FI115532B

FI115532B - Menetelmä kardiovaskulaaristen sairauksien riskin havaitsemiseksi

Info

Publication number: FI115532B
Application number: FI20021783A
Authority: FI
Inventors: Jukka Salonen; Mia Pirskanen; Tomi-Pekka Tuomainen
Original assignee: Jurilab Ltd Oy
Priority date: 2002-10-07
Filing date: 2002-10-07
Publication date: 2005-05-31
Also published as: CA2501481A1; EP1554399A1; WO2004031407A1; AU2003268976A1; US20060166205A1; FI20021783A0; FI20021783A

Description

115532

Menetelmä kardiovaskulaaristen sairauksien riskin havaitsemiseksi

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän tunnistaa kohteen alttius kardiovaskulaarisille sairauksille tai riski kehittää sydäninfarkti (MI) tai 5 serebrovaskulaarinen aivohalvaus havainnoimalla geenipolymorfismeja ja muita geenimutaatioita kohteen biologisesta näytteestä ja mahdollisesti hankkimalla informaatiota koskien kohteen perhe- ja lääketieteellistä historiaa, verta, seerumia, plasmaa, virtsa-analyyttejä ja kliinisiä löydöksiä. Keksintö antaa myös käyttöön monimuuttujamallin, muuttujien yhdistelmän tai algoritmin, joka parhaiten kuvaa 10 kardiovaskulaaristen sairauksien, erityisesti MI:n ja aivohalvauksen, todennäköisyyttä. Keksintö koskee myös testipakkausta ja ohjelmistoa menetelmän suorittamiseksi.

KEKSINNÖN ALA

15 Esillä oleva keksintö on yleisesti suunnattu menetelmään sydäninfarktin (MI) ja serebrovaskulaarisen aivohalvauksen riskin arvioimiseksi yksilössä, kuten ihmisessä. Erityisesti keksintö kohdistuu menetelmään, joka käyttää hyväksi sekä geneettistä että fenotyyppistä informaatiota sekä kyselylomakkeilla hankittua informaatiota pistemäärän muodostamiseksi, joka pistemäärä antaa todennäköisyyden kehittää MI tai aivohalvaus.

20 Lisäksi keksintö antaa käyttöön testipakkauksen menetelmän toteuttamiseksi.

» · ·* *' Testipakkausta voidaan käyttää kardiovaskulaaristen sairauksien etiologiaan perustuvan » * ’; ’ diagnoosin määräämiseen hoidon ja ehkäisevien interventioiden, kuten • • ’ ruokavalioneuvojen, kohdistamiseksi sekä kohteen ositukseen kliinisissä kokeissa, jotka , , testaavat lääkkeitä ja muita interventioita.

"lv 25

KEKSINNÖN TAUSTA

Sepelvaltimosydänsairaus (CHD) ja serebrovaskulaarinen sairaus ovat multifaktorisairauksia ja johtavia kuolleisuuden, kuoleman ja invaliditeetin syitä • » » ;,; 30 maailmanlaajuisesti. Siitä huolimatta, että ikävakioitu CHD:n ja aivohalvauksen ‘! ‘ esiintyvyys ja niistä johtuva kuolleisuus ovat vielä laskemassa läntisessä maailmassa, ‘ ’ ‘ kardiovaskulaaristen tapahtumien lukumäärä ja niitä seuraavat sairaalassaolot ja I » » * · ‘ * · · * kustannukset ovat kasvamassa väestön elinajan odotuksen kohoamisen johdosta. Kaksos- ja migraatiotutkimuksiin perustuen on arvioitu, että CHD:n ja aivohalvauksen periytyvyys 2 115532 on 50 - 60 %:n luokkaa eikä mitään tärkeitä geenivaikutuksia ole. Siten monet geenit ja ei-geneettiset riskitekijät myötävaikuttavat CHD:n kehittymiseen ja etenemiseen. CHD:n erilaisilla kliinisillä ilmenemismuodoilla (se on angina pectoris, sydäninfarkti, äkillinen kuolema) ja aivohalvauksen kliinisillä ilmenemismuodoilla on osittain päällekkäiset, mutta 5 myös hieman erilliset patofysiologia ja riskitekijät.

CHD ja aivohalvaus voivat aiheutua erilaisissa yksilöissä eri syistä ja eri patofysiologisten reaktioteiden kautta. Usein kuitenkin samat riskitekijät ja reaktiotiet vaikuttavat, mutta niiden tärkeys kussakin yksilössä vaihtelee. Mitä tulee patofysiologiaan, CHD ja 10 aivohalvaus voivat aiheutua sepelvaltimoiden (serebrovaskulaaristen valtimoiden) obstruktiosta, näiden vasokonstriktiosta tai vasospasmista, tromboottisesta ilmiöstä tai rytmihäiriöistä. Sepelvaltimon tai serebrovaskulaarisen valtimon obstruktion aiheuttaa useimmiten aterooman muodostuminen. Tämä on monimutkainen sairaus, mutta lipidit ja niiden metabolia, kuten oksidaatio, näyttelevät avainroolia. Muita aterooman 15 muodostumiseen johtavia tärkeitä tekijöitä ovat tupakointi, hypertensio, diabetes, lihavuus ja hyperhomokysteinemia. Lisäriskitekijät sisältävät kohonneet koagulaatiotekijät, verihiutaleaktivaation ja typpioksidin alentuneen saatavuuden. Miehillä, vanhemmilla henkilöillä ja niillä joilla on CHD:tä perhehistoriassa, on kohonnut riski.

20 Henkilöillä, joilla on mutaatioita geeneissä, jotka säätelevät lipidejä, niiden metaboliaa, * I · ‘, ; verenpainetta, verihiutalefunktioita, koagulaatiota, fibrinolyysiä, homokysteiinimetaboliaa .; ' ja kardiaalisen lihaksen toimintaa, voi odottaa olevan CHD:n kohonnut riski. Näiden mutaatioiden lukumäärän arviointia voidaan käyttää ennustamaan MI:täja . . serebrovaskulaarista aivohalvausta.

• « · • i · 25 • ·

Joukolla meta-analyysejä on tutkittu monimuuttujariskifunktioita erilaisista väestöistä ,:. CHD:n ennustamisessa. Mikään näistä ei ole koskenut spesifisten, genotyypitettyjen « · » · . *". geenimutaatioiden vaikutuksia. Äskettäinen meta-analyysi koski riskin määräämistä, ', suhteellisten riskien suuruutta ja absoluuttisen riskin arviointia prospektiivisissa ‘!!! 30 seurantatutkimuksissa (Diverse Populations Collaborative Group 2002). Tulosmitta on • ’ CHD:stä johtuva kuolema. Analyysi käsitti 105 420 miestä ja 56 535 naista, jotka olivat • t *' iältään 35 -74 vuotta ja vapaita CHD:stä perustasolla, 16 havainnointitutkimuksesta ja '' * yhteensä 27 analyyttisestä ryhmästä. Toimintaominaiskäyrän alle jäävää pinta-alaa (AUC) ohjaavan vastaanottajan alla käytettiin päättelemään monimuuttujariskifunktion kyky 3 115532 määrätä riski oikein. AUC:t erosivat merkittävästi tutkimusten välillä (p < 0,01), mutta olivat hyvin samanlaisia erilaisten riskifunktioiden suhteen sovellettuna samaan väestöön, mikä viittasi samanlaiseen kykyyn sijoittaa riski erilaisiin malleihin. Pääriskitekijöihin (ikä, systolinen verenpaine, seerumin kokonaiskolesteroli, tupakointi ja diabetes) liittyvien 5 suhteellisten riskien laajuus vaihteli merkittävästi eri tutkimuksissa (p < 0,05 homogeenisyyden suhteen). Absoluuttisen riskin ennuste ei ollut kovin tarkka useimmissa tapauksissa, kun yhdestä tutkimuksesta saatua mallia sovellettiin erilaiseen tutkimukseen. Tekijät päättelivät, että kun tarkasteltiin kvalitatiivisesti, pääriski tekijät ovat yhteydessä CHD-kuolleisuuteen vaihtelevissa väestösarjoissa.

