CN102108396B - Cad及ami易感性诊断试剂盒和snp在其制备中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种冠心病及急性心肌梗塞易感性检测试剂盒和SNP在该试剂盒制备中的用途，所涉及的SNP为rsl2050757。发明人验证了rsl2050757位点T等位基因与冠心病及急性心肌梗塞易感性之间的显著相关性，据此通过检测rsl205075 7位点T等位基因，可以预测受试者的冠心病及急性心肌梗塞易感性，从而能够促进疾病的早期预防和治疗。所述试剂盒可以利用测序、Taqman探针SNP检测、PCR-SSCP和其他本领域已知可用于检测样本中特定SNP存在与否的技术来检测样本中rsl2050757的基因型，进而判断受试者是否具有冠心病及急性心肌梗塞易感性。

Description

CAD及AMI易感性诊断试剂盒和SNP在其制备中的用途

技术领域

本发明涉及一种冠心病(Coronary artery disease，CAD)及急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction，AMI)易感性检测试剂盒，以及一种SNP在制备冠心病及急性心肌梗塞易感性检测试剂盒中的用途。

背景技术

冠心病和急性心肌梗塞是西方发达国家第一大病，其致死率居所有疾病中的第一位。据美国心脏协会统计，全美约有1260万人患有CAD，750万人患有AMI。仅在1999年，美国有52万多人死于CAD和AMI。在40岁以上的人群中，约有49％的男性，32％的女性受到慢性CAD的威胁^[1]。2002年，美国医疗保障系统在CAD方面的花费总额大约为111,8亿美元，已给国家带来沉重的经济负担^[1]。在我国，随着老年化进程的加速，以及人民生活水平的大幅度改善，该病业已成为威胁我国人口健康的重要疾病之一。其在我国发病率和死亡率呈迅速上升趋势，是中国居民死因构成中上升最快的疾病。据卫生部心血管部防治办公室统计资料预测：1998年至2008年间，中国男性发病率将较以往同期增加26.1％，女性将增加19.0％，估计中国每年死于各种CAD的人数将超过100万。

大部分CAD和AMI的病理基础是冠状动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)，脂蛋白以及单核细胞进入血管内膜下组织，来自血液的单核细胞吞噬大量脂质转变成为泡沫细胞，从而触发AS过程^[2-8]导致CAD；在AS的基础上，炎症细胞聚集于损伤部位，局部炎症反应或其它的损伤导致内膜细胞的破坏，引起血管粥样斑块的破裂，及进一步的侵蚀与伴随的组织因子释放，引起血小板激活并形成血栓则将最终导致AMI的发生^[2-8]。临床上，无明显粥样斑块破裂或动脉内膜严重破坏的患者，病人可能只有稳定性心绞痛的症状，然而一旦动脉壁的完整性遭到破坏，并产生血栓，病人则极有可能出现不稳定性心绞痛，并导致AMI而突发心脏病引起死亡。

临床和流行病学研究显示CAD和AMI的发病与多种危险因素有关，包括吸烟、老龄化、性别、高脂肪饮食，低抗氧化水平、传染性病原体、个人的心绞痛病史、AMI家族史、肥胖、糖尿病、高血压、血浆甘油三酯的升高、，以及高密度脂蛋白胆固醇的降低等，而血液中Lp(a)、同型半胱氨酸、C反应蛋白、载脂蛋白E、纤维蛋白原以及血浆酶原水平的升高，则是近年来发现的导致CAD和AMI的一些新的危险因素^[2-8]。总之，CAD/MI是由多种环境因素和遗传因素相互作用所致的复杂性疾病。发病机制复杂、临床表现多变、对治疗效果存在明显的个体差异、没有根本治愈疾病的方法。疾病往往有一个逐渐发展过程，早期病变较轻和较易治疗，但较难诊断和发现；而晚期病变较重，基本上没有治愈的可能，只能依赖替代、对症和姑息治疗；被动地延缓病人的生命。这在病人生理和心理上、病人家庭和社会的经济上、乃至医疗资源合理利用上均会带来极大的负担。因此，如果能够早期预测疾病的易感性，判断高危人群，早做预防，及早诊治，将有利于降低疾病的发病率和致残率，并提高疾病的治愈率。

