CN115927600A - 检测rs532223多态性的物质在制备预测PMO严重程度的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测rs532223多态性的物质在制备预测PMO严重程度的产品中的应用。本发明还公开了检测rs532223多态性的物质在如下1)‑5)中任一种中的应用：1)预测或辅助预测PMO患者骨流失程度；2)筛查或辅助筛查PMO重症患者或携带PMO重症基因型的个体；3)筛查或辅助筛查PMO轻症患者或携带PMO轻症基因型的个体；4)评价或辅助评价待测者PMO患病风险；5)筛查或辅助筛查PMO易感个体或携带PMO易感基因型的个体。

Description

检测rs532223多态性的物质在制备预测PMO严重程度的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及检测rs532223多态性的物质在制备预测PMO严重程度的产品中的应用。

背景技术

绝经后骨质疏松(Postmenopausal Osteoporosis，PMO)是最常见的骨骼疾病，PMO导致的骨密度下降以及骨折严重影响了人类健康。2016年的统计研究表明，我国50岁以上的女性人群中PMO患病率高达34.65％。通常状态下PMO的症状不易被察觉，往往患者发生了骨折才意识到其存在，而此时对于患者的治疗将产生较大的经济压力。

目前国内外一系列研究表明PMO的发生及骨密度下降程度与个体遗传易感性密切相关，发现的易感基因可能作为一种重要的分子标志物用于预防和诊断疾病、评估病情严重程度，并提供有效的治疗办法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何预测PMO患者骨流失程度或PMO严重程度或如何评价PMO患病风险或如何筛查PMO重症患者或PMO易感个体。

为了解决上述技术问题，本发明提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质的新用途。

本发明提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备预测或辅助预测PMO患者骨流失程度或PMO严重程度的产品中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在预测或辅助预测PMO患者骨流失程度或PMO严重程度中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查PMO重症患者或携带PMO重症基因型的个体的产品中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在筛查或辅助筛查PMO重症患者或携带PMO重症基因型的个体中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查PMO轻症患者或携带PMO轻症基因型的个体的产品中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在筛查或辅助筛查PMO轻症患者或携带PMO轻症基因型的个体中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备评价或辅助评价待测者PMO患病风险的产品中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在评价或辅助评价待测者PMO患病风险中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查PMO易感个体或携带PMO易感基因型的个体的产品中的应用。

本发明还提供了检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在筛查或辅助筛查PMO易感个体或携带PMO易感基因型的个体中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品；所述产品的功能为如下1)-5)任一种：

1)预测或辅助预测PMO患者骨流失程度或PMO严重程度；

2)筛查或辅助筛查PMO重症患者或携带PMO重症基因型的个体；

3)筛查或辅助筛查PMO轻症患者或携带PMO轻症基因型的个体；

4)评价或辅助评价待测者PMO患病风险；

5)筛查或辅助筛查PMO易感个体或携带PMO易感基因型的个体。

本发明提供的产品包括检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质。

上述任一所述应用或产品中，所述骨流失程度可按照如下方法进行预测：检测PMO患者基因组DNA中rs532223位点的基因型，并根据rs532223位点的基因型判断PMO患者骨流失程度：rs532223位点为AA基因型的PMO患者的骨流失程度比rs532223位点为GA基因型的PMO患者严重，rs532223位点为GA基因型的PMO患者的骨流失程度比rs532223位点为GG基因型的PMO患者严重。

所述PMO严重程度可按照如下方法进行预测：检测PMO患者基因组DNA中rs532223位点的基因型，并根据rs532223位点的基因型判断PMO患者的PMO严重程度：rs532223位点为AA基因型的PMO患者的PMO严重程度高于rs532223位点为GA基因型的PMO患者，rs532223位点为GA基因型的PMO患者的PMO严重程度高于rs532223位点为GG基因型的PMO患者。

所述PMO患病风险可按照如下方法进行评价：检测待测者基因组DNA中rs532223位点的基因型，并根据rs532223位点的基因型评价待测者PMO患病风险：rs532223位点为AA基因型或GA基因型的待测者的PMO患病风险高于rs532223位点为GG基因型的待测者。