10

Uusi Sheffieldin taulukkoja muunnettu joint British societies -sepelvaltimoriskiennuste (JBS) -kaavio ovat laajasti käytettyjä (Rabindranath et ai. 2002). JBS-kaavio approksimoi iän ja systolisen verenpaineen ja uusi Sheffieldin taulukko puolittaa verenpaineen, ja nämä yksinkertaistukset voivat johtaa diagnostiseen epätarkkuuteen. Menetelmät: Kaavioiden 15 diagnostinen toimintakyky arvioitiin ja verrattiin yksilöityä laboratoriota vastaan perustuen CHD-riskin laskemiseen 1 102 kohteella ensihoidossa. Uusi Sheffieldin taulukkoja muunnettu JBS-kaavio suoriutuivat yhtä hyvin.

Useimmat aikaisemmin käytetyt mallit, joita on käytetty ennustamaan 20 sepelvaltimosydänsairaudesta (CHD) johtuvan kuoleman yksilöllistä riskiä kehitettiin • « « *, ; kolme vuosikymmentä sitten saaduista Framinghamin sydäntutkimuksen tuloksista. CHD- . * ’ kuolleisuusasteet ovat laskeneet merkittävästi tuon ajan jälkeen sekä riskitekijätilanteen • « • »» * , että lääketieteellisten interventioiden parantumisen tuloksena. Tämän yhden tutkimuksen . . tuloksien yleistäminen väestöön kokonaisuudessaan pysyy tärkeänä asiana. Liao ja • * · . * · ) 25 työtoverit (1999) vertasivat ennustavia funktioita, jotka oli johdettu CHD:n • » pääriskitekijöistä Framinghamista ja kahdesta muusta äskeisestä amerikkalaisesta ,:. seurannasta, the First and Second National Health and Nutrition Examination Survey • « · * . . (NHANESI ja NHANESII). Osallistujat käsittivät Framinghamin tutkimuksesta 1 846 miestä ja 2 323 naista, jotka olivat iältään 35 - 69 vuotta ja vapaita CHD:stä neljännessä ]!!! 30 tutkimuksessa (1954 - 1958), 2 753 miestä ja 3 858 naista NHANES Irstä (1971 - 1975); ja 2 655 miestä ja 3 050 naista NHANES IEsta (1976 - 1980). Kolmea seurantaa seurattiin 24 • * ' vuotta (Framingham) 20 vuotta (NHANES I) ja 15 vuotta (NHANES II). Tutkimusten joukossa oli merkittävää heterogeenisyyttä Coxin kertoimien suuruudessa yksittäisille tekijöille (se on systolinen verenpaine, seerumin kokonaiskolesteroli ja tupakointitilanne) 4 115532 erityisesti miesten joukossa. Kun riskitekijöitä tarkasteltiin kollektiivisesti, funktioilla, jotka oli johdettu erilaisista seurannoista ja joita oli sovellettu niihin, oli kuitenkin samanlainen kyky sijoittaa yksittäinen riski. Toimintaominaiskäyrän alle jäävät pinta-alat olivat 0,71 - 0,76 miehillä ja 0,76 - 0,81 naisilla, kun erilaisia riskifunktioita sovellettiin 5 niiden omaan väestöön tai toiseen väestöön. Kumulatiivinen CHD-eloonjääminen, joka havaittiin naisilla kahdessa seurannassa, oli lähellä sitä, mitä ennustettiin Framinghamin yhtälöstä. Tekijät päättelivät, että Framinghamin riskimalli CHD-kuolleisuusasteiden ennustamiseksi antaa kohtuullisen ennusteen, joka määrää riskin Yhdysvaltojen valkoisen väestön yksilöille ajanjaksolla 1975 - 1990. Kuitenkin absoluuttisen riskin ennustaminen 10 on vähemmän tarkkaa.

KEKSINNÖN YHTEENVETO

Esillä olevan keksinnön mukainen kohde on menetelmä kardiovaskulaaristen sairauksien, 15 erityisesti MI:n ja aivohalvauksen, riskin tunnistamiseksi havainnoimalla geenipolymorfismeja ja muita geenimutaatioita kohteen biologisesta näytteestä. Informaatio, joka on saatu tästä menetelmästä, voidaan yhdistää muun yksilöä koskevan informaation kanssa, esim. tulokset verimittauksista, kliinisestä tutkimuksesta ja kyselylomakkeista. Geneettinen informaatio sisältää tiedot mutaatioista geeneissä, jotka ; 20 ovat yhteydessä MI:n ja/tai aivohalvauksen kanssa. Verimittaukset sisältävät veri- tai I »» · : ’, · plasma- tai seerumianalyyttien määritykset, jotka ennustavat CHD:tä tai aivohalvausta,

» I

*. ’. · kuten veren lipidi-, homokysteiini-, glukoosi- ja insuliinikonsentraatiot ja • · • » ·* ’' nikotiinimetaboliittien virtsaerityksen. Kyselylomakkeella kerättävä informaatio sisältää informaation koskien sukupuolta, ikää, perhe- ja lääketieteellistä historiaa ja terveyteen ';* 25 liittyviä tapoja, kuten tupakointia. Tutkimuksella kerätty kliininen informaatio sisältää * ” ’ esim. informaation koskien pituutta, painoa, lonkan ja vyötärön ympärysmittaa, systolista ja diastolista verenpainetta, sykettä, muita elektro-/audiografisia parametrejä ja maksimaalista hapenottoa.

30 Keksintö antaa erityisesti käyttöön menetelmän geneettisen muuntelun tai polymorfismin, so. mutaation, havainnoimiseksi kohteella havainnoimalla geneettistä muuntelua tai polymorfismia, se on mutaatiota, geeneissä, jotka koodaavat: t (a) a2B-adrenoseptoria, ja 5 115532 (b) apolipoproteiinia B; ja vähintään yhdessä geeneistä, jotka koodaavat: 5 (c) dimetyyliarginiinidimetyyliaminohydrolaasia 1 (d) fibrinogeeni beetaa (e) natriureettista peptidiprekursoria A; ja

(f) neuropeptidiä Y

10 jossa menetelmässä i) hyödynnetään biologista näytettä, joka on saatu testattavasta potilaasta, ii) havainnoidaan mutaatioita geeneissä, mutaation löytymisen kolmesta tai useammasta geenistä osoittaessa potilaan noussutta riskiä sairastua 15 sepelvaltimotautiin ja/tai sydäninfarktiin.

KEKSINNÖN MUKAISTEN EDULLISTEN SUORITUSMUOTOJEN 20 YKSITYISKOHTAINEN SELITYS

• · » • * · • < * * * » ’. ’.' Edullisessa suoritusmuodossa keksintö käsittää informaation yhdistelmän suuresta joukosta : ‘ muuttujia (mittauksia) MI:n ja aivohalvauksen todennäköisyyden ennustamiseksi.

Ennusteinformaatio sisältää genomisessa DNA:ssa olevien genotyyppien ja haplotyyppien ; / 25 arvioinnin ja mahdollisesti tiedot, jotka ovat hankittavissa haastatteluilla, ’ ’' kyselylomakkeilla, kliinisellä tutkimuksella ja/tai verianalyyttimittauksilla. Tämä ennusteinformaatio voidaan kerätä missä iässä tahansa. Tämä menetelmä on myös '!!! sovellettavissa keski-ikäisiin henkilöihin.

