetelmään geneettisen vaihtelun tai • · polymorfismin, eli mutaation, havaitsemiseksi defensiinigeenissä menetelmän käsittäessä * · · • » i . vaiheet: • · · • *· • ♦ 9 118265 i) annetaan käyttöön biologinen näyte, joka on otettu testattavalta kohteelta, ii) havainnoidaan defensiinigeenin genotyyppimuunnoksen läsnäolo tai poissaolo biologisessa näytteessä defensiinin genotyyppimuunnoksen läsnäolon osoittaessa 5 kardiovaskulaarisen sairauden lisääntynyttä riskiä mainitulla kohteella.
Edullisesti geneettinen vaihtelu määritetään lisäksi geeneistä, jotka on valittu ryhmästä, I
joka koostuu:
10 a) alfa-2B-adrenoseptorista, S
b) apolipoproteiini B:stä ja c) beeta-2- adrenergisestä reseptorista jolloin genotyyppimuunnoksen läsnäolo mainituissa geeneissä osoittaa kardiovaskulaarisen 15 sairauden, kuten sydäninfarktin (AMI) tai sepelvaltimotaudin (CHD), lisääntynyttä riskiä mainitulla kohteella.
Menetelmä voi käsittää lisäksi vaiheen, jossa valitaan kohde, jolla on defensiiniproteiinin i ilmentämistä, tuottamista tai tasoja vähentävä defensiinigeenin sekvenssimuunnos, 20 kliinisiin lääketutkimuksiin, joissa testataan yhdisteiden antikoronaarisia ja , . myokardiaalista iskemiaa ehkäiseviä vaikutuksia.
• * · • * • · • · · • · ·
Edullisesti defensiinigeenin mainittu genotyyppimuunnos on mutaation homo-tai φ · heterotsygoottimuoto.
· * · · 25 . . , . , • · · * .·**, Menetelmän mukainen havainnointivaihe voi olla DNA-määritys. Tällainen • · * * * havainnointivaihe voidaan toteuttaa myös käyttämällä geeni- tai DNA-sirua, -mikroarrayta, . .*. -liuskaa, -levyä tai samanlaista, useamman kuin yhden määritettävän geenin, mutaation tai • · * RNA-ekspression yhdistelmää. Lisäksi eräs keksinnön mukaisista edullisista
• M
30 suoritusmuodoista on alleelikuvion määrittäminen polymeraasiketjureaktiolla. Menetelmän • · havainnointivaihe voi perustua myös pyyntikoettimeen, joka sitoutuu spesifisesti * * defensiininukleiinihappomuunnokseen.
• · · * · · * ' • * · • ·* • · 10 118265
Biologinen näyte menetelmää varten voi olla esim. verinäyte tai poskivanunäyte.
Mainitusta näytteestä eristetään genomi-DNA:ta.
Testattava kohde on edullisesti nisäkäs, edullisemmin kädellinen ja edullisimmin ihminen.
5
Lisäksi menetelmää voidaan käyttää edullisesti sen määrittämiseksi, onko kohteella haitallisten vaikutusten tai reaktioiden lisääntynyt riski, jos kohteelle annetaan defensiiniantagonisteja.
10 Keksinnön mukainen menetelmä kohdistuu edullisesti seuraavien geenien muunnosten havainnointiin: ihmisen beetadefensiini-1 (esim. 3'UTR+5A—>G -muunnos), ihmisen beetadefensiini-129 (esim. 5'UTR -27T—>C -muunnos ja/tai IVS1 -13_-12insCTC), ihmisen alfadefensiini-5 (esim. IVS1 +198C—»T -muunnos ja/tai IVS1 +243G—>C - f muunnos), beeta-2-adrenerginen reseptori (esim. GlylöArg-muunnos ja/tai Glu27Gln-15 muunnos) ja alfa-2B-adrenerginen reseptori (esim. insertio/deleetiomuunnos, kuten kokeellisessa osassa on määritelty) ja apolipoproteiini B-geeni (esim. Thr98Ile-muunnos).
Siten luetellut geenimuunnokset esitetään tässä CHD:n ja/tai AMI:n ennustamiseksi. Alan ammattilainen voi kuitenkin löytää tavanomaisella työllä uusia toiminnallisia mutaatioita mainituista geeneistä. Tällaisten muunnosten katsotaan olevan alan ammattilaisten 20 ulottuvilla tässä esitetyn avulla. · * · ,1 .1 Esillä oleva keksintö antaa lisäksi käyttöön testipakkauksen geneettisen vaihtelun tai • · 1 • # 1 *".1 polymorfismin, eli mutaation, havainnoimiseksi defensiinigeenissä akuutin sydäninfarktin, • 1 * 1 AMI:n, ja sepelvaltimotaudin, CHD:n, riskin määrittämiseen kohteella testipakkauksen * · "J 25 käsittäessä välineet defensiinigeenialleelin havainnoimiseen ja mahdollisesti ohjelmiston * "··. ja/tai ohjeet määrityksen tulosten tulkitsemiseksi. Testipakkaus voi antaa käyttöön myös • · välineet geenien muunnosten havainnoimiseen, jotka geenit on valittu ryhmästä, joka . .·. koostuu: • · · .
• · · ··· • · ♦ · ··· *. 30 a) alfa-2B-adrenoseptorista, ····· * 1 . b) apolipoproteiini B:stä ja • · ^ e) beeta-2-adrenergisestä reseptorista • · · • · · • φ • · · 1 Edullisesti havainnoidut muunnokset ovat edellä ja kokeellisessa osassa kuvattuja.
11 1 1 8265 ..-..../...o.. ,/4
Testipakkaus voi perustua nukleiinihappopyyntikoettimeen, joka sitoutuu spesifisesti genotyyppimuunnokseen, kuten keksinnössä on määritelty, ja/tai DNA-siruun, :¾ raikroarrayhin, DNA-liuskaan, DNA-levyyn tai tosiaikaiseen PCR: ään perustuviin ; 5 testeihin. Testipakkaus voi käsittää myös kyselylomakkeen potilaan tietojen hankkimiseksi koskien ikää, sukupuolta, pituutta, painoa, hypertension ja hyperkolesterolemian perhehistoriaa, kardiovaskulaarisia sairauksia koskevaa lääketieteellistä historiaa.
Julkaisut ja muut materiaalit, joita on käytetty tässä keksinnön taustan valaisemiseen ja 10 erityisesti antamaan käyttöön lisäyksityiskohtia mitä tulee sen käytäntöön, sisällytetään tähän viitteeksi.
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin kokeellisessa osassa.
15 KOKEELLINEN OSA
Yksittäisten genotyyppien määrittäminen
Kokeellisessa osassa mainitun spesifisen geenin tunnistamiseen olemme käyttäneet Locus 20 Link ID-numeroita (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/). Kokeellisessa osassa mainittujen spesifisten, tunnettujen SNP:iden tunnistamiseen olemme käyttäneet rs- • * * ·. /;· .* ,* numeroita NCBI SNP-tietokannasta (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/).
• · · * * · * · · * ··* • · • *
Keksinnön mukainen menetelmä kyseisen DNA-vaihtelun alleelikuvion määrittämiseen • * 25 voidaan toteuttaa polymeraasiketjureaktiolla (PCR) yhdistelmässä alleelispesifisen aluke-ekstensiomenetelmän (SNaPshot, Applied Biosystems) kanssa, mitä seuraa • · kapillaarielektroforeesi ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteella (Applied ) . .·. Biosystems).
» · · • * * ··· • · • · • · * * . 30 Snapshot-reaktiossa kyseisen vaihtelun sisältävä genomi-DNA-alue monistetaan PCR:llä.
• ·
Monistettu PCR-tuote puhdistetaan ja käytetään templaattina snapshot-reaktiossa.
® . Snapshot-reaktioon suunnitellaan ekstensioaluke siten, että alukkeen 3'-pää on välittömästi • · · ] kiinnostavan polymorfisen kohdan vieressä. Snapshot-reaktiossa ekstensioaluke • · * **’: hybrdisoituu komplementaariseen templaattiinsa fluoresoivien, leimattujen dideoksi- 12 . 1 1 8265 NTP:iden ([F]ddNTP:t) ja DNA-polymeraasin läsnä ollessa. Polymeraasi pidentää aluketta vain yhdellä nukleotidilla lisäten yhden [F]ddNTP:n sen 3'-päähän. Koska kukin neljästä [F]ddNTP:stä leimataan erilaisella fluoresoivalla värillä, genotyypit voidaan erottaa.
5 Jos samassa reaktiossa on määrä määrittää monia SNP:itä, ekstensioalukkeet tarvitsee suunnitella siten, että ne eroavat toisistaan merkittävästi pituudeltaan (4 - 6 nukleotidia).
Alukkeen pituutta voidaan muuntaa lisäämällä ekstensioalukkeiden 5'-päähän vaihteleva mutta tunnettu lukumäärä ei-homologisia nukleotideja (dT, dA, dC tai cGATC).
Ekstensioalukkeiden pituuseron johdosta snapshot-tuotteet voidaan havainnoida 10 kapillaarielektroforeesissa tuotteen koon mukaisesti. SnaPshot-genotyypityksen suorittamiseksi standardiolosuhteissa katso käyttäjän käsikirjaa (ABI Prism SnaPshot Multiplex kit, Protocol, Applied Biosystems).
Polymeraasiketjureaktio (PCR) 15
Kyseiset mutaatiot sisältävät genomi-DNA-alueet voidaan monistaa PCR:llä joko erillisissä reaktioissa tai kaikki yhdessä reaktioseoksessa (eli moninkertaisessa PCR:ssä).
PCR-monistus toteutettiin 30 μΐ.η tilavuudessa: reaktioseos sisälsi 40 ng ihmisen genomi- f DNA:ta (uutettu perifeerisestä verestä), IX PCR-puskuria (QIAGEN), 200 μΜ kutakin 20 nukleotidia (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Finnzymes), 0,75 μΜ DEFB1-PCR-alukkeita, 0,5 , . μΜ DEFB 129-ja DEFA5-PCR-alukkeita ja 0,25 μΜ ADRB2-PCR-alukkeita ja 2,5 * · · yksikköä Hot Start Taq -DNA-polymeraasia (QIAGEN). Ensin reaktiota pidettiin 5 s • · · • * t -y "I.* minuuttia 96 °C:ssa, sen jälkeen seuraavat kolme vaihetta toistettiin 35 syklin ajan: 30 * • * I" sekuntia 94 °C:ssa, 1 minuutti 57 °C:ssa, 1 minuutti 72 °C:ssa, minkä jälkeen reaktiota • » "jt 25 pidettiin 72 °C:ssa vielä 5 minuuttia ja sen jälkeen pidettiin 1 minuutti 10 °C:ssa ja * ]·", säilytettiin 4 °C:ssa PTC-220 DNA Engine Dyad-PCR-laitteessa (MJ Research).
• · * · · . APOBdle PCR-monistus toteutettiin 20 μ1:η tilavuudessa: reaktioseos sisälsi 40 ng ihmisen * * · .**·. genomi-DNA:ta (uutettu perifeerisestä verestä), IX PCR-puskuria (QIAGEN), 200 μΜ • * * . 30 kutakin nukleotidia (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Finnzymes), 10 pmoolia APOB-PCR- • * alukkeita ja 2,0 yksikköä Hot Start Taq -DNA-polymeraasia (QIAGEN). Ensin reaktiota • · pidettiin 7 minuuttia 94 °C:ssa, sen jälkeen seuraavat kolme vaihetta toistettiin 35 syklin • · · [ ajan: 45 sekuntia 94 °C:ssa, 45 sekuntia 54 °C:ssa, 1 minuutti 72 °C:ssa, minkä jälkeen • * · • * * • · 13 1 1 8265 reaktiota pidettiin 72 °C:ssa vielä 5 minuuttia ja sen jälkeen pidettiin 1 minuutti 10 °C:ssa ja säilytettiin 4 °C:ssa PTC-220 DNA Engine Dyad-PCR-laitteessa (MJ Research).
DEFB129 IVSl-13_-12insCTC:lle monistus toteutettiin 40 μ1:η tilavuudessa: reaktioseos i 5 sisälsi 60 ng ihmisen genomi-DNA:ta (uutettu perifeerisestä verestä), IX PCR-puskuria (QIAGEN), 200 μΜ kutakin nukleotidia (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Finnzymes), 20 pmoolia DEFB129 IVSl-13_-12insCTC-PCR-alukkeita ja 3,0 yksikköä Hot Start Taq -DNA-polymeraasia (QIAGEN). Ensin reaktiota pidettiin 7 minuuttia 96 °C:ssa, sen jälkeen seuraavat kolme vaihetta toistettiin 35 syklin ajan: 45 sekuntia 94 °C:ssa, 45 sekuntia 57 10 °C:ssa, 1 minuutti 72 °C:ssa, minkä jälkeen reaktiota pidettiin 72 °C:ssa vielä 5 minuuttia ΐ ja sen jälkeen pidettiin 1 minuutti 10 °C:ssa ja säilytettiin 4 °C:ssa PTC-220 DNA Engine Dyad-PCR-laitteessa (MJ Research). ; PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB1-geenin (defensiini-beeta-1, Locus 15 link ID: 1672) 3'UTR+5A>G-mutaation (rsl047031) monistamiseen oli seuraava: 5’-CAT AAT TTC AGC CCG ATG TG -3’ (SEQ ID NO: 1) ja 5’- CAC CCT AAC CCC CTA CTT CT-3’ (SEQ ID NO:2). ^ PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB129 -geenin (defensiini-beeta- 1 20 129, Locus link ID: 140881) 5’UTR-27T>C (rs2298148) monistamiseen oli
. . seuraava: 5’- GGG CTT GCT CTT TCT TTC -3’ (SEQ ID NO:3) ja 5’- TCC TTG
• · · / / GTT CCT CTC ATC -3’ (SEQ ID NO:4).
• 1 · ""‘"ί * 1 · · • 1 1 * · • • · » • · 1 *...1 PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen ADRB2 -geenin (beeta-2- adrenerginen ..'i 25 reseptori, Locus link ID: 154) Glyl6Arg (rsl042713)- ja Glu27Gln (rs1042714) • · · *···1 -mutaatioiden monistamiseen oli seuraava: 5’-CTG AGT GTG CAG GAC GAG-3’ja (SEQ ID NO:5) 5’- CAC ATT GCC A AA CAC GAL -3’ (SEQ ID NO:6).
• 1 · • · · ··· · · • · . .
14 ; 1 1 826 5 AAG AGG AGC ATC AAA G-3’(SEQ ID N0:9) ja 5’-TCA AGC CTA TTA GCC TAC A-3’ (SEQ ID NO: 10).
PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen APOB -geenin (apolipoproteiini B, Locus I
5 link ID: 338) Thr98Ile-mutaatio (tunnettu myös Thr71Ile-mutaationa, rs 1367117) monistamiseen oli seuraava: 5’-GAC AAC CTC AAT GCT CTG CT-3’(SEQ ID NO: 11) ja 5’- TGA CTT ACC TGG ACA TGG CT -3’ (SEQ ID NO:12).
PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB129-geenin (defensiini-beeta-129, 10 Locus link ID: 140881) IVSl-13_-12insCTC-muunnoksen (seuraavassa sekvenssissä, SEQ : j ID NO:32, SEQ ID NO:33, insertio on asemassa 444-446) monistamiseen oli seuraava: 5’-GGC TAC TGA GTT TGG TGA-3’(SEQ ID NO:34) ja 5’-GTG TTT ATT GAA TGA CTG ATG -3’ (SEQ ID NO:35).
15 PCR-tuotteet puhdistettiin SAP (katkaravun alkalinen fosfataasi, USB)-ja Exol (Exonuclease I, New England BioLabs) -käsittelyllä. Tämä suoritettiin PCR-reaktioista olevien liittymättömien dNTP:iden ja alukkeiden osallistumisen myöhempään aluke-ekstensioreaktioon välttämiseksi. Tarkemmin sanoen 2,5 μΐ SAP:a (1 yksikkö/μΐ, USB), 0,25 μΐ Exol.tä (20 yksikköä/μΐ, New England Biolabs), 1,0 μΐ 10 X Exol-puskuria (New 20 England Biolabs) ja 6,25 μΐ lUCkta lisättiin 5 pl:aan PCR-tuottetta. Reaktiota sekoitettiin ja , # inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Sen jälkeen reaktiota pidettiin 75 °C:ssa 15 minuuttia 9 · * ,* / entsyymien inaktivoimiseksi ja säilytettiin 4 °C:ssa.
• · · i · · ···· # * · • · ♦ · ::: Myöhemmässä aluke-ekstensioreaktiossa (SNaPshot-reaktiossa) sekoitetaan putkessa 1,5 • * "I, 25 μΐ SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix:ä (Applied Biosystems), 3 μΐ puhdistettuja
]··*. PCR-tuotteita, 1 μΐ yhdistettyjä ekstensioalukkeita (1 μΜ kutakin) ja 4,5 μΐ puskuria (IX
• · • * *
AmpliTaq Gold -puskuri 2 mM MgCh, Applied Biosystems). Reaktiota inkuboidaan 96 j . °C:ssa 5 sekuntia, ja sen jälkeen se alistetaan 35 syklille 95 °C:ssa 10 s, 50 °C:ssa 5 s ja 60 *«· °C:ssa 30 s PTC-220 DNA Engine Dyad-PCR-laitteessa (MJ Research).
* . 30 • ♦ · * * * · <<i(; Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen DEFA5 IVS1+198C>T-mutaation • ·
genotyypitykselle SNaPShot-reaktiossa oli: 5’-TTT TTT TTT TTT TTT CTT TTT TCT
V ! AAG ACT TTC AG -3’ (SEQ ID NO: 13).
* · * • · 5 15 118265
Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen DEFA5 IVSl+243G>C-mutaation genotyypitykselle SNaPShot -reaktiossa oli: 5’- TTT TTT TTT TTT TTT TTT TGC TAC TTT TAA GAT AGA AAG A -3’ (SEQ ID NO:14). |
Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB 1 3'UTR+5A>G-mutaation genotyypitykselle SNaPShot -reaktiossa oli: 5’- TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGT GCT GCA AGT GAG CTG -3’ (SEQ ID NO: 15).
10 Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB129 IVSl-27T>C-mutaation genotyypitykselle SNaPShot-reaktiossa oli: 5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CCA GAG AGG AAG CCT TG-3’(SEQ ID NO: 16).
Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen ADRB2 Glyl6Arg-mutaation 15 genotyypitykselle SNaPShot -reaktiossa oli: 5’- T TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTC TTG CTG GCA CCC AAT -3 ’ (SEQ ID NO: 17).
Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen ADRB2 Glu27Gln-mutaation genotyypitykselle SNaPShot -reaktiossa oli: 5’- TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 20 TTT TTT TTT TTT TTT TTT TAC CAC GAC GTC ACG CAG -3’ (SEQ ID NO: 18).
* · • · · * · · ; Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen APOB Thr98Ile (Thr71 Ile, rs 1367117) ; • « · ·
.·*·. -mutaation genotyypitykselle SNaPShot-reaktiossa oli: 5’-TTT TTT TTT TTT TGA
.**·; AGA CC A GCC AGT GCA-3’(SEQ ID NO: 19).
• · · ·;· 25
MM
;***: Ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB 129-geenin (defensiini-beeta-129)
IVSl-13_-12insCTC-muunnoksen genotyypitykselle SNaPShot-reaktiossa oli: 5’-TTT
: TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GCT CAATGGCTTTCT CT-3’ ·· » • · · (SEQ ID NO:56). Snapshot-reaktiossa deleetio-CTC-alleeli havainnoidaan T-nukleotidina, 30 kun taas insertio-CTC-alleelin läsnäolo havainnoidaan C-nukleotidina.
• · • · %
Aluke-ekstensioreaktion (snapshot-reaktion) jälkeen lisättiin 1 yksikkö SAP:a (USB) :\j reaktioseokseen ja reaktiota inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Entsyymi inaktivoitiin 16 1 1 8265 f inkuboimalla reaktioseosta 75 °C:ssa 15 minuuttia ja se sijoitettiin 4 °C:seen. Ekstension jälkeinen käsittely suoritettiin liittymättömien fluoresoivien ddNTP:iden aiheuttaman aluke-ekstensiotuotteiden (SNaPshot-tuotteiden) peittymisen ehkäisemiseksi ABI Prism 3100 Genetic Analyzer-laitteella suoritetun elektroforeesin aikana.
5 ADRA2B-insertio/deleetiopolymorfismin DNA-fragmenttianalyysi
ADRA2B-geenin insertio/deleetiopolymorfismi koskee kolmen glutamiinihapon (Glu) insertiota tai deleetiota 12 Glu-aminohapon alueessa kodoneissa 298 - 309. Siten alleelista 10 riippuen ADRA2B-lokuksessa on joko 9 Glu:ta (deleetio, muunnosmuoto) (SEQ ID
NO:20) tai 12 Glurta (insertio) (SEQ ID NO:22). Riippuen siitä, oliko monistetulla alleelilla insertio vai deleetio tutkitussa lokuksessa, PCR-tuotteen koko oli 91 bp (insertioalleeli) tai 82 bp (deleetioalleeli). Homotsygooteilla (insertio/insertio tai ? deleetio/deleetio) havaittiin vain yhden kokoinen fragmentti, joko 91 bp (insertio/insertio) 15 tai 82 bp (deleetio/deleetio). Heterotsygooteilla havaittiin molemmat edellä mainitut fragmentit.
PCR-monistus toteutettiin 20 μ1:η tilavuudessa: reaktioseos sisälsi 40 ng ihmisen genomi-DNA:ta (uutettu perifeerisestä verestä), IX PCR-puskuria (QIAGEN), 200 μΜ kutakin 20 nukleotidia (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 pmoolia ADRA2B-PCR-alukkeita ja 2,0 , , yksikköä Hot Start Taq -DNA-polymeraasia (QIAGEN). Ensin reaktiota pidettiin 7 « · i • ·· .* .* minuuttia 95 °C:ssa, sen jälkeen seuraavat kolme vaihetta toistettiin 35 syklin ajan: 45 • a · • · · ]!!,* sekuntia 94 °C:ssa, 45 sekuntia 54 °C:ssa, 1 minuutti 72 °C:ssa, minkä jälkeen reaktiota * · V,',' pidettiin 72 °C:ssa vielä 5 minuuttia ja sen jälkeen pidettiin 1 minuutti 10 °C:ssa ja « * *]·. 25 säilytettiin 4 °C:ssa PTC-220 DNA Engine Dyad -PCR-laitteessa (MJ Research).
·*·· *·« • · • · * · · PCR-alukepari ADRA2B-geenin (alfa-2B- adrenerginen reseptori, Locus link ID: 151)
. insertio/deleetiopolymorfismin monistamiseen oli seuraava 5’-GGG TGT TTG TGG
GGC ATC TC -3’ (SEQ ID NO:24) ja 5’- TGG CAC TGC CTG GGG TTC A -3’ (SEQ
• * · ^ . 30 ID NO:25). Fluoresoiva leima on lisätty toisen edellä mainitun PCR-alukkeen 5’-päähän.
• *
Siksi PCR-fragmentti on havaittavissa ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteella • · ; (Applied Biosystems) toteutetussa kapillaarielektroforeesissa.
• · · • « * * * Kapillaarielektroforeesi ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteella 118265 17
Yhdistettyjen SNaPshot-tuotteiden 1 μ1:η eriä, 0,5 μΐ ADRA2B-PCR-tuotetta, 9,25 μΐ Hi-Di-formamidia (Applied Biosystems) ja 0,25 μΐ GeneScan-120 LIZ-kokostandardia .¾ (Applied Biosystems) yhdistettiin 96-kuoppaisessa 3100 optical microamp -levyssä 5 (Applied Biosystems). Reaktiot denaturoitiin asettamalla ne 95 °C:seen 5 minuutiksi ja sen jälkeen ne lisättiin ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteeseen (Applied Biosystems). Elektroforeesin mittaustulokset käsiteltiin ja genotyypit tehtiin näkyviksi käyttämällä GenoTyper Analysis-ohjelmaa, versiota 3.7 (Applied Biosystems).
10 Uusien mutaatioiden tunnistaminen ihmisen beetadefensiinigeeneistä Käytimme hierarkkista, fenotyyppikohdennettua sekvensointimenetelmää (katso WO -i 02/074230) uusien mutaatioiden löytämiseksi beetadefensiini-1-geenistä. Koska defensiinien tiedetään toimivan infektioita vastaan suojaamiseksi, esitettiin hypoteesi, että 15 kohteilla, joilla oli usein toistuvia infektioita, olisi alentuneita, ja kohteilla, joilla oli harvempia infektioita, olisi korkeita tai normaaleja kehon defensiinitasoja ja -aktiivisuuksia. Sekvensointiin valittiin 48 Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor ^
Study (KIHD)-tutkimuksen tutkittavaa, joilla oli suurin määrä respiratorisia ja virtsainfektioita edeltävinä viitenä vuotena, ja 48 sukupuoli-ja ikäsovitettua kohdetta, 20 joilla ei ollut respiratorisia eikä virtsainfektioita edeltävinä viitenä vuotena. Sekvensoimme „ viisi erilaista defensiini-alfa-geeniä(DEFAl, DEFA3, DEFA4, DEFA5 ja DEFA6) ja • »« kuusi erilaista defensiini-beeta-geeniä (DEFB1, DEFB103, DEFB4, DEFB118, DEFB126 • · · ,·'·! ja DEFB129).
* · • · · .
··· · • · * · · 25 Sekvensoinnissa havaitsimme viisi mutaatiota DEFA5-geenissä (DEFA5 IVS1 +1980T, DEFA5IVS1 +243G>C, DEFA5 Arg71Cys [rs7839771], DEFA5 3'UTR+109A>G ja DEFA5 3'UTR +1680T).
« • · a • 1 · ··· • · · • · "1 DEFB1-geenissä havaitsimme viisi mutaatiota (DEFB1 5'UTR-52G>A [rsl799946], 30 DEFB1 5'UTR-44C>G [rs 1800972], DEFB1 5'UTR-20A>G [rs 11362], DEFB1 IVS1+19T>A [rs2293958]jaDEFBl 3'UTR+5A>G [rs 1047031]).
• · · : • · · • · a · f 1 · • · · • · 18 11 8265 DEFB2-geenissä havaitsimme kolme mutaatiota (DEFB2 5'UTR-108T>C [rs2740086], DEFB2 T>C Pro29Pro [rs2740090] ja DEFB2 3'UTR+164G>A [rs2737531]).
DEFB118-geenistä havaitsimme yhden mutaation (DEFB118 T>C Cys34Arg).
5 DEFBl26-geenissä havaitsimme kaksi mutaatiota (DEFB126 deleetio CAAA163_ 166 lukukehyksen muuttuminen ja DEFB126 deleetio CC317_318 lukukehyksen muuttuminen).
10 DEFBI29-geenissä havaitsimme viisi mutaatiota (DEFB129 5'UTR-^41G>A [rs2298149], DEFB129 5'UTR-27T>C [rs2298148], DEFB129IVS1-680T [rs6074833], DEFB129 IVS1-13_-12insCTC ja DEFB129 A201G synonyyminen Leu67Leu:lle).
Edellä mainituista defensiini-alfa- and defensiini-beeta-geenimuunnoksista 9 (yhdeksää) ; 15 seuraavaa ei ole raportoitu aikaisemmin: DEFA5 IVS1+198 OT, DEFA5 IVS1+243 G>C, DEFA5 3’UTR+109 A>G, DEFA5 3’UTR+168 OT, DEFB129 lVSl-13_-12insCTC, DEFB 129 A>G leu671eu (CTG67CTA), DEFB118 T>C Cys34Arg (TG34CGC), ' DEFB 126 eksoni 2 deleetio c.163_ 166delCAAA ja DEFB126 eksoni 2 deleetio . . c.317 318delCC.
• « · — « 20 • · · • · · [···[ PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFA5-geenin (defensiini-alfa-5) IVS1+198 1 • · .···, C>T -muunnos (seuraavassa sekvenssissä, [SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8)] substituutio • · • « · sijaitsee asemassa 553) monistamiseen oli seuraava: 5’- AGA AAG AGG AGC ATC AAA !·*·. G -3’ (SEQ ID NO:9) ja 5’- TCA AGC CTA TTA GCC TAC A -3’ (SEQ ID NO: 10).
25 Sekvensointialuke oli: 5’ - TCA GGT CTT CTC CCA GCA (SEQ ID NO:26) ! ··· • · · ··· :***· PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFA5-geenin (defensiini-alfa-5, Locus link
.,[.: ID:1670) IVS1+243 G>C -muunnos (seuraavassa sekvenssissä, [SEQ ID NO:7, SEQ ID
# ·
NO:8)] substituutio sijaitsee asemassa 598) monistamiseen oli seuraava: 5’-AGA AAG
• · 30 AGG AGC ATC AAA G -3’ (SEQ ID NO:9) ja 5’- TCA AGC CTA TTA GCC TAC A -3’ • · ·
Y [ (SEQ ID NO: 10). Sekvensointialuke oli: 5’ - TCA GGT CTT CTC CCA GCA (SEQ ID
** " KO:26) ' 19 118265 PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFA5-geenin (defensiini-alfa-5, Locus link ID:1670) 3TJTR+109 A>G -muunnos (seuraavassa sekvenssissä, [SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28] substituutio sijaitsee asemassa 515) monistamiseen oli seuraava: 5’- GGA TGA 5 AGC AGA ATG AAG A -3’ (SEQ ID NO:29) ja 5’- AAA GGA ACC ATA CAA ACC A -3’ (SEQ ID NO:30). Sekvensointialuke oli: 5’ - GTT AGT CTG GCT GTG CTT - 3’ (SEQ ID NO:31).
PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFA5-geenin (defensiini-alfa-5, Locus link 10 ID: 1670) 3TJTR+168 OT -muunnos (seuraavassa sekvenssissä, [SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28] substituutio sijaitsee asemassa 574) monistamiseen oli seuraava: 5’- GGA TGA AGC AGA ATG AAG A-3’(SEQ ID NO:29) ja 5’-AAA GGA ACC ATA CAA ACC A -3’(SEQ ID NO:30). Sekvensointialuke oli: 5’- GTT AGT CTG GCT GTG CTT - 3’ (SEQ ID NO:31).
15 PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB129-geenin (defensiini-beeta-129,
Locus link ID: 140881) IVSl-13_-12insCTC -muunnos (seuraavassa sekvenssissä, SEQ ID ;
NO:32, insertio on asemassa 444-446) (SEQ ID NO:33) monistamiseen oli seuraava: 5’-GGC TAC TGA GTT TGG TGA -3’ (SEQ ID NO:34) ja 5’- GTG TTT ATT GAA TGA 20 CTG ATG -3’ (SEQ ID NO:35). Sekvensointialuke oli: 5’ - CAA GGA AGG CAG ACT
. . ΑΑΛ - 3’ (SEQ ID NO:36).
• · · • · · * · • · • * · *",* PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB129-geenin (defensiini-beeta-129, •
Locus link ID: 140881) leu671eu (CTA67CTG), A>G -muunnos (SEQ ID NO:37) (SEQ ID
* ·
"I 25 NO:39) monistamiseen oli seuraava: 5’-GGC TAC TGA GTT TGG TGA-3’(SEQ ID
NO:34) ja 5’- GTG TTT ATT GAA TGA CTG ATG -3’ (SEQ ID NO:35).
Sekvensointialuke: 5’ - CAA GGA AGG CAG ACT A AA - 3’ (SEQ ID NO:36).
• * · • * » ·**·.( ,··*. PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB118-geenin (defensiini-beeta-118, • *
30 Locus link ID:117285) Cys34Arg (TGC34CGC), T>C-mutaatio (SEQ ID NO:41) (SEQ ID
»···*
. NO:43) monistamiseen oli seuraava: 5’- AGG TTG AGT ATT TGC CAG AC -3’ (SEQ ID
• · · · · NO:45) ja 5’- AGG ACA GGG GTG AGT GAT A -3’ (SEQ ID NO:46).
··· : Sekvensointialuke oli: 5’ - AGG TTG AGT ATT TGC CAG AC - 3’ (SEQ ID NO:45).
• * t * · • · 20 ' 118265
PCR-alukeparin nukleotidi sekvenssi ihmisen DEFB126:n (defensiini-beeta-126, Locus link ID:81623) eksoni 2 deleetio c,163 166delCAAA (SEQ ID NO:47) (SEQ ID NO:49) monistamiseen oli seuraava: 5’- AAT GGT GAG AAA GAT G AC AG -3’ (SEQ ID NO:51) ja 5’- GTT GAA TGG AGG GAA AGT -3’ (SEQ ID NO:52). Sekvensointialuke I
5 oli: 5’ - GTA GGT ATT TAT GAT TAG - 3’ (SEQ ID NO:53). Tämä mutaatio johtaa muutokseen DEFB126-geenin proteiinin aminohapporakenteessa aminohappokodonista 55 ja lopuksi epäkypsään STOP-kodoniin aminohapposeamassa 82 (SEQ ID NO:47).
PCR-alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DEFB126-geenin (defensiini-beeta-126,
10 Locus link ID:81623) eksoni 2 deleetio c.317_318delCC (SEQ ID NO:54) (SEQ ID
NO:49) monistamiseen oli seuraava: 5’-AAT GGT GAG AAA GAT GAC AG-3’(SEQ ID NO:51) ja 5’- GTT GAA TGG AGG GAA AGT -3’ (SEQ ID NO:52). j
Sekvensointialuke oli: 5’- GTA GGT ATT TAT GAT TAG - 3’(SEQ ID NO:53). Tämä mutaatio johtaa myös DEFB126-geenin muuttuneeseen aminohapporakenteeseen 15 aminohappokodonista 106 (SEQ ID NO:54).
AMI:n ia CHD:n riskin testaaminen
Riskitekijöitä MI:lle ja sepelvaltimotaudille tutkittiin KIHD-kohortissa. Lyhyesti, "Kuopio ; 20 Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study" (KIHD) on prospektiivinen väestötutkimus , , miehillä Itä-Suomessa (Salonen 1988, Tuomainen et ai. 1999). KIHD:n tutkimuskäytännön * · · 4 «· hyväksyi Kuopion yliopiston tutkimuseettinen komitea. Tutkimusnäyte käsitti iältään 42, • · · * 1 * *!!,1 48, 54 tai 60 vuotta olevia miehiä Itä-Suomesta. Yhteensä tutkittiin 2 682 miestä 1984 - 89 :
• · V
• « t'V·' aikana. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen, tietoihin perustuvan suostumuksen.
• * 25 Sepelvaltimotapahtumien seurantaa suoritettiin 2001 loppuun, mikä sai aikaan keskimäärin * 1 * 1 .···, 14,4 vuoden seuranta-ajan. Genotyypitykset suoritettiin noin 1 600 miehelle, mistä aiheutui • · • * 1 yli 23 000 seurannan henkilövuotta. i • · * • · · * 1 · ;***. Tulokset CHD:stä ja AMI:sta seurannan aikana hankittiin tietokoneyhteydellä kansalliseen, *·1 30 tietokoneelliseen sairaalasta kotiinpääsyrekisteriin. Diagnostinen informaatio kerättiin * 1 tttt· sairaaloista ja kaikki sydänkohtaustapahtumat luokiteltiin tiukkojen, ennakkoon 7 • · määriteltyjen kriteerien mukaisesti. Akuuttien sepelvaltimotapahtumien diagnostinen i · i *;1 ] luokittelu perustui oireisiin, elektrokardiografisiin löydöksiin, kardiaalisten entsyymien • · 1 • · 1 1 kohoamisiin, autopsialöydöksiin ja CHD:n historiaan. Kukin epäilty 21 1 1 8265 sepelvaltimotapahtuma (ICD-9-koodit 410 - 414 ja ICD-10-koodit 120 -125) luokiteltiin 1) selvä akuutti sydäninfarkti (AMI), 2) todennäköinen AMI, 3) tyypillinen, yli 20 minuutin akuutti rintakipuepisodi, joka osoitti CHD:n, 4) iskeeminen, kardiaalinen pysähdys onnistuneella elvytyksellä, 5) ei akuuttia sepelvaltimotapahtumaa tai 6) ei luokiteltavissa i 5 oleva kohtalokas tapaus. Kategoriat 1) - 3) yhdistettiin esillä olevaa analyysiä varten merkitsemään MI:tä. Analyysissä käytetystä 1 548 mieskohteesta, joista oli täydelliset tiedot, 256 miestä kehitti AMI:n seurannan aikana.
Hypertensio määriteltiin joko systolisena verenpaineena (BP) > 165 Hgmm tai diastolisena 10 BP > 95 Hgmm tai antihypertensiivisenä hoitona. Hoitaja mittasi molemmat verenpaineet aamulla random-zero-elohopeaverenpainemittarilla. Mittauskäytäntö sisälsi kolme mittausta selällään, yhden seisovassa ja kaksi istuvassa asennossa viiden minuutin välein.