所述PMO重症患者为携带PMO重症基因型的患者。所述PMO重症基因型为AA基因型；所述AA基因型为rs532223位点为A的纯合体。

所述PMO轻症患者为携带PMO轻症基因型的患者。所述PMO轻症基因型为GG基因型；所述GG基因型为rs532223位点为G的纯合体。

所述PMO易感个体为携带PMO易感基因型的个体。所述PMO易感基因型为AA基因型或GA基因型；所述AA基因型为rs532223位点为A的纯合体；所述GA基因型为rs532223位点为G和A的杂合体。

上述任一所述应用或产品中，所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质包括检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的试剂和/或仪器；所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的试剂和/或仪器可包括通过下述至少一种方法确定rs532223位点多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片和基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

进一步的，所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的试剂包括扩增rs532223位点的特异性引物对和/或单碱基延伸引物。其中，扩增rs532223位点的特异性引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出含有rs532223位点的人基因组DNA片段即可。所述单碱基延伸引物可根据人基因组中rs532223位点上游或下游(不包括该SNP位点)序列设计，所述单碱基延伸引物的3’末端核苷酸对应于人基因组rs532223位点的相邻位核苷酸(即rs532223位点的前一位核苷酸或rs532223位点的后一位核苷酸)。

所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的仪器含有如下仪器中的一种或多种：PCR仪、DNA测序仪、质谱仪。

更进一步的，所述特异性引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。

所述单碱基延伸引物为序列表中序列3所示的单链DNA分子。

上述任一所述应用或产品中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒与仪器的组合产品，如由用于PCR扩增rs532223位点的引物对、单碱基延伸引物和质谱仪组成的产品、或由用于PCR扩增rs532223位点的引物对、单碱基延伸引物和DNA测序仪组成的产品。

在实际应用中，为了提高准确率，可将检测rs532223位点多态性或基因型的物质与其他物质(如检测其他与PMO相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查易患PMO个体的产品。

上述任一所述应用或产品中，所述产品适用于女性，具体可适用于中国汉族女性。

上述任一所述应用或产品中，所述rs532223位点为人基因组第6号染色体第7016792位脱氧核糖核苷酸。

上述任一所述应用或产品中，所述待测者为女性，具体为中国汉族女性。

上述任一所述应用或产品中，所述PMO患者为绝经后骨质疏松患者。

本发明以两组由中国汉族血缘上无关的女性PMO患者组成的病例群体为研究对象进行实验和验证发现：rs532223位点基因型与PMO患者群体的骨密度降低水平显著相关，并通过线性回归分析并矫正年龄及身体质量指数后，证明rs532223多态性位点是PMO患者重症化的一个风险因素(骨密度T-score下降，BETA＝-0.69，p＝5.65×10^-6)。本发明首次发现rs532223位点是与PMO重症化相关的单核苷酸多态位点，rs532223位点为AA基因型的PMO患者的骨流失程度比rs532223位点为GA基因型的PMO患者严重，rs532223位点为GA基因型的PMO患者的骨流失程度比rs532223位点为GG基因型的PMO患者严重。检测rs532223位点多态性或基因型的物质可用于筛查PMO易感个体、预测PMO严重程度、筛查携带PMO重症基因型的个体和评价PMO患病风险。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测rs532223位点基因型方法的建立

本发明中的rs532223位点位于人基因组第6号染色体第7016792位(参考人类38版参考序列，GRCh38)，该位点的多态性为G/A，共存在如下三种基因型：GG、GA或AA。检测rs532223位点基因型的方法具体如下：

1、基因组DNA的提取

提取待测样品基因组DNA，以其为模板进行基因型检测。

2、引物的设计与合成

使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计用于PCR扩增rs532223位点的特异性引物对(由正向引物和反向引物组成)及用于单碱基扩增反应的单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。引物具体序列如下：

正向引物：5’-ACGTTGGATGCCTCTATCCATTAGTGGGTC-3’(序列1)；

反向引物：5’-ACGTTGGATGCTGATTATCATGTGTGCGAC-3’(序列2)；

单碱基延伸引物：5’-GGGTCTTTTCCCTATGC-3’。

3、rs532223位点基因型检测

1)PCR扩增

按照表1配制PCR反应体系，并按照如下程序进行PCR扩增：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。PCR扩增结束后得到PCR产物。

表1、每个PCR反应体系的组分

2)PCR产物碱性磷酸酶处理

PCR反应结束后，将上述1)得到的PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs，得到碱性磷酸酶处理后产物。

