CN102757955B - 与冠心病相关的12号染色体易感区域标签单核苷酸多态性位点及其组成的单体型与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与冠心病相关的12号染色体易感区域标签单核苷酸多态性位点及其组成的单体型与应用。所述标签单核苷酸多态性位点为染色体12q21上邻近ATP2B1基因区域的一段紧密连锁区域内rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259、rs11105378位点。所述单体型在上述位点的单核苷酸分别为A、A、T、A、A、A、G、T、G、C、C；G、G、C、G、G、G、A、G、C、T、T；或G、A、T、G、A、A、G、T、G、T、C。本发明的标签单核苷酸多态性位点及单体型在冠心病的预防和/或诊断中有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及与冠心病相关的12号染色体易感区域标签单核苷酸多态性位点及其组成的单体型与应用，具体涉及染色体12q21上邻近ATP2B1基因区域的一段紧密连锁区域的基因内一系列区域标签单核苷酸多态性位点、所述单核苷酸多态性位点组成的单体型及其检测方法以及用于检测人群冠心病患病风险中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化性心脑血管病已成为世界范围关注的主要健康问题。2004年的世界卫生组织(WHO)报告显示，全世界每年心血管疾病以冠心病和脑卒中为主导致的死亡人数达高达1720万，占所有死亡人数的三分之一。预计2020年这一数字将进一步增加50％，高达2500万，心血管疾病是全球人类的“头号杀手”。在中国进行的一项大规模前瞻性研究也显示，心脏疾病已经成为中国人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第1位。我国每年新发心肌梗死50万人，随着生活方式的改变以及动脉粥样硬化相关的危险因素持续增加，冠心病与心肌梗死发病也还将呈持续上升趋势。
大量的研究资料表明，冠心病是一种复杂疾病，是由多个微效基因与环境因素长期相互作用所致。因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因，在人群中进一步筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于冠心病的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。从基础到临床，人们对此进行了大量的研究，并在冠心病的危险因素和冠心病发生的病理生理学方面积累了大量的知识，但是关于冠心病与心肌梗死发生的确切遗传分子机制却知之甚少，对于怎样鉴定遗传易感基因以及鉴定受试者的冠心病遗传易感性，一直缺乏全面系统有效的识别方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点；本发明的另一个目的是提供一种由染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点组成的染色体12q21区域基因单体型，特别是提供一种由染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点组成的染色体12q21区域基因危险性单体型；本发明的另一个目的是提供一种检测本发明的染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的方法；本发明的另一目的是提供一种检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的试剂在制备检测染色体12q21区域基因单体型的制剂或试剂盒中的应用；本发明的另一个目的是提供一种检测染色体12q21区域基因单体型的方法；本发明的另一目的是提供一种体外检测冠心病相关基因的方法；本发明的另一目的是提供一种检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用；本发明的另一目的是提供一种检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的试剂在制备用于体外检测待测样品中是否含有染色体12q21区域基因危险性单体型的制剂或试剂盒中的应用；本发明的另一目的是提供一种体外检测待测样品中是否含有染色体12q21区域基因危险性单体型的方法；本发明的另一目的是提供一种体外检测来自待测个体的样品中染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的试剂在制备预测待测个体患冠心病的危险性的制剂或试剂盒中的应用；本发明的另一目的是提供一种体外预测待测个体患冠心病的危险性的方法；本发明的另一目的是提供一种检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的多态性的试剂盒。
首先，本发明提供了染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点(taggingSNPs，tSNPs)，该位点分别为染色体12q21区域基因的单核苷酸位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378。上述多态性位点是在大量实验的基础上得出的。在本发明的具体实施方式中，首先使用全基因组芯片(Affymetrix AxiomTM Genome-WideCHB 1 Array Plate)芯片对1515例冠心病患者和5019例正常人对全基因组范围内SNP进行基因分型，利用芯片得到的数据，评价基因型和表型的关联关系，从而得到可能与冠心病之间存在潜在关联的染色体区域；其次选择相应染色体区域代表性的位点使用Fludigm EP1 TMGENETIC ANALYSIS system，Taqman MGB探针法进行基因分型实验，进一步在15460例冠心病患者和11472例对照样本中验证。在数据分析中使用Haploview软件计算染色体区域位点间的连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)情况，用r2表示(0-1)，同时构建单体型(haplotype)比较其在患者和正常对照之间的单体型差异，验证并确定冠心病的易感人群。使用logistic回归分析评估每个SNP位点与冠心病的关系，计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio，OR)和95％的可信区间。本发明中，通过大量实验研究分析首次得出，位于染色体12q21上邻近ATP2B1基因区域的一段紧密连锁区域内(更具体地说该区域位于染色体12q21上88505kb～88650kb区域间，数据来源：人类基因组数据库Human(NCBI build36)一系列SNP位点(rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378，特别是rs7136259)与冠心病易感性显著相关，在本发明的大量实验结果基础上，这些SNPs可以作为染色体12q21区域基因的标签SNPs，为研究染色体12q21区域基因功能提供了新的方法，在保证研究把握度的前提下，能够有效减少研究环节，降低研究成本。