Kaikkien kuuden mittauksen keskiarvoja käytettiin systolisina ja diastolisina verenpaineina. CHD:n perhehistoria määriteltiin positiiviseksi, jos kohteen joko äidillä, 15 isällä tai sisaruksilla oli AMI:n tai angina pectoriksen historiaa. Serebrovaskulaarisen aivohalvauksen ja diabeteksen perhehistoriat määriteltiin samalla tavoin. Aikuisuuden sosioekonominen asema (SES) on indeksi, joka koostuu koulutuksen, työn, tulojen ja aineellisten elinolojen asteista. Asteikko on käänteinen alhaisen pistemäärän vastatessa korkeaa SES:ä. Nämä tiedot on kerätty itse annetulla kyselylomakkeella. Seerumin f 20 ferritiini määritettiin kaupallisella kaksoisvasta-aineradioimmunomäärityksellä (Amersham . , International, Amersham, UK). Lipoproteiinit, mukaan lukien korkean tiheyden • * · * * .* .* lipoproteiini (HDL)ja matalan tiheyden lipoproteiini (LDL), erotettiin tuoreista | • · · ' ' ·'. A*.
seeruminäytteistä ultrasentrifugaatiolla, jota seurasi hyvin matalan tiheyden lipoproteiinin • t t ''*t (VLDL) välitön poistaminen ja LDL:n saostaminen. Kolesterolin konsentraatio määritettiin • · « · ,·. 25 sen jälkeen entsymaattisesti. Seerumin C-reaktiiivinen proteiini mitattiin kaupallisella, *9·· ,*··. hyvin herkällä immunometrisellä määrityksellä (Immulite High Sensitivity CR Assay, • · ··· DPC, Los Angeles). Paraoksonaasi 1-ja HFE (HLA-H) -mutaatioiden genotyypitys on . kuvattu muualla (Salonen et ai. 1999, Tuomainen et ai 1999).
• * · • ·· • * » * ·*· 30 Beetadefensiini-1-geenissä, 3'UTR+5:ssä, genotyypitetystä 1 548 miehestä 165 oli AA- • · homotsygootteja, 690 heterotsygoottejaja 693 GG-homotsygootteja. GG-homotsygooteista • · 19,0 % (132 miestä) kehitti ensimmäisen AMhnsa seurannan aikana verrattuna 14,5 %:iin • · * . (124 miestä) muista miehistä (vaarasuhde 1,39, 95 %:n CI 1,06 - 1,82, p = 0,017).
« · * i «·
Logistisessa rnonimuuttujamallissa, jossa kontrolloidaan voimakkaimpia muita 22 1 1 8265 kovariaatteja, vastaava sovitettu vaarasuhde oli 1,35 (95 %:n CI 1,01 -1,80, p = 0,044, taulukko 1). GG-genotyypin ja AMI:n riskin välisellä yhteydellä oli taipumus olla voimakkaampi miehillä, joilla ei ollut aikaisempaa CHD:n historiaa (vaarasuhde 1,44, 95 %:n CI 1,04 - 2,00, p = 0,030), kuin niillä, joilla oli aikaisempi CHD (vaarasuhde 1,32, 95 5 %:n CI 0,81-2,17, p = 0,314).
Muut geenimutaatiot, jotka ennustivat AMI:a logistisessa mallissa, olivat deleetio/insertio alfa-2B-adrenergisen reseptorin geenissä ja Thr98Ile-SNP apolipoproteiini B-geenissä (taulukko 1). AMI:n ennustetta lisänneet fenotyyppiset tiedot olivat ikä, minkä tahansa 10 ateroskleroottisen sairauden historia, tupakoinnin savukevuodet, CHD:n ja diabeteksen perhehistoria, tyypin 2 diabeteksen läsnäolo ja seerumin kokonaiskolesteroli ja korkean tiheyden lipoproteiini (HDL) -kolesteroli (taulukko 1). Näistä 12 muuttujasta muodostettiin empiirinen, binäärinen, logistinen funktio (taulukko 1). Väestöstä johtuva riski, joka laskettiin riskipistemäärän kvintiilien kautta Miettinen OS:n mukaisesti, oli 0,76.
15 Vaarasuhde kvintiileille (matalin vertailuna): 12.8, 95 %:n luottamusväli (CI) 7.2 - 22.9, 6.4 (3.5 -11.5), 2.4 (1.3 - 4.6) ja 1.5 (0.8 - 3.1). Kun ennustetussa todennäköisyydessä (pistearvo) käytettiin 0,2:n jakoa, vaarasuhde oli 5.3, jossa 95 %:n CI oli 4.0 - 7.0, pO.001.
20 Analysoimme myös AMI:n riskin ennusteen viiden vuoden sisällä perustason . , tutkimuksesta geenimutaatioiden ja fenotyyppitietojen avulla (taulukko 2). Toinen • * · ,* .* beetadefensiini (DEFB129) -SNP, joka sijaitsi IVS1-13 -12insCTC:ssä, oli AMI:n • · · .
• · voimakas ennustaja. Insertio-CTC-alleelin kantajilla oli 2,3-kertainen AMT.n riski (95 %:n t · "•'m CI 1,4 - 3,9, p = 0,002). Myös apolipoproteiini B:n Thr-homotsygoottisuus ennusti AMI:a • · M* 25 voimakkaasti ja alfa-2B-adrenergisen reseptorigeenin deleetiohomogeenisyys melko * • * · * .··, voimakkaasti. Fenotyyppi ti edot, jotka ennustivat AMI:a viidessä vuodessa, olivat ikä, • * * · · minkä tahansa ateroskleroottisen sairauden historia, tupakoinnin savukevuodet, . hypertension läsnäolo, kolesterolia alentavan lääkityksen käyttö, CHD:n ja diabeteksen • * * perhehistoria, vyötärön ja lonkan ympärysmitan suhde ja seerumin kokonaiskolesterolin ja • · * tm\t. 30 korkean tiheyden lipoproteiini (HDL)-kolesterolin ja ferritiinin konsentraatiot. Kun • · käytettiin ennustetun todennäköisyyden oletusjakoa (0,50), malli ennusti oikein 95,5 %:a • * havaituista AMI:sta. Kun käytettiin ennustetun todennäköisyyden 0,2:n jakoa, vaarasuhde a a * ; . oli 11,1, jossa 95 %:n CI oli 5,9 - 21,2, p < 0,001.
··· • · · * * 23 1 1 8265
Analysoimme myös AMI:n ennustajat miehillä, joilla oli CHD:n perhehistoriaa (taulukko 3). Samat kolme mutaatiota ennustivat AMI:a. Kyselylomakkeen mittauksista voimakkaimpia ennustajia olivat CHD:n historia kohteella ja hänen sosioekonominen asemansa. Biokemiallisista mittauksista ennustavimpia olivat seerumin ferritiinin ' 5 konsentraatio (luokiteltu kahteen luokkaan), seerumin C-reaktiivinen proteiini, seerumin LDL-kolesteroli ja seerumin HDL-kolesteroli (suojaava). Kun käytettiin ennustetun todennäköisyyden oletusjakoa (0,50), malli ennusti oikein 94,0 %:a havaituista AMLsta.
Kun käytettiin ennustetun todennäköisyyden 0,2:n jakoa, vaarasuhde oli 8,2, jossa 95 %:n CI oli 4,0- 16,8, p< 0,001.
10
Toisessa tilastollisessa analyysissä analysoimme AMI:n ennustajat kahden vuoden sisällä riskitekijämittauksista (taulukko 4). Paraoksonaasi 1-geenin Leu54Met-mutaatio ja HFE (HLA-H) -geenin Cys282Tyr-mutaatio olivat voimakkaimmat AMI:n geneettiset ennustajat. Muita, ei-geneettisiä ennustajia esitetään taulukossa 4. .
15
Esitämme siten tässä ihmisen defensiinigeenin, kuten ihmisen beetadefensiini-1- ja -129- geenien, genotyypitysmutaatioihin perustuvan uuden geneettisen testin valinnaisen monimuuttujamallin kanssa, joka ennustaa tulevan sydäninfarktin oikein hyvin tietosarjassa, josta ne oli johdettu. Keksintömme ja sitä tukevan empiirisen näytön 20 perusteella ihmisen beetadefensiinien mutaatiot ovat yhteydessä AMI:n ja CHD:n . lisääntyneeseen riskiin sekä terveillä henkilöillä että niillä, joilla on CHD:n perhehistoriaa.
• 1 ♦
Siten ensimmäistä kertaa osoitetaan, että defensiinit liittyvät AMI:iin ja CHD:hen ja että • · 1 ."·! defensiinigeenissä oleva mutaatio voi olla tilastollisesti merkittävä riskitekijä AMPlle ja • · .···. CHD:lle.
• · • 1 · 25
Iti • · · · .1··. Kun muutamien tärkeiden mutaatioiden tieto yhdistetään fenotyyppisen tiedon kanssa, • · · monimuuttujariskiennustemallin ennuste tehostuu. Etuna on, että vain pieni joukko ; genotyypityksiä ja biokemiallisia tai muita mittauksia tarvitaan suorittaa ja hyvin lyhyt itse ·1· annettu kyselylomake tarvitaan täyttää. Riskimalli voidaan arvioida/muodostaa seurannan • · · 30 erilaisille pituuksille, mikä mahdollistaa niiden käytön erilaisiin tarkoituksiin.
• · * ·····'.
• · ···'.
• · 1 * · · · • 1 · • ·· • · 118265 ;> ^ MOiriTt^rScSOO^-i^^rO Ρ οο \ο o tq -h tq ο^ »η (sq-t^ ö I Ν Ή* « Μ* ρί (N ^D — Ο ο° Ö —Γ SO VO Γ-"' </"Γ ιτΓ θ' Os fT OS so ^ ο ^ σγ σ> ο^ ^·„ on ^ ^ q ο ν OS γ3 >—Γ Ψ-* θ' o' ** I—Γ t—Γ —I — I—I ι-Γ θ' ο —---------— ----------- Λ Μ
‘3 4J
γ- Ό s S rt 5 l5 *** SS ui v> \D m oo O o M h m m P ctf CO Γ-- r^) O On O On ^ (N P“
^ I> rS --Γ ^ rS i-H ^-1 ^-Γ ΓΠ -h" O
C ---------------------
PJ
s 't oo Γ' oo — o n o ^ n Λίίί-.'^-ΟΟΟΌΟΟοΟοΟοΟ O =? o O O O o o O o' ° θ' Ö ' X Cu o' o' o' o' V V o V o V o o Ό —---------—--------- <n rs
1¾ SO O
Γ3 m -- 00 t> VO o «O Ό CJ\ ., S W — m —' rs —i 0" -q —r rs o rq g oo o' o" o" o" o' o" V d o ό o' o’ § B ^ B β | .a o ·«+
CfcJOVO'-iOvooOsO^foomcNoo e u rq lt> m q o Ό θ__ sq rs r- | rs -3 o" o" o' o' o' o' o' o ö —' o' , ζΛ---—----—------- '5b 0 u — Π g o o - λ O ο ΰ h
1 3 £ 2 H
P ^ <u «ϋ O
.·. : a o <£ 5 ^ o ·. *: « '-3 ± .2 .2 “ • · «s 3 e £ Ή s :.:: s = p ^ £ 1 << < <<c<< .···. -g S ?o 5 £ H £ fc fc • * .2¾ .— --------------
'** B
··· ^ C/3 : : oo > * * · ^d“ ,_4 • ^ g oi ~ cd ~ , *:* ~ > .2 > g ~ ^ .***. w 5 ω ' q '—' a -¾ II c« o ό 2 rt o Bo ... ω § ω W Ο ·- £ eg Ν2 Μ) 3 0/ £? Ο Ο .Ο ^ ο 5
I £ Έ X £ .2 * ^ 5 ’ο - I
• ί ο 2 2 2 Λ > ·β “ cö ä S- ::: g o a.s, S c -;g . ^ > o w ·*· V ϋ & ί i2 *iö il -
: : « ^ H H g 7 g S .«> ts S
··* id O c _ c ^ £ S 2 ....: -C W g =! P O ^ ΕΛ 3 " ö M ^ ^ 2 * * B '£?££?« 1X1 H « g §3 H -g 9 - • M .λ örtfe>-p s B s? ϊ » c 'ΐ "’" 5 s a r* p -B :§ ·ΰ V > 2 -a s j Ä := a -S S3 o ΰ 'rt' o * · · ö Pr^PbnS *2 ® ϋ ·β -cö ^ * oo :-:: 11 « Λ»*?* lä lisiin s·
:··.: il Io?f^ii&ol! 1-351111 -S
Se ωΡ^§^·§Ε.3^20||-ίΕΐ.2.3^^ J
H PJ ffl E < m < ^|< p ää <d ‘u c« 2 up O w w !> = 1 1 8265 ♦ 1-^ 1g > <n m oo t—i o in o i—i <js so o ττ o o o © 3 oo_ ^ ^ r-n ^ o O <3 »n <N eS^ C S en (ν' r-t ι-h en tN —" G-" ri es —Γ —Γ ^
vO C * r il *\ e, G" I
o'- G O in G es in O ^ Οι M m iO if \o r- JS Ifl O ΓΟ C-; O o © ©^ en OO On 0Λ « q -g
*3 © M <-* θ' —Γ —Γ 1-H o" o" ^ 0' —1 ö o‘ S
G -—-------------— ‘3 U ä •5» „ J - 1 ·§ ε g p =? .SS ^ ^
Sc3 O G ^-i oo in oo o es es es in © G G m y g m en G O >—iOinOm^t-in-Η·^·!—i ©
Cl n ι\ «s λλ *n η#ι γ ι' r r, r r.
C N H m rt M H HM (S| rt l^ H o h C
C -----.--——-------------'S
U -Li .s i cg +j 5?? es — rtH ioo t-' r-· o en es es en o g > oCotso—1 oenoooooGGi—'cn\ö . M «s ©η en <© o « —1_ Or r| O —r — Or g
> o. o o <©" o' o o o o o" o o o' o' θ' H
tn Ö g « S oo oo S" (N h in r~- oo in O '«f oo es es o <u o o r- en r— <n ^ oo r- G -h « o ™ ^-v W r-j es en o es Or es^ θ__ es es en — in o^ 2 3 g M OOOOOOOOOOOOO© jj .* _ " | 5
. . . 2 S
S +- 2 -Gi ö g _g Ö CO T3 ö c c
G ’ — OO G
5jp-*inr-'Ooiocsi>GenmenG^H'-jy4 onfc m © es t--o i> G es g <n t-- oo m p g cu oo es es„ ©^ o G^ ©_ oo m i> i-^ - ^ Ö es GJ M o" o” rtrt" o' o' o" o" o" o' o' O O , o' "tn
2-- I
ΐ S' 13 lii! Λ ti ^ ^ o t> B j t— o 5: tn © o ω £ ? SO en (u O p
.·. : Co .5 5 ϋ H
*· " .2 '-g £ .9 s -a : .*, © G -H i 3 S led :: : 5 g ^ rn S ^ <j < C < C <i C < C < < -g * | 2 h fc £ ^ Z Z Z Z Z, X 3 **··· _§--------- T3
.***. 4J « S
··:* ε ·|> :g s *" ^ s .2 > ?. s ω ‘s § i
**··: g g "o 8 -g g s S s ε § | -s S
I .2 3 oo § s O C n5oä§ JjO.
3 1 -c a -a i G -I c' öwo a I V
. .*. g e S g -2>sS'Saea^r£^3
* * ^ Λ, 3-2 . S*, ‘JTt CL ^ 53 w S —h IS QJ
·:· I y. ctrg .s e e"! =esi »g as .··.: I , lit S ||?ί ls?|8o
,rt Cj 00 · M cE“S§:Goi3-Gg'C^C
i-H C/3 _, fl) PO CS k> Tf\ e—' P '3
....: ^ .Λ o > g S ^ p Ti-g S S S c \ 'o -1 .S
S -.S I Ή :S ui « G I Ö c | Q Έ 2 u .*:*. ^ | g o H a H ’Sg-S-S, -s * -1 *.·· s·^ a 23 s-8cc ^-^εεεε g -g *·. : 1g i 3 S a .& g| ^ s « « s " ϊ s s ^ **·: Ί g gSc^g^U^S 1^1 §Ö3 s 3 3 3 Jp
Ctf G <D rr.^ o Ό «J =r ri *j Q <D <D <U .P s>
H W ffl ><G<; B^-i'utziBK^'H'UQiicowM >"G
1 1 8265 d — Ο :Λ q > •2 2 «n oo in ^ ^ ο η γλ
5b ö c m" K φ h m h h -ι ιλ ίο vO ^ Λ *- Λ Λ "V
" o^titNOOrnOOONfNONro to ra ^ o o\ γί n e-^ o^ oo oo —^ a\ ra- -n § a\ £ o — —Γ —Γ —Γ o o o' o' —2 -2 to —--------—--g 3 ra ¢3 <L) -0 <U *-p d ? 3 ä? C C/5 _ ctf cti O, .-¾ JSra-oOo-ioora- — -ηγ-γ-- ra- ra 13 't 'Ί " o. ^ ^ ° ^
C P —· ri m tn —Γ —Γ o" R r-Γ C
ra -_—_--,--_—.---— —---Έ
S M
S O
p ^ ’S
S Sor^'ra-OfO'st'itTrotN >
“ CosO—iOvO(nCNOO\0 VC
H ra o O O o" O ’“t <N hh ©^ ©^ m a & o' o" o" V o' o" o' o" o' o' g Ä -------------n < ω
^ t^ONOir'CNCOO^tOOO O
W rT^ ts m Ό rn rf «N n ra- m m J2 t-M ro rä"^ m o m —i^oom ,¾ ,.
