CN102757954B

CN102757954B - 与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点组合及其应用

Info

Publication number: CN102757954B
Application number: CN201210185221.1A
Authority: CN
Inventors: 顾东风; 鲁向锋; 黄建凤; 曹杰; 王来元; 李宏帆
Original assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: CN102757954A

Abstract

本发明涉及与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点组合及其应用，具体涉及包括rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的单核苷酸多态性位点组合，其中，所述rs2123536携带T等位基因、rs1842896携带T等位基因、rs9349379携带G等位基因、rs9268402携带G等位基因、rs12524865携带C等位基因、rs10757274携带G等位基因、rs1333042携带G等位基因、rs7136259携带T等位基因和rs11066280携带A等位基因的个体患冠心病的风险升高1.13到1.36倍，本发明还涉及针对所述单核苷酸多态性位点及其组合的检测方法以及用于评估人群冠心病患病风险中的应用。

Description

与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点组合及其应用

技术领域

本发明涉及与冠心病相关的多个基因单核苷酸多态性位点组合及其应用，具体涉及包括rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的单核苷酸多态性位点组合、针对所述单核苷酸多态性位点及其组合的检测方法以及用于评估人群冠心病患病风险中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化性心脑血管病已成为世界范围关注的主要健康问题。2004年的世界卫生组织(WHO)报告显示，全世界每年心血管疾病以冠心病和脑卒中为主导致的死亡人数达高达1720万，占所有死亡人数的三分之一。预计2020年这一数字将进一步增加50％，高达2500万，心血管疾病是全球人类的“头号杀手”。在中国进行的一项大规模前瞻性研究也显示，心脏疾病已经成为中国人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第1位。我国每年新发心肌梗死50万人，随着生活方式的改变以及动脉粥样硬化相关的危险因素持续增加，冠心病与心肌梗死发病也还将呈持续上升趋势。

大量的研究资料表明，冠心病是一种复杂疾病，是由多个微效基因与环境因素长期相互作用所致。因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因，在人群中进一步筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于冠心病的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。从基础到临床，人们对此进行了大量的研究，并在冠心病的危险因素和冠心病发生的病理生理学方面积累了大量的知识，但是关于冠心病与心肌梗死发生的确切遗传分子机制却知之甚少，对于怎样鉴定遗传易感基因以及鉴定受试者的冠心病遗传易感性，一直缺乏全面系统有效的识别方法。

早期识别冠心病高危人群，采取针对性的生活方式干预，是减少冠心病发生，从而遏制医疗费用增长、延长期望寿命的关键。目前，大家普遍认为在个体水平采用模型方法利用个体传统危险因素水平是识别冠心病高危人群的有效方法。危险预测已为疾病预防、政府决策和卫生干预方案效果评价，同时也可以为临床治疗提供可参考的信息。全基因组学技术与流行病学方法的整合为人类复杂疾病或性状的生物学研究带来了全新的视角。个体风险评估是其临床决策的一个重要组成部分，若据此采取更早或更强的干预措施，患者有可能从中受益。目前已发现，冠心病相关的遗传易感性基因座可对冠心病发病风险发挥独立影响，因此应重新评估这些遗传变异在疾病风险预测中的作用。以有效提高疾病风险预测的能力，从而在传统危险因素的基础上进一步加强对疾病风险的认识。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种多个基因单核苷酸多态性位点组合；本发明的另一个目的是提供所述的多个基因单核苷酸多态性位点组合的应用，具体是其在制备用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置或模型中的应用；本发明的另一个目的是提供一种检测本发明的多个基因单核苷酸多态性位点的方法；本发明的另一目的是提供一种体外检测冠心病相关基因的方法；本发明的另一目的是提供一种检测本发明的多个基因单核苷酸多态性位点的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂、试剂盒或检测装置或模型中的应用；本发明的另一目的是提供一种体外检测来自待测个体的样品中多个基因单核苷酸多态性位点的试剂在制备预测待测个体患冠心病的危险性的制剂、试剂盒或检测装置或模型中的应用；本发明的另一目的是提供一种体外预测待测个体患冠心病的危险性的方法。

本发明的另一目的是提供一种用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置，根据基因多态性预测个体冠心病发病风险，能够很好的识别冠心病的高危人群，从而针对性的进行干预，达到延缓和预防冠心病发生的目的。

首先，本发明提供了一种多个基因单核苷酸多态性位点组合，所述的多个基因单核苷酸多态性位点包括以下位点：rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280。上述多态性位点是在大量实验的基础上得出的。在本发明的具体实施方式中，利用FludigmEP1 ^TMGENETIC ANALYSISsystem，Taqman MGB探针法对7012例冠心病患者和8579例对照样本进行基因分型实验，对数据进行大量实验研究分析，首次得出上述9个SNP位点(rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280)与冠心病易感性显著相关。