在本发明的大量实验结果基础上，本发明的进一步研究发现，这一系列SNPs位点与冠心病易感性显著相关，见表1，这些SNPs的危险等位基因分别是：rs1401982多态性位点为G，rs2681472多态性位点为G，rs2681492多态性位点为C，rs2681485多态性位点为G，rs11105354多态性位点为G，rs12579302多态性位点为G，rs17249754多态性位点为A，rs11105364多态性位点为G，rs11105368多态性位点为C，rs7136259多态性位点为T，rs11105378多态性位点为T。携带这些危险等位基因的个体发生冠心病的相对风险是没有携带者的1.21-1.27倍。其中染色体rs7136259多态性位点T等位基因携带者的冠心病发病风险是C等位基因的携带者的1.21倍(OR＝1.21，95％CI：1.11-1.33)。该区域rs7136259和rs1401982，rs2681472，rs2681492，rs2681485，rs11105354，rs12579302，rs17249754，rs11105364，rs11105368，rs11105378多态性位点具有强的连锁不平衡(r2＞0.8，见表2)。染色体12q21区域代表位点rs7136259进一步在15460例冠心病患者和11472例对照样本中验证，合并所有16975例病例和16491对照样本分析显示rs7136259与冠心病的关联更加显著(P＝5.68×10-10)。本发明的研究结果进一步证实了Chr12q21区域多态位点与冠心病密切相关。
在上述标签SNP的基础上，本发明又对由rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378组成的单体型进行了深入研究。结果发现：由Chr12q21区域rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378构建了3种单体型：A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C；G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T；G-A-T-G-A-A-G-T-G-T-C，其中单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C和G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T在人群中最为常见，频率分别为0.603和0.36，这两个单体型与冠心病的易感性相关联，其频率在冠心病患者和正常人对照之间存在显著性差异。冠心病风险单体型(危险性单体型)为G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T，在冠心病病例中的频率为0.395，显著的高于对照组的频率0.351。而单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C在冠心病病例中的频率为0.568，显著的低于对照组的频率0.613，可以认为是保护性单体型。
从而，一方面，本发明提供了由本发明的标签单核苷酸多态性位点组成的染色体12q21区域基因单体型，该单体型在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为G、G、C、G、G、G、A、G、C、T、T；A、A、T、A、A、A、G、T、G、C、C；或G、A、T、G、A、A、G、T、G、T、C。其中，在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为G、G、C、G、G、G、A、G、C、T、T的单体型为染色体12q21区域基因危险性单体型，在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为A、A、T、A、A、A、G、T、G、C、C的单体型为染色体12q21区域基因保护性单体型，本发明通过大量的确切的实验结果说明了该问题，在校正年龄、BMI、高血压、吸烟、饮酒后，携带单体型G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T的个体患冠心病的危险性比携带其他单体型的个体患冠心病的危险性显著升高。携带单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C的个体患冠心病的危险性比携带其他单体型的个体患冠心病的危险性显著降低。
另一方面，本发明提供一种检测本发明的染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的方法。可用本领域已知的多种技术在DNA水平、RNA水平检测本发明染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点。例如：
可以采用直接测序的方法，通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异，具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对DNA直接进行测序，或是近年来发展的焦磷酸测序(Pyrosequencing)、微测序(SNaPshot)等。焦磷酸测序技术适于对已知的短序列的测序分析，其原理是引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。SnaPshot技术平台是Applied Biosystems，ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒，可对多个SNP位点同时进行基因分型，也被称为minisequencing，该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。