30 Genomisia DNA-genotyyppejä koskeva informaatio koskee polymorfismia, kuten yhden nukleotidin polymorfismeja (SNP:t) ja mutaatioita, esim. seuraavissa geeneissä (OMIM-:,; ]: lyhenteet): APOA1, APOA2, APOA4, APOB, APOC1, APOC2, APOC3, APOC4, APOD, ‘: : APOE, ARG, LDLR, OLR1, MSR1, MSR2, LP A, LPL, LIPC, LIPG, CETP, ETL, GPIIIa, ICAM1, ICAM2, ICAM3, SELL, SELE, MMP1, MMP3, ITGB n, ADD1, ADD2, ADD3, 6 11 E 5 32 NPY, NPY1R, NPY2R, NPY3R, NPY4R, NPY5R HFE1, HFE2, HFE3, TFRC, TFR2, PONI, PON2, SODI, SOD2, SOD3, CAT, GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTP1, GPX1, GPX3, TNFA, TNFB, TRX, NOS3, NOS3, DDAH1, DDAH2, ADRB1, ADRB2, ADRB3, F2, F5, F7, F8, FI3, VWF, ΡΑΠ, PAI2, FGA, FGB, FGG, ACE, AGT, AGTR1, ATG, 5 SCAP, SCNN1A, SCNN1B, NPPA, CBS, MTHFR tai missä tahansa muissa ehdokasgeeneissä, joiden havaitaan liittyvän alttiuteen MI:lle tai aivohalvaukselle.

Tiedot, jotka voidaan hankkia kyselylomakkeella, haastattelulla tai kliinisellä tutkimuksella, sisältävät informaatiota koskien: 10 1) ikää, 2) sukupuolta, 3) lääketieteellistä historiaa, se on vallitsevia sairauksia, 4) perhehistoriaa, se on vanhempien ja sisarusten sairauksia, 5) tupakointia, 15 6) alkoholinkäyttöä, 7) fyysistä aktiivisuutta ja liikuntaa, 8) korkeaa painoa tai liikalihavuutta lapsuudessa ja nuoruudessa, 9) luonteenpiirteitä kuten depressiota, ahdistuneisuutta, vihamielisyyttä, 10) psykologisia ja mielentiloja kuten vihaa, ärtyisyyttä, 20 11) alhaista itsekunnioitusta tai heikkoa minäkuvaa, \ ; * 12) sosiaalisten taitojen puutetta, sosiaalista eristymistä, sosiaalisen verkoston puuttumista, . ’ ‘ 13) minäkuvaa, joka edistää alkoholin käyttöä (esim. kevyesti ottava), * * * 14) aikuisuuden sosioekonomisia olosuhteita (esim. olemalla naimaton, eronnut tai leski . . aviosuhteeltaan, omistamatta puhelinta, alhainen sosioekonominen asema, työttömyys ja 25 urbaani asuinpaikka,

• I

15) stressaavia elämäntapahtumia, 16) selviytymistapoja, selviytymiskapasiteettia, vihakontrollia, . * . 17) diabeteshistoriaa, 18) korkeaa, havaittua kardiovaskulaarista riskiä, 77. 30 19) korkeaa sairaalassaolojen määrää, huonoa terveydentilaa, ’ ’ 20) verenpainetta, sykettä, maksimaalista hapenottoa, *, i ] ’ 21) muuta asiaankuuluvaa informaatiota, jota voidaan kerätä kohteen itse hoitamalla ‘'1 ’ kyselylomakkeella, kohteen haastattelulla tai kliinisellä tutkimuksella.

7 115532

Informaatio, joka on hankittavissa mittauksilla veri-, verisolu-, plasma-, seerumi- tai virtsanäytteistä, sisältää: 1) seerumin tai plasman kolesteroli, HDL- ja LDL-kolesteroli, 2) seerumin tai plasman triglyseridit, 5 3) seerumin tai plasman apolipoproteiinit, 4) seerumin tai plasman insuliinikonsentraatio, 5) veren tai seerumin glukoosikonsentraatio, 6) veren hemoglobiinikonsentraatio, 7) seerumin ferritiini- tai transferriinireseptorikonsentraatiot, 10 8) seerumin fibrinogeenin ja muun koagulaatiotekijän konsentraatio, 9) verihiutaleaktivaation, -aggregaation ja/tai -adheesion mittaus, 10) seerumin tai plasman tulehdusmarkkereiden, kuten CRP:n, konsentraatiot, 11) muu asiaankuuluva informaatio, joka voidaan hankkia kemiallisilla tai biokemiallisilla mittauksilla.

15

Lukuisia genotyypitysmenetelmiä on kuvattu alalla nukleiinihappojen analysoimiseksi spesifisten sekvenssivaihteluiden, esim. SNP:iden, insertioiden ja deleetioiden läsnäolon suhteen (katsaukseksi katso Syvänen 2001 ja Nebelcheva Kristensen et ai. 2001). Näissä menetelmissä nukleiinihappoa sisältävä näyte (esim. veri, kudosnäytepala tai poskisolut) 20 hankitaan potilaalta ja kiinnostavat sekvenssivaihtelut tunnistetaan ja visualisoidaan : · ’ nukleiinihapoista.

• 1 · • < · • t • ’ Geeneissä olevia alleelimuunnoksia voidaan erottaa entsymaattisilla menetelmillä • · . . (restriktioendonukleaasien, DNA-polymeraasien, ligaasien jne. avulla), elektroforeettisilla 25 menetelmillä [esim. yksijuosteinen konformaatiopolymorfismi (SSCP),

• I

heterodupleksianalyysi, fragmenttianalyysi ja DNA-sekvensointi], kiinteäfaasimäärityksillä : t (dot blotit, mikroarrayt, mikrohiukkaset, mikrotiitterilevyt jne.) ja fysikaalisilla , · *. menetelmillä [esim. hybridisaatioanalyysi, massaspektrometria ja denaturoiva korkean erotuskyvyn nestekromatografia (DHPLC)]. Useimmissa genotyypitysmäärityksistä ';;; 30 käytetään erilaisia polymeraasiketjureaktio (PCR) -sovelluksia sekä lisäämään signaalin suhdetta taustaan sekä säästämään näytteen nukleiinihappoa ennen alleelierotusta.

'· ’ * Havainnoitavia leimoja (fluorokromit, radioaktiiviset leimat, biotiini, muunnetut ’ * · · ’ nukleotidit, hapteenit jne.) voidaan käyttää tehostamaan alleelimuunnosten visualisoimista.

115532 8

Keksintö perustuu periaatteeseen, että suoritetaan pieni joukko genotyypityksiä ja tyypitettävät mutaatiot valitaan niiden kyvyn perusteella ennustaa MI:tä ja/tai aivohalvausta. Tästä syystä voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää genomisessa DNA-näytteessä olevien mutaatioiden genotyypittämiseksi. Jos käytetään ei-rinnakkaisia 5 menetelmiä, kuten tosiaikaista PCR:ää, tyypitykset tehdään peräkkäin. PCR-reaktiot voidaan limittää tai ne voidaan toteuttaa erikseen peräkkäin tai rinnakkaissa erissä.

Pistemäärä, joka ennustaa MI:n tai aivohalvauksen todennäköisyyttä, voidaan laskea käyttämällä monimuuttujaelinaikamallia tai logistista regressioyhtälöä seuraavasti: 10

Kardiovaskulaarisen sairauden todennäköisyys = [1 + e ('('a + I(bl1Xl))]''jossa e on Napierin vakio, Xj ovat kardiovaskulaariseen sairauteen liittyviä muuttujia, b, ovat näiden muuttujien kertoimia logistisessa funktiossa ja a on vakiotermi logistisessa funktiossa. Malli voi lisäksi sisältää minkä tahansa vuorovaikutuksen (tuotteen) tai minkä tahansa 15 muuttujien Xj termejä, esim. bjXj. Algoritmi on kehitetty yhdistämään informaatio yksinkertaisen MI:n ennusteen tuottamiseksi riskin prosenttiosuutena 10 vuodessa. Vaihtoehtoinen tilastollinen malli on elinaikamalli, kuten Coxin verrannollisten hasardien malli.