不论以上何种因素引发的CAD和AMI，均受到患者本身的遗传基因的调控，而流行病学研究表明，患者的家族史是可引发CAD和AMI的最主要因素^[6-7]，这进一步说明了基因与该疾病发生的相关性。因此，发现这些与CAD和AMI相关的易感基因，并根据发现的易感基因诊断病人患CAD和AMI的可能性，将促进疾病的早期预防、做到及早治疗并改善预后。

发明内容

发明人发现了rs12050757位点T等位基因与CAD及MI的相关性，并据此开发了CAD及MI易感性检测试剂盒，和rs12050757位点T等位基因在制备检测CAD及MI易感性的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种检测冠心病及急性心肌梗塞易感性的试剂盒，其中包括检测样本中rs12050757基因型的试剂，所述rs12050757位点信息为AGAAAAAGAAAGATTGCCTATAAAAG[C/T]ATGACAATTAGATCAACCACAGACT。如果样本中检测到rs12050757位点等位基因为T，则说明提供该样本的个体具备冠心病及急性心肌梗塞易感性。

该试剂盒可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP的试剂，只要其能够检出样本中rs12050757位点是否存在T等位基因。其包括但不限于下面列举的各实施方式。

在第一实施方式中，该试剂盒包括利用测序法检测样本中rs12050757位点T等位基因存在的试剂。测序法是本领域所公知的技术，所需的引物等试剂本领域普通技术人员均可根据需要自行选择(参见ABI、Beckman等公司测序仪相关使用说明)，在此不再赘述。利用该试剂盒，通过测序法可以直接测得样本中rs12050757的序列，从而判断其是否携带T等位基因，进而判断其冠心病及急性心肌梗塞易感性。

在第二实施方式中，所述试剂盒包括利用Taqman探针SNP检测法检测样本中rs12050757基因型的试剂。其中所用Taqman探针为针对rs12050757设计的探针，该探针可以使用试剂公司提供的探针：如ABI公司的相应探针C_32199671_10；也可使用软件自行设计，如PREMIER Biosoft公司的BeaconDesigner 7.5。

在第三实施方式中，所述试剂盒为利用PCR-单链构象多态性法检测样本中rs12050757基因型的试剂盒。该试剂盒中包括用于扩增rs12050757的引物，PCR试剂、对照样本和检测构象的电泳所需试剂。所述电泳优选非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对照样本中包括rs12050757位点CC纯合子的阴性对照样本和rs12050757位点TT纯合子的阳性对照样本中的至少一个，还可以包括也可以不包括杂合子CT对照样本。优选同时包括上述三种对照样本。待测样本扩增产物与对照样本的扩增产物同时电泳，比较其电泳结果可以得出待测样本中rs12050757是否携带T等位基因的检测结果。

上述第一、第二和第三实施方式的试剂盒中包括设计用于扩增rs12050757的引物，该引物具有如下特征：

1)扩增产物长度在100-300bp之间；

2)引物长度在15～30碱基之间；

3)G+C含量在40％～60％之间；

4)碱基随机分布；

5)引物自身不能有连续4个碱基的互补；和

6)引物之间不能有连续4个碱基的互补。

该引物可以采用软件来设计，(如使用Primer5、Oligo6等)，例如，可以采用如下所述引物对：上游引物：5′GGAAGTCCCACAAGTAGAAA 3′；下游引物：5′CCCACAGTAACACCCAAG 3′。

本发明提供了一种SNP在制备诊断冠心病及急性心肌梗塞易感性的试剂盒中的用途，其中所述SNP为rs12050757，如果样本中检测到rs12050757位点携带T等位基因的存在，则说明提供该样本的个体具备冠心病及急性心肌梗塞易感性。