也可以采用基于杂交的方法，具体包括Taqman探针法，DNA芯片法等。TaqManSNP基因分型原理：利用核酸外切酶对5’特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号，反应体系包括：以基因组DNA或PCR产物为模板；一对PCR引物，以及分别用FAM和VIC标记的2条MGB探针检测SNP的两种类型；在PCR反应终点读取分型数据。DNA芯片技术：待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上，由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。
还可以采用基于引物延伸的方法，如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(MALDI-Tof-MS)。基质辅助激光解析离子飞行时间质谱检测原理：紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止，根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。
还可以采用基于构象的方法，具体例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)分析、变性高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography，dHPLC)等分析技术。其中，RFLP的原理：有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型；如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析来实现。SSCP：在非变性的条件下，单链DNA具有一定的折叠结构，这种折叠结构是由它的核苷酸序列决定的，SSCP的灵敏性依赖于SNP对折叠的影响和折叠如何影响目的序列的电泳迁移率，其策略是，将PCR扩增的待测片段与去离子甲酰胺混合，接着95℃变性解链，再骤冷到冰中，然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；稳定的理想条件下，凝胶电泳分离的结果是在某一位置范围内杂合子包含分隔很近的两条带，正常的DNA片段居于其中一条带，纯合突变SNP的DNA片段居于另一条带。DGGE：利用双链DNA分子在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时，会在一定变性剂浓度下发生部分解链，导致电泳迁移率下降；分别具有一种SNP等位基因型的两种DNA分子间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同时间发生部分解链，从而被分离成两条带。DHPLC：该技术是一项在SSCP和DGGE基础上发展起来的检测SNP的突变技术，此技术将未知的DNA片段与野生型DNA混和，经加热变性后再使其降温重退火，若为有突变的DNA，此时所形成的双螺旋有两种，即为同源双螺旋和异源双螺旋，基于同源双螺旋和异源双螺旋解链温度的不同，通过控制DHPLC的温度，使其维持在接近DNA分子Tm值下运行，然后进行洗脱，越小的DNA分子与柱的亲和力越小，就越容易洗脱下来；DNA经过PCR扩后，由于错配碱基的存在而形成异源双链，因为单链DNA所带的电荷比双链少，先被洗脱下来，而与正常的配对双链分开，最后根据色谱峰的峰型或数目来确定SNP的有或无。
还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)。该分析技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。
在具体实施时，本领域的技术人员可以根据实际情况选择上述的任一种技术体外检测本发明染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点。也可以采用多种技术的组合来体外检测染色体12q21区域基因序列的突变位点。例如，当限制性片断长度多态性分析方法与PCR结合后，检测灵敏性和特异性更高。当直接测序法与PCR结合使用时，检测灵敏性大大提高。在本发明的一个具体实施方式中，应用的是Taqman MGB方法，使用的是FludigmEP1TMGENETIC ANALYSIS system平台，由于该平台是属于较高通量的基因分型平台，在样本数为96个样本检测96个位点(使用96.96动态芯片)或48个样本检测48个位点(使用48.48动态芯片)时，具有经济高效的优点。而在具体到本发明的方案应用于少量待测样品的分析检测时，采用FludigmEP1TM GENETICANALYSIS system平台就不具备经济性和效率上的优势，此时可采用实时荧光定量PCR系统，如Applied Biosystems的7900HT(Fast)real time PCR系统、7500real time PCR系统等，应用Taqman-MGB探针法对单个位点进行基因分型；也可以应用PCR-RFLP、HRM等其他基因分型方法。
在上述检测本发明的染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的方法的基础上，本发明还提供了检测染色体12q21区域基因的单核苷酸多态性位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378的试剂在制备检测染色体12q21区域基因单体型的制剂或试剂盒中的应用。更具体地，所述检测染色体12q21区域基因的单核苷酸多态性位点的试剂可以为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合(PCR-RFLP)的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
另一方面，本发明还提供一种检测染色体12q21区域基因的危险性单体型的方法，该方法包括检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点。