20 KOKEELLINEN OSA

• 1 • f ·

Yksittäisten genotyyppien määrittäminen SNaPShotilla . , Keksinnön mukainen menetelmä kyseisten kodonien/mutaatioiden alleelikuvion • · » . ‘ 25 määrittämiseksi voidaan suorittaa polymeraasiketjureaktiolla (PCR) yhdistelmässä • 1 esimerkiksi alleelispesifisen aluke-ekstensiomenetelmän (SNaPshot, Applied Biosystems) tai DNA-fragmenttianalyysin kanssa, joita seuraa kapillaarielektroforeesi ABI Prism 3100 . · · ·, Genetic Analyzer -laitteella (Applied Biosystems).

t I

';;! 30 SNaPshot-reaktiossa kyseisen mutaation sisältävä genominen DNA-alue monistetaan PCR:llä. Monistettu PCR-reaktio puhdistetaan ja tuotetta käytetään templaattina SNaPshot- • · ·1 ‘ ‘ reaktiossa.

• » · » 115532 9 SNaPshot-reaktiota varten suunnitellaan ekstensioaluke, joka päättyy yhden nukleotidin 5'-suuntaan annetusta yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) -lokuksesta. SNaPshot-reaktiossa ekstensioaluke sitoutuu komplementaariseen templaattiinsa fluoresoivaleimattujen dideoksi-NTP:iden ([F]ddNTP:t) ja DNA-polymeraasin läsnä 5 ollessa. Polymeraasi pidentää aluketta vain yhdellä nukleotidillä lisäämällä yhden [F]ddNTP:n sen 3'-päähän. Analysoiduissa tuloksissa nukleotidi A nähdään vihreän värisenä, C nähdään mustan värisenä, G nähdään sinisen värisenä ja T punaisen värisenä. Jos esimerkiksi genotyyppi on A/A, silloin havaitaan vain vihreä väri. Heterotsygoottiselle A/C:lle havaitaan vihreä ja musta väri.

10

Kun monia SNP:itä määritetään samassa reaktiossa, ekstensioalukkeiden pitää erota merkittävästi pituudeltaan (4 - 6 nukleotidiä) lopullisten SNaPshot-tuotteiden välisen päällekkäin menon välttämiseksi. Tämä voidaan toteuttaa lisäämällä vaihteleva lukumäärä nukleotidejä dT, dA, dC tai cGATC erilaisten ekstensioalukkeiden 5'-päähän. Erilaiset 15 SNP:t voidaan havainnoida sen jälkeen kapillaarielektroforeesilla SNaPshot-tuotteen erilaisen koon mukaisesti. SnaPshot-genotyypityksen suorittamiseksi standardiolosuhteissa, katso käyttäjän käsikirjasta (ABI Prism SnaPshot Multiplex kit, Protocol, Applied Biosystems).

20 DNA-fragmenttianalyysissä fluoresoiva leima on kiinnitetty PCR-alukkeen 5'-päähän.

• · · ·' . * DNA-fragmenttianalyysissä genotyypitettävän lokuksen alleelit ovat erilaisia pituudeltaan • * · ’ · ’ · * (se on tutkittavassa lokuksessa on nukleotidilukumäärältään tunnettu deleetio tai insertio).

: ’ * Erilaiset alleelit voidaan sen jälkeen havainnoida kapillaarielektroforeesin jälkeen [ * eripituisten pcr-tuotteiden (se on alleelien) erilaisten liikkumisnopeuksien johdosta.

25 * *

Polymeraasiketjureaktio (PCR)

Kyseiset mutaatiot sisältävät genomiset DNA-alueet voidaan monistaa PCR:llä joko • ’ erillisissä reaktioissa tai kaikki yhdessä ainoassa reaktioseoksessa (se on moninkertainen •;;; 30 PCR) PTC-220 DNA Engine Dyad PCR -laitteella (MJ Research). PCR-monistus '; * suoritettiin 20 μ1:η tilavuudessa: reaktioseos sisälsi 60 ng ihmisen genomista DNA:ta ; * * (uutettu perifeerisestä verestä), IX PCR-puskuria (QIAGEN), 100 μΐ kutakin nukleotidiä ’ ·.. ‘ (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,5 μΜ kutakin aluketta ja 1 yksikkö DNA-polymeraasia (QIAGEN, Hot Start Taq DNA -polymeraasi). PCR-olosuhteet pitää määrittää kokeellisesti 10 1 1 5532 ja seuraavaa standardikäytäntöä voidaan käyttää aluksi: ensin reaktiota pidettiin 10 minuuttia 94 °C:ssa, sen jälkeen seuraavat kolme vaihetta toistettiin 35 syklin ajan: 45 sekuntia 94 °C:ssa, 45 sekuntia 55 °C:ssa, l minuutti 30 sekuntia 72 °C:ssa, minkä jälkeen reaktiota pidettiin 72 °C:ssa vielä 5 minuuttia, ja lopuksi pidettiin 4 °C:ssa.

5 APQB Thr98Ile (tunnetaan myös APQB Thr71Ile:näl

Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen APOB-geenin (apolipoproteiini B -geeni) Thr98Ile-mutaation (SEQ ID NO:l) (SEQ ID NO:3) (tunnetaan myös Thr71Ile-mutaationa) monistamiseksi oli seuraava: 5’- GAC AAC CTC AAT GCT CTG CT -3’ 10 (SEQ ID NO:5) ja 5’- TGA CTT ACC TGG ACA TGG CT -3’ (SEQ ID NO:6).

NPPA Val32Met

Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen NPPAm (natriureettisen peptidin esiaste A -geeni) [geeni tunnetaan myös ANF:nä tai ANP:nä tai PND:nä tai pronatriodilatiinina 15 (atrialisnatriureettinen peptidi)] Val32Met-mutaation (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 10) monistamiseksi oli seuraava: 5’- GCC AAG AGA GGG G AA CC A GAG -3’ (SEQ ID NO:X12) ja 5’- AGT GAG CAC AGC ATC AGA AAG C-3’ (SEQ ID NO:13).

DDAH1IVS2-33QT

20 Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen DDAH1 :n I f » ·’ (dimetyyliarginiinidimetyyliaminohydrolaasi 1) IVS2-33C>T-mutaation (seuraavissa sekvensseissä SEQ ID NO: 15 ja SEQ ID NO: 16 IVS2-33C>T-polymorfismi sijoittuu [ asemaan 1041) monistamiseksi oli seuraava: 5’- ATC CTG CTT TCT GCC CTT T -3’ * * * - · ! 1 (SEQ ID NO: 17) ja 5AAG CCA GTG AAG CGT AAA CAC-3’ (SEQ ID NO: 18).

25

FGB -455G>A

Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen FGB-geenin (fibrinogeeni-beeta -geeni) promoottorimutaation -455G>A-mutaation (seuraavissa sekvensseissä SEQ ID NO:20 ja 21 FGB -455G>A-polymorfismi sijoittuu asemaan 1437) (SEQ ID NO:20) (SEQ ID 30 NO:21) monistamiseksi oli seuraava: 5’- AAC ACA CAA GTG AAC AGA CAA G-3’ (SEQ ID NO:22) ja 5 GCA CTC CTC AAA GAG AGA TG -3 ’ (SEQ ID NO:23).