在本发明的大量实验结果基础上，本发明的进一步研究发现，这些SNPs的危险等位基因分别是：rs2123536多态性位点为T、rs1842896多态性位点为T、rs9349379多态性位点为G、rs9268402多态性位点为G、rs12524865多态性位点为C、rs10757274多态性位点为G、rs1333042多态性位点为G、rs7136259多态性位点为T、rs11066280多态性位点为A。携带这些危险等位基因的个体发生冠心病的相对风险是没有携带者的1.13到1.36倍。

从而，一方面，本发明提供一种检测本发明的多个单核苷酸多态性位点的方法。可用本领域已知的多种技术在DNA水平、RNA水平检测本发明所述的多个单核苷酸多态性位点。例如：

可以采用直接测序的方法，通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异，具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对DNA直接进行测序，或是近年来发展的焦磷酸测序(Pyrosequencing)、微测序(SNaPshot)等。焦磷酸测序技术适于对已知的短序列的测序分析，其原理是引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。SnaPshot技术平台是AppliedBiosystems，ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒，可对多个SNP位点同时进行基因分型，也被称为minisequencing，该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。

也可以采用基于杂交的方法，具体包括Taqman探针法，DNA芯片法等。TaqMan SNP基因分型原理：利用核酸外切酶对5’特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号，反应体系包括：以基因组DNA或PCR产物为模板；一对PCR引物，以及分别用FAM和VIC标记的2条MGB探针检测SNP的两种类型；在PCR反应终点读取分型数据。DNA芯片技术：待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上，由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。

还可以采用基于引物延伸的方法，如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(MALDI-Tof-MS)。基质辅助激光解析离子飞行时间质谱检测原理：紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止，根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。

还可以采用基于构象的方法，具体例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳(denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)分析、变性高效液相色谱技术(denaturing high performanceliquid chromatography，dHPLC)等分析技术。其中，RFLP的原理：有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型；如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析来实现。SSCP：在非变性的条件下，单链DNA具有一定的折叠结构，这种折叠结构是由它的核苷酸序列决定的，SSCP的灵敏性依赖于SNP对折叠的影响和折叠如何影响目的序列的电泳迁移率，其策略是，将PCR扩增的待测片段与去离子甲酰胺混合，接着95℃变性解链，再骤冷到冰中，然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；稳定的理想条件下，凝胶电泳分离的结果是在某一位置范围内杂合子包含分隔很近的两条带，正常的DNA片段居于其中一条带，纯合突变SNP的DNA片段居于另一条带。DGGE：利用双链DNA分子在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时，会在一定变性剂浓度下发生部分解链，导致电泳迁移率下降；分别具有一种SNP等位基因型的两种DNA分子间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同时间发生部分解链，从而被分离成两条带。DHPLC：该技术是一项在SSCP和DGGE基础上发展起来的检测SNP的突变技术，此技术将未知的DNA片段与野生型DNA混和，经加热变性后再使其降温重退火，若为有突变的DNA，此时所形成的双螺旋有两种，即为同源双螺旋和异源双螺旋，基于同源双螺旋和异源双螺旋解链温度的不同，通过控制DHPLC的温度，使其维持在接近DNA分子Tm值下运行，然后进行洗脱，越小的DNA分子与柱的亲和力越小，就越容易洗脱下来；DNA经过PCR扩后，由于错配碱基的存在而形成异源双链，因为单链DNA所带的电荷比双链少，先被洗脱下来，而与正常的配对双链分开，最后根据色谱峰的峰型或数目来确定SNP的有或无。

还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)。该分析技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。

在具体实施时，本领域的技术人员可以根据实际情况选择上述的任一种技术体外检测本发明所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。也可以采用多种技术的组合来体外检测所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。例如，当限制性片断长度多态性分析方法与PCR结合后，检测灵敏性和特异性更高。当直接测序法与PCR结合使用时，检测灵敏性大大提高。在本发明的一个具体实施方式中，应用的是Taqman MGB方法，使用的是FludigmEP1 ^TMGENETIC ANALYSIS system平台，由于该平台是属于较高通量的基因分型平台，在样本数为96个样本检测96个位点(使用96.96动态芯片)或48个样本检测48个位点(使用48.48动态芯片)时，具有经济高效的优点。而在具体到本发明的方案应用于少量待测样品的分析检测时，采用FludigmEP1 ^TMGENETIC ANALYSIS system平台就不具备经济性和效率上的优势，此时可采用实时荧光定量PCR系统，如Applied Biosystems的7900HT(Fast)real time PCR系统、7500real time PCR系统等，应用Taqman-MGB探针法对单个位点进行基因分型；也可以应用PCR-RFLP、HRM等其他基因分型方法。