检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的方法可以为本领域已知的任何检测单核苷酸多态性的方法，例如可以为本说明书前面提到的直接测序法、基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术等检测方法。此外，本发明检测染色体12q21区域基因的危险性单体型的方法还可包括对所述标签单核苷酸多态性位点的检测结果进行统计分析。例如，在本发明的一个实施方式中，该方法利用Haploview程序，校正年龄、BMI、高血压、吸烟、饮酒后，对由本发明的标签单核苷酸多态性位点的结果进行统计分析，尤其对由本发明的标签单核苷酸多态性位点组成的单体型进行统计分析，从而得出了染色体12q21区域基因的危险性单体型。
另一方面，本发明还提供一种体外检测冠心病相关基因的方法，该方法包括检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378。本发明在大量实验及统计分析的基础上，选取了16975例冠心病患者和16491例正常人为研究对象，以确切的实验数据证明了染色体12q21区域基因与冠心病的关系，从而提供了冠心病相关基因。
从而，本发明还提供了检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378的试剂在制备用于体外检测待测样品中是否含有染色体12q21区域基因危险性单体型的制剂或试剂盒中的应用，其中，染色体12q21区域基因危险性单体型在rs7136259位点的单核苷酸为T。更进一步地，染色体12q21区域基因危险性单体型在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为G、G、C、G、G、G、A、G、C、T、T。
另一方面，本发明还提供一种体外检测待测样品中是否含有染色体12q21区域基因的危险性单体型的方法，该方法包括：
1)提取待测样品的DNA，针对染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378设计引物进行PCR扩增；
2)对全部PCR产物进行分析；
3)鉴定rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378位点的单核苷酸多态，其构成的单体型是否为：A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C；G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T；或G-A-T-G-A-A-G-T-G-T-C。
另一方面，本发明还提供一种体外检测来自待测个体的样品中染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378的试剂在制备预测待测个体患冠心病的危险性的制剂或试剂盒中的应用。从另一角度而言，本发明还提供了一种体外预测待测个体患冠心病的危险性的方法，该方法包括体外检测来自待测个体的样品中染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378。其中，携带rs7136259位点的单核苷酸为T的个体或者携带由位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的单核苷酸组成的单体型G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T的个体患冠心病的危险性比携带由位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的单核苷酸组成的单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C或G-A-T-G-A-A-G-T-G-T-C的个体患冠心病的危险性显著升高。含有本发明的基因的待测样品可以从受试者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。优选来自血液。可以先从受试者的细胞获得含有本发明的基因的待测样品，然后按照常规方法提取基因的DNA。所述待测个体优选为中国汉族人。本发明通过大量的实验，校正年龄、BMI、高血压、吸烟、饮酒后，与单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C或G-A-T-G-A-A-G-T-G-T-C相比，携带单体型G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T的个体患冠心病的危险显著升高。在本发明大样本的统计分析的基础上，可以单独使用本发明的方法，体外检测来自待测个体的样品中染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378构成的单体型，以体外预测待测个体患冠心病的危险性，也可以同时考虑其他环境危险因素，例如是否吸烟、是否高血压、是否糖尿病、是否血脂紊乱和是否有心梗家族史等，以达到体外预测待测个体患冠心病危险性的目的。
另一方面，本发明还提供一种检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的多态性的试剂盒，试剂盒分别含有：
1)扩增rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378位点的引物；
2)PCR扩增酶及相应缓冲液；
3)测定rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378位点多态的试剂。
所述试剂盒内可以装有一个或多个容器，容器内装有用以检测含有所述多态性位点的染色体12q21区域基因的一种或多种组分。按照具体检测方法及检测多态性位点的不同，试剂盒可含有不同组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。本领域普通技术人员已知，扩增所述多态性位点的引物，可以依据本发明已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45％-50％左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，例如(Oligo 6.53软件)。PCR扩增的酶可以为TaqDNA聚合酶、Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。试剂盒中检测所述多态性的试剂根据检测方法的不同而不同。例如，采用Taqman探针方法，试剂盒中可以含有用于检测特异SNP位点的taqman-MGB探针；采用MALDI-TOF-MS方法，试剂盒中可以含用于检测特异SNP位点的单碱基延伸引物；采用聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合方法来检测所述多态性位点时，试剂盒中可以含有限制性内切酶和相应的酶切图谱。所述检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点的多态性的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因，以及体外检测待测个体患冠心病的危险性。