115532 11

NPY -52PG

Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen NPY-geenin (neuropeptidi Y -geeni) -520G-mutaation (seuraavissa sekvensseissä SEQ ID NO:25 ja 26 NPY -52C>G-polymorfismi sijoittuu asemaan 1000) (SEQ ID NO:25) (SEQ ID NO:26) monistamiseksi oli seuraava:

5 5’- GTT CTC TCT GCG GGA CTG GG-3’ ja (SEQ ID NO:27) 5’- CTG CCC TGG GAT

AGA GCG AA-3’ (SEQ ID NO:28).

CBS Ile278Thr

Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen CBS-geenin (kystationi-beeta-syntaasigeeni) 10 Ue278Thr-mutaation (SEQ ID NO:36) (SEQ ID NO:38) monistamiseksi oli seuraava: 5’-GAG CCT GGG TTC TTG GGT TTC -3’ (SEQ ID NO:40) ja 5’- GGT TGT CTG CTC CGT CTG GTT -3’ (SEQ ID NO:41).

LPL Asn318Ser (tunnetaan myös LPL Asn291Ser -mutaationa) 15 Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen LPL-geenin (lipoproteiinilipaasigeeni)

Asn318Ser-mutaation (SEQ ID NO:43) (SEQ ID NO:45) (tunnetaan myös LPL Asn291Ser -mutaationa) monistamiseksi oli seuraava: 5’- CGC TCC ATT CAT CTC TTC ATC G -3’ (SEQ ID NO:47) ja 5’- CCC CCT ATC AAC AGA AAC ACC A -3’ (SEQ ID NO:48).

20 ITGB3 Leu59Pro (tunnetaan myös Leu33Pro-mutaationa) * » · ·' · ’ Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen ITGB3:n (integriini, beeta 3, ’ ·' · ‘ verihiutaleglykoproteiini Ilia, antigeeni CD61) Leu59Pro-mutaation (SEQ ID NO:50) • ’ ’ (SEQ ID NO:52) (tunnetaan myös Leu33Pro-mutaationa) monistamiseksi oli seuraava: 5’-

; ; GCA GGA GGT AGA GAG TCG CCA -3’ (SEQ ID NO:54) ja 5’- GGG CAC AGT TAT

';, 7 25 CCT TCA GCA-3 ’ (SEQ ID NO:55).

NPPA OPA152Arg ^ Alukeparin nukleotidisekvenssi ihmisen NPPA:n (natriureettisen peptidin esiaste A -geeni) [geeni tunnetaan myös ANF:na tai ANP.nä tai PND:nä tai pronatriodilatiinina ; 30 (atrialisnatriureettinen peptidi)] OPA152Arg-mutaation (SEQ ID NO:57) (SEQ ID NO:59)

; ’ monistamiseksi oli seuraava: 5’- TTA GCA GTT CAT ATT CCT CCC C -3’ (SEQ ID

NO:61) ja 5’- AGC CTC TTG CAG TCT GTC CC -3’ (SEQ ID NO:62).

12 1 1 5532 PCR-tuotteiden puhdistaminen SNaPshot-reaktiota varten PCR-tuotteet puhdistettiin SAP (katkaravun alkaalinen fosfataasi, USB Corporation) - ja Exol (eksonukleaasi I, USB Corporation) -käsittelyllä. Tämä suoritettiin PCR-reaktiosta 5 olevien liittymättömien dNTPiiden ja alukkeiden myöhempään aluke-ekstensioreaktioon osallistumisen estämiseksi. Tarkemmin sanoen 5 yksikköä SAP:a ja 2 yksikköä ExoLtä. lisättiin 15 pl:aan PCR-tuotetta. Reaktio sekoitettiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Sen jälkeen reaktiota inkuboitiin 75 °C:ssa 15 minuuttia entsyymien inaktivoimiseksi ja pidettiin jälkeenpäin 4 °C:ssa.

10

Aluke-ekstensioreaktio (SNaPshot-reaktio)

Seuraavassa aluke-ekstensioreaktiossa (SNaPshot-reaktio) 5 μΐ SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix:ä (Applied Biosystems), 3 μΐ puhdistettuja PCR-tuotteita, 1 μΐ yhdistettyjä 15 ekstensioalukkeita (riippuen SNaPshot-reaktion signaalista seoksen alukekonsentraatiot voivat vaihdella välillä 0,05 -1 μΜ) ja 1 μΐ vettä sekoitetaan putkessa. Reaktiota inkuboidaan 94 °C:ssa 2 minuuttia ja se alistetaan sen jälkeen 25 syklille 95 °C:ssa 5 s, 50 °C:ssa 5 s ja 60 °C:ssa 5 s PTC-220 DNA Engine Dyad PCR -laitteessa (MJ Reasearch).

20 Ihmisen APOB Thr71Ile -mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen

‘ · ’ nukleotidisekvenssi SNaPShot-reaktiossa oli seuraava: 5’- TTT TTT TTT TTT TGA AGA

• 1 ;; : CCA GCC AGT GCA -3 ’ (SEQ ID NO:7).

• « • 1' ( ! ’ Ihmisen NPPA Val32Met -mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen • » -

I. ' 25 nukleotidisekvenssi SNaPShot-reaktiossa oli seuraava: 5’- TT TTT TTT TTT TTT TTT

AAT CCC ATG TAC AAT GCC -3 ’ (SEQ ID NO: 14).

Ihmisen DDAH 1 IVS2-33C>T-mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi SNaPShot-reaktiossa oli seuraava: 5’- T TTT TTT TTT TTT TTT 30 TTT TTT GTA CAG TCA CTG GTG CCA -3’ (SEQ ID NO: 19).

Ihmisen FGB-promoottorin -455G>A-mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi SNaPshot-reaktiossa oli seuraava: 5’- TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTC TAT TTC AAA AGG GGC-3’ (SEQ ID NO:24).

5 i3 1 1 5532

Ihmisen NPY-geenin -52 OG -mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi SNaPShot-reaktiossa oli seuraava: 5’- T TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GAG GAG GGA AGG TGC TGC G -3’ (SEQ ID NO:29).

Ihmisen LPL Asn291 Ser -mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi oli seuraava: 5’- TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TCT TTT GGC TCT GAC TTT A -3’ (SEQ ID NO:49) 10 Ihmisen ITGB3 Leu33Pro -mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen nukleotidisekvenssi oli seuraava: 5’- TT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTC ACA GCG AGG TGA GCC C -3’ (SEQ ID NO:56).

Ihmisen NPPA OPA152Arg -mutaation genotyypityksen ekstensioalukkeen 15 nukleotidisekvenssi oli seuraava: 5’- T TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT

TTT TTT TTT TTT TTT CTC CCT GGC TGT TAT CTT C -3’ (SEQ ID NO:63).

Ekstension jälkeinen käsittely 20 Aluke-ekstensioreaktion jälkeen lisättiin 1 yksikkö SAP:a reaktioseokseen ja reaktiota inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Entsyymi inaktivoitiin inkuboimalla reaktioseosta < 9 > : . * 75°C:ssa 15 minuuttia. Jälkeenpäin näytteet sijoitettiin 4 °C:seen. Ekstension jälkeinen ♦ > ’· * ’ käsittely suoritettiin liittymättömien, fluoresoivien ddNTP:iden aluke-ekstensiotuotteiden « · : ' ’ (SNaPshot-tuotteet) peittämisen estämiseksi ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteella 25 suoritetun elektroforeesin aikana.