此外，本发明还可进一步包括对所述多个单核苷酸多态性位点的检测结果进行统计分析。例如，在本发明的一个实施方式中，校正年龄、BMI、收缩压、舒张压、血糖、TC、TG、HDLC、LDLC、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒等信息后，对由本发明的标签单核苷酸多态性位点的结果进行统计分析，并建立了用于评估待测个体患冠心病风险的模型，进而提供了一种用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置。

根据本发明所提供的用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置主要包括检测单元以及数据分析单元，其中：

所述检测单元是用于检测待测个体携带单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的危险等位基因情况，获得检测结果；其中所述各单核苷酸多态性位点的危险等位基因分别是：rs2123536多态性位点为T、rs1842896多态性位点为T、rs9349379多态性位点为G、rs9268402多态性位点为G、rs12524865多态性位点为C、rs10757274多态性位点为G、rs1333042多态性位点为G、rs7136259多态性位点为T、rs11066280多态性位点为A；

所述数据分析单元是用于对检测单元的检测结果进行分析处理，其中包括按照以下公式计算待测个体冠心病遗传危险因素评分：

遗传危险因素评分＝∑log(OR_i)×N_i，其中OR_i指第i个单核苷酸多态性位点的相对危险度，N_i指研究对象所携带第i个单核苷酸多态性位点的危险等位基因数目。

本发明所述的用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置，可以是虚拟装置，只要能实现所述检测单元以及数据分析单元的功能即可。所述的检测单元可以是包括各种检测试剂、试剂盒或检测仪器；所述的数据分析单元可以是任何可以实现对检测单元的检测结果进行分析处理而得出待测个体冠心病遗传危险因素评分的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先按照上述遗传危险因素评分公式而制定的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出遗传危险因素评分数值。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述遗传危险因素评分的高低与待测个体患冠心病危险性的高低成线性正相关。

在本发明的具体实施方式中，为了实际应用中方便评估待测个体患冠心病风险，检测了8579个健康人和7012个冠心病患者携带所述9个SNP基因单核苷酸多态性位点的危险等位基因情况，按照以下公式计算每个研究对象进行冠心病遗传危险因素评分：遗传危险因素评分＝∑log(OR_i)×N_i，其中OR_i指第i个SNP的相对危险度，N_i指研究对象(待测个体)所携带第i个SNP的危险等位基因数目；并根据所有研究对象冠心病遗传危险因素评分将研究对象等分为5组，建立了冠心病患病风险对照模型。在本发明的具体实时方式中，所述的5组分别为第1组0.115～1.200、第2组1.201～1.473、第3组1.474～1.737、第4组1.738～2.021和第5组2.022～2.972；冠心病遗传危险因素评分最低组到最高组，冠心病患病风险逐渐升高。在实际应用检测评估待测个体患冠心病风险时，可将该待测冠心病遗传危险因素评分与遗传危险因素评分最低的第1组相比，评估其患冠心病患病风险的高低。

根据本发明的具体实施方案，本发明的用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置还可进一步包括评估单元，该评估单元是用于将所得到的待测个体冠心病遗传危险因素评分与上述冠心病患病风险对照模型的5组数据进行比较，从而评估待测个体患冠心病患病风险的高低(理论上评分的高低与发病风险是线性关系，同一组内评分的高低也实际上反映危险性的高低)。

所述的评估单元可以是任何可以实现将数据分析单元所得到的待测个体冠心病遗传危险因素评分与上述冠心病患病风险对照模型的5组数据进行比较的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将冠心病患病风险对照模型的5组数据制定数据图表的形式作为冠心病患病风险速查表，将数据分析单元所得到的待测个体冠心病遗传危险因素评分对照该冠心病患病风险速查表，确定相应的分组，评估待测个体患冠心病患病风险的高低。

本发明中，所述多个基因单核苷酸多态性位点组合状态能提供待测个体患冠心病风险率信息，所述rs2123536携带T等位基因、rs1842896携带T等位基因、rs9349379携带G等位基因、rs9268402携带G等位基因、rs12524865携带C等位基因、rs10757274携带G等位基因、rs1333042携带G等位基因、rs7136259携带T等位基因和rs11066280携带A等位基因的个体患冠心病的风险升高1.13到1.36倍

从而，另一方面，本发明还提供了所述的多个基因单核苷酸多态性位点组合在制备用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置和模型中的应用。

另一方面，本发明还提供了检测单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂、试剂盒或用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置或模型中的应用。其中所述检测单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的试剂可以前述方法中用到的试剂，例如为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。