综上所述，本发明发现了与冠心病相关的染色体12q21区域基因11个重要变异位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378。其中rs7136259位点特别是所述11个位点的特定组合，大大增加了个体罹患冠心病的风险。这一发现在临床上具有潜在的应用价值：对染色体12q21区域基因的这11个位点进行基因型鉴定，若是发现某个体携带G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T单体型，则该个体与携带A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C或G-A-T-G-A-A-G-T-G-T-C单体型的个体相比，患冠心病的风险显著升高。据此，医生可以指导该个体改变不良生活习惯，降低环境因素对疾病的诱发。可见，染色体12q21区域基因标签SNP组成的单体型在冠心病的预测和预防中有重要的应用前景。
附图说明
图1为显示chr12q21区域SNP位点与冠心病的关联图表。其中，横坐标为染色体位置，纵坐标为SNP位点与冠心病的关联显著性P值(-log10P)，代表位点rs7136259以◆表示。
图2为实施例中使用FludigmEP1 TMGENETIC ANALYSIS system，Taqman MGB探针法进行基因分型实验时，进行Assay和Sample的加样过程示意图。
图3显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)代表位点rs7136259基因分型结果(聚类图)。其中，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为C/C纯合子，2、绿色为T/T纯合子，3、蓝色为C/T杂合子，4、黑色为阴性对照(NTC)。
图4为应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs7136259位点的截屏图。
图5为96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs7136259基因分型数据导出结果(部分)截图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例一chr12q21基因标签SNPs的选择和检测
一、病例对照样本入选标准
冠心病病例包括心肌梗死患者和心绞痛患者。心肌梗死病例的入选诊断标准为急性心肌梗死诊断标准(根据WHO 1979年的诊断标准)：即典型胸痛症状持续30分钟以上；心电图连续2个导联ST段抬高(肢体导联0.1mv，胸导联0.2mv)并有系列动态变化；心肌坏死的血清标记物浓度升高，如肌钙蛋白(TNT/TNI)升高，心肌同工酶(CK-MB)升高大于正常值高限的2倍。心绞痛病例的入选诊断标准为经冠脉造影发现冠状动脉至少一个主要分支狭窄超过70％。经各项检查除外心脏瓣膜疾病、先天性心脏病、心力衰竭、严重的肾脏及肝脏疾病、继发性高血压、心肌病、家族性高胆固醇血症及可疑冠心病患者。符合上述诊断的病例可以入选本研究。对照组入选标准：既往无冠心病或其他动脉粥样硬化病史，无胸痛、胸闷等心脏病症状，心电图无明显缺血性改变。病例组和对照组均为中国汉族人，且无血缘关系。
研究人群的基本特征：研究人群包括筛查阶段的芯片检测样本(包括1515例冠心病患者和5019例对照)，基本特征如下表：
二、研究实验方案
在中国汉族人群中选取1515例冠心病患者和5019例正常人为研究对象。使用全基因组芯片(Affymetrix AxiomTM Genome-Wide CHB 1 Array Plate)对全基因组范围内SNP进行基因分型。利用芯片得到的数据，评价基因型和表型的关联关系，从而得到可能与冠心病之间存在潜在关联的染色体区域。在数据分析中使用Haploview软件计算染色体区域位点间的连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)情况，用r2表示(0-1)，同时构建单体型(haplotype)比较其在患者和正常对照之间的单体型差异，验证并确定冠心病的易感人群。使用logistic回归分析评估每个SNP位点与冠心病的关系，计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio，OR)和95％的可信区间。
Chr12q21区域SNP位点序列
三、实验结果
通过全基因组关联(GWAS)分析计算SNP芯片的每个位点关联强度(OR值)和显著性水平(P值)，发现位于染色体12q21上邻近ATP2B1基因区域(88505kb～88650kb区域间)有一个关联信号(P值小于0.001)(见图1，给出了rs7136259上下游共300K区域所有位点与冠心病关联的显著性)。这一段紧密连锁区域内一系列SNP位点(rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378)与冠心病易感性显著相关(见表1)。这一系列SNP位点及其两翼相关序列如下：
rs1401982 AGACACAGGATACAAGAACCTCAATA[G/A]GTCCCTCATTTAGTATAGAGCAATT(SEQ ID No.1)
rs2681472 GGTTCATAGTGGGTCTGCCATGTAAA[C/T]AGCTGCAAGAAGAGCATTCCAAGCA(SEQ ID No.2)
rs2681492 GTGGACCGGAGTTCAAATCTAGAAGT[T/C]GCGAGTAACACCAATGACCTGAGAC(SEQ ID No.3)
rs2681485 TTAATACCTCTGGTCGGACCCGTTGT[G/A]TATGAGACAGAGATGTTTTTTTTTT(SEQ ID No.4)
rs11105354 CATGTTTTTTAGTACATTTTTGGAAT[A/G]GGGAAATAAATGCAGAAAAACTTTC(SEQ ID No.5)
rs12579302 CTTTTGGCCGGCAAAAACTATACTCT[A/G]TATGATTTGTCACATGTTACCACCT(SEQ ID No.6)