• » • · » • I • > « · * · " ADRA2B-insertio/deleetiopolvmorfismin DNA-fragmenttianalwsi *!!. ADRA2B-insertio/deleetiomutaatio * t • 30 ADRA2B-geenin (alfa2B-adrenergisen reseptorin geeni) insertio/deleetiopolymorfismi •:; ' (SEQ ID NO:30) (SEQ ID NO:32) oli seuraava 5’- GGG TGT TTG TGG GGC ATC TC - ‘'; · ’ 3’ (SEQ ID NO:34) ja 5’- TGG CAC TGC CTG GGG TTC A -3’ (SEQ ID NO:35).

: · Fluoresoiva leima on lisätty toisen edellä mainitun pcr-alukkeen 5'-päähän. Siten pcr- ' ‘ fragmentti on havainnoitavissa ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteella suoritetussa 35 kapillaarielektroforeesissa.

115532 14 ADRA2B-geenin insertio/deleetiopolymorfismi koskee kolmen glutamiinihapon insertiota tai deleetiota 12 Glu-aminohapon alueella kodoneissa 298 - 309 (SEQ ID NO:30). Siten genotyypistä riippuen ADRA2B-lokuksessa on joko 9 Glurta (deleetio) tai 12 Glu:ta 5 (insertio). Riippuen siitä, oliko monistetussa alleelissa insertio tai deleetio tutkitussa lokuksessa, pcr-tuotteen koko oli 91 bp (insertioalleeli) tai 82 bp (deleetioalleeli). Siten homotsygooteilla havaittiin vain yhden kokoinen fragmentti, joko 91 bp (insertio/insertio) tai 82 bp (deleetio/deleetio). Heterotsygooteilla havaittiin kumpikin edellä mainituista fragmenteista.

10

Kapillaarielektroforeesi ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteella

Yhdistettyjen SNaPshot-tuotteiden 1 μ1:η näyte-eriä, 0,5 - 1,0 μΐ ADRA2B-insertio/deleetio-pcr-tuotetta, 9,00 μΐ Hi-Di-formamidia (Applied Biosystems) ja 0,25 μΐ 15 GeneScan-120 LIZ -kokostandardia (Applied Biosystems) yhdistettiin 96-kuoppaisessa 3100 optical microamp -levyssä (Applied Biosystems). Reaktiot denaturoitiin asettamalla ne 95 °C:seen 5 minuutiksi ja lisäämällä ne sen jälkeen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer -laitteeseen (Applied Biosystems). Elektroforeesitulokset käsiteltiin ja genotyypit visualisoitiin käyttämällä GeneScan Analysis -versiota 3.7 (Applied Biosystems).

20 > * ♦ • ', MI:n ia aivohalvauksen riskin testaaminen * * * » k · ! * · MI:n ja aivohalvauksen riskitekijöitä tutkittiin KIHD-seurannassa. Lyhyesti, "Kuopio • l * i * ’ Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study" (KIHD) on prospektiivinen väestötutkimus • t '· "· 25 miehillä Itä-Suomessa (Salonen 1988, Tuomainen et ai., 1999). KIHDrn I · a » » ’ · · · ’ tutkimuskäytännön hyväksyi Kuopion yliopiston tutkimuseettinen komitea. Tutkimusnäyte käsitti iältään 42, 48, 54 tai 60 vuotta olevia miehiä Itä-Suomesta. Yhteensä tutkittiin 2 682 ";; miestä 1984 - 89 aikana. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen, tietoihin perustuvan » ' ’ suostumuksen. Sepelvaltimo- ja serebrovaskulaaristen tapahtumien seurantaa suoritettiin . . 30 2000 loppuun, mikä sai aikaan keskimäärin 13,4 vuoden seuranta-ajan. Genotyypitykset ’ -. ’ suoritettiin noin 1 600 miehelle, mistä aiheutui yli 21 000 seurannan henkilövuotta.

; , ·' Perustasotutkimuksen osallistujista 1 038 miestä tutkittiin uudelleen noin neljä vuotta perustasoselvityksen jälkeen vuosina 1991-3. Seuranta-ajan keskiarvo oli 4,1 vuotta.

15 1 1 5532 1 177 sopivasta miehestä 139:ään ei saatu yhteyttä, tai he kieltäytyivät osallistumasta, 1 038 (88,2 %) miestä osallistui.

Sisäkkäinen tapaus-verrokkisarja valittiin koostuen 47 miehestä, jotka kehittivät MI:n 2000 5 loppuun mennessä, ja 47 verrokkimiestä, jotka oli sovitettu iän, asuinpaikan, paastoamisajan ja tutkimuspäivän suhteen ja joilla ei ollut MI:tä 2000 loppuun mennessä. Tapauksilla eikä verrokeilla ei ollut MI:tä ennen 1991 - 3 -tutkimusta. Samalla tavoin valittiin 22 miehen tapaus-verrokkisaija, joilla miehillä oli aivohalvaus seurannan aikana, ja 22 identtisesti sovitettua verrokkia. Kummallakaan ryhmässä ei ollut aikaisempaa 10 aivohalvausta ennen 1991-3 -tutkimusta. Suuri joukko genotyypityksiä suoritettiin näissä sisäkkäisissä tapaus-verrokkisarjoissa.

Tulokset CHD:stä ja serebrovaskulaarisesta sairaudesta seurannan aikana hankittiin tietokoneyhteydellä kansalliseen, tietokoneelliseen sairaalasta kotiinpääsyrekisteriin.

15 Diagnostinen informaatio kerättiin sairaaloista ja kaikki sydänkohtaukset ja serebrovaskulaariset tapahtumat luokiteltiin tiukkojen, ennakkoon määriteltyjen kriteerien mukaisesti. Akuuttien sepelvaltimotapahtumien diagnostinen luokittelu perustui oireisiin, elektrokardiografisiin löydöksiin, kardiaalisten entsyymien kohoamisiin, autopsialöydöksiin ja CHD:n historiaan. Kukin epäilty sepelvaltimotapahtuma (ICD-9-20 koodit 410 - 414 ja ICD-10-koodit 120 -125) luokiteltiin 1) selvä akuutti sydäninfarkti ·’ · ’ (AMI), 2) todennäköinen AMI, 3) tyypillinen, yli 20 minuutin akuutti rintakipuepisodi, joka osoitti CHD:n, 4) iskeeminen, kardiaalinen pysähdys onnistuneella elvytyksellä, 5) ei • · * ’ akuuttia sepelvaltimotapahtumaa tai 6) ei luokiteltavissa oleva kohtalokas tapaus.

• · · * > . , Kategoriat 1) - 3) yhdistettiin esillä olevaa analyysiä varten merkitsemään MI:tä.

• » T

I.,' 25 Serebrovaskulaariset tapahtumat luokiteltiin FINNMONICA-kriteerien mukaisesti.

ψ i . Tämän projektin tarkoitus oli kehittää yksinkertainen geenitesti, jota voidaan käyttää , · · ·, diagnosoimaan CHD ja serebrovaskulaarinen sairaus ja ennustamaan akuutin • » · • t sydäninfarktin ja aivohalvauksen riski terveillä ja sairailla henkilöillä. Meillä oli saatavana ”;; 30 useita tulossarjoja tätä työtä varten. Malli muodostettiin prospektiivisessa, sisäkkäisessä • » ’ i * tapaus-verrokkisarjassa 50 miehellä, joilla ei ollut aikaisempaa MI:tä, mutta jotka • » ‘ '' kehittivät MI:n 8 vuoden seurannan aikana, ja 50 ikäsovitettua verrokkimiestä, jotka eivät ’ · · - ‘ kehittäneet MI:tä seurannan aikana. Tämä tapaus-verrokkisarja saatiin KIHD 1991 - 3 - tutkimuksesta, jossa tutkittiin yli 1 000 iältään 46 - 64 -vuotiasta miestä Itä-Suomesta 115532 16 (katso viite 4). Tyypitimme yli 100 mutaatiota, joiden oletettiin olevan asiaankuuluvia, mitä tulee CHDihen ja aivohalvaukseen, DNA-näytteissä, jotka oli hankittu perustasolla, ja keräsimme fenotyyppistä informaatiota, joka tuotti yli 5 000 muuttujaa.