另一方面，本发明还提供了体外检测来自待测个体的样品中单核苷酸多态性位点：rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的试剂在制备预测待测个体患冠心病的危险性的制剂、试剂盒或检测装置中的应用，其中，所述rs2123536携带T等位基因、rs1842896携带T等位基因、rs9349379携带G等位基因、rs9268402携带G等位基因、rs12524865携带C等位基因、rs10757274携带G等位基因、rs1333042携带G等位基因、rs7136259携带T等位基因和rs11066280携带A等位基因的个体患冠心病的危险性显著升高。

含有本发明的基因的待测样品可以从受试者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发或活组织检查。优选来自血液。可以先从受试者的细胞获得含有本发明的基因的待测样品，然后按照常规方法提取基因的DNA。所述待测个体优选为中国汉族人。

在本发明大样本的统计分析的基础上，可以单独使用本发明的方法，体外检测来自待测个体的样品中单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的携带等位基因情况，以体外预测待测个体患冠心病的危险性，也可以同时考虑其他环境危险因素，例如是否吸烟、是否高血压、是否糖尿病、是否血脂紊乱和是否有心梗家族史等，以达到体外预测待测个体患冠心病危险性的目的。

综上所述，本发明发现了与冠心病相关的9个重要变异位点：rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280，这几个位点的特定组合，大大增加了个体罹患冠心病的风险。这一发现在临床上具有潜在的应用价值：对这9个位点进行基因型鉴定，若是发现某个体rs2123536携带T等位基因、rs1842896携带T等位基因、rs9349379携带G等位基因、rs9268402携带G等位基因、rs12524865携带C等位基因、rs10757274携带G等位基因、rs1333042携带G等位基因、rs7136259携带T等位基因和rs11066280携带A等位基因，其患冠心病的风险显著升高。本发明的用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置，能够很好的识别冠心病的高危人群。据此，医生可以利用研究对象基因型结果计算冠心病危险评分，完成研究对象基因型检测报告和个体化健康指导报告，并报告研究对象患冠心病风险的高低。个体化健康指导报告是在基因型结果的基础上，结合冠心病生活方式危险因素评估研究对象患冠心病的风险，并制定出针对研究对象的个体化健康行动方案。进一步可有针对性的进行干预，指导该个体改变不良生活习惯，降低环境因素对疾病的诱发，从而达到延缓和预防冠心病发生的目的。可见，本发明的技术在冠心病的预测和预防中有重要的应用前景。

附图说明

图1A-1显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)中，rs9349379位点基因分型结果(聚类图)，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为A/A纯合子，2、绿色为G/G纯合子，3、蓝色为A/G杂合子，4黑色为阴性对照NTC。图1A-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs9349379位点的截屏图。图1A-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs9349379基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1B-1显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)中，rs7136259位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为C/C纯合子，2、绿色为T/T纯合子，3、蓝色为C/T杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1B-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时认rs7136259位点的截屏图。图1B-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs7136259基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1C-1显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)中，rs2123536位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为C/C纯合子，2、绿色为T/T纯合子，3、蓝色为C/T杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1C-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs2123536位点的截屏图。图1C-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs2123536基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1D-1显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)中，rs1842896位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为G/G纯合子，2、绿色为T/T纯合子，3、蓝色为G/T杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1D-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs1842896位点的截屏图。图1D-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs1842896基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1E-1显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)中，rs11066280位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为A/A纯合子，2、绿色为T/T纯合子，3、蓝色为A/T杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1E-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs11066280位点的截屏图。图1E-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs11066280基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1F-1显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)中，rs9268402位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为A/A纯合子，2、绿色为G/G纯合子，3、蓝色为A/G杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1F-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs9268402位点的截屏图。图1F-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs9268402基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1G-1显示96个样本中(94个待测样本及2个阴性对照)，rs12524865位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、经色为A/A纯合子，2、绿色为从C/C纯合子，3、蓝色为A/C杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1G-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs12524865位点的截屏图。图1G-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs12524865基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1H-1显示96个样本中(94个待测样本及2个阴性对照)，rs10757274位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为G/G纯合子，2、绿色为A/A纯合子，3、蓝色为A/G杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1H-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs10757274位点的截屏图。图1H-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs10757274基因分型数据导出结果(部分)截图。

图1I-1显示96个样本(94个待测样本及2个阴性对照)中，rs1333042位点基因分型聚类图，X轴代表VIC荧光强度，Y轴代表FAM荧光；基因型结果：1、红色为A/A纯合子，2、绿色为G/G纯合子，3、蓝色为A/G杂合子，4、黑色为阴性对照NTC。图1I-2显示应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析时rs1333042位点的截屏图。图1I-3显示96个样本(其中包含两个阴性对照NTC)rs1333042基因分型数据导出结果(部分)截图。