5 CO o' CD o" o' o" o' o" o" o" o" ^ d -p
SP
cä H
• *-N *"*
0 U
^ ^™s c
:cd _Q G
ζΛ W' ^
<Λ . S
<ϋ tC g -g o «n o ooifNO^mr' ^ q H vi p- m in^o\o\«)^Oph ra o E «j «Ί R a, R R - S' o o g (N _ M O O ·—< hh o O O ι © h-i 'm ^ra -----————— .-.111--ra r- ^ g ra u -ö eo - a a > P vp t> ^ g H ω *3 ro 1 o « e =9 I „ '3 .g & g : *.: ° .2 a ^ “ .;: : .*. -c J R ' ι ^ “ « ·*· · o ‘Eo ."*. .S 2 a T £ H Y. Y. 4. <L /L 7, • · J3----„----------- 33 ··* ω ra
·"*· -S rt S
C. ·£> .M > g ·:* R i o £ ^ t .***, S g ti °^a^i3g «C' ^ I -s a | s |§ I ja® 3 B a & I Ui & 3? s 3 f 1 |a ··· ö rS u o B ex .„ b g ra ra
... « P ro S ω w 43 ra: & « s tS
v i ^ αι i'ci u il il . ? uran 2 ? s m h λ m ^ ••"; ^SSwa,ra>“Ji>'^ -rg flä JN -Q) c. m £ G rt -S o -B ·= 2 ra ····: £ g " s>'s S s s I ,s g-ΰ | «> ^ .*:·. ^ f Λ 1 "S | 2 ^ § Ι ° κ ώ ^ 'Ξ' 9 “
y: il f 4®iS| =sä||fui II
* * g g S u^SogS'SP'uuSBra ^ § ra 2 S ^rnOoS-SpoariUiUlUIDira »2^2 PE il a ><jra<C E ϋ « I m M;/! k > > ra ^_ 1 1 8265 13 > ro ^ g »n cn ^ ^ tt o^ oo ö S oC ιλ « « >n w - ιλ i dig...... , . , λ ·ΐ
d^ctNtNr--oooa\oo\oo -K
.,_ o r-· m —< cn oo o o σ\ « ·- V I rt r% rs v% r> rt «\ r> rt #t ^ φ'Ν 1—H C~3 »—» < CT^b «----------— Ί ; S cd
Cd JS
ä"—i aj m .
Ό cd Λ d P P 0s ^ c/3 __ 5 g ^ .SaOinO—i m ιλ d oo d d o o ^ l· h t q m w o 2 ^ ^rttarariN nnri d S —----------"S' d d '° d *3 id o cd .<2 s -H 00 CO fN Ό O <—I O 00 >
Di)dOd\(N(NONrnooin-H \ö
O cp o rn O On O O^ On O S
“ Dh o' o" θ' θ' θ' θ' θ' θ' o' 2 >----------— d . . B " g OO O ^ Π rH n rj n ^ Η r < ^ oo h <n η μ σ\ JS '< Ö W ^ »ri m in ^ en g c/i o' o' o' cT o' cT o' o' o' '
c$_______ _ C
C — .rt
C3 S
.-¾ s .
ed w : c o> c
cd 00 P
d w dd i I d a * hpootoo^i^-d-oocN J2
S fc O Ch Ot —< I/Ί ON '«f —1 m P
m ^ ^ °i, 'T r-p oo ο_ η P ’ <N -‘'o' ^ ^ o' o' o" o" o' 73 £ p
§ I
< I
O +3 <5 ΓΊ cn . ,
Λ4 cd tJ- 00 O
. ^ W (N >s ·*· : r^i 3 § >, < -<<!<!<! <i <3 2 *· " d S z z z -s : .*. .¾ —---—-------— 13 i • · « Ο ,Ji • · · , i *H , d >0> rt C/3 * t · Λ :: :cd ‘c id £ 5 d~ Id ♦ ♦· 0) oo C Ö : : -s 3 & ύ ··♦ .2 ”o £ > β .:. g pp o-a S o a : ω <U ft u c3 a **·* r- · · S -n cd ζ ... oo ελ w ^ y d ^ :: m >>d,22 cd — ··· :cd icd cj m d ‘S 2 . 'i :td 3 "d Pi d ^ H ’rt _r :> a έ S3 5 v ’ •c g|i2 : a ‘g g ^ £ 1Ί a a :: m ^ > « o o s -d
··· o ‘d dT :cd 'S & ^-Γ O ;« S
. P :cdt3 • ? a 3 c g & « Λ οι j-
. 2 s -g -I ‘5 3 fe .g r- -S
·:** b - < 3 :¾ ^ « -3 :§ S -s ö .2 m -d Ο ω -c O ^ Ϊ « g hs?u'^c:§ ίί : Λ: a ϊ I if & i >| S B I 1-8 ···= li issipflgi! !i ,edd cdö-d-SS^^Z^PPicdL™^ H b S < O <! wÄ> wm > > Έ 28 118265 KIRJALLISUUS:
Bamathan ES, Raghunath PN, Tomaszewski JE, Ganz T, Cines DB, Higazi A al-R. Immunohistochemical localization of defensin in human coronary vessels. Am J Pathol.
1997; 150: 1009-20.
Bensch KW, Raida M, Magert HJ, Schulz-Knappe P, Forssmann WG. hBD-1: a novel beta-defensin from human plasma. FEBS Lett. 1995; 368: 33 l-5.Callen DF, Baker E,
Simmers RN, Seshadri R, Roninson IB. Localization of the human multiple drug resistance gene, MDR1, to 7q21.1. Hum. Genet. 1987; 77: 142-144.
Diverse Populations Collaborative Group. Prediction of mortality from coronary heart disease among diverse populations: is there a common predictive function? Heart 2002; 88: 222-8. ; ;
Dork T, Stuhrmann M. Polymorphisms of the human beta-defensin-1 gene. Mol Cell Probes. 1998; 12: 171-3.
Ganz T, LehrerRI. Defensms. Pharmacol Ther. 1995; 66: 191-205.
.·. : Hoover DM, Chertov O, Lubkowski J. The structure of human beta-defen sin-1: new • · · • · : insights into structural properties of beta-defensins. J Biol Chem. 2001; 276: 39021-6. · • · · · • φ ♦ • · . 1 • · • · ·
Jia HP, Schutte BC, Schudy A, Linzmeier R, Guthmiller JM, Johnson GK, et al. Discovery • · · * · · of new human beta-defensins using a genomics-based approach. Gene. 2001; 263:211-8.
• 1 · · * · • 2 · ·
Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, Hartmann J, et al. Expression of ·· j 1·· human beta-defensins 1 and 2 in kidneys with chronic bacterial infection. BMC Infect Dis.
2002; 2: 20.
·· · ♦ · 2 • · • · :3: Nedelcheva Kristensen V, Kelefiotis D, Kristensen T and Borresen-Dale: High- * · · .···. Throughput methods for detection of genetic variation. Biotechniques 30:318-332,2001.
• · # · · • · 2 • · 3 • 1 · 29 118265
Salonen JT. Is there a continuing need for longitudinal epidemiologic research - The Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study. Ann Clin Res 1988: 20: 46-50.
Salonen JT, Malin R, Tuomainen T-P, Nyyssönen K, Nissinen T, Lakka TA, Lehtimäki T. Polymorphism in the high density lipoprotein paraoxonase gene and the risk of acute myocardial infarction in men: a prospective population-based study. Brit Med J 1999; 319: 487-9.
Schutte BC, McCray PB Jr. β-defensins in lung host defense. Annu Rev Physiol. 2002; 64: 709-48.
Snapir A, Heinonen P, Tuomainen T-P, Alhopuro P, Karvonen MK, Lakka TA, Nyyssönen K, Salonen R, Kauhanen J, Valkonen V-P, Pesonen U, Koulu M, Scheinin M, Salonen JT.
An Insertion/Deletion polymorphism in the <X2B-adrenergic receptor gene is a novel genetic risk factor for acute coronary events. J Am Coll Cardiol 2001; 37: 1516-1522.
Syvänen A-C: Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms.
Nature reviews/ Genetics 2:930-942,2001
Tuomainen T-P, Kontula K, Nyyssönen K, Lakka TA, Heliö T, Salonen JT. Increased risk : of acute myocardial infarction in carriers of the hemochromatosis gene Cys282Tyr • · j .1 2 3. mutation: A prospective cohort study in men in Eastern Finland. Circulation 1999; 100:
!1"·! 1274-1279. V.· J
• · · • 1 · • 1 • · • · 1 ··· Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB Jr, Ganz T. Human beta-defensin- • · · · 1: an antimicrobial peptide of urogenital tissues. J Clin Invest. 1998; 101: 1633-42.
• · • · • 1· * · · • · * · * · · • · · • 1 « • 1 * 1 * · · • · • t · ····'·' • · · * · · · · t 1 2 • · 3 1 %
118265 I
SEQUENCE LISTING
<110> Oy Jurilab Ltd <120> Method for detecting the risk of acute myocardial infarction and coronary heart disease <130> 40597 <160> 56 ? <170> Patentin version 3.1 f: <210> 1 <211> 20 <212 > DNA .
<213> Artificial Sequence < 2 2 0 > ., <223> PCR primer <400> 1 cataatttca gcccgatgtg 20 <210> 2 , . <211> 20 • <212> DNA * · ; . <213> Artificial Sequence :.: : <22o> <223> PCR primer **··* <400> 2 ; caccctaacc ccctacttCt 20 • * * • · · • * · · ,··. <210> 3
*...· < 211 > 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence ··· <22 0 > *"* <223> PCR primer : : <4oo> 3 • · · • gggcttgctc tttctttc 18 • · · · · • * <2io> 4
*·" <211> 18 • <212> DNA
‘ <213> Artificial Sequence • · < 2 2 0 > <223> PCR primer 2 118265 f <400> 4 tccttggttc ctctcatc 18 <210> 5
<211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ctgagtgtgc aggacgag 18
<210> 6 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer ? <400> 6 cacattgcca aacacgat 18 <210> 7 ; <211> 736 l· ΐ
, <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 7 agaaagagga gcatcaaagg gatcttgaga acaaaggcag tccttcccct cccaatcaca 60 tgcccacctc ctctcactgc agcttctgtc tcaggtcttc tcccagcaga gctataaatc 120 caggctgact cctcactccc cacatatcca ctcctgctct ccctcctgca ggtgacccca 180 gccatgagga ccatcgccat ccttgctgcc attctcctgg tggccctgca ggcccaggct 240 • · • · · *. *; gagtcactcc aggaaagagc tgatgaggct acaacccaga agcagtctgg ggaagacaac 300 < • · ♦ · · • · « · · ·.£· ·*· * caggaccttg ctatctcctt tgcaggaaat ggactctctg ctcttagaac ctcaggtagg 360 • * • * Γ” agacatcaat cttgcacatc tgcaaaatct agaaaaaaag gattggagaa aggatctgga 420 • · • · • * · gtcaagtgtg gaaaggtcta cctcacttga gtgactttac ttaatcttcc tggaccttga 480 * »·** .***. ttttctcatc tataaattaa tcagtgagaa ccaaataaat ctaaaagatt ttcttttttc 540 • Il taagactttc agttccaaga tatttctgtg aaatttgcta cttttaagat agaaagacct 600 acactgacta gttctttgta gatctaaatg ggcagactta gttatataga gagtgtttta 660 • · * » · ·...* ctttgtccat tggaaaagct tttagaacct agagaggaac ctataggtgt gttttgatgt 720 * aggctaatag gcttga 736 ··· • · • · · , *. <210> 8 : : j <211> 736
<212> DNA
• * <213> Homo sapiens < 10 0 > 8
3 118265 J
agaaagagga gcatcaaagg gatcttgaga acaaaggcag tccttcccct cccaatcaca 60 tgcccacctc ctctcactgc agcttctgtc tcaggtcttc tcccagcaga gctataaatc 120 caggctgact cctcactccc cacatatcca ctcctgctct ccctcctgca ggtgacccca 180 gccatgagga ccatcgccat ccttgctgcc attctcctgg tggccctgca ggcccaggct 240 gagtcactcc aggaaagagc tgatgaggct acaacccaga agcagtctgg ggaagacaac 300 caggaccttg ctatctcctt tgcaggaaat ggactctctg ctcttagaac ctcaggtagg 360 agacatcaat cttgcacatc tgcaaaatct agaaaaaaag gattggagaa aggatctgga 420 gtcaagtgtg gaaaggtcta cctcacttga gtgactttac ttaatcttcc tggaccttga 480 ttttctcatc tataaattaa tcagtgagaa ccaaataaat ctaaaagatt ttcttttttc 540 taagactttc agctccaaga tatttctgtg aaatttgcta cttttaagat agaaagagct 600 acactgacta gttctttgta gatctaaatg ggcagactta gttatataga gagtgtttta 660 ctttgtccat tggaaaagct tttagaacct agagaggaac ctataggtgt gttttgatgt 720 aggctaatag gcttga 736 <210> 9 <211> 19 /¾
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 agaaagagga gcatcaaag 19 4 1 1 8265 <220> <22 3 > PGR primer , <400> 12 tgacttacct ggacatggct 20 <210> 13 <211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> Snapshot primer <400> 13 tttttttttt tttttctttt ttctaagact ttcag 35 <210> 14 <211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> Snapshot primer < 4 0 0 > 14 tttttttttt tttttttttg ctacttttaa gatagaaaga 40 <210> 15 <211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <22 °> <223> Snapshot primer <400> 15 tttttttttt tttttttttt tttttttagt gctgcaagtg agctg 45 . . <210> 16 ·,’·: <211> 50
: ,·, <212> DNA
t.I : <213> Artificial Sequence <220> |·· <223> Snapshot primer <4oo> ie *** tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttccagaga ggaagccttg 50 • * · * · · « * * * <210> 17 <211> 55
<212 > DNA
·;· <213 > Artificial Sequence <220> <223> Snapshot primer < 4 0 0 > 17 *;··; tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttc ttgctggcac ccaat 55 * * * e··.·.· * · ’·* <210> 18 : <2ii> so
*" I <212> DNA
*·**ί <213> Artificial Sequence <220> 4 118265 <223> Snapshot primer <400> 18 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttaccacga cgtcacgcag gQ <210> 19 <211> 30 '
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> Snapshot primer <400> 19 tttttttttt tttgaagacc agccagtgca 30 <210> 20 <211> 1344
<212> DNA
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (1344) ; <223> Coding sequence for variant human ADRA2B gene <400> 20 atg gac cac cag gac ccc tac tcc gtg cag gcc aca gcg gcc ata gcg 48
Met Asp His Gin Asp Pro Tyr Ser Val Gin Ala Thr Ala Ala lie Ala 1 5 10 15 gcg gcc ate acc ttc etc att etc ttt acc ate ttc ggc aac get ctg 96
Ala Ala lie Thr Phe Leu lie Leu Phe Thr lie Phe Gly Asn Ala Leu 20 25 30 gtc ate ctg get gtg ttg acc age ege teg ctg ege gcc cct cag aac 144
Val lie Leu Ala Val Leu Thr Ser Arg Ser Leu Arg Ala Pro Gin Asn 35 40 45 . ctg ttc ctg gtg teg ctg gcc gcc gcc gac ate ctg gtg gcc aeg etc 192 *. ·; Leu Phe Leu Val Ser Leu Ala Ala Ala Asp He Leu Val Ala Thr Leu : .·. 50 55 60 • · · • · · * ;***· ate ate cct ttc teg ctg gcc aac gag ctg ctg ggc tac tgg tac ttc 240 *** He He Pro Phe Ser Leu Ala Asn Glu Leu Leu Gly Tyr Trp Tyr Phe : : 65 70 75 80 * * * Φ ...Ϊ* egg ege aeg tgg tgc gag gtg tac ctg gcg etc gac gtg etc ttc tgc 288 .···. Arg Arg Thr Trp Cys Glu Val Tyr Leu Ala Leu Asp Val Leu Phe Cys '···* 85 90 95 , acc teg tec ate gtg cac ctg tgc gcc ate age ctg gac ege tac tgg 336 i4*i* Thr Ser Ser He Val His Leu Cys Ala He Ser Leu Asp Arg Tyr Trp *“! 100 105 110 * · • · • · · ' . gee gtg age ege gcg ctg gag tae aac tec aag ege acc ccg ege ege 384 ·"*: Ala Val Ser Arg Ala Leu Glu Tyr Asn Ser Lys Arg Thr Pro Arg Arg ... 115 120 125 • a • · • · · , *. ate aag tgc ate ate etc act gtg tgg etc ate gcc gcc gtc ate teg 432 .*.· : He Lys Cys He He Leu Thr Val Trp Leu He Ala Ala Val He Ser \ 130 135 140 • · · · · • · ctg ccg ccc etc ate tac aag ggc gac cag ggc ccc cag ccg ege ggg 480 6 Π8265
Leu Pro Pro Leu lie Tyr Lys Gly Asp Gin Gly Pro Gin Pro Arg Gly 145 150 155 160 cgc ccc cag tgc aag etc aac cag gag gec tgg tae ate ctg gee tee 528
Arg Pro Gin Cys Lys Leu Asn Gin Glu Ala Trp Tyr lie Leu Ala Ser 165 170 175 ; age ate gga tet ttc ttt get cct tgc etc ate atg ate ett gtc tae 576
Ser He Gly Ser Phe Phe Ala Pro Cys Leu He Met He Leu val Tyr 180 185 190 ctg cgc ate tae ctg ate gee aaa cgc age aac cgc aga ggt ccc agg 624
Leu Arg He Tyr Leu He Ala Lys Arg Ser Asn Arg Arg Gly Pro Arg 195 200 205 gee aag ggg ggg cct ggg cag ggt gag tee aag cag ccc ega ccc gac 672
Ala Lys Gly Gly Pro Gly Gin Gly Glu Ser Lys Gin Pro Arg Pro Asp ί 210 215 220 ; cat ggt ggg get ttg gee tea gee aaa ctg cca gee ctg gee tet gtg 720
His Gly Gly Ala Leu Ala Ser Ala Lys Leu Pro Ala Leu Ala Ser Val 225 230 235 240 get tet gee aga gag gtc aac gga cac teg aag tee act ggg gag aag 768
Ala Ser Ala Arg Glu Val Asn Gly His Ser Lys Ser Thr Gly Glu Lys 245 250 255 gag gag ggg gag ace cct gaa gat act ggg ace egg gee ttg cca ccc 816 *
Glu Glu Gly Glu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Thr Arg Ala Leu Pro Pro f 260 265 270 i agt tgg get gee ett ccc aac tea ggc cag ggc cag aag gag ggt gtt 864
Ser Trp Ala Ala Leu Pro Asn Ser Gly Gin Gly Gin Lys Glu Gly Val 275 280 285 tgt ggg gca tet cca gag gat gaa get gaa gag gag gaa gag gag gag 912 . , Cys Gly Ala Ser Pro Glu Asp Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 290 295 300 » · * · · : gag gag tgt gaa ccc cag gca gtg cca gtg tet ccg gee tea get tgc 960 .***. Glu Glu Cys Glu Pro Gin Ala Val Pro Val Ser Pro Ala Ser Ala Cys ’*··* 305 310 315 320 ·*· • · ’*1 age ccc ccg ctg cag cag cca cag ggc tee egg gtg ctg gee ace eta 1008
Ser Pro Pro Leu Gin Gin Pro Gin Gly Ser Arg Val Leu Ala Thr Leu .··. 325 330 335 • · • Φ · cgt ggc cag gtg etc ctg ggc agg ggc gtg ggt get ata ggt ggg cag 1056
Arg Gly Gin Val Leu Leu Gly Arg Gly Val Gly Ala He Gly Gly Gin ··· 340 345 350 ···· *** tgg tgg cgt ega agg geg cac gtg acc egg gag aag cgc ttc acc ttc 1104 • ^ Trp Trp Arg Arg Arg Ala His Val Thr Arg Glu Lys Arg Phe Thr Phe *:··* 355 360 365 • · · gtg ctg get gtg gtc att ggc gtt ttt gtg etc tgc tgg ttc ccc ttc 1152
Val Leu Ala Val Val He Gly Val Phe Val Leu Cys Trp Phe Pro Phe * 370 375 380 ··* * "**! ttc ttc age tae age ctg ggc gee ate tgc ccg aag cac tgc aag gtg 1200
Phe Phe Ser Tyr Ser Leu Gly Ala He Cys Pro Lys His Cys Lys Val ’ί' 385 390 395 400 7 118265 ecc cat ggc etc ttc cag ttc ttc ttc tgg ate ggc tae tgc aac age
Pro His Gly Leu Phe Gin Phe Phe Phe Trp lie Gly Tyr Cys Asn Ser 8 405 410 415 tea ctg aac ect gtt ate tae ace ate ttc aac cag gac ttc ege cgt 1296
Ser Leu Asn Pro Vai Ile Tyr Thr He Phe Asn Gin Asp Phe Arg Arg 420 425 430 gee ttc egg agg ate ctg tgc ege ccg tgg ace cag aeg gee tgg tga 1344
Ala Phe Arg Arg He Leu Cys Arg Pro Trp Thr Gin Thr Ala Trp 435 440 445 <210> 21 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Met Asp His Gin Asp Pro Tyr Ser Vai Gin Ala Thr Ala Ala He Ala 1 5 10 15
Ala Ala He Thr Phe Leu He Leu Phe Thr He Phe Gly Asn Ala Leu 20 25 30 ;
Val He Leu Ala Val Leu Thr Ser Arg Ser Leu Arg Ala Pro Gin Asn 35 40 45
Leu Phe Leu Val Ser Leu Ala Ala Ala Asp He Leu Val Ala Thr Leu 50 55 60 • · *· ” He He Pro Phe Ser Leu Ala Asn Glu Leu Leu Gly Tyr Trp Tyr Phe : 65 70 75 80 • · · * * 1 • · III Arg Arg Thr Trp Cys Glu Val Tyr Leu Ala Leu Asp Val Leu Phe Cys 8S 90 95 **· ····
·***· Thr Ser Ser He Val His Leu Cys Ala He Ser Leu Asp Arg Tyr Trp **··1 100 105 HO
..I;1 Ala Val Ser Arg Ala Leu Glu Tyr Asn Ser Lys Arg Thr Pro Arg Arg ,···. 115 120 125 • · • · · ♦ "’2 He Lys Cys He He Leu Thr Val Trp Leu He Ala Ala Val He Ser .···. 130 135 140 • 1 * 1 1 • · · 1 Leu Pro Pro Leu He Tyr Lys Gly Asp Gin Gly Pro Gin Pro Arg Gly 2 145 150 155 160 8 118265
Arg Pro Gin Cys Lys Leu Asn Gin Glu Ala Trp Tyr lie Leu Ala Ser 165 170 175 !