5 Noin 100 mutaatiosta MI:n neljä ennustavinta valittiin käyttämällä hierarkista, asteittaista, binääristä, logistista mallinnusta (taulukko 1). Nämä ennustivat 61 %:a tulevista MT.stä (R square 16 %). Teoreettisesti (perustuen kaksostutkimuksiin) tämä on maksimaalinen ennuste, joka voidaan saada geenien avulla. Toinen vaihe oli löytää ennustavimmat muut muuttujat. Testasimme samalla tavoin yli 1 000 muuttujaa mukaan lukien kaikki tunnetut 10 CHD:n riskitekijät. Määriteltiin kuuden muuttujan sarja (taulukko 1), joka lisäsi ennustetta 80 %:iin (R square 53 %), ja MI:n ennustettu todennököisyys kullekin henkilölle vaihteli välillä 0,0002 - 0,9991. Nämä voidaan ilmoittaa käyttämällä viittä yksinkertaista kysymystä ja mittaamalla vyötärön ja lonkan ympärysmitat. Mikään yli 200 testatusta biokemiallisesta mittauksesta ei antanut paljon lisää informaatiota malliin. Sama koski 15 verenpainetta ja muita kliinisiä mittauksia. Ikä ja sukupuoli tarvitaan lisäksi mallissa.

Muodostimme myös 3 geenin mallin, joka neljän kyselylomakemuuttujan kanssa ennusti 80 %:a (R square 55 %) serebrovaskulaarisista aivohalvauksista (taulukko 2).

20 Siten keksimme 10 muuttujan mallin, joka ennusti tulevaa sydäninfarktia, ja 7 muuttujan « · • · * mallin, joka ennusti aivohalvausta erittäin hyvin tulossarjassa, josta ne oli johdettu. 80 %:n ’; ennuste on korkeampi kuin missään julkaistussa epidemiologisessa seurantatutkimuksessa.

» ' , On etu, että tarvitsee suorittaa vain pieni joukko genotyypityksiä ja tarvitsee täyttää hyvin . . lyhyt, itse hoidettava kyselylomake. Yksi molemmissa testeissä olevista mutaatioista on ^! 25 sama, siten tarvitaan yhteensä vain kuusi genotyypitystä ennustamaan sekä MI että aivohalvaus.

115532 Τ3 •s χλ cd e3 σν oo § ^ (N 'O (N U0 ^ © °° -- P" (N es vo es ro rt es ro Λ o > oo oo rs oo n « n n u vo m ro -h r-- © >—li— vo ή TO O rt © © © © © (N © © o, ö © © ö ©©©©©© ro -s- ro oo r- r-· σ\ t-- to- r-- Γτ^ i—t O CS in N ro ro ro ro W vo © rovooovovovoCTv 00 rt ö a —i O © © O © e rt •s oo p ro -h tn 't O h vo O Oi oo

e ro VO (S (N ro OO VO O; h (N

ω rt σν -- (n —< ro »n r--; ro © TO" ro rt es _; © rt rt

/«"S

Ji § O r- E © t-· cd <u b l_ g « « b Λ 1 .2 § | « & .§ | p? t; * ::: g £ -g g jg ^ <<<<<< . . ö • u * .s *! * * * i i dj •ä I | , .s 3 :.·.: 5 -S S 'S - S g > < -S g 2 .se :: to ω 3 > ε „ λ .§ S g -n -2, · -S e ‘3

o to o ^ ^ w ω ,—s _S2 S

o 'Ti. rt Έ > ω ίΐ- Ό s? 2 S to ‘-P 2 g ω 2 C* =TO .¾ <υ Λ 2 ω «a > ·- o,

13 & o. =3 g S

• M rt TO fi TO § >1 TO fr © - ;TO

• r* cd Oh ’zp 0) *a £ e/) —

• ^ ’ir» tt> i2 O i2 CD ^ ™ S

g g α | -a 1 fi: g | g ^ g s ,: 9 § g JS ö J .S I 8 I w S ’S § ^ 2 μ .Λ ö .A o ,ο Ö J3 <« -a J2 .2 vo E ·ο!ωωΐ)·*= i ΰ 2 ® a p, M © • ^ *- e »h o μ m .¾ u 5 1Γ “ tn : o ^ rtllllS ‘e ^ «e ^ « g .S, PQ .¾ o, ^ K ΐ 8 ft o ξ !§ S *λ : H [ω £ J2 < i2 < i* Q a h|U Μ\3\> -3- > 18 115532 <L> Ä 3 ¢/5 cd

§ 't VO ui CN VO

J VO cK S ~ ^ r> Tj· ^ *—* OV «n '

O

> 00 00 fN (N (N h- OV

ϊ—H r—' r"H T-H t~) [ ~J

<£,

"s -S

S O oo m co (N h t O

es c <o f- Os oo fN — m

ω oo ov r-; (N

e W CO (N N- oi —‘ Ö Ö 3 --------- 3

C · »M

0 δ e « ... <3 o "?< 5 ro

' * · β Ό A o V

; , · p <s O 'P A

* . .22 iS >n ti O

: : : 5P5 2 “£<:<<< £ % 7 ^ ΖΖΖ,Ζ j'·.. | --------- • · * · · £j I I ϋ .' g 'δ i • > . δ j) » '

VA ·£ > JS

3 -o & % o ; : w 'w' cd <λ /—n •c -c "S w ^ o Nc c o 2 s. ω 5 -p ja og&öa^s^ "* "m C fr Ö • $ C « ti Öi) S£ ^ > 2 <D 9> . .£ 2 « o rt > N, -rt 5 JS Ό "*: < 2 :λ g) S e .- 3 .3 '^ ·§ ·« ... ; » ! SiS8S läjä 8 S > äo « ξ“& « ö !2 g in" 1 3 -g 2 § O g g§ o ’’· 3 Ö ^iCMS^cgO-ca^ ^ 5 S 20P oi § S 3ΛΛ «* ,,,,: h ω > 115532 19

Kirjallisuus

Diverse Populations Collaborative Group. Prediction of mortality from coronary heart disease among diverse populations: is there a common predictive function? Heart 2002; 88: 5 222-8.

Liao Y, McGee DL, Cooper RS, Sutkowski MB. How generalizable are coronary risk prediction models? Comparison of Framingham and two national cohorts. Am Heart J 1999; 137: 837-45.

10

Nedelcheva Kristensen V, Kelefiotis D, Kristensen T and Borresen-Dale: High-Throughput methods for detection of genetic variation. Biotechniques 30:318-332,2001.

Rabindranath KS, Anderson NR, Gama R, Holland MR. Comparative evaluation of the 15 new Sheffield table and the modified joint British societies coronary risk prediction chart against a laboratory based risk score calculation. Postgrad Med J 2002; 78: 269-72.

Salonen JT. Is there a continuing need for longitudinal epidemiologic research - The Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study. Ann Clin Res 1988: 20: 46-50.

20 • ·' Salonen JT, Malin R, Tuomainen T-P, Nyyssönen K, Nissinen T, Lakka TA, Lehtimäki T.

’; ’ · ’ Polymorphism in the high density lipoprotein paraoxonase gene and the risk of acute ' myocardial infarction in men: a prospective population-based study. Brit Med J 1999; 319: ! ! 487-9.

* * I

25

Snapir A, Heinonen P, Tuomainen T-P, Alhopuro P, Karvonen MK, Lakka TA, Nyyssönen : K, Salonen R, Kauhanen J, Valkonen V-P, Pesonen U, Koulu M, Scheinin M, Salonen JT.