图2为冠心病危险等位基因遗传贡献速查图表。

图3为冠心病患病风险速查图表。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例一多个SNPs的选择和检测

一、病例对照样本入选标准

冠心病病例包括心肌梗死患者和心绞痛患者。心肌梗死病例的入选诊断标准为急性心肌梗死诊断标准(根据WHO 1979年的诊断标准)：即典型胸痛症状持续30分钟以上；心电图连续2个导联ST段抬高(肢体导联0.1mv，胸导联0.2mv)并有系列动态变化；心肌坏死的血清标记物浓度升高，如肌钙蛋白(TNT/TNI)升高，心肌同工酶(CK-MB)升高大于正常值高限的2倍。心绞痛病例的入选诊断标准为经冠脉造影发现冠状动脉至少一个主要分支狭窄超过70％。经各项检查除外心脏瓣膜疾病、先天性心脏病、心力衰竭、严重的肾脏及肝脏疾病、继发性高血压、心肌病、家族性高胆固醇血症及可疑冠心病患者。符合上述诊断的病例可以入选本研究。对照组入选标准：既往无冠心病或其他动脉粥样硬化病史，无胸痛、胸闷等心脏病症状，心电图无明显缺血性改变。病例组和对照组均为中国汉族人，且无血缘关系。

研究人群包括7012例冠心病患者和8579例正常人，其基本特征如下表：

表1 病例组和对照组基本特征

	病例	对照
			样本量	7012	8579
男性/女性	5887/1125	5865/2714
			年龄	51.65±8.03	55.31±8.80
BMI(kg/m²)	26.27±3.64	24.65±3.64
			收缩压(mmHg)	124.09±17.80	140.23±22.86
舒张压(mmHg)	77.33±11.42	86.23±12.89
			血糖(mg/dL)	107.02±33.73	94.56±30.07
TC(mg/dL)	173.35±41.65	182.53±34.58
			TG(mg/dL)	161.13±101.04	145.99±106.07

HDLC(mg/dL)	39.48±10.05	50.74±12.43
			LDLC(mg/dL)	95.10±32.62	103.68±29.21
高血压(％)	57.06	56.52
			糖尿病(％)	24.57	3.76
吸烟(％)	67.61	37.87
			饮酒(％)	44.41	32.51

二、研究实验方案

首先在中国汉族人群中选取7012例冠心病患者和8579例正常人为研究对象，采集空腹血并收集年龄、性别、血压水平、血脂水平、身高、体重、吸烟、饮酒和疾病史等相关信息。应用FludigmEP1 TMGENETIC ANALYSIS system基因分型系统，Taqman MGB探针法对96个单核苷酸多态性(SNP)位点进行基因分型实验，进一步进行重复验证，从中筛选出9个冠心病患病风险的多态性位点(SNP)(2p24.1区域rs2123536、4q32.1区域rs1842896、6p24.1区域rs9349379、6p21.32区域rs9268402、6q23.2区域rs12524865、9p21.3区域rs10757274、9p21.3区域rs1333042、12q21.33区域rs7136259和12q24.13区域rs11066280。这9个独立的位点达到全基因组水平的显著性(P值＜5.0×10^-8)。使用logistic同归分析评估每个SNP位点与冠心病的关系，计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio，OR)和95％的可信区间。综合每个个体携带9个SNP位点的危险等位基因情况，对每个研究对象进行冠心病遗传危险因素评分，评分方法是研究对象携带风险等位基因的数目与风险等位基因效应值(log(OR))相乘获得每个SNP位点遗传效应，然后对9个SNP的遗传效应求和得到该研究对象的冠心病遗传危险因素评分，计算公式：遗传危险因素评分＝∑log(OR_i)×N_i，其中OR_i指第i个SNP的相对危险度，N_i指研究对象所携带第i个SNP的危险等位基因数目。根据所有研究对象冠心病遗传危险因素评分将研究对象等分为5组，与遗传危险因素评分最低的1组相比，计算其他各组患冠心病患病风险的高低。

其中，使用EP1基因分析系统(FludigmEP1 ^TMGENETIC ANALYSIS system：该系统为美国芯片Fludigm公司开发的高通量基因分型系统，由集成流体管道(IFC)芯片、集成流体管道控制器(IFC controller)、热循环系统和荧光信号采集系统(EP 1reader)构成；采用Taqman基因分型常规试剂，可同时对96个样本96个SNP位点进行基因分型；是一种高通量的开放式基因分析平台(Wang，J.，Lin，M.，Crenshaw，A.，Hutchinson，A.，Hicks，B.，Yeager，M.，Berndt，S.，Huang，W.，Hayes，R.B.，Chanock，S.J.，Jones，R.C.，andRamakrishnan，R.2009 Nov 28.High-throughput single nucleotide polymorphism genotypingusing nanofluidic Dynamic Arrays.BMC Genomics)。