rs17249754 TTCCAAGACCTTCTTAAATTACTCCA[A/G]CTCTTTCCAGGGTCCTCAAGTCTGC(SEQ ID No.7)
rs11105364 TTTTGAATTTTGAGAATATGTCTTAC[G/T]GCTATATTAGCAATGAGCCTAAGTA(SEQ ID No.8)
rs11105368 TTTTCAGAAACAACGGAACAGAACTA[C/G]TATTTAAAAACTATAATTCAAGAAA(SEQ ID No.9)
rs7136259 AGGTTTGTGTAGTACACTGTGTGAAT[C/T]TGCACAATAACGAAATTGCAACGCA(SEQ ID No.10)
rs11105378 TTTTGGAGCTAGTCTGTTTTTCATGG[C/T]ATGTTAACAAAAGAACATTAGTTTT(SEQ ID No.11)
上述SNP位点的危险等位基因分别是：rs1401982多态性位点为G，rs2681472多态性位点为G，rs2681492多态性位点为C，rs2681485多态性位点为G，rs11105354多态性位点为G，rs12579302多态性位点为G，rs17249754多态性位点为A，rs11105364多态性位点为G，rs11105368多态性位点为C，rs7136259多态性位点为T，rs11105378多态性位点为T，见表1。携带这些危险等位基因的个体发生冠心病的相对风险是没有携带者的1.21-1.27倍。其中rs7136259多态性位点T等位基因携带者的冠心病发病风险是C等位基因的携带者的1.21倍(OR＝1.21，95％CI：1.11-1.33)。该区域rs7136259和rs1401982，rs2681472，rs2681492，rs2681485，rs11105354，rs12579302，rs17249754，rs11105364，rs11105368，rs11105378多态性位点具有强的连锁不平衡(r2＞0.8，见表2)。
由Chr12q21区域rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378构建了3种单体型，其中单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C和G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T在人群中最为常见，频率分别为0.603和0.36。这两个单体型与冠心病的易感性相关联，其频率在冠心病患者和正常人对照之间存在显著性差异(见表3)。冠心病风险单体型为G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T，在冠心病病例中的频率为0.395，显著的高于对照组的频率0.351。
表1.Chr12q21区域SNP位点与冠心病的关联结果
区域：表示该多态性位点所在的染色体区带；Risk allele：风险等位基因；Other allele：参照等位基因；基因频率为风险等位基因频率。OR(95％CI)表示与携带参照等位基因的个体相比，携带风险等位基因的个体发生冠心病的相对风险。
表2.Chr12q21区域rs7136259与其他SNP连锁不平衡关系(r2)
表3.Chr12q21区域SNP单体型与冠心病的关联结果
*单体型分别由rs1401982，rs2681472，rs2681492，rs2681485，rs11105354，rs12579302，rs17249754，rs11105364，rs11105368，rs7136259，rs11105378组成。
实施例二chr12q21基因标签SNPs的检测
本实施例中，进一步在15460例冠心病患者和11472例对照样本中针对实施例一所选择的相应染色体区域代表性的位点进行检测，同时作为对实施一所选择标签SNPs的验证。
一、病例对照样本入选标准
病例对照样本入选标准同实施例一。研究人群为重复检测验证样本(包括15460例冠心病患者和11472例对照)，基本特征如下表：
二、检测方法
本实施例的重复检测验证，是使用FludigmEP1 TMGENETIC ANALYSIS system，该系统为美国芯片Fludigm公司开发的高通量基因分型系统，由集成流体管道(IFC)芯片、集成流体管道控制器(IFC controller)、热循环系统和荧光信号采集系统(EP1 reader)构成；采用Taqman基因分型常规试剂，可同时对96个样本96个SNP位点进行基因分型；是一种高通量的开放式基因分析平台(Wang，J.，Lin，M.，Crenshaw，A.，Hutchinson，A.，Hicks，B.，Yeager，M.，Berndt，S.，Huang，W.，Hayes，R.B.，Chanock，S.J.，Jones，R.C.，and Ramakrishnan，R.2009 Nov 28.High-throughput single nucleotide polymorphism genotyping using nanofluidicDynamic Arrays.BMC Genomics)。
Taqman MGB探针法进行基因分型实验，该基因分型实验具体如下：
仪器、材料
仪器：FludigmEP1 TMGENETIC ANALYSIS system
试剂、样本：
耗材：
| 96.96基因分型芯片 | 96.96 Dynamic Array(138X) |
| 芯片控制液(150μl×2) | Control Line Fluid(150μl×2) |
| 96孔PCR板和一次性封板膜 | 96well plates and seal(one-off) |
实验方法
(一)操作步骤：
1.Assay制备：在96孔PCR板上，参照下表制备Assay mix
| Component | 每个加样孔体积(μl) |
| 40×Taqman Genotyping Assay | 1.25 |
| 2×Assay Loading Reagent | 2.5 |
| ROX(50×) | 0.25 |
| DNase/RNase-free water | 1.0 |
| 总体积 | 5.0 |
加完后，盖上一次性封板膜，微孔板振荡器上充分混匀，微孔板离心机上2500～3000rpm(500g离心力左右)离心30秒，放置冰上备用。
2.sample制备：在96孔PCR板中参照下面表格制备Sample mix：