Ser lie Gly Ser Phe Phe Ala Pro Cys Leu lie Met lie Leu Val Tyr 180 185 190
Leu Arg lie Tyr Leu lie Ala Lys Arg Ser Asn Arg Arg Gly Pro Arg 195 200 205
Ala Lys Gly Gly Pro Gly Gin Gly Glu Ser Lys Gin Pro Arg Pro Asp 210 215 220
His Gly Gly Ala Leu Ala Ser Ala Lys Leu Pro Ala Leu Ala Ser Val 225 230 235 240
Ala Ser Ala Arg Glu Val Asn Gly His Ser Lys Ser Thr Gly Glu Lys 245 250 255
Glu Glu Gly Glu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Thr Arg Ala Leu Pro Pro 260 265 270
Ser Trp Ala Ala Leu Pro Asn Ser Gly Gin Gly Gin Lys Glu Gly Val 275 280 285
Cys Gly Ala Ser Pro Glu Asp Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 290 295 300 .·, · Glu Glu Cys Glu Pro Gin Ala Val Pro Val Ser Pro Ala Ser Ala Cys '· *** 305 310 315 320 • * • « · « · « : : Ser Pro Pro Leu Gin Gin Pro Gin Gly Ser Arg Val Leu Ala Thr Leu III 325 330 335 • * • · • · · ···! Arg Gly Gin Val Leu Leu Gly Arg Gly Val Gly Ala lie Gly Gly Gin ;***; 340 345 350 * · ·
Trp Trp Arg Arg Arg Ala His Val Thr Arg Glu Lys Arg Phe Thr Phe ...T 355 360 365 **· • · • · • · ·
Val Leu Ala val Val lie Gly Val Phe Val Leu Cys Trp Phe Pro Phe *:*" 370 375 380 • · • · ' ♦ · *·· . Phe Phe Ser Tyr Ser Leu Gly Ala lie Cys Pro Lys His Cys Lys Val :.: : 385 390 395 400 * ·
Pro His Gly Leu Phe Gin Phe Phe Phe Trp He Gly Tyr Cys Asn Ser 9 118265 405 410 415
Ser Leu Asn Pro val lie Tyr Thr lie Phe Asn Gin Asp Phe Arg Arg 420 425 430
Ala Phe Arg Arg lie Leu Cys Arg Pro Trp Thr Gin Thr Ala Trp 435 440 445 <210> 22 <211> 1353
<212> DNA
<213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> CDS <222> (1)..(1353) <223> Coding sequence for human ADRA2B gene <400> 22 atg gac cac cag gac ccc tac tcc gtg cag gcc aca gcg gcc ata gcg 48
Met Asp His Gin Asp Pro Tyr Ser Val Gin Ala Thr Ala Ala lie Ala 1 5 10 15 gcg gcc ate acc ttc etc att etc ttt acc ate ttc ggc aac get ctg 96
Ala Ala lie Thr Phe Leu lie Leu Phe Thr lie Phe Gly Asn Ala Leu 20 25 30 gtc ate ctg get gtg ttg acc age ege teg ctg ege gcc cct cag aac 144
Val He Leu Ala Val Leu Thr Ser Arg Ser Leu Arg Ala Pro Gin Asn 35 40 45 ctg ttc ctg gtg teg ctg gcc gcc gcc gac ate ctg gtg gcc aeg etc 192
Leu Phe Leu Val Ser Leu Ala Ala Ala Asp He Leu Val Ala Thr Leu - 50 55 60 ·’·.· ate ate cct ttc teg ctg gcc aac gag ctg ctg ggc tac tgg tac ttc 240 t* * He He Pro Phe Ser Leu Ala Asn Glu Leu Leu Gly Tyr Trp Tyr Phe : ss 70 75 so • ·· · • · · *...· egg egc aeg tgg tgc gag gtg tac ctg gcg etc gac gtg etc ttc tgc 288 .···. Arg Arg Thr Trp Cys Glu Val Tyr Leu Ala Leu Asp Val Leu Phe Cys 85 90 95 • 7 %·· **·· acc teg tcc ate gtg cac ctg tgc gcc ate age ctg gac ege tac tgg 336 l J Thr Ser Ser He Val His Leu Cys Ala He Ser Leu Asp Arg Tyr Trp 100 105 110 ,:. gcc gtg age C9C gcg ctg gag tac aac tcc aag ege acc ccg ege ege 384 : ··,: Ala Val Ser Arg Ala Leu Glu Tyr Asn Ser Lys Arg Thr Pro Arg Arg .*··. 115 120 125 • ♦ *·· ....: ate aa9 tgc atc atc etc act gtg tgg etc ate gcc gcc gtc ate teg 432 ’ * He Lys Cys He He Leu Thr Val Trp Leu He Ala Ala Val He Ser .·'*. 130 135 140 • · * * * : .·. ctg ccg ccc etc atc tac aag ggc gac cag ggc ccc cag ccg ege ggg 480 :.: : Leu Pro Pro Leu lie Tyr Lys Gly Asp Gin Gly Pro Gin Pro Arg Gly ....: 145 150 155 160 • · ege ccc cag tgc aag etc aac cag gag gcc tgg tae atc ctg gcc tcc 528 ίο 1 1 8265
Arg Pro Gin Cys Lys Leu Asn Gin Glu Ala Trp Tyr lie Leu Ala Ser 165 170 175 age ate gga tet ttc ttt get cct tgc etc ate atg ate ett gtc tae 576
Ser lie Gly Ser Phe Phe Ala Pro Cys Leu lie Met lie Leu Val Tyr 180 185 190 ctg ege ate tae ctg ate gee aaa ege age aac ege aga ggt ccc agg 624
Leu Arg lie Tyr Leu lie Ala Lys Arg Ser Asn Arg Arg Gly Pro Arg 195 200 205 gee aag ggg ggg cct ggg cag ggt gag tee aag cag ccc ega ccc gac 672
Ala Lys Gly Gly Pro Gly Gin Gly Glu Ser Lys Gin Pro Arg Pro Asp 210 215 220 cat ggt ggg get ttg gee tea gee aaa ctg cca gee ctg gee tet gtg 720
His Gly Gly Ala Leu Ala Ser Ala Lys Leu Pro Ala Leu Ala Ser val 225 230 235 240 get tet gee aga gag gtc aac gga cac teg aag tee act ggg gag aag 768
Ala Ser Ala Arg Glu Val Asn Gly His Ser Lys Ser Thr Gly Glu Lys 245 250 255 gag gag ggg gag ace cct gaa gat act ggg ace egg gee ttg cca ccc 816
Glu Glu Gly Glu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Thr Arg Ala Leu Pro Pro 260 265 270 agt tgg get gee ett ccc aac tea ggc cag ggc cag aag gag ggt gtt 864
Ser Trp Ala Ala Leu Pro Asn Ser Gly Gin Gly Gin Lys Glu Gly Val 275 280 285 tgt ggg gca tet cca gag gat gaa get gaa gag gag gaa gag gag gag 912
Cys Gly Ala Ser Pro Glu Asp Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 290 295 300 gag gag gag gaa gag tgt gaa ccc cag gca gtg cca gtg tet cog gee 960 .‘•tj Glu Glu Glu Glu Glu Cys Glu Pro Gin Ala Val Pro Val Ser Pro Ala ’* 305 310 315 320 * · * * · *".* tea get tgc age ccc ccg ctg cag cag cca cag ggc tec egg gtg ctg 1008
Ser Ala Cys Ser Pro Pro Leu Gin Gin Pro Gin Gly Ser Arg Val Leu ,···. 325 330 335 • * ·«· ··· gee acc eta cgt ggc cag gtg etc ctg ggc agg ggc gtg ggt get ata 1056 ···· Ala Thr Leu Arg Gly Gin Val Leu Leu Gly Arg Gly Val Gly Ala lie :***: 340 345 350 ·** 39t ggg cag tgg tgg cgt ega agg geg cac gtg acc egg gag aag ege 1104 .I. GlV Gly Gin Trp Trp Arg Arg Arg Ala His Val Thr Arg Glu Lys Arg ···* 355 360 365 • · · • · * ♦ ttc acc ttc gtg ctg get gtg gtc att ggc gtt ttt gtg etc tgc tgg 1152 ....: Phe Thr Phe Val Leu Ala Val Val lie Gly Val Phe Val Leu Cys Trp ’ * 370 375 380 ··· • * *** ttc ccc ttc ttc ttc age tae age ctg ggc gee ate tgc ccg aag cac 1200 : .·. Phe Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ser Leu Gly Ala He Cys Pro Lys His · 385 390 395 400 ····· • · tgc aag gtg ccc cat ggc etc ttc cag ttc ttc ttc tgg ate ggc tae 1248
Cys Lys Val Pro His Gly Leu Phe Gin Phe Phe Phe Trp He Gly Tyr 11 ' 118265 : 405 410 415 tgc aac age tea ctg aac ect gtt ate tae ace ate ttc aac cag gac 1296
Cys Asn Ser Ser Leu Asn Pro Vai Ile Tyr Thr He Phe Asn Gin Asp 420 425 430 ttc ege cgt gee ttc egg agg ate ctg tgc ege ccg tgg ace cag aeg 1344
Phe Arg Arg Ala Phe Arg Arg He Leu Cys Arg Pro Trp Thr Gin Thr 435 440 445 gee tgg tga 1353
Ala Trp 450 <210> 23 <211> 450 '
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 23
Met Asp His Gin Asp Pro Tyr Ser Vai Gin Ala Thr Ala Ala He Ala 15 10 15
Ala Ala He Thr Phe Leu He Leu Phe Thr He Phe Gly Asn Ala Leu 20 25 30
Vai He Leu Ala Val Leu Thr Ser Arg Ser Leu Arg Ala Pro Gin Asn 35 40 45
Leu Phe Leu Val ser Leu Ala Ala Ala Asp He Leu Val Ala Thr Leu 50 55 60 • * • · · *· '· Ile He Pro Phe Ser Leu Ala Asn Glu Leu Leu Gly Tyr Trp Tyr Phe • ·*· 65 70 75 80 • · · • * * * **^ Arg Arg Thr Trp Cys Glu Val Tyr Leu Ala Leu Asp Val Leu Phe Cys 85 90 95 t * · ·*·· ;***· Thr Ser Ser He Val His Leu Cys Ala He Ser Leu Asp Arg Tyr Trp **** 100 105 110 «
Ala Val Ser Arg Ala Leu Glu Tyr Asn Ser Lys Arg Thr Pro Arg Arg ,*··. 115 120 125 • · *·· ***** Ile Lys Cys He He Leu Thr Val Trp Leu He Ala Ala Val He Ser .···. 130 135 140 • · • · · • · ·.· ; Leu Pro Pro Leu He Tyr Lys Gly Asp Gin Gly Pro Gin Pro Arg Gly 145 150 155 160 • · 118265 12
Arg Pro Gin Cys Lys Leu Asn Gin Glu Ala Trp Tyr lie Leu Ala Ser 165 170 175
Ser lie Gly Ser Phe Phe Ala Pro Cys Leu lie Met lie Leu Val Tyr 180 185 190
Leu Arg lie Tyr Leu lie Ala Lys Arg Ser Asn Arg Arg Gly Pro Arg 195 200 205
Ala Lys Gly Gly Pro Gly Gin Gly Glu Ser Lys Gin Pro Arg Pro Asp 210 215 220
His Gly Gly Ala Leu Ala Ser Ala Lys Leu Pro Ala Leu Ala Ser Val 225 230 235 240
Ala Ser Ala Arg Glu Val Asn Gly His Ser Lys Ser Thr Gly Glu Lys 245 250 255 .,:
Glu Glu Gly Glu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Thr Arg Ala Leu Pro Pro 260 265 270
Ser Trp Ala Ala Leu Pro Asn Ser Gly Gin Gly Gin Lys Glu Gly Val 275 280 285
Cys Gly Ala Ser Pro Glu Asp Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 290 295 300
Glu Glu Glu Glu Glu Cys Glu Pro Gin Ala Val Pro Val Ser Pro Ala 305 310 315 320 • · • · ··· • · · ··· « .·♦·, Ser Ala Cys Ser Pro Pro Leu Gin Gin Pro Gin Gly Ser Arg Val Leu ...1 325 330 335 ··· • · • · *:1 Ala Thr Leu Arg Gly Gin Val Leu Leu Gly Arg Gly Val Gly Ala lie *1” 340 345 350 * » • · • · ·
Gly Gly Gin Trp Trp Arg Arg Arg Ala His Val Thr Arg Glu Lys Arg .t. 355 360 365 ···· • · 1 • · • ·
Phe Thr Phe Val Leu Ala Val Val lie Gly Val Phe Val Leu Cys Trp ....: 370 375 380 • · * · · Φ ♦ * 1 *" Phe Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ser Leu Gly Ala lie Cys Pro Lys His : 385 390 395 400 « · · • 1 · · · !
Cys Lys Val Pro His Gly Leu Phe Gin Phe Phe Phe Trp lie Gly Tyr 405 410 415 1 1 8265
Cys Asn Ser Ser Leu Asn Pro Val lie Tyr Thr lie Phe Asn Gin Asp 420 425 430 . Phe Arg Arg Ala Phe Arg Arg He Leu Cys Arg Pro Trp Thr Gin Thr 435 440 445
Ala Trp 450 <210> 24
<211> 20 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 gggtgtttgt ggggcatctc 20 : <210> 25 <211> 19
< 212 > DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> Snapshot primer <400> 25 tggcactgcc tggggttca 19 <210> 26 : <211> 18
*· <212> DNA
• ·*; <213> Artificial Sequence <22o> <223> Sequencing primer *.· <400> 26 • · *...* tcaggtcttc tcccagca 18 * • · · ·*·· <2io> 27 *** < 211 > 619 <212> DNA <21.3> Homo sapiens „i:‘ < 4 0 0 > 27 .·*·, ggatgaagca gaatgaagag taggtaaccc tgaggttgag aggtatattg ttggaccagg 60 • * · ] gagcaggtaa taaatacatc ctggatagac tcacatgggg aaaaaaacta tgatcttgca 120 .***. tgactaacac atagctagta agatttcttg tcacttacga caaagacatg aattttctcc 180 ft · ; atcctaacat gactgataca gtgtctctta tttagactat ctcagttagt ctggctgtgc 240 • · · • · * · ttgtcctttt tcccacctcc ctcgctgtgc ctgaccctct cttctttcca caggttctca 300 ggcaagagcc acctgctatt gccgaaccgg ccgttgtgct acccgtgagt ccctctccgg 360 14 1 1 8265 ggtgtgtgaa atcagtggcc gcctctacag actctgctgt cgctgagctt cctagataga 420 aaccaaagca gtgcaagatt cagttcaagg tcctgaaaaa agaaaaacat tttactctgt 480 gtaccttgtg tctttctaaa tttctctctc caaagtaaag ttcaagcatt aaacttagtg 540 tgtttgacct ttttaatttt cttttctttt tccttttttt tcttttgctt tgttatatgg 600 tggtttgtat ggttccttt 619 <210> 28 <211 > 619
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28 I
ggatgaagca gaatgaagag taggtaaccc tgaggttgag aggtatattg ttggaccagg 60 gagcaggtaa taaatacatc ctggatagac tcacatgggg aaaaaaacta tgatcttgca 120 tgactaacac atagctagta agatttcttg tcacttacga caaagacatg aattttctcc 180 atcctaacat gactgataca gtgtctctta tttagactat ctcagttagt ctggctgtgc 240 ttgtcctttt tcccacctcc ctcgctgtge ctgaccctct cttctttcca caggttctca 300 ggcaagagcc acctgctatt gccgaaccgg ccgttgtgct acccgtgagt ccctctccgg 360 ggtgtgtgaa atcagtggcc gcctctacag actctgctgt cgctgagctt cctagataga 420 aaccaaagca gtgcaagatt cagttcaagg tcctgaaaaa agaaaaacat tttactctgt 480 gtaccttgtg tctttctaaa tttctctctc caaaataaag ttcaagcatt aaacttagtg 540 tgtttgacct ttttaatttt cttttctttt tccctttttt tcttttgctt tgttatatgg 600 • Φ ♦ ♦ ♦ *· *· tggtttgtat ggttccttt 619 • · · • · · • ·· · <2io> 29 'ft <211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence ···! <22 0> :***: <223> PCR primer **· <400> 29 ggatgaagca gaatgaaga 19 • · · ...