Taqman MGB探针法进行基因分型实验的具体操作如下：

仪器、材料

仪器：EP1基因分析系统(FludigmEP1 ^TMGENETIC ANALYSIS system)

试剂、样本：

耗材：

96.96动态芯片	96.96 Dynamic Array(138X)
		96孔PCR板和一次性封板膜	96 well plates and seal(one-off)

实验方法

(一)操作步骤：

1.Assay制备：在96孔PCR板上，参照下表制备Assay mix

Component	每个加样孔体积(μl)
		40×Taqman Genotyping Probe	1.25
2×Assay Loading Reagent	2.5
		ROX(50×)	0.25
DNase/RNase-free water	1.0
		总体积	5.0

加完后，盖上一次性封板膜，微孔板振荡器上充分混匀，微孔板离心机上2500～3000rpm(500g离心力左右)离心30秒，放置冰上备用。

2.sample制备：

在96孔板中参照下面表格制备Sample mix：

Component	每个加样孔体积(μl)
		Master Mix(2×)	3
20×GT Sample Loading Reagent	0.3
		AmpliTaq Gold DNA聚合酶	0.06
Genomic DNA	2.52
		DNase/RNase-free water	0.12
总体积	6.0

加完后，盖上一次性封板膜，微孔板振荡器上充分混匀，微孔板离心机上2500～3000rpm(500g离心力左右)离心30秒左右，放置冰上备用。

3.加样及扩增

芯片于集成流体管道控制器HX中初始化后，加样。(Assay的加样量为4.2μl/孔，Sample的加样量为5.2μl/孔)。将加好样的芯片重新放置于集成流体管道控制器HX中，启动“Load Mix(138X)”程序，进行分液和混合。

上述过程完成后，马上(一小时内)将芯片从集成流体管道控制器HX中取出，去掉芯片后面蓝色的贴膜，将芯片置于热循环系统(Stand alone Thermo Cycler)中，启动Thermo Cycler PCR仪，PROGTM96程序，进行PCR过程。PCR结束后，关掉PCR仪下方真空泵(Vacuum Pump)，打开PCR仪上面盖子，取下芯片。

(二)数据采集：在PCR结束前20分钟，启动荧光信号采集系统(EP1 reader)，Fluidigm Data Collection Software version 3采集数据。

(三)数据分析：将采集到的数据应用SNP Genotyping Analysis software version 3.0软件进行数据分析。以X轴代表VIC荧光信号强度，Y轴代表FAM荧光信号强度，根据两种荧光信号的相对高度进行聚类，以红色和绿色分别代表XX、YY纯合子，蓝色代表杂合子，黑色代表阴性对照(NTC)。基因分型结果以excel表格输出。

三、实验结果

本发明所筛选出的9个单核苷酸多态位点及其两翼序列：

rs2123536 AAAGAGGGACGGGGAATCAGAAAGTG[T/C]GCGTCGTATTTCAGACATCAAACGT(SEQ ID No.1)

rs1842896 AGTATTATTTAAAATAGCACCAAAAT[G/T]CATTCCCTTAAAAGCACTAGTTATC(SEQ ID No.2)

rs9349379 GTCTATGCCCTTGAGATCATATAAAA[G/A]TAGCTTAAAATCATTGGCCATAGTT(SEQ ID No.3)

rs9268402 aaatcttgagagggatatgaacatcc[A/G]gattgaagacgatcaaagcatccca(SEQ ID No.4)

rs12524865 GAAGGTGAATGGGAAAAATAACTTAA[A/C]GTCAGTCCCAAAGGCTAAAGTGGTA(SEQ ID No.5)

rs10757274 GTGGGTCAAATCTAAGCTGAGTGTTG[A/G]GACATAATTGAAATTCACTAGATAG(SEQ ID No.6)

rs1333042 GGCAAGGGGACATACCAAACACTAAC[A/G]GGCACATTGGGGTTTTCTGGCTATT(SEQ ID No.7)

rs7136259 aggtttgtgtagtacactgtgtgaat[C/T]tgcacaataacgaaattgcaacgca(SEQ ID No.8)

rs11066280 GAGAGGTTCTTTCCTTTGAAAACCAT[A/T]CTTCTGTGGAAATAGCTGACAAATT(SEQ ID No.9)