所制备试剂盒为上述试剂盒中的至少一种，也可以是利用其他本领域已知的技术鉴定该SNP存在的其他试剂盒。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方式利用ABI公司提供的探针(货号C_32199671_10)开展Taqman探针法realtime PCR检测SNP位点结果截图。

图2为利用PCR-单链构象多态性法检测SNP的结果图。左侧两条电泳带为两个纯合子，最右侧一条电泳带为杂合子。

具体实施方式

鉴于基因与CAD及AMI发生的相关性，发现CAD及AMI的易感基因成为CAD及AMI治疗研究的首要任务。目前，有三种遗传学手段可用来研究如CAD等人类多基因遗传病^[9]：

(1)对大家系进行连锁分析以定位疾病基因，然后通过突变分析发现致病基因。由于大家系难以收集，一些常见疾病发病时间较晚，拟表型(phenocopy)的干扰等问题的存在，使得这一方法在研究常见的复杂性疾病方面困难重重；

(2)候选基因关联分析法。即对已知候选基因中1-5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorhism，SNP)位点进行基因型分型，对其在病人群体和对照群体中频率进行统计分析，或者对基因数据进行单倍型(即一条染色体上的多个SNP的组合)分型，然后对每一个单倍型在病人群体和对照群体中频率进行统计分析。如所研究SNP位于外显子或剪切位点，或可能的启动子区域，则该SNP有可能与所研究疾病直接相关。候选基因关联分析法只局限于对已知基因的研究，而且经常会引起假阳性、假阴性，同时选择候选基因时往往易受到主观性的影响，而对多个SNPs组合或者单倍型的协同作用不能做出客观分析，这些缺陷限制了其在搜寻人类复杂性疾病易感基因中的广泛应用；

(3)全基因组SNP关联分析。这是一项近年日益受到重视的研究多基因疾病的手段。全基因组SNP关联分析具有客观性的优势，用这种方法可将整个人类基因组与某种多基因病的临床表型进行关联分析^[10-14]。但这种方法的巨大费用限制了它的大规模应用。但近年来，大容量的SNP数据库的建立，DNA分型新技术的发展使得其成本大为降低，为该技术在发现人类复杂性疾病的易感基因的应用创造了条件。

总而言之，由于最近1-2年新技术的发展和成本的降低，使应用全基因组SNP关联分析对复杂疾病进行研究已经成为可能。

在本项研究中，发明人应用全基因组SNP关联分析，通过人类基因组中广泛分布的SNPs，对CAD人群和正常对照人群进行基因DNA分型和统计分析。在该统计分析中，如果某个SNP的一种等位基因或基因型的频率在以上两类人群中出现显著的差异，那么这个SNP则被认为可能与CAD相关。然后将这些结果在其它患者群体中加以验证，只有通过验证而继续阳性的SNP或基因才是真正的CAD易感基因。

通过这种方法，发明人发现在中国人群中，rs12050757位点T等位基因与CAD及AMI相关，是其易感基因位点。这是第一次对中国人冠心病人群进行全基因组SNPs研究，并首次将rs12050757位点T等位基因与CAD及AMI相关联。下面说明发现该关联性的具体方法和流程。

1、建立标准化临床标本库及信息管理系统：

冠心病病人的临床诊断标准是：1)AMI：存在以下症状中的至少两种：持续胸痛30分钟以上，心电图符合AMI，达到MI标准的显著CK的MB同工酶(CK-MB)升高；或2)冠状动脉旁路移植术，冠状动脉搭桥术，冠状动脉球囊扩张/支架术，或血管造影发现冠状动脉70％以上狭窄。凡符合其中一项标准，即诊断为冠心病。所有的正常对照都是通过血管造影，没有发现冠状动脉狭窄的个体。所有参与研究的这些病例和正常对照，都志愿接受跟踪调查，同时建立有相应的完整资料库。