**·· .···. <210> 30 '···* <211> 19
. < 212 > DNA
• · · · · * * <213> Artificial Sequence ;·.
,···. <22 0> , *·*·* <223> PCR primer j ,·, <400> 30 :.: : aaaggaacca tacaaacca 19 * • · · » * * * <210> 31 15 T-s 118265
<211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> ·, <223> Sequencing primer <400> 31 gttagtctgg ctgtgctt 18 <210> 32 <211> 1052
<212 > DNA
<213> Homo sapiens <400> 32 gggctactga gtttggtgaa aagataagac tcctgaaaat tctattgatt ctcttttgaa 60 cttctttctt aaattagttt tatgatggac ttggctctca ttggtatttc ccaagattat 120 ggagatggga tagtgatgtc tgacaagtac ctaagatgct aagttgaagg tctaaaattc 180 catcctaaaa gcaaataatt actctatcat ctacgtgccc tttgcttctt aaagttactc 240 aaggaaggca gactaaacag gaaatttact ttggattcaa gaggggcata gagacgctct 300 cagcctgccc atttgccttc atcaacattc ctaaacactg ggcttaaaat gtagtatgag 360 taaactctct cttagtctat ccatctccca ctagcagttt taacatcatc tctagttatt 420 aaccttggct caatggcttt ctcctctttt tttatacaga atttattggc ttgagacgct 480 gtttaatggg tttggggaga tgcagggatc actgcaatgt ggatgaaaaa gagatacaga 540 aatgcaagat gaaaaaatgt tgtgttggac caaaagtggt taaattgatt aaaaactacc 600 tgcaatatgg aacaccaaat gtacttaatg aagacgtcca agaaatgcta aaacctgcca 660 ,·. * agaattctag tgctgtgata caaagaaaac atattttatc tgttctcccc caaatcaaaa 720 • «« * · • ·*· gcactagctt ttttgctaat accaactttg tcatcattcc aaatgccacc cctatgaact 780 ·«« * • e · ϊ J ctgccaccat cagcactatg accccaggac agatcacata cactgctact tctaccaaga 840 *·* ·,.,· gtaacaccaa agaaagcaga gattctgcca ctgcctcgcc accaccagca ccacctccac 900 ··* •••ϊ caaacatact gccaacacca tcactggagc tagaggaagc agaagagcag taatgtggat 960 • a · • · • « "* ctttccctta aaactccaag ttcctctcta tttttgctat ctataaaatg acatagaact 1020 . gtttcctctg tcatcagtca ttcaataaac ac 1052 • · · * ··· • · *··♦* <210> 33 .
<21.1 > 1049
,J'*5 <212> DNA
,»··, <213> Homo sapiens <400> 33 • *· gggctactga gtttggtgaa aagataagac tcctgaaaat tctattgatt ctcttttgaa 60 • · · • · · · cttctttctt aaattagttt tatgatggac ttggctctca ttggtatttc ccaagattat 120 • · ggagatggga tagtgatgtc tgacaagtac ctaagatgct aagttgaagg tctaaaattc 180 16 i 118265 catcctaaaa gcaaataatt actctatcat ctacgtgccc tttgcttctt aaagttactc 240 aaggaaggca gactaaacag gaaatttact ttggattcaa gaggggcata gagacgctct 300 cagcctgccc atttgccttc atcaacattc ctaaacactg ggcttaaaat gtagtatgag 360 taaactctct cttagtctat ccatctccca ctagcagttt taacatcatc tctagttatt 420 aaccttggct caatggcttt ctcttttttt atacagaatt tattggcttg agacgctgtt 480 taatgggttt ggggagatgc agggatcact gcaatgtgga tgaaaaagag atacagaaat 540 gcaagatgaa aaaatgttgt gttggaccaa aagtggttaa attgattaaa aactacctgc 600 aatatggaac accaaatgta cttaatgaag acgtccaaga aatgctaaaa cctgccaaga 660 attctagtgc tgtgatacaa agaaaacata ttttatctgt tctcccccaa atcaaaagca 720 ctagcttttt tgctaatacc aactttgtca tcattccaaa tgccacccct atgaactctg 780 ccaccatcag cactatgacc ccaggacaga tcacatacac tgctacttct accaagagta 840 acaccaaaga aagcagagat tctgccactg cctcgccacc accagcacca cctccaccaa 900 acatactgcc aacaccatca ctggagctag aggaagcaga agagcagtaa tgtggatctt 960 tcccttaaaa ctccaagttc ctctctattt ttgctatcta taaaatgaca tagaactgtt 1020 tcctctgtca tcagtcattc aataaacac 1049 <210> 34
<211> 18 -· <212> DNA
<213ι· Artificial Sequence : <220> *. " <223> PCR primer : .*. <400> 34 ·** * ggctactgag tttggtga 18 • · • · • · · ♦ ·* <210> 35
<211> 21 ...: <212> DNA
j***· <213> Artificial Sequence **··* <220> <223> PCR primer , <400> 35 ..*♦* gtgtttattg aatgactgat g 21 ·*# • · • · ***' * . <210> 36
*"" <211> 18 .···, <212> DNA
**»»* <213> Artificial Sequence . . <2 2 0 > I <223> Sequencing primer ....: <400> 36 caaggaaggc agactaaa 18 17 .21«, 37 1 1 8265 <211> 552 ; <212 > DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (552) <223> Coding sequence for the variant human DEFB129 gene <400> 37 atg aag etc ett ttt cct ate ttt gcc age etc atg eta cag tae cag 48
Met Lys Leu Leu Phe Pro He Phe Ala Ser Leu Met Leu Gin Tyr Gin 1 5 10 15 gtg aac aca gaa ttt att ggc ttg aga ege tgt tta atg ggt ttg ggg 96
Vai Asn Thr Glu Phe He Gly Leu Arg Arg Cys Leu Met Gly Leu Gly 20 25 30 aga tgc agg gat cac tgc aat gtg gat gaa aaa gag ata cag aaa tgc 144
Arg Cys Arg Asp His Cys Asn Val Asp Glu Lys Glu He Gin Lys Cys ; 35 40 45 aag atg aaa aaa tgt tgt gtt gga cca aaa gtg gtt aaa ttg att aaa 192 -:
Lys Met Lys Lys Cys Cys Val Gly Pro Lys Val Val Lys Leu He Lys 50 55 60 aac tac ctg caa tat gga aca cca aat gta ett aat gaa gac gtc caa 240
Asn Tyr Leu Gin Tyr Gly Thr Pro Asn Val Leu Asn Glu Asp Val Gin 65 70 75 80 gaa atg eta aaa cct gcc aag aat tet agt get gtg ata caa aga aaa 288
Glu Met Leu Lys Pro Ala Lys Asn Ser Ser Ala Val He Gin Arg Lys 85 90 95 cat att tta tet gtt etc ccc caa ate aaa age act age ttt ttt get 336
His He Leu Ser Val Leu Pro Gin He Lys Ser Thr Ser Phe Phe Ala .*. Ϊ 100 105 110 • *» • · * j*j aat ace aac ttt gtc ate att cca aat gcc acc cct atg aac tet gcc 384 ***#* Asn Thr Asn Phe Val He He Pro Asn Ala Thr Pro Met Asn Ser Ala : : 115 120 125 • · · * · · acc ate age act atg acc cca gga cag ate aca tac act get act tet 432
Thr He Ser Thr Met Thr Pro Gly Gin He Thr Tyr Thr Ala Thr Ser -- ····* 130 135 140 • · · • · *** acc aag agt aac acc aaa gaa age aga gat tet gcc act gcc teg cca 480
Thr Lys Ser Asn Thr Lys Glu Ser Arg Asp Ser Ala Thr Ala Ser Pro . 145 150 155 160 • *·· .···. cca cca gca cca cct cca cca aac ata ctg cca aca cca tea ctg gag 528 *···* Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Asn He Leu Pro Thr Pro Ser Leu Glu 165 170 175 • · ,···, eta gag gaa gca gaa gag cag taa 552 *·..* Leu Glu Glu Ala Glu Glu Gin . 180 ·*·.
• · · • · * · * * " <210> 38 <211> 183 11 8265 18 <213 > Homo sapiens <400> 38
Met Lys Leu Leu Phe Pro lie Phe Ala Ser Leu Met Leu Gin Tyr Gin 1 5 10 15
Val Asn Thr Glu Phe lie Gly Leu Arg Arg Cys Leu Met Gly Leu Gly 20 25 30
Arg Cys Arg Asp His Cys Asn Val Asp Glu Lys Glu lie Gin Lys Cys 35 40 45
Lys Met Lys Lys Cys Cys Val Gly Pro Lys Val Val Lys Leu lie Lys 50 55 60
Asn Tyr Leu Gin Tyr Gly Thr Pro Asn Val Leu Asn Glu Asp Val Gin 65 70 75 80
Glu Met Leu Lys Pro Ala Lys Asn Ser Ser Ala Val lie Gin Arg Lys 85 90 95
His He Leu Ser Val Leu Pro Gin He Lys Ser Thr Ser Phe Phe Ala 100 105 lio
Asn Thr Asn Phe Vai Ile He Pro Asn Ala Thr Pro Met Asn Ser Ala 115 120 125 ;*·.· Thr He Ser Thr Met Thr Pro Gly Gin He Thr Tyr Thr Ala Thr Ser / / 130 135 140 'i • · · ♦ · · ♦ # · · *·*
Thr Lys Ser Asn Thr Lys Glu Ser Arg Asp Ser Ala Thr Ala Ser Pro .**·. 145 150 155 160 * · • · · * • * · ·*** Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Asn He Leu Pro Thr Pro Ser Leu Glu 165 170 175 ·* ·
Leu Glu Glu Ala Glu Glu Gin ···· 180 * · * • · • · * · · <210> 39 * * <211> 552
;··*. <212> DNA
*** <213> Homo sapiens : .·. <220> : <22i> cos ·;··: <222> (1)..(552) <223> Coding sequence for the human DEFB129 gene <400> 39 19 1 1 8265 atg aag etc ett ttt cct ate ttt gee age etc atg eta cag tae cag 48 ;
Met Lys Leu Leu Phe Pro lie Phe Ala Ser Leu Met Leu Gin Tyr Gin 1 5 10 15 gtg aac aca gaa ttt att ggc ttg aga ege tgt tta atg ggt ttg ggg 96
Val Asn Thr Glu Phe lie Gly Leu Arg Arg Cys Leu Met Gly Leu Gly 20 25 30 aga tgc agg gat cac tgc aat gtg gat gaa aaa gag ata cag aaa tgc 144
Arg Cys Arg Asp His Cys Asn Vai Asp Glu Lys Glu He Gin Lys Cys 35 40 45 aag atg aaa aaa tgt tgt gtt gga cca aaa gtg gtt aaa ttg att aaa 192
Lys Met Lys Lys Cys Cys Val Gly Pro Lys Val Val Lys Leu lie Lys ' 50 55 60 aac tac eta caa tat gga aca cca aat gta ett aat gaa gac gtc caa 240
Asn Tyr Leu Gin Tyr Gly Thr Pro Asn Val Leu Asn Glu Asp Val Gin 65 70 75 80 gaa atg eta aaa cct gcc aag aat tet agt get gtg ata caa aga aaa 288
Glu Met Leu Lys Pro Ala Lys Asn Ser Ser Ala Val He Gin Arg Lys 85 90 95 cat att tta tet gtt etc ccc caa ate aaa age act age ttt ttt get 336
His He Leu Ser Val Leu Pro Gin He Lys Ser Thr Ser Phe Phe Ala 100 105 110 aat acc aac ttt gtc ate att cca aat gcc acc cct atg aac tet gee 384
Asn Thr Asn Phe Val He He Pro Asn Ala Thr Pro Met Asn Ser Ala 115 120 125 acc ate age act atg acc cca gga cag ate aca tac act get act tet 432
Thr He Ser Thr Met Thr Pro Gly Gin He Thr Tyr Thr Ala Thr Ser 1 130 135 140 t ·*.ϊ acc aag agt aac acc aaa gaa age aga gat tet gcc act gcc teg cca 480 / J Thr Lys Ser Asn Thr Lys Glu Ser Arg Asp Ser Ala Thr Ala Ser Pro : 145 150 155 ieo ··· · • · · ·...· cca cca gca cca cct cca cca aac ata ctg cca aca cca tea ctg gag 528 ’ .···. Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Asn He Leu Pro Thr Pro Ser Leu Glu ’···* 165 170 175 ♦ «· *··* eta gag gaa gca gaa gag cag taa 552 : ; Leu Glu Glu Ala Glu Glu Gin *** 180 <210> 40 .··*. <211> 183
*···’ <212> PRT
<213> Homo sapiens * * <400> 40 • · · • ♦ "** Met Lys Leu Leu Phe Pro He Phe Ala Ser Leu Met Leu Gin Tyr Gin : 1 5 10 15 • · · ··· ♦
Val Asn Thr Glu Phe He Gly Leu Arg Arg Cys Leu Met Gly Leu Gly 20 25 30 118265 20
Arg Cys Arg Asp His Cys Asn Vai Asp Glu Lys Glu He Gin Lys Cys 35 40 45
Lys Met Lys Lys Cys Cys Val Gly Pro Lys Vai Val Lys Leu He Lys 50 55 60
Asn Tyr Leu Gin Tyr Gly Thr Pro Asn Val Leu Asn Glu Asp Val Gin 65 70 75 80
Glu Met Leu Lys Pro Ala Lys Asn Ser Ser Ala Val He Gin Arg Lys 85 90 95
His He Leu Ser Val Leu Pro Gin He Lys Ser Thr Ser Phe Phe Ala 100 105 110
Asn Thr Asn Phe Val He He Pro Asn Ala Thr Pro Met Asn Ser Ala 115 120 125
Thr He Ser Thr Met Thr Pro Gly Gin He Thr Tyr Thr Ala Thr Ser 130 135 140
Thr Lys Ser Asn Thr Lys Glu Ser Arg Asp Ser Ala Thr Ala Ser Pro 145 150 155 160
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Asn He Leu Pro Thr Pro Ser Leu Glu 165 170 175 • * * · · * · * * ·.· * Leu Glu Glu Ala Glu Glu Gin .···. 180 • · • · · • · · • · *·*·* <210> 41 ·** <211> 372
"" <212 > DNA
• <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
.:. <222> (1)..(372) ·*·· <223> Coding sequence for the variant human DEFB118 gene <4oo> 4i *" atg aaa etc ctg ctg ctg get ett ect atg ett gtg etc eta ccc caa 48 ·...! Met Lys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Met Leu Val Leu Leu Pro Gin ’ * 1 5 10 15 *·· • * • ♦ ’** gtg ate cca gee tat agt ggt gaa aaa aaa tgc tgg aac aga tea ggg 96 : Val He Pro Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Lys Cys Trp Asn Arg Ser Gly !·: · 20 25 30 ·····.; * · cac ege agg aaa caa tgc aaa gat gga gaa gca gtg aaa gat aca tgc 144
His Arg Arg Lys Gin Cys Lys Asp Gly Glu Ala Val Lys Asp Thr Cys 21 1 1 8265 ; 35 40 45 aaa aat ett ega get tgc tgc att cca tee aat gaa gac cac agg ega 192
Lys Asn Leu Arg Ala Cys Cys lie Pro Ser Asn Glu Asp His Arg Arg 50 55 60 gtt ect geg aca tet ccc aca ccc ttg agt gac tea aca cca gga att 240
Val Pro Ala Thr Ser Pro Thr Pro Leu Ser Asp Ser Thr Pro Gly lie , 65 70 75 80 att gat gat att tta aca gta agg ttc aeg aca gac tae ttt gaa gta 288 lie Asp Asp lie Leu Thr Val Arg Phe Thr Thr Asp Tyr Phe Glu Val 85 90 95 age age aag aaa gat atg gtt gaa gag tet gag geg gga agg gga act 336
Ser Ser Lys Lys Asp Met Val Glu Glu Ser Glu Ala Gly Arg Gly Thr 100 105 110 gag acc tet ett cca aat gtt cac cat age tea tga 372
Glu Thr Ser Leu Pro Asn Val His His Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 42
Met Lys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Met Leu Val Leu Leu Pro Gin 15 10 15
Val lie Pro Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Lys Cys Trp Asn Arg Ser Gly 20 25 30 • · ♦ · · · .