图1A-1～图1A-3至图1I-1～图1I-3分别显示了关于上述9个基因型多态性位点的基因分型聚类图以及数据分析时的部分截图。

分析结果显示，上述9个基因型多态性位点(rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280)与冠心病患病风险显著关联。其中，rs2123536携带T等位基因、rs1842896携带T等位基因、rs9349379携带G等位基因、rs9268402携带G等位基因、rs12524865携带C等位基因、rs10757274携带G等位基因、rs1333042携带G等位基因、rs7136259携带T等位基因和rs11066280携带A等位基因的个体患冠心病的风险明显升高，冠心病患病风险升高1.13到1.36倍(见表2)。

根据8579个健康人和7012个冠心病患者9个多态性位点(rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280)进行冠心病遗传危险因素评分，将人群等分为5组，分别为第1组0.115～1.200、第2组1.201～1.473、第3组1.474～1.737、第4组1.738～2.021和第5组2.022～2.972。冠心病遗传危险因素评分最低组到最高组，冠心病患病风险逐渐升高，存在明显的剂量效应关系(见表3)，与评分最低组相比，最高组患冠心病的风险升高2.34倍(95％置信区间2.11-2.59)。这表明利用这9个基因型可以很好的预测冠心病患病风险的高低。

表2 9个单核苷酸多态位点与冠心病患病之间的关联关系

OR(95％CI)表示与携带参照等位基因的个体相比，携带风险等位基因的个体发生冠心病的相对风险。

表3 冠心病遗传危险评分分组和冠心病风险之间的关系

实施例二待测个体冠心病患病风险评估实例

根据实施例一所检测的8579个健康人和7012个冠心病患者9个多态性位点(rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280)情况，制定冠心病危险等位基因遗传贡献速查图表(图2)以及冠心病患病风险速查图表(图3)。冠心病遗传危险因素评分最低组到最高组，冠心病患病风险逐渐升高，存在明显的剂量效应关系。

待测个体李四，中国汉族人，男性，55岁。利用本发明的用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置评估其患冠心病风险高低，所述的用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置包括检测单元、数据分析单元、评估单元，主要按照如下步骤进行：

(1)分离待测个体抗凝血中DNA，利用检测单元检测9个位点的基因型，该实施例中，检测单元主要包括Applied Biosystems的7900HT Fast real time PCR系统，具体操作参照说明书的记载进行：

主要试剂耗材：20×，40×，或80×SNP Genotyping Assay(本领域的技术人员也可以根据其所掌握的现有技术知识自行设计合成的引物、探针各一对)；TaqMan Genotyping Master Mix(2×)，Applied Biosystems PN4371357；384孔光学PCR板(MicroAmp^TMOptical 384-WellReaction Plate with Barcode)，Applied Biosystems PN4309849；光学膜(MicroAmp^TMOpticalAdhesive Film)，Applied Biosystems PN4311971；DNase-free，RNase-free sterile-filtered water；Genomic DNA(10～50ng/μl)。

反应体系示例：使用Applied Biosystems SNP基因分型试剂(Genotyping Assay)时，以384孔PCR板为例：TaqMan Genotyping Master Mix(2×)2.50μl；TaqMan genotyping assay mix(20×)0.25μl；Genomic DNA(10～50ng/μl)1.0μl；DNase-free，RNasefree water 1.25μl；Tatal5.0μl。

反应条件：

经检测，李四9个位点的基因型分别为：rs2123536为CT，rs1842896为GG，rs9349379为AA，rs9268402为AG，rs12524865为AA，rs10757274为AA，rs1333042为AG，rs7136259为CC，rs11066280为AT，其风险等位基因的数目分别为：1、0、0、1、0、0、1、0和1。

(2)对检测结果进行分析处理：

利用数据分析单元对检测结果进行分析处理，其包括图2所示的冠心病危险等位基因遗传贡献速查图表，将所述9个单核苷酸多态性位点的检测结果对照该图表，查找出各位点相应的危险等位基因遗传贡献，相加，得到遗传危险因素评分，具体如下：

遗传危险因素评分＝∑log(OR_i)×N_i，其中OR_i指第i个单核苷酸多态性位点的相对危险度，N_i指研究对象所携带第i个单核苷酸多态性位点的危险等位基因数目遗传危险因素评分：

遗传危险因素评分＝1×0.122+0×0.140+0×0.174+1×0.148+0×0.122+0×0.307+1×0.293+0×0.131+1×0.231＝0.794。

(3)冠心病患病风险评估：

对照评估单元的冠心病患病风险速查表(图3)，确定李四的遗传危险因素评分数值在第一组，说明李四由于遗传原因发生冠心病的风险较低。本发明提供了一种根据基因多态性预测结合个体水平冠心病发病风险的模型，能够很好的识别冠心病的高危人群，从而针对性的进行干预，达到延缓和预防冠心病发生的目的。利用研究对象基因型结果计算冠心病危险评分，完成研究对象基因型检测报告和个体化健康指导报告，并报告研究对象患冠心病风险的高低。