2、对冠心病患者进行分子分型，并对分型结果进行可靠性分析：

总实验流程如下：

(1)SNP芯片扫描：对大于200例中国汉族冠心病病人和大于200例对照进行了全基因组90万SNP的全基因组扫描和CNV位点关联分析，统计分析，获得与中国汉族人群冠心病相关的易感位点。

(2)大样本验证：另外选择大于400对CAD病人-对照人群进行对最显著的10个SNP位点的等位基因分布频率调查，筛选出其中在CAD人群中频率显著高于对照组的位点。

3、统计分析：

(1)对每一个SNP数据单独分析。首先计算该SNP每一等位基因在病人群体和对照群体中的频率。然后对小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)进行卡方检验(Chi-square test)和Fisher精确检测分析(Fisher exact test)(two-tailed，＝0.05)，获得P值，以及95％的置信区间。如果MAF小于5％，那么仅使用Fisher精确检验进行分析。

(2)以PHASE程序估计每个基因的所有分型SNP构成的单倍型，把每一个单倍型作为一个SNP的等位基因处理，检测其在两组数据(病例和对照)之间的统计学意义。

(3)全基因组SNPs扫描，最大缺陷是存在许多假阳性，对于那些在一期研究中P＜10^-6的SNPs，在二期验证收集的数据中，进行SNP分型和统计分析。重复实验中，基因型分型将用DNA测序法完成。

4、确定冠心病易感基因：

通过以上对患者和对照的全基因组SNPs的关联分析，发现和冠心病显著相关的SNP，并把这个基因定为易感基因。

5、结果

发明人首先对230例中国汉族冠心病病人和230例对照进行了全基因组90万SNP和CNV位点关联分析，获得了与中国汉族人群冠心病相关的易感位点13个(P＜10^-2).

表1：一期SNP芯片分析结果

在二期验证中，发明人在北京地区另外选择了423对CAD病人-对照人群进行了对最显著的10个SNP位点进行了等位基因分布频率调查，结果发现其中有1个位点(rs12050757)在CAD人群中的频率显著高于对照组(表2)。

表2：位点rs12050757[C/T]在CAD-对照人群中的分布频率

通过上述实验和分析，得到了易感基因rs12050757。rs12050757位点信息如下：

AGAAAAAGAAAGATTGCCTATAAAAG[C/T]ATGACAATTAGATCAACCACAGACT。

其中T等位基因在CAD病人中的基因频率和基因型频率显著高于对照人群。

发明人据此开发了一种诊断CAD及AMI的试剂盒，其中利用测得的rs12050757位点T等位基因与CAD及AMI的相关性，通过检测rs12050757的基因型，测定受试者的CAD及AMI易感性。所有现有技术中可以检测SNP存在的技术均可用于本发明，而不限于本说明书中为了说明而作为实例举出的具体实施方式。本领域技术人员应理解，那些未在此具体描述，但是能够实现上述目的技术也落入本发明的范围内，本发明的保护范围为权利要求书中所限定。

下面通过具体实施例详细说明本发明。本领域技术人员应清楚，本发明并不限于此处所列出的实施例，其保护范围由所附权利要求书限定，下面的实施例仅仅是以示例的方式说明本发明，以使本发明更易于理解。

实施例1：直接测序法检测样本中的rs12050757

提取DNA：

从被测者获得5ml静脉EDTA抗凝血液样本。然后按照普通盐析法或采用专门的DNA提取试剂盒，如购自美国Omega公司的DNA提取试剂盒，提取待测血样的基因组DNA。

PCR扩增：

采用上游引物5′GGAAGTCCCACAAGTAGAAA 3′和下游引物5′CCCACAGTAACACCCAAG 3′对样品DNA进行PCR扩增(可采用例如日本TaKaRa公司的Takara PCR Thermal Cycler PCR扩增仪)。采用50μl PCR反应体系进行rs12050757的基因扩增，内含1×PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，100～150ng的基因组DNA，上下游引物均为0.5μM，dNTP为0.2mM，TaKaRa公司的ExTaq DNA聚合酶1.5U。PCR扩增循环参数如下：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后再延伸5分钟。