His Arg Arg Lys Gin Cys Lys Asp Gly Glu Ala Val Lys Asp Thr Cys : 35 40 45 • · · · • · • · * .*·*. Lys Asn Leu Arg Ala Cys Cys lie Pro Ser Asn Glu Asp His Arg Arg *...* 50 55 60 i ··· ··*· : *: Val Pro Ala Thr Ser Pro Thr Pro Leu Ser Asp Ser Thr Pro Gly lie *" 65 70 75 80 • ...I Ile Asp Asp He Leu Thr Val Arg Phe Thr Thr Asp Tyr Phe Glu Val 85 90 95 ♦ · • ·· * * Ser Ser Lys Lys Asp Met Val Glu Glu Ser Glu Ala Gly Arg Gly Thr .**·. 100 105 110 • ♦ ··· • · • * * :.: : Glu Thr Ser Leu Pro Asn Val His His Ser Ser ....: 115 120 • * ί ' f : ..... -il .......-..wjl-.. —ί--^.^··.ι--..·<.' - ««nm· »'«" . ·™ 22 <21ο> « : 1 1 8265 <211> 372
<212> DNA
<213 > Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <223> Coding sequence of the human DEFB118 gene <400> 43 atg aaa etc ctg ctg ctg get ett cct atg ett gtg etc eta ccc caa 48
Met Lys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Met Leu Val Leu Leu Pro Gin 1 5 10 15 gtg ate cca gee tat agt ggt gaa aaa aaa tgc tgg aac aga tea ggg 96
Val lie Pro Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Lys Cys Trp Asn Arg Ser Gly ’ 20 25 30 cac tgc agg aaa caa tgc aaa gat gga gaa gca gtg aaa gat aca tgc 144
His Cys Arg Lys Gin Cys Lys Asp Gly Glu Ala Val Lys Asp Thr Cys 35 40 45 aaa aat ett ega get tgc tgc att cca tcc aat gaa gac cac agg ega 192
Lys Asn Leu Arg Ala Cys Cys lie Pro Ser Asn Glu Asp His Arg Arg 50 55 60 gtt cct geg aca tet ccc aca ccc ttg agt gac tea aca cca gga att 240
Val Pro Ala Thr Ser Pro Thr Pro Leu Ser Asp Ser Thr Pro Gly lie 65 70 75 80 att gat gat att tta aca gta agg ttc aeg aca gac tac ttt gaa gta 288
Ile Asp Asp He Leu Thr Val Arg Phe Thr Thr Asp Tyr Phe Glu Val 85 90 95 age age aag aaa gat atg gtt gaa gag tet gag geg gga agg gga act 336
Ser Ser Lys Lys Asp Met Val Glu Glu Ser Glu Ala Gly Arg Gly Thr 100 105 110 « · t · · .* gag acc tet ett cca aat gtt cac cat age tea tga 372 ; : · Glu Thr Ser Leu Pro Asn Val His His Ser Ser \\Y 115 120 • * * · «·· • · * *...* <210> 44 .:. <211> 123
···· <212> PRT J
; · <213> Homo sapiens *** <400> 44 ,j. Met Lys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Met Leu Val Leu Leu Pro Gin ...: 1 5 10 15 • · * • · * · » · ·
Val He Pro Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Lys Cys Trp Asn Arg Ser Gly ” : 20 25 30 • · · » · • * • * · ; His Cys Arg Lys Gin Cys Lys Asp Gly Glu Ala Val Lys Asp Thr Cys :.: : 35 40 45 • · * · · • ·
Lys Asn Leu Arg Ala Cys Cys He Pro Ser Asn Glu Asp His Arg Arg 118265 • · . 23 50 55 60
Vai Pro Ala Thr Ser Pro Thr Pro Leu Ser Asp Ser Thr Pro Gly Ile 65 70 75 80
Ile Asp Asp Ile Leu Thr Vai Arg Phe Thr Thr Asp Tyr Phe Glu Vai 85 90 95
Ser Ser Lys Lys Asp Met Vai Glu Glu Ser Glu Ala Gly Arg Gly Thr 100 105 110
Glu Thr Ser Leu Pro Asn Vai His His Ser Ser 115 120 <210> 45
<211> 20 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 45 aggttgagta tttgccagac 20 <210> 46 <21 :> 19 i;
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> ·; ' <223> PCR primer <400>46 : ·.; aggacagggg tgagtgata 19 • · • · : « ♦ * * · ··· v φ···' <210 > 47 <211> 246 <212 > DNA j • · **· <213> Homo sapiens ; *:* <220> *;;; <22i> cds <222> (1) . . (246) 4 <223> Coding sequence for the variant human DEFB126 gene <400> 47 ·!. atg aag tee eta ctg ttc acc ett gca gtt ttt atg etc ctg gcc caa 48 ··*· Met Lys Ser Leu Leu Phe Thr Leu Ala Val Phe Met Leu Leu Ala Gin , l 5 io is • * · * ....I ttg gtc tea ggt aat tgg tat gtg aaa aag tgt eta aac gac gtt gga 96
Leu Val Ser Gly Asn Trp Tyr Val Lys Lys Cys Leu Asn Asp Val Gly :***: 20 25 30 • a · ί .*. att tgc aag aag aag tgc aaa cct gaa gag atg cat gta aag aat ggt 144 ... : He Cys Lys Lys Lys Cys Lys Pro Glu Glu Met His Val Lys Asn Gly *:**: 35 40 45 tgg gca atg tgc ggc aaa ggg act get gtg ttc cag ctg aca gac gtg 192 118265 24
Trp Ala Met Cys Gly Lys Gly Thr Ala Val Phe Gin Leu Thr Asp Val 50 55 60 eta att ate ctg ttt tet gtg tee aga caa aga eta caa gaa ttt caa 24 0 ,:
Leu lie lie Leu Phe Ser Val Ser Arg Gin Arg Leu Gin Glu Phe Gin 65 70 75 80 cag taa 246
Gin <210> 48 ” <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 48
Met Lys Ser Leu Leu Phe Thr Leu Ala Val Phe Met Leu Leu Ala Gin 1 5 10 15
Leu Vai Ser Gly Asn Trp Tyr Val Lys Lys Cys Leu Asn Asp Val Gly 20 25 30 lie Cys Lys Lys Lys Cys Lys Pro Glu Glu Met His Val Lys Asn Gly ; 35 40 45 \ ΐ
Trp Ala Met Cys Gly Lys Gly Thr Ala Val Phe Gin Leu Thr Asp Val 50 55 60
Leu He He Leu Phe Ser Val Ser Arg Gin Arg Leu Gin Glu Phe Gin ‘ 65 70 75 80 • · ' • · · * · · • · : Gin r *·· · ·♦· • · • · *·· • · *···* <210> 49 ... <211> 336 ·;;; <2i2> dna : : <213> Homo sapiens ··· <220>
<221> CDS
.:. <222> (1) . . (336) •••I <223> Coding sequence of the human DEFB126 gene ;***· <4 00> 49 *” atg aag tec eta ctg ttc acc ett gca gtt ttt atg etc ctg gcc caa 48
Met Lys Ser Leu Leu Phe Thr Leu Ala Val Phe Met Leu Leu Ala Gin * * 1 5 10 15 »·· • · *" ttg gtc tea ggt aat tgg tat gtg aaa aag tgt eta aac gac gtt gga 96 ; .·. Leu Val Ser Gly Asn Trp Tyr Val Lys Lys Cys Leu Asn Asp Val Gly :.: : 20 25 30 ···«* • · att tgc aag aag aag tgc aaa cct gaa gag atg cat gta aag aat ggt 144 lie Cys Lys Lys Lys Cys Lys Pro Glu Glu Met His Val Lys Asn Gly 25 .......:., 1 1 8265 ·.' 35 40 45 } tgg gca atg tgc ggc aaa caa agg gac tgc tgt gtt cca get gac aga 192
Trp Ala Met Cys Gly Lys Gin Arg Asp Cys Cys Val Pro Ala Asp Arg 50 55 60 1 cgt get aat tat cct gtt ttc tgt gtc cag aca aag act aca aga att 240
Arg Ala Asn Tyr Pro Val Phe Cys Val Gin Thr Lys Thr Thr Arg lie 65 70 75 80 tea aca gta aca gca aca aca gca aca aca act ttg atg atg act act 288
Ser Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Leu Met Met Thr Thr 85 90 95 get teg atg tet teg atg get cct acc ccc gtt tet ccc act ggt tga 336
Ala Ser Met Ser Ser Met Ala Pro Thr Pro Val Ser Pro Thr Gly 100 105 110 <210> 50 <211> 111 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 50
Met Lys Ser Leu Leu Phe Thr Leu Ala Val Phe Met Leu Leu Ala Gin 1 5 10 15
Leu Val Ser Gly Asn Trp Tyr Val Lys Lys Cys Leu Asn Asp Val Gly 20 25 30 lie Cys Lys Lys Lys Cys Lys Pro Glu Glu Met His Val Lys Asn Gly 35 40 45 • * • · · ,* / Trp Ala Met Cys Gly Lys Gin Arg Asp Cys Cys Val Pro Ala Asp Arg : 50 55 go • » · · • · · • · • · • * · ,···, Arg Ala Asn Tyr Pro Val Phe Cys Val Gin Thr Lys Thr Thr Arg lie *...* 65 70 75 80 * * · * • · * « : *: Ser Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Leu Met Met Thr Thr 85 90 95 * • * * *··! Ala Ser Met Ser Ser Met Ala Pro Thr Pro Val ser Pro Thr Gly
100 105 HO
• · · ·*«*· * * <210> 51
.***. <211> 20 **;·* <212 > DNA
: .·. <213> Artificial Sequence ··· · <220> ·;··· <223> PCR primer <400> 51 aatggtgaga aagatgacag 20 118265 26 <210> 52 <211> 18 <212> DNA ' <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 52 gttgaatgga gggaaagt 18 <210> 53
<211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer <400> 53 gtaggtattt atgattag 18 <210> 54 <211> 334
<212> DNA
<213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> CDS i <222> (1)..(333) <223> Coding sequence for the variant human DEFB126 gene <403> 54 atg aag tee eta ctg ttc acc ett gca gtt ttt atg etc ctg gcc caa 48
Met Lys Ser Leu Leu Phe Thr Leu Ala Val Phe Met Leu Leu Ala Gin 1 5 10 15 ttg gtc tea ggt aat tgg tat gtg aaa aag tgt eta aac gac gtt gga 96 ; ·.; Leu Val Ser Gly Asn Trp Tyr Val Lys Lys Cys Leu Asn Asp Val Gly .* .* 20 25 30 • · · ♦ *·'' ··· * ,·*·, att tgc aag aag aag tgc aaa cct gaa gag atg cat gta aag aat ggt 144 *...· lie Cys Lys Lys Lys Cys Lys Pro Glu Glu Met His Val Lys Asn Gly 35 40 45 • · *:· tgg gca atg tgc ggc aaa caa agg gac tgc tgt gtt cca get gac aga 192 "" Trp Ala Met Cys Gly Lys Gin Arg Asp Cys Cys Val Pro Ala Asp Arg 50 55 60 cgt get aat tat cct gtt ttc tgt gtc cag aca aag act aca aga att 240 .:. Arg Ala Asn Tyr Pro Val Phe Cys Val Gin Thr Lys Thr Thr Arg lie ***· 6S 70 75 80 • II • * * · "* tea aca gta aca gca aca aca gca aca aca act ttg atg atg act act 288 ...,: Ser Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Leu Met Met Thr Thr ΐ 85 90 95 * · • f *1* get teg atg tet teg atg get cct acc cgt ttc tcc cac tgg ttg a 334 : Ala Ser Met Ser Ser Met Ala Pro Thr Ar9 phe Ser His Trp Leu j 100 105 110 • · <210> 55 27 11i2tb <211> m v
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 55
Met Lys Ser Leu Leu Phe Thr Leu Ala Val Phe Met Leu Leu Ala Gin 1 5 10 15
Leu Val Ser Gly Asn Trp Tyr Val Lys Lys Cys Leu Asn Asp Val Gly 20 25 30
Tie Cys Lys Lys Lys Cys Lys Pro Glu Glu Met His Val Lys Asn Gly 35 40 45
Trp Ala Met Cys Gly Lys Gin Arg Asp Cys Cys Val Pro Ala Asp Arg 50 55 60
Arg Ala Asn Tyr Pro Vai Phe Cys Vai Gin Thr Lys Thr Thr Arg He 65 70 75 80
Ser Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Leu Met Met Thr Thr 85 90 95
Ala Ser Met Ser Ser Met Ala Pro Thr Arg Phe Ser His Trp Leu 100 105 110 <210> 56 <211> 50
<212> DNA
• ·,· <213> Artificial Sequence / / <220> ; !_; : <223> snapshot primer ··· <400> 56 *...· tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttgctcaat ggctttctct 50 • · · • · * a * ··· • · * # **· * · * ♦ *·· ·«· ··*· ··· * · • · ··· «•••a a # • a ♦ • a • a • a ♦ a • a • aa · · ·· a
Mata • a

Claims (29)

3d 1 1 8265
1. Menetelmä kardiovaskulaarisen sairauden riskin määrittämiseksi havainnoimalla geneettistä vaihtelua tai polymorfismeja eli mutaatioita biologisessa näytteessä, jossa 5 menetelmässä havainnoidaan ihmisen beetadefensiini-l:n genotyyppimuunnoksen, joka käsittää 3'UTR+5A—>G-mutaation, ja/tai ihmisen beetadefensiini-129:n genotyyppimuunnoksen, joka käsittää IVSl-13_-12insCTC-mutaation, läsnäolo tai poissaolo biologisessa näytteessä, mainitun genotyyppimuunnoksen läsnäolon osoittaessa kardiovaskulaarisen sairauden lisääntynyttä riskiä kohteella, josta biologinen näyte on J 10 peräisin.
2. Förfarande enligt patentkravet 1, i vilket detektionssteget är en DNA-bestämning.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa havainnoimisvaihe on DNA-määritys.
3. Förfarande enligt patentkravet 1, i vilket detektionssteget utförs genom användning av gen- eller DNA-chip, -mikroarray, -remsa, -panel eller en motsvarande kombination av 15 flera än en gen, mutation eller RNA-ekspression, som skall bestämmas.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa havainnointi vaihe toteutetaan käyttämällä geeni- tai DNA-sirua, -mikroarrayta, -liuskaa, -levyä tai samanlaista, useamman kuin yhden määritettävän geenin, mutaation tai RNA-ekspression yhdistelmää.
4. Förfarande enligt patentkravet 1, i vilket allelkombinationen bestäms genom användning av en polymeraskedjereaktion. :\j 20 5. Förfarande enligt patentkravet 1, i vilket det biologiska provet är ett blodprov eller ett • · • buccalt strykprov och genomiskt DNA isoleras frän nämnda prov. • 1 · · * · 1 • · * # • · 1
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa alleelikuvio määritetään käyttämällä | • · . ,·£ • ;*; polymeraasiketjureaktiota. :f * * * * . *< * · * · · '· * * » · > · · jyJ
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa biologinen näyte on verinäyte tai • * · ·;· poskivanunäyte ja genomi-DNA eristetään mainitusta näytteestä. • · · * 25 ' • * · j t
6. Förfarande enligt patentkravet 1, i vilket detektionssteget är baserad pä en fängstsond, • 1 1 • · » ···· :’125 7. Förfarande enligt patentkravet 1, i vilket nämnda kardiovaskulära sjukdom är en akut * 1 · " myokardinfarkt (AMI) eller kranskärlssjukdom (CHD). ·· · * · · * 1^: 8. Förfarande enligt patentkravet 1, i vilket den genetiska variationen ytterligare . .1. detekteras i gener, som har selekterats frän en grupp, som omfattar 30 *·· a) alfa-2B-adrenoceptor • · · • · • · · · · » • · 36 b) apo lipoprotein B och 118265 c) beta-2-adrenerga receptor varvid närvaron av variantgenotypen i nämnda gen visar en ökad risk för en 5 kardiovaskulär sjukdom hos nämnda objekt
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa havainnointivaihe perustuu . pyyntikoettimeen. • * · • * * · • · · * . !
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu kardiovaskulaarinen • * .···. 30 sairaus on akuutti sydäninfarkti (AMI) tai sepelvaltimotauti (CHD). * · · * • · * ··· ·*· ···''' * · • · *·· ^ 118265 31
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa geneettinen vaihtelu määritetään ; 'Xl lisäksi geeneistä, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu: 5 a) alfa^B-adrenoseptorista, b) apolipoproteiini B:stä ja c) beeta-2-adrenergisestä reseptorista jolloin genotyyppimuunnoksen läsnäolo mainituissa geeneissä osoittaa 10 kardiovaskulaarisen sairauden lisääntynyttä riskiä mainitulla kohteella.
9. Förfarande enligt patentkravet 8, i vilket nämnda variantgenotyp är insertions/deletionsmutationen av alfa-2B-adrenoceptorgenen, eller nämnda variantgenotyp är Glyl6Arg-och/eller Glu27Gln-mutationen av den beta-2-adrenerga 10 receptoren,
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, jossa mainittu genotyyppimuunnos on alfa-2B-adrenoseptorigeenin insertio/deleetiomutaatio, tai mainittu genotyyppimuunnos on beeta-2- adrenergisen reseptorin GlylöArg-ja/tai Glu27Gln-mutaatio. , ' 15 ^
10. Förfarande enligt patentkravet 8, i vilket nämnda variantgenotyp ärThr98Ile- ; mutationen av apolipoprotein-B-genen. 15 11. Förfarande enligt patentkravet 1, vilket förfarande vidare omfattar ett steg, i vilket konsentration av kolesterol i blod, serum eller plasma, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol, trigl yserid, apolipoproteinet B och AI, fibrinogen, ferritin, transferrin reseptor, C-reaktiv protein, insulin i serum eller plasma bestäms för att bekräfta indikeringen frän detektionssteget. M ·1. : 20 * M * a : 12. Förfarande enligt patentkravet 1, vilket förfarande vidare omfattar ett steg, i vilket • 1 · · ,.' • · · ·./ : : sannolikheten för en kardiovaskulär sjukdom kalkyleras genom användning av en * 1 · logistisk regressionsekvation pä följande sätt: • 1 · * • · 1 • a · ·
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, jossa mainittu genotyyppimuunnos on apolipoproteiini-B-geeninThr98Ile-mutaatio.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka käsittää lisäksi vaiheen, jossa .‘. j 20 määritetään veren, seerumin tai plasman kolesterolin, HDL-kolesterolin, LDL- j kolesterolin, triglyseridin, apolipoproteiini B:n ja AI:n, fibrinogeenin, ferritiinin, f • · · · transferriinireseptorin, C-reaktiivisen proteiinin, seerumin tai plasman insuliinin • * · ;*’*· konsentraatio havainnointivaiheesta hankitun osoituksen vahvistamiseksi. ··· ··· ··*·
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka käsittää lisäksi vaiheen, jossa • · · lasketaan kardiovaskulaarisen sairauden todennäköisyys käyttämällä logistista ·*».. regressioyhtälöä seuraavasti: • · ♦ * ♦ • · • · · ··*·. Kardiovaskulaarisen sairauden todennäköisyys = [1 + e W'a+s(bl*Xl))] '•jossa e on ,···. 30 Napierin vakio, X; ovat kardiovaskulaariseen sairauteen liittyviä muuttujia, bj ovat näiden • · • · · muuttujien kertoimia logistisessa funktiossa ja a on vakiotermi logistisessa funktiossa. • * • · · * **· • · • · • · · 32 ,. 1 1 8265 . .Λ'
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, jossa aja bj määritetään väestöstä, jossa menetelmää on määrä käyttää.
14. Förfarande enligt patentkravet 12, i vilket Xi selekteras Mn en mängd variabler, som har uppmätts i en population, i vilken förfarandet är avsett att användas. 5 15. Förfarande enligt patentkravet 12, i vilket b, har värden mellan -20 - 20 och/eller i vilket Xi är binära variabler, som kan ha värden 0 (noli) eller 1 (ett), eller som är kodade som värden 0 (noll) eller 1 (ett).