| Component | 每个加样孔体积(μl) |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | 3 |
| 20×GT Sample Loading Reagent | 0.3 |
| AmpliTaq Gold DNA聚合酶 | 0.06 |
| Genomic DNA | 2.52 |
| DNase/RNase-free water | 0.12 |
| 总体积 | 6.0 |
加完后，盖上一次性封板膜，微孔板振荡器上充分混匀，微孔板离心机上2500～3000rpm(500g离心力左右)离心30秒左右，放置冰上备用。
3.加样及扩增
芯片于集成流体管道控制器HX中初始化后，参照图2加样。(Assay的加样量为4.2μl/孔，Sample的加样量为5.2μl/孔)。将加好样的芯片重新放置于集成流体管道控制器HX中，启动“Load Mix(138X)”程序，进行分液和混合。
上述过程完成后，马上(一小时内)将芯片从集成流体管道控制器HX中取出，去掉芯片后面蓝色的贴膜，将芯片置于热循环系统(Stand alone Thermo Cycler)中，启动Thermo Cycler PCR仪，PROGTM96程序，进行PCR过程。PCR结束后，关掉PCR仪下方真空泵(Vacuum Pump)，打开PCR仪上面盖子，取下芯片。
(二)数据采集：启动荧光信号采集系统(EP1reader)，FluidigmData Collection Softwareversion 3采集数据。
(三)数据分析：将采集到的数据应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析。以X轴代表VIC荧光信号强度，Y轴代表FAM荧光信号强度，根据两种荧光信号的相对高度进行聚类，以红色和绿色分别代表XX、YY纯合子，蓝色代表杂合子，黑色代表阴性对照(NTC)。基因分型结果以excel表格输出。
三、实验结果
检测的rs7136259位点基因分型聚类图见图3。应用SNP Genotyping Analysis softwareversion 3.0软件进行数据分析时rs7136259位点的截屏参见图4。96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs7136259基因分型数据导出结果(部分)截图参见图5。
本实施例中，12q21区域代表位点rs7136259进一步在15460例冠心病患者和11472例对照样本中验证，rs7136259与冠心病的显著关联(P＝7.5×10-7)见表4，进一步合并所有16975例病例和16491对照样本分析显示rs7136259与冠心病的关联更加显著(P＝5.68×10-10)(见表5)，这一结果进一步证实了Chr12q21区域多态位点与冠心病密切相关。
表4.Chr12q21区域代表位点rs7136259在重复验证样本中的关联结果
HWE P为HWE检验的P值。
表5.Chr12q21区域代表位点rs7136259在16975例病例和16491例对照样本中的关联结果
区域：表示该多态性位点所在的染色体区带；“Risk Allele(Freq)”：表示风险等位基因及其基因频率；OR(95％CI)表示与携带参照等位基因的个体相比，携带风险等位基因的个体发生冠心病的相对风险。
通过本发明的上述实验研究，对所述SNP位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和/或rs11105378以及由这些SNP位点组成的单体型在患者和正常人之间频率差异的分析，可以得出各位点具体碱基的变异及由其组成的单体型差异和冠心病易感性的关系。如属于以下特征之一的人群均为冠心病的易感人群：染色体12q21区域内邻近ATP2B1基因区域的rs1401982多态性位点为G，rs2681472多态性位点为G，rs2681492多态性位点为C，rs2681485多态性位点为G，rs11105354多态性位点为G，rs12579302多态性位点为G，rs17249754多态性位点为A，rs11105364多态性位点为G，rs11105368多态性位点为C，rs7136259多态性位点为T，rs11105378多态性位点为T，以及由位于此基因区域的SNP位点rs1401982，rs2681472，rs2681492，rs2681485，rs11105354，rs12579302，rs17249754，rs11105364，rs11105368，rs7136259，rs11105378组成的单体型G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T的个体。
根据本发明Chr12q21区域由一段邻近ATP2B1基因区域内的SNP位点以及由一系列SNP位点组成的单体型的变异特性判断冠心病易感人群的方法，可以对未出现冠心病早期临床症状的人群，尤其具有传统危险因素的冠心病高危人群，进行无创快速简便的筛查，早期发现冠心病易感对象，并采取相应的保健措施，降低冠心病与心肌梗死的发病率。这是本发明的一个重要用途。
根据本发明也可以为研发针对性的冠心病基因治疗提供了科学依据。本发明为进一步检测基因表达调控、蛋白功能，深入研究冠心病的致病机制，开发新型治疗药物和基因治疗，实现基于遗传学背景的个体化诊疗莫定了重要基础，并带来重要的医学健康效益和经济效益。
Claims (13)
1.一种检测染色体12q21区域基因的单核苷酸多态性位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂在制备检测中国汉族人与冠心病相关的染色体12q21区域基因单体型的制剂或试剂盒中的应用；其中，在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为G、G、C、G、G、G、A、G、C、T、T的单体型为染色体12q21区域基因危险性单体型，在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为A、A、T、A、A、A、G、T、G、C、C的单体型为染色体12q21区域基因保护性单体型，携带单体型G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T的个体患冠心病的危险性比携带其他单体型的个体患冠心病的危险性显著升高，携带单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C的个体患冠心病的危险性比携带其他单体型的个体患冠心病的危险性显著降低。