SAP反应体系如表2所示。

SAP反应条件如下：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持。

表2、SAP反应体系

3)单碱基延伸

碱性磷酸酶处理结束后进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸产物。

单碱基延伸反应体系如表3所示。

单碱基延伸反应条件如下：

I.94℃30秒；

II.94℃5秒；

III.52℃5秒；

IV.80℃5秒；

V.回到III，4次循环；

VI.回到II，39次循环；

VII.72℃3分钟；

VII.4℃。

表3、单碱基延伸反应体系

4)树脂纯化

将Clean Resin树脂(美国Sequenom公司)平铺到6mg的树脂板中；然后加16μL水到上述3)得到的单碱基延伸产物的对应孔内；再将干燥后的树脂倒入单碱基延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与单碱基延伸产物充分接触；最后离心使树脂沉入孔底部，得到树脂纯化后的延伸产物。

5)芯片点样

启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(SEQUENOM公司)，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片(SEQUENOM公司)上。

6)质谱检测

使用MALDI-TOF检测点样后的SpectroCHIP芯片，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，确定待测样品中rs532223位点基因型。

实施例2、rs532223位点基因型与PMO严重程度的相关性分析

一、研究对象

研究对象是北京积水潭医院于2019年9月至2021年4月期间获得的第一组150例PMO患者和第二组191例PMO患者的外周血样品。全部PMO患者均进行qCT(定量CT)检查，所有341名患者的腰椎椎体松质骨平均骨密度q值均<80，符合骨质疏松的诊断标准。全部PMO患者均无与自身免疫相关的疾病(例如白癜风、银屑病、I型糖尿病等)和肿瘤。全部PMO患者均是血缘上无关的中国女性汉族人，年龄范围为54-92岁，平均年龄为68.24±8.09岁，其中，2％PMO患者具有吸烟史，0.3％PMO患者具有饮酒史，47.2％PMO患者患有高血压，20％PMO患者患有2型糖尿病。以上每个研究对象均签署知情同意书，本研究得到北京积水潭医院医学伦理委员会的批准。

二、rs532223位点基因型与PMO患病风险及严重程度的相关性分析

1、基于第一组PMO患者进行rs532223位点基因型与PMO患病风险及严重程度的相关性分析

按照实施例1中建立的rs532223位点基因型的检测方法，分别提取第一组150例PMO患者的外周血样品的基因组DNA进行PCR扩增、单碱基延伸反应和基因分型，确定PMO患者DNA的rs532223位点基因型。然后将rs532223位点基因型与PMO患病风险及PMO严重程度进行相关性分析。试验所有数据采用R 4.0统计软件进行处理统计。rs532223位点基因型与PMO患病风险的相关性分析中以正常人群的骨密度参考数据库(“正常人群的骨密度参考数据库”记载于文献“中国人群定量CT椎体骨密度正常参考数据库及BMI、年龄的相关性:基于中国健康定量CT大数据队列研究”中)作为基准。

在第一组150例PMO患者中，rs532223位点基因型为AA的个体为106例，rs532223位点基因型为GA的个体为39例，rs532223位点基因型为GG的个体为5例。通过Logistic回归分析校正后，得到rs532223位点变异与人群的显著性p值为5.65×10^-6，Beta(突变表型贡献度)为-0.69，95％置信区间为0.40-0.98。以上结果说明rs532223位点是与PMO患病风险相关的单核苷酸多态性位点，rs532223位点为AA基因型和GA基因型的个体的PMO患病风险高于rs532223位点为GG基因型的个体。

第一组150例PMO患者DNA的rs532223位点的基因型频率的分布与T-score均值见表4。结果显示：150例PMO患者中，rs532223位点基因型为AA的个体为106例，基因型频率为70.7％，rs532223位点基因型为AA的个体的T-score均值为-4.11；rs532223位点基因型为GA的个体为39例，基因型频率为26％，rs532223位点基因型为GA的个体的T-score均值为-3.38；rs532223位点基因型为GG的个体为5例，基因型频率为3.3％，rs532223位点基因型为GG的个体的T-score均值为-3.01。以上结果说明rs532223位点是与PMO严重程度相关的单核苷酸多态性位点，rs532223位点为AA基因型的PMO患者的骨流失程度比rs532223位点为GA基因型的PMO患者严重，rs532223位点为GA基因型的PMO患者的骨流失程度比rs532223位点为GG基因型的PMO患者严重。