14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, jossa Xi on valittu muuttujien joukosta, jotka on mitattu väestöstä, jossa menetelmää on määrä käyttää.
15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, jossa bj ovat arvojen-20 ja 20 välillä ja/tai jossa Xi ovat binäärisiä muuttujia, joilla voi olla arvot 0 (nolla) tai 1 (yksi) tai jotka I 10 on koodattu 0:ksi (nollaksi) tai l:ksi (yhdeksi).
16. Förfarande enligt patentkravet 12, i vilket i har värden mellan 0 (ingenting) 10 - 100 000.
16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, jossa i on arvojen 0 (ei yhtään) ja 100 000 välillä.
17. Förfarande enligt patentkravet 12, i vilket en kortvarig, medelläng och/eller längvarig risk för CHD och/eller AMI hos objektet förutspäs.
17. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, jossa ennustetaan kohteen CHD:n ja/tai AMI:n lyhytkestoinen, keskikestoinen ja/tai pitkäkestoinen riski.
18. Användning av en testförpackning för att detektera en genetisk variation eller polymorfism, dvs. mutation i en defensingen genom att bestämma risken för akut hjärtinfarkt (AMI) och kranskärlssjukdom (CHD) hos ett objekt, varvid testförpackningen omfattar medel för detektering av en human betadefensin-1 variantgenotyp, som omfattar mutationen 3'UTR +5A—»G, och/eller en human betadefensin-129 variantgenotyp, som : ’ ·. · 20 omfattar mutationen IVS1 -13_-12insCTC, och eventuellt programvara för tolkningen av • « ; bestämningens resultat. «M · • · · • · • · • 1 · : 1 1 1: 19. Användning enligt patentkravet 18, i vilken testförpackningen vidare omfattar medel ^j· för detektering av en genetisk variation eller polymorfism, dvs. mutation i gener, som har 25 selekterats frän en grupp, som omfattar • · | a) alfa-2B-adrenoceptor • · b) apolipoproteinet B och . c) beta-2-adrenerga receptor 30 • · * · · *· · · • · · • · • · 1 ···«· • · 38 118265
18. Testipakkauksen käyttö geneettisen vaihtelun tai polymorfismin eli mutaation havainnoimiseen defensiinigeenissä akuutin sydäninfarktin, AMI, ja sepelvaltimotaudin, : 20 CHD, riskin määrittämiseksi kohteella, testipakkauksen käsittäessä välineet ihmisen • · j .1. beetadefensiini-1 :n genotyyppimuunnoksen, joka käsittää 3'UTR +5A—>G -mutaation, * 2 1 2 ;3; ja/tai ihmisen beetadefensiini-129:n genotyyppimuunnoksen, joka käsittää IVS1-13_- • 1 · :3: 12insCTC-mutaation, havainnointiin ja mahdollisesti ohjelmiston määrityksen tulosten * · 1 *:. tulkitsemiseksi. ·1·1 25 , • 1 ·
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen käyttö, jossa testipakkaus lisäksi käsittää välineet geneettisen vaihtelun tai polymorfismin eli mutaation havainnointiin geeneistä, jotka on * :”2 valittu ryhmästä, joka koostuu: * 1 · • 1 1 • 1 0 m 1 .···. 30 a) alfa-2B-adrenoseptorista, • 1 * 1 1 b) apolipoproteiini B:stä ja t · · • 1 · · 2 • · 3 * · · 33 1 1 8265 c) beeta-2-adrenergisestä reseptorista
20. Användning enligt patentkravet 19, varvid den genetiska variationen ärbestämd säsom i patenkravet 9 eller 10.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, jolloin geneettinen vaihtelu on kuten patenttivaatimuksissa 9 tai 10 on määritelty. 5 ;
21. Användning enligt nägot av patenkraven 18 - 20, varvid testförpackningen omfattar 5 en fängstnukleinsyrasond, med vilken specifikt nämnda genetiska variation kan identifieras.
21. Jonkin patenttivaatimuksista 18 - 20 mukainen käyttö, jolloin testipakkaus käsittää nukleiinihappopyyntikoettimen, jolla voidaan spesifisesti tunnistaa mainittu geneettinen vaihtelu.
22. Användning enligt nägot av patenkraven 18 - 20, varvid testförpackningen omfattar tester baserade pä en DNA-chip, microarray, DNA-remsa, DNA-panel eller realtids-PCR. 10
22. Jonkin patenttivaatimuksista 18 - 21 mukainen käyttö, jolloin testipakkaus käsittää DNA-siruun, mikroarrayhin, DNA-liuskaan, DNA-levyyn tai tosiaikaiseen PCR:ään perustuvia testejä.
23. Användning enligt nägot av patenkraven 18 - 20, varvid testförpackningen omfattar ett frägeformulär för att skaffa patientinformation, som hänför sig till aider, kön, längd, vikt, familjehistoria beträffande hypertension och hyperkolesterolemia och patienthistoria beträffande kardiovaskulära sjukdomar. 15
23. Jonkin patenttivaatimuksista 18-22 mukainen käyttö, jolloin testipakkaus käsittää 15 kyselylomakkeen potilastiedon hankkimiseksi koskien ikää, sukupuolta, pituutta, painoa, hypertension ja hyperkolesterolemian perhehistoriaa, lääketieteellistä historiaa koskien kardiovaskulaarisia sairauksia.
24. Isolerad nukleinsyra, som kodar för alfadefensin-5-protein, varvid nämnda nukleinsyra omfattar 1VS1+243G—>C -mutationen, och vars nukleinsyrasekvens visas i sekvensen SEQ ID NO:7. : * ·.: 20 25. Isolerad nukleinsyra, som kodar för betadefensin-129-protein, varvid nämnda : : : nukleinsyra omfattar IVS1 -13 - 12insCTC -mutationen, och vars nukleinsyrasekvens :1: visas i sekvensen SEQ ID NO:32. J ··· • · ♦ • * • · • · · . . *:* 26. Nukleinsyra enligt patentkrav 24 eller 25, som omfattar RNA-sekvens. #·· : : 25 ··
24. Eristetty nukleiinihappo, joka koodaa alfadefensiini-5-proteiinia, mainitun : 20 nukleiinihapon käsittäessä IVS1+243G—>C -mutaation, ja jonka nukleiinihappo- • 1 j .2. sekvenssi esitetään sekvenssissä SEQ ID NO:7. • · · 1 ••e·." • · -• · · i"2. 25. Eristetty nukleiinihappo, joka koodaa beetadefensiini-129-proteiinia, mainitun • · · ... nukleiinihapon käsittäessä IVSl-13_-12insCTC-mutaation, ja jonka ···· ;3; 25 nukleiinihapposekvenssi esitetään sekvenssissä SEQ ID NO:32. ···
25 Sannolikheten för en kardiovaskulär sjukdom = [1 + e i vilken e är Napiers konstant, X1 är variabler, som hänför sig tili den kardiovaskulära sjukdomen, bjier är • 1·· koefficienter av dessa variabler i den logistiska funktionen, och a är en konstant term i * 1 · den logistiska funktionen. • 1 · * · · • 1 1 .2·. 30 13. Förfarande enligt patentkravet 12, i vilket a och bj bestäms i en population, i vilken * · 1 förfarandet används. • · · • · • 1 1 · · · 2 • 1 37 118265
26. Patenttivaatimuksen 24 tai 25 mukainen nukleiinihappo, joka käsittää RNA- ·3: sekvenssin. • · · « * 1 · * « · • 1 .···, 30 27. Menetelmä patenttivaatimuksessa 24 tai 25 määritellyn nukleiinihapon läsnäolon • · * · · määrittämiseksi biologisesta näytteestä menetelmän käsittäessä vaiheet: ♦ 1 · * « · · · 2 • · • 1 3 « · · : 34 1 1 8 2 6 5 a) käsitellään mainittua näytettä yksijuosteisen kohdenukleiinihapon hankkimiseksi, tai jos kohdenukleiinihappo on jo yksijuosteista, käytetään suoraan vaihetta (b); b) saatetaan mainittu kohdenukleiinihappo kosketukseen nukleiinihappopyyntikoettimen 5 ja nukleiinihappodetektorikoettimen kanssa; c) havainnoidaan pyyntikoettimen, kohdenukleiinihapon ja detektorikoettimen kompleksi.
27. Förfarande för att bestämma närvaron av nukleinsyran enligt patentkrav 24 eller 25 i ·· ' ♦ *·· ett biologiskt prov, varvid förfarandet omfattar stegen: > • · · . • · · . . • · • · · : ·*. a) behandling av nämnda prov för att erhälla en enkelkedjad mälnukleinsyra, eller om ··· .1. 30 mälnukleinsyran redan är enkelkedjad, används direkt steget b); • · · • · · • · • · * • · · · · • · i 39 1 1 8265 b) försättande av nämnda mälnukleinsyra i kontakt med en fängstnukleinsyrasond och en nukleinsyradetektorsond; c) detektering av komplex av fangstnukleinsyrasonden, malnukleinsyran och detektorsonden. 5
28. Förfarande enligt patentkravet 27, i vilket fangstnukleinsyrasonden fastnar eller är kabapel att fastna vid en fast fas och omfattar cDNA-sekvensen enligt patentkrav 26 och i vilket en signal, som har detekterats frän den fasta fasen, är ett bevis pä närvaron av nukleinsyran bestämd i patentkrav 24 eller 25 i provet. 10
28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, jossa nukleiinihappopyyntikoetin 10 kiinnittyy tai kykenee kiinnittymään kiinteään faasiin ja käsittää patenttivaatimuksen 26 mukaisen cDNA-sekvenssin ja jossa havainnoitu signaali kiinteästä faasista on osoitus patenttivaatimuksessa 24 tai 25 määritellyn nukleiinihapon läsnäolosta näytteessä. ΐ
29. Testipakkaus geneettisen vaihtelun tai polymorfismin eli mutaation havainnoimiseksi 15 defensiinigeenissä testipakkauksen käsittäessä välineet ihmisen beetadefensiini-129:n genotyyppimuunnoksen, joka käsittää IVSl-13_-12insCTC-mutaation, havainnointiin ja mahdollisesti ohjelmiston määrityksen tulosten tulkitsemiseksi käytettäväksi akuutin sydäninfarktin, AMI, ja sepelvaltimotaudin, CHD, riskin määrittämiseen kohteella. • * • · · * ·· • · • · * * · ·*· .·;$ • · · * _; • · * • · φ · • * · **· * * * · • · ♦ • · · • · · · • · • « • · * * · • · V: * ·· • « * * • · φ • · · * · · 1 ' • « • · ·*· • · ♦ · ·· ··· ··· ··* • ... 1 * * • · ·· 35 1 1 8265 1 .Förfarande för bestämning av risken för en kardiovaskulär sjukdom genom att detektera en genetisk variation eller polymorfismer, dvs. mutationer i ett biologiskt prov, i vilket 5 förfarande detekteras närvaron eller fränvaron av en human betadefensin-1 variantgenotyp, som omfattar mutationen 3'UTR +5 A—»G, och/eller en human beta-defensin-129 variantgenotyp, som omfattar mutationen IVSl-13_-12insCTC, i ett biologiskt prov; varvid närvaron av variantgenotypen visar en ökad risk för en kardiovaskulär sjukdom för det objekt frän vilket det biologiska provet härstammar. 10
29. Testförpackning för att detektera en genetisk variation eller polymorfism, dvs. ' mutation i en defensingen, varvid testförpackningen omfattar medel for detektering av en human betadefensin-129 variantgenotyp, som omfattar mutationen IVSl-13_-12insCTC, i och eventuellt programvara för tolkningen av bestämningens resultat för användning i 15 bestämning av en risk för akut hjärtinfarkt (AMI) eller kranskärlssjukdom (CHD) hos ett objekt. • « • · · • * · • · • * · . * * · ♦ « · · * * · • · • * φ · · * « · * t • · * · · *·* * * * · * • · · * · • · • · · • · '* • · * • · · • · • · • · · ··· * · * • · • * ··· * • · · • · * • ··«·· • ·
FI20040052A 2004-01-15 2004-01-15 Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi FI118265B (fi)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20040052A FI118265B (fi) 2004-01-15 2004-01-15 Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi
PCT/FI2005/050007 WO2005068653A1 (en) 2004-01-15 2005-01-17 Method for detecting the risk of cardiovascular diseases such as acute myocardial infarction and coronary heart disease by analysing defensin
US10/586,312 US20070299025A1 (en) 2004-01-15 2005-01-17 Method for Detecting the Risk of Cardiovascular Diseases Such as Acute Myocardial Infarction and Coronary Heart Disease By Analysing Defesin
EP05701762A EP1711629A1 (en) 2004-01-15 2005-01-17 Method for detecting the risk of cardiovascular diseases such as acute myocardial infarction and coronary heart disease by analysing defensin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20040052A FI118265B (fi) 2004-01-15 2004-01-15 Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi
FI20040052 2004-01-15

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20040052A0 FI20040052A0 (fi) 2004-01-15
FI20040052A FI20040052A (fi) 2005-07-16
FI118265B true FI118265B (fi) 2007-09-14

Family

ID=30129385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20040052A FI118265B (fi) 2004-01-15 2004-01-15 Menetelmä akuutin sydäninfarktin ja sepelvaltimotaudin riskin havaitsemiseksi

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20070299025A1 (fi)
EP (1) EP1711629A1 (fi)
FI (1) FI118265B (fi)
WO (1) WO2005068653A1 (fi)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2789941A1 (en) * 2009-02-26 2010-09-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Infertility associated defb-126 deletion polymorphism
CN102552306B (zh) * 2010-12-13 2015-04-08 马鞍山国声生物技术有限公司 一种减少中性粒细胞抗菌肽产量的小分子干扰rna
RU2488111C1 (ru) * 2012-05-23 2013-07-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России) Способ определения риска развития инфаркта миокарда у больных с острым коронарным синдромом
CN113502325B (zh) * 2021-07-02 2024-09-10 厦门市妇幼保健院(厦门市优生优育服务中心、厦门大学附属妇女儿童医院、厦门市林巧稚妇女儿童医院) 用于孕期铁营养缺乏风险评估检测试剂盒与应用方法
CN113637738B (zh) * 2021-08-08 2023-07-28 华中科技大学同济医学院附属协和医院 与冠心病相关的snp位点及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070021360A1 (en) * 2001-04-24 2007-01-25 Nyce Jonathan W Compositions, formulations and kit with anti-sense oligonucleotide and anti-inflammatory steroid and/or obiquinone for treatment of respiratory and lung disesase
FI116940B (fi) * 2001-07-20 2006-04-13 Juvantia Pharma Ltd Oy Alfa-2B-adrenoseptorivälitteisen sairauden hoitoon tai ehkäisyyn käyttökelpoiset yhdisteet
RU2004105035A (ru) * 2001-07-20 2005-06-27 Ой Ювантиа Фарма Лтд (Fi) Соединения, полезные для лечения или профилактики заболевания, опосредованного альфа-2b-адреноцептором
FI115532B (fi) * 2002-10-07 2005-05-31 Jurilab Ltd Oy Menetelmä kardiovaskulaaristen sairauksien riskin havaitsemiseksi
GB0300718D0 (en) * 2003-01-13 2003-02-12 Ares Trading Sa Proteins
EP1616194A2 (en) * 2003-04-08 2006-01-18 Genova, Ltd. Secreted polypeptide species associated with cardiovascular disorders
WO2004106941A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-09 Genova Ltd. Secreted polypeptide species associated with cardiovascular disorders

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005068653A1 (en) 2005-07-28
EP1711629A1 (en) 2006-10-18
FI20040052A (fi) 2005-07-16
US20070299025A1 (en) 2007-12-27
FI20040052A0 (fi) 2004-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101582321B1 (ko) 심장성 부정맥의 위험 관리를 위한 유전적 마커
Ek et al. Mutation analysis of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1 (PGC-1) and relationships of identified amino acid polymorphisms to Type II diabetes mellitus
Buraczynska et al. Renalase gene polymorphisms in patients with type 2 diabetes, hypertension and stroke
DK2471954T3 (en) Susceptibility genetic variants associated with cardiovascular diseases
Gerull et al. Identification of a novel frameshift mutation in the giant muscle filament titin in a large Australian family with dilated cardiomyopathy
JP6628226B2 (ja) 痛風発症素因の評価方法
US20090098557A1 (en) Identification of genetic markers associated with parkinson disease
Yoshida et al. Association of genetic variants with hemorrhagic stroke in Japanese individuals
EP2116618A1 (en) Diagnosis and treatment of Kawasaki disease
WO2012107580A1 (en) In vitro diagnosis method for predicting a predisposition to cardiomyopathy
WO2013080227A1 (en) Genetic variants useful for risk assessment of arterial disease
WO2002098355A2 (en) Methods and reagents for diagnosis and treatment of insulin resistance and related conditions
Totomoch-Serra et al. The ADRA2A rs553668 variant is associated with type 2 diabetes and five variants were associated at nominal significance levels in a population-based case–control study from Mexico City
US20070299025A1 (en) Method for Detecting the Risk of Cardiovascular Diseases Such as Acute Myocardial Infarction and Coronary Heart Disease By Analysing Defesin
US20100167285A1 (en) Methods and agents for evaluating inflammatory bowel disease, and targets for treatment
US20050053956A1 (en) Detection of a predisposition for the development of coronary artery disease
Yesilada et al. Prevalence of known mutations and a novel missense mutation (M694K) in the MEFV gene in a population from the Eastern Anatolia Region of Turkey
M'dimegh et al. Identification of a novel AGXT gene mutation in primary hyperoxaluria after kidney transplantation failure
JP4956565B2 (ja) Ｅｄｇ５遺伝子多形ｖ２８６ａと二型糖尿病および静脈血栓症／肺塞栓症との関連性、並びに、その利用
JP2008000096A (ja) 尿路結石症の発症リスク判定方法、及び発症リスク判定用キット
US6414131B1 (en) Gene and methods for diagnosing neuropsychiatric disorders and treating such disorders
US20080194419A1 (en) Genetic Association of Polymorphisms in the Atf6-Alpha Gene with Insulin Resistance Phenotypes
de Jong et al. No association between Annexin A5 genetic variants and deep venous thrombosis
CN101622361A (zh) 用于心律不齐的风险管理的遗传标记物
JP5119378B2 (ja) ベータアゴニストに対する気管支拡張反応の検出及び予測方法

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118265

Country of ref document: FI