获得rs12050757的扩增产物：

取50μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，刀片切取目的条带。按照E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒(Omega公司)要求进行目的条带的DNA回收纯化。取2ul回收产物用UV2000紫外分光光度仪(日本岛津公司)测定紫外光吸收值，进行DNA浓度测定，并将最终浓度调整至约10-50ng/μl。

测序：

以回收后的产物为模板，以扩增时使用的下游引物作为测序引物，按照CEQ^TM DTCS-Quick Start Kit测序试剂盒(美国Beckman公司)要求进行测序PCR反应，反应结束并纯化后，用美国Beckman公司的CEQ8000型基因测序仪进行分离以判读扩增产物的序列。

将测得的序列与rs12050757序列进行比对，判断其中是否存在T等位基因。

实施例2：Taqman探针SNP检测法检测rs12050757

设计引物用于特异性扩增包含rs12050757位点的PCR产物，同时设计两条Taqman-MGB探针，分别针对rs12050757位点C和T等位基因。

引物设计原则为：

1、序列选取应在基因的保守区段

2、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构

3、引物长度在18到24个核苷酸。

4、Tm值在55-65℃，GC含量在40％-60％

5、引物之间的Tm值相差避免超过2℃

6、引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

7、PCR扩增片段长度在50bp-150bp

8、引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个的G和C。

Taqman MGB探针设计原则为：

1、探针的5’端避免出现G；

2、Tm值应为65-67℃；

3、尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp；

4、尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，避免出现4个或4个以上的G重复出现；

5、将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。

荧光基团可以采用FAM、VIC等来标记两个等位基因。

利用上述引物和探针，对待测样本进行实时定量PCR。

PCR条件：95℃预变性10分钟后进入30个扩增循环：92℃变性12秒，60℃退火及延伸1分钟(此阶段检测荧光信号)。

分析结果，测得样本中rs12050757位点是否存在等位基因T。

实施例3：PCR-单链构象多态性(single-strand conformationalpolymorphism，SSCP)法检测rs12050757

该方法的基本原理如下：

在不含变性剂的中性聚丙烯酸胺凝胶中，单链DNA的迁移率除与DNA的长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构像。相同长度的单链DNA，因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同。PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置。靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段有基团变异存在。例如，在SNP检测中，C等位基因纯合子、T等位基因纯合子和C/T杂合子电泳后会表现为不同的泳带位置，如图2所示。

步骤：

首先设计引物用于扩增样本和三种对照中的rs12050757位点，引物可以采用与实施例1相同的引物。PCR扩增条件也可与实施例1相同。

然后，对上述PCR扩增产物进行单链构象多态性(single-strandconformational polymorphism，SSCP)分析，以筛选出具有多态性的样本。取PCR扩增产物6μl(约300ng)，与4μl变性上样缓冲液混合，95℃加热5分钟，立即置于冰上1分钟，将上述10μl混合液上样于6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，4℃条件下稳压260V电泳2小时，用标准银染方法显带，观察带型分析样品基因型。

对照中的两种纯合子及杂合子会显示不同的带型，其效果如图2所示，从左至右依次为2种不同的纯合子及一种杂合子SSCP电泳后图谱。

将待测样本与对照样本同时电泳，比较其带型，得出其rs12050757基因型。

参考文献

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Claims (4)

1.一种检测冠心病易感性的试剂盒，其中包括检测样本中特定SNP位点rs12050757的基因型的试剂，所述rs12050757序列信息为AGAAAAAGAAAGATTGCCTATAAAAG[C/T]ATGACAATTAGATCAACCACAGACT。

2.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒包括利用测序法检测样本中rs12050757的基因型的试剂。

3.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒包括利用Taqman探针SNP检测法检测样本中rs12050757的基因型的试剂。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒为利用PCR-单链构象多态性法检测样本中rs12050757的基因型的试剂盒。

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