Claims

1.检测单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的试剂在制备用于评估中国汉族人待测个体患冠心病风险的检测装置中的应用；

其中，所述用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置包括检测单元以及数据分析单元；

所述检测单元是用于检测待测个体携带所述9个单核苷酸多态性位点的危险等位基因情况，获得检测结果；所述9个单核苷酸多态性位点的危险等位基因分别是：rs2123536多态性位点为T、rs1842896多态性位点为T、rs9349379多态性位点为G、rs9268402多态性位点为G、rs12524865多态性位点为C、rs10757274多态性位点为G、rs1333042多态性位点为G、rs7136259多态性位点为T、rs11066280多态性位点为A；

所述数据分析单元是用于对检测单元检测待测个体携带所述9个单核苷酸多态性位点的危险等位基因情况的检测结果进行分析处理，其中包括按照以下公式计算待测个体冠心病遗传危险因素评分，其中是待测个体携带风险等位基因的数目与风险等位基因效应值log(OR)相乘获得每个单核苷酸多态性位点遗传效应，然后对9个单核苷酸多态性位点遗传效应求和得到个体的冠心病遗传危险因素评分：

遗传危险因素评分=∑log（OR_i）×N_i，其中OR_i指第i个单核苷酸多态性位点的相对危险度，N_i指待测个体所携带第i个单核苷酸多态性位点的危险等位基因数目；其中各单核苷酸多态性位点OR为：rs2123536：1.13；rs1842896：1.15；rs9349379：1.19；rs9268402：1.16；rs12524865：1.13；rs10757274：1.36；rs1333042：1.34；rs7136259：1.14；rs11066280：1.26；

其中，遗传危险因素评分的高低与待测个体患冠心病危险性的高低成线性正相关。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述多个基因单核苷酸多态性位点组合状态提供待测个体患冠心病风险率信息，所述rs2123536携带T等位基因、rs1842896携带T等位基因、rs9349379携带G等位基因、rs9268402携带G等位基因、rs12524865携带C等位基因、rs10757274携带G等位基因、rs1333042携带G等位基因、rs7136259携带T等位基因和rs11066280携带A等位基因的个体患冠心病的风险升高1.13到1.36倍。

3.体外检测来自待测个体的样品中单核苷酸多态性位点：rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的试剂在制备预测中国汉族人待测个体患冠心病的危险性的制剂、试剂盒或检测装置中的应用，其中，所述rs2123536携带T等位基因、rs1842896携带T等位基因、rs9349379携带G等位基因、rs9268402携带G等位基因、rs12524865携带C等位基因、rs10757274携带G等位基因、rs1333042携带G等位基因、rs7136259携带T等位基因和rs11066280携带A等位基因的个体患冠心病的危险性显著升高。

4.根据权利要求1或3所述的应用，其中，待测样品来自待测个体的血液、尿、唾液、胃液、头发或活组织检查。

5.根据权利要求1或3所述的应用，其中所述检测单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的试剂为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。

6.一种用于评估待测个体患冠心病风险的检测装置，该装置包括检测单元以及数据分析单元，其中：

所述检测单元是用于检测中国汉族人待测个体携带单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的危险等位基因情况，获得检测结果；其中所述各单核苷酸多态性位点的危险等位基因分别是：rs2123536多态性位点为T、rs1842896多态性位点为T、rs9349379多态性位点为G、rs9268402多态性位点为G、rs12524865多态性位点为C、rs10757274多态性位点为G、rs1333042多态性位点为G、rs7136259多态性位点为T、rs11066280多态性位点为A；所述检测单元包括检测单核苷酸多态性位点rs2123536、rs1842896、rs9349379、rs9268402、rs12524865、rs10757274、rs1333042、rs7136259和rs11066280的试剂；

所述数据分析单元是用于对检测单元检测中国汉族人待测个体携带所述9个单核苷酸多态性位点的危险等位基因情况的检测结果进行分析处理，其中包括按照以下公式计算待测个体冠心病遗传危险因素评分，其中是待测个体携带风险等位基因的数目与风险等位基因效应值log(OR)相乘获得每个单核苷酸多态性位点遗传效应，然后对9个单核苷酸多态性位点遗传效应求和得到该研究对象的冠心病遗传危险因素评分：

遗传危险因素评分=∑log（OR_i）×N_i，其中OR_i指第i个单核苷酸多态性位点的相对危险度，N_i指研究对象所携带第i个单核苷酸多态性位点的危险等位基因数目；其中各单核苷酸多态性位点OR为：rs2123536：1.13；rs1842896：1.15；rs9349379：1.19；rs9268402：1.16；rs12524865：1.13；rs10757274：1.36；rs1333042：1.34；rs7136259：1.14；rs11066280：1.26；