表4、骨质疏松患者rs532223多态性位点的基因型频率及严重程度评分

	PMO患者(n＝150)	T-score均值
			AA	106(70.7％)	-4.11
GA	39(26％)	-3.38
			GG	5(3.3％)	-3.01

注：T-score均值表示该组所有患者的T-score平均值，其中T-score为qCT测量的q值。

2、基于第二组PMO患者进行rs532223位点基因型与PMO患病风险及严重程度的相关性分析

为了验证rs532223位点基因型与PMO患病风险及PMO严重程度的相关性，按照同样的原理和方法，以第二组191例PMO患者为样本再次进行rs532223位点基因型与PMO患病风险及PMO严重程度的相关性分析。数据采用R 4.0.1统计软件进行处理统计。rs532223位点基因型与PMO患病风险的相关性分析中以正常人群的骨密度参考数据库(“正常人群的骨密度参考数据库”记载于文献“中国人群定量CT椎体骨密度正常参考数据库及BMI、年龄的相关性:基于中国健康定量CT大数据队列研究”中)作为基准。

在第二组191例PMO患者中，rs532223位点基因型为AA的个体为141例，rs532223位点基因型为GA的个体为47例，rs532223位点基因型为GG的个体为3例。通过Logistic回归分析校正后，得到rs532223位点变异与人群的显著性p值为0.033，Beta(突变表型贡献度)为0.32，95％置信区间为0.028-0.613。以上结果说明rs532223位点是与PMO患病风险相关的单核苷酸多态性位点，与步骤1中得出的结果一致。

第二组191例PMO患者DNA的rs532223位点的基因型频率的分布与T-score均值见表5。结果显示：191例PMO患者中，rs532223位点基因型为AA的个体为141例，基因型频率为73.83％，rs532223位点基因型为AA的个体的T-score均值为-3.68；rs532223位点基因型为GA的个体为47例，基因型频率为24.6％，rs532223位点基因型为GA的个体的T-score均值为-3.39；rs532223位点基因型为GG的个体为3例，基因型频率为1.57％，rs532223位点基因型为GG的个体的T-score均值为-2.96。以上结果说明rs532223位点基因型与该群体骨流失程度也显著相关，与步骤1中得出的结果一致。

表5、骨质疏松患者rs532223多态性位点的基因型频率及严重程度评分

注：T-score均值表示该组所有患者的T-score平均值，其中T-score为qCT测量的q值。

综上所述，rs532223位点是与PMO患病风险及严重程度相关的风险位点，可用于筛查PMO重症个体、预测PMO患者的骨流失程度、筛查携带PMO易感基因型的个体和评价PMO患病风险。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备预测或辅助预测PMO患者骨流失程度或PMO严重程度的产品中的应用；

或，检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在预测或辅助预测PMO患者骨流失程度或PMO严重程度中的应用。

2.检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查PMO重症患者或携带PMO重症基因型的个体的产品中的应用；

或，检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在筛查或辅助筛查PMO重症患者或携带PMO重症基因型的个体中的应用。

3.检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查PMO轻症患者或携带PMO轻症基因型的个体的产品中的应用；

或，检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在筛查或辅助筛查PMO轻症患者或携带PMO轻症基因型的个体中的应用。

4.检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备评价或辅助评价待测者PMO患病风险的产品中的应用；

或，检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在评价或辅助评价待测者PMO患病风险中的应用。

5.检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在制备筛查或辅助筛查PMO易感个体或携带PMO易感基因型的个体的产品中的应用；

或，检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质在筛查或辅助筛查PMO易感个体或携带PMO易感基因型的个体中的应用。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质为检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的试剂和/或仪器。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的试剂包括扩增rs532223位点的特异性引物对和/或单碱基延伸引物。

8.一种产品，其含有检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质；

所述产品的功能为如下1)-5)任一种：

1)预测或辅助预测PMO患者骨流失程度或PMO严重程度；

2)筛查或辅助筛查PMO重症患者或携带PMO重症基因型的个体；

3)筛查或辅助筛查PMO轻症患者或携带PMO轻症基因型的个体；

4)评价或辅助评价待测者PMO患病风险；

5)筛查或辅助筛查PMO易感个体或携带PMO易感基因型的个体。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的物质为检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的试剂和/或仪器。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述检测人基因组中rs532223位点多态性或基因型的试剂包括扩增rs532223位点的特异性引物对和/或单碱基延伸引物。