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述检测染色体12q21区域基因的单核苷酸多态性位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂为：用于直接测序法的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述检测染色体12q21区域基因的单核苷酸多态性位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂为：用于聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述检测染色体12q21区域基因的单核苷酸多态性位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂为：用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述检测染色体12q21区域基因的单核苷酸多态性位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂为用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
6.检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂在制备用于体外检测中国汉族人冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用；其中，携带由位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的单核苷酸组成的单体型G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T的个体患冠心病的危险性比携带由位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的单核苷酸组成的单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C或G-A-T-G-A-A-G-T-G-T-C的个体患冠心病的危险性显著升高。
7.检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点rs7136259的试剂在制备用于体外检测中国汉族人冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用；其中，rs7136259多态性位点T等位基因携带者的冠心病发病风险是C等位基因的携带者的1.21倍。
8.检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂在制备用于体外检测来自中国汉族人的待测样品中是否含有与冠心病相关的染色体12q21区域基因危险性单体型或保护性单体型的制剂或试剂盒中的应用，其中，染色体12q21区域基因危险性单体型在rs7136259位点的单核苷酸为T。
9.根据权利要求8所述的应用，其中：
染色体12q21区域基因危险性单体型在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为G、G、C、G、G、G、A、G、C、T、T；
染色体12q21区域基因保护性单体型在rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378位点的单核苷酸分别为A、A、T、A、A、A、G、T、G、C、C。
10.检测染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点rs7136259的试剂在制备用于体外检测来自中国汉族人的待测样品中是否含有与冠心病相关的染色体12q21区域基因危险性单体型或保护性单体型的制剂或试剂盒中的应用，其中，染色体12q21区域基因危险性单体型在rs7136259位点的单核苷酸为T。
11.体外检测来自待测个体的待测样品中染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点：rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的试剂在制备预测中国汉族人待测个体患冠心病的危险性的制剂或试剂盒中的应用，其中，携带由位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的单核苷酸组成的单体型G-G-C-G-G-G-A-G-C-T-T的个体患冠心病的危险性比携带由位点rs1401982、rs2681472、rs2681492、rs2681485、rs11105354、rs12579302、rs17249754、rs11105364、rs11105368、rs7136259和rs11105378的单核苷酸组成的单体型A-A-T-A-A-A-G-T-G-C-C或G-A-T-G-A-A-G-T-G-T-C的个体患冠心病的危险性显著升高。
12.体外检测来自待测个体的待测样品中染色体12q21区域基因的标签单核苷酸多态性位点rs7136259的试剂在制备预测中国汉族人待测个体患冠心病的危险性的制剂或试剂盒中的应用，其中，携带rs7136259位点的单核苷酸为T的个体的冠心病发病风险是C等位基因的携带者的1.21倍。
13.根据权利要求8～12任一项所述的应用，其中所述的待测样品来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查或尸体解剖材料。
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| Common Variants in the ATP2B1 Gene Are Associated With Susceptibility to Hypertension : The Japanese Millennium Genome Project;Yasuharu Tabara;《Hypertension》;20101004;第56卷;973-980 * |
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| The Ca2+ pump of the plasma membrane;Carafoli E;《J Biol Chem》;19921231;第267卷;2115–2118 * |
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