An Insertion/Deletion polymorphism in the (X2B-adrenergic receptor gene is a novel genetic risk factor for acute coronary events. J Am Coll Cardiol 2001; 37: 1516-1522.

30 : ‘' Syvänen A-C: Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms.

‘ ’ Nature reviews/ Genetics 2:930-942,2001 115532 20

Tuomainen T-P, Kontula K, Nyyssönen K, Lakka TA, Heliö T, Salonen JT. Increased risk of acute myocardial infarction in carriers of the hemochromatosis gene Cys282Tyr mutation: A prospective cohort study in men in Eastern Finland. Circulation 1999; 100: 1274-1279.

5

Valkonen V-P, Päivä H, Salonen JT, Lakka TA, Lehtimäki T, Laakso J, Laaksonen R. Risk of acute coronaiy events in relation to concentration of serum asymmetrical dimethylarginine. Lancet 2001; 358: 2127-2128.

• · • 1 · a > » • « * a > « > • · ;

Claims

2i 1 1 5532

1. Menetelmä geneettisen muuntelun tai polymorfismin, so. mutaation, havainnoimiseksi geeneissä, jotka koodaavat: 5 (a) ci2B-adrenoseptoria, ja (b) apolipoproteiinia B; ja vähintään yhdessä geeneistä, jotka koodaavat: 1° (c) dimetyyliarginiinidimetyyliaminohydrolaasia 1 (d) fibrinogeeni beetaa (e) natriureettista peptidiprekursoria A; ja (f) neuropeptidiä Y 15 jossa menetelmässä i) hyödynnetään biologista näytettä, joka on saatu testattavasta potilaasta, ii) havainnoidaan mutaatioita geeneissä, mutaation löytymisen kolmesta tai 20 useammasta geenistä osoittaessa potilaan noussutta riskiä sairastua sepelvaltimotautiin ja/tai sydäninfarktiin. * * » I » • f ·

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa muuntelu tai polymorfismi • ‘ » * . havainnoidaan lisäksi vähintään yhdessä seuraavista geeneistä: ! ! 25 i » · • j » (· / (g) kystatioonibetasyntaasi (h) glykoproteiini Ilb/IIIa ,:, (i) lipoproteiinilipaasi (j) tuumorinekroositekijä alfa (TNFA) 30 (k) koagulaatiotekijä 5 (F5) ja ’, .. (1) koagulaatiotekijä 7 (F7)

' ' ‘ 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa havainnointivaihe on '' ' nukleiinihappomääritys. 22 1 1 5 532

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, jossa havainnointivaihe suoritetaan käyttäen DNA-lastua, microarray-tekniikkaa, liuskaa, paneelia tai vastaavaa useamman kuin yhden määritettävän geenin, mutaation tai RNA-ekspression yhdistelmää.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, jossa polymorfismit määritetään käyttäen polymeeraasiketjureaktiota.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa biologinen näyte on verinäyte tai bukkaalinen tupponäyte. 10

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka lisäksi käsittää vaiheen, jossa menetelmän vaiheessa ii) saatuihin tuloksiin yhdistetään informaatiota, joka liittyy veriarvoihin, seerumin tai plasman kolesteroliarvoihin, HDL-kolesteroliarvoihin, LDL-kolesteroliarvoihin, triglyseridiarvoihin, apolipoproteiini B- ja AI-arvoihin, 15 fibrinogeeniarvoihin, ferritiiniarvoihin, transferoivan reseptorin arvoihin, C-reaktiivisen proteiinin arvoihin, seerumikonsentraatioarvoihin tai plasman insuliinikonsentraatioarvoihin, havainnointivaiheen tuloksen vahvistamiseksi.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa valitut geenit ovat natriureettinen 20 peptidiprekursori A, <X2B-adrenoseptori, apolipoproteiini B ja dimetyyliarginiinidimetyyliaminohydrolaasi 1.

• · • · » • · • * · .; 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa valitut geenit ovat fibrinogeeni beeta, • 9 • » » a2B-adrenoseptori, apolipoproteiini B ja neuropeptidi Y. : 25

, · ·, 10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka lisäksi käsittää vaiheen, jossa * · » menetelmän vaiheessa ii) saatuihin tuloksiin yhdistetään informaatiota, joka liittyy .:. systoliseen ja diastoliseen verenpainearvoihin, pulssin mittaukseen, maksimaaliseen .'". hapenottokykyyn tai muuhun elektrokardiografiseen mittaukseen, havainnointivaiheen 30 tuloksen vahvistamiseksi.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, jossa havainnoidut mutaatiot ovat natriureettisen peptidiprekursori A:n Val32Met, ci2B-adrenoseptorin kolmen 23 1 1 5532 glutamiinihapon insertio/deleetio 12 Glu-aminohapon alueella kodoneissa 298-309, apolipoproteiini B:n Thr98Ile ja dimetyyliarginiinidimetyyliaminohydrolaasi 1 :n SNP IVS2-330T.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa havainnoidut mutaatiot ovat fibrinogeeni beetan SNP -455G>A, oc2B-adrenoseptorin kolmen glutamiinihapon insertio/deleetio 12 Glu-aminohapon alueella kodoneissa 298-309, ja neuropeptidi Y:n SNP-520G.

13. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, joka lisäksi käsittää vaiheen, jossa lasketaan kardiovaskulaarisen sairauden todennäköisyys käyttäen logistista regressioyhtälöä seuraavasti: Kardiovaskulaarisen sairauden todennäköisyys = [1 + e jossa e on Napierin 15 vakio, X,:t ovat kardiovaskulaariseen sairauteen liittyviä muuttujia, bj:t ovat näiden muuttujien kertoimia logistisessa funktiossa, ja a on vakiotermi logistisessa funktiossa.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jossa ajabj määritetään populaatiossa, jossa menetelmää käytetään. 20 ...

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jossa X,:t valitaan muuttujista, jotka on * · ! määritetty populaatiossa, jossa menetelmää käytetään.

• * · • · • * . 16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jossa b;:t ovat arvoja väliltä -20 - 20. • ’ 25

• * * > · , · · , 17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jossa Xj:t ovat binaarisia muuttujia, *» · joilla voi olla arvoja, tai jotka on koodattu arvoiksi, 0 (nolla) tai 1 (yksi).

> 18. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jossa i:t ovat arvoja väliltä 0 (ei mitään) 30 - 100 000.

19. Testipakkaus kardiovaskulaarisen sairauden riskin, erityisesti sydäninfarkti-ja sydänhalvausriskin, määrittämiseen potilaalla, joka pakkaus käsittää tarvikkeet geneettisen muuntelun tai polymorfismin, so. mutaation, havainnoimiseen geeneissä: 115532 (a) a2B-adrenoseptori, ja (b) apolipoproteiini B; 5 ja vähintään yhdessä geeneistä (c) dimetyyliarginiinidimetyyliaminohydrolaasi 1 (d) fibrinogeeni beeta (e) natriureettista peptidiprekursori A; ja 10 (f) neuropeptidi Y ja mahdollisesti tietokoneohjelman saatujen tulosten tulkitsemiseen.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen testipakkaus, joka käsittää DNA-lastun, microarrayn, 15 DNA-liuskan, DNA-paneelin tai reaaliaikaisen PCR-pohjaisen testin.

21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen testipakkaus, joka käsittää kyselylomakkeen potilastietojen hankkimiseksi, jotka tiedot liittyvät ikään, sukupuoleen, pituuteen, painoon, perhehistoriaan koskien kardiovaskulaarisa sairauksia ja hyperkolesterolemiaa ja 20 potilashistoriaan koskien kardiovaskulaarisia sairauksia. • · » • · • » • · » • · » • · ♦ ► » • · ♦ » 1 • t · » · I 25 115532