CN112342292A - 体外检测SelS基因启动子突变的试剂及其在制备冠心病筛查试剂盒的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及冠心病易感基因检测试剂或试剂盒技术领域，是一种体外检测SelS基因启动子突变的试剂及其在制备冠心病筛查试剂盒的应用，SelS基因启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，SelS基因启动子突变时，其核苷酸序列表中第84位至第89位缺失。本发明公开了一种新的与冠心病易感性密切相关的SelS基因启动子突变位点，并基于该启动子突变位点开发用于冠心病筛查或预测的试剂盒，该发明所述SelS基因启动子突变位点的应用，可以更加精准的在分子水平上实现对冠心病的早期筛查，针对性强，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及冠心病易感基因检测试剂或试剂盒技术领域，是一种体外检测SelS基因启动子突变的试剂及其在制备冠心病筛查试剂盒的应用。
背景技术
冠心病(Coronary Artery Disease，CAD)是指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变，引起血管腔狭窄、阻塞或冠状动脉血管功能性改变即冠状动脉痉挛，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，又称冠状动脉粥样硬化性心脏病。尽管医疗技术的飞速发展，使得CAD危险因素防控体系不断完善，但流行病学研究推测，CAD的发病率和死亡率仍将在未来20年内呈现递增趋势。CAD是一种复杂疾病，对CAD病因学、早期诊断、治疗及预防等方面的研究是目前的热点问题。研究显示，CAD具有重要的遗传基础，并被认为与环境因素等效，但从遗传学角度对其开展疾病早期筛查与诊断远不够理想。有鉴于此，目前亟需探寻和发掘特异、准确、敏感的CAD易感基因，以用于冠心病的防治与诊疗。
SelS基因多态性与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂水平、促炎和抗炎细胞因子、先兆子痫、类风湿性关节炎及癌症的发生、发展可能有关。尽管SelS是导致CAD风险的候选基因已经十分明确，但在不同人群中关于SelS基因多态性与CAD之间的关联目前尚未明了。Alanne等在芬兰的两项独立前瞻性研究中发现SelS基因多态性对冠心病发病风险的影响，提示SelS基因多态性与冠心病发病显著相关，尤其是在女性群体中。此外，他们还观察到，在欧美2型糖尿病患者中，SelS的基因多态性与亚临床冠心病的风险相关。Li等在中国汉族人群中发现SelS基因SNP rs4965814与缺血性脑卒中密切相关。课题组前期研究也发现在中国人群中，SelS与2型糖尿病及血浆甘油三酸酯水平升高相关。由此可见，SelS在炎症和糖脂代谢中发挥重要作用，可能与CAD的发生发展密切相关，但具体位点和片段仍未精确定位，致使后期开发以相关基因位点或片段为干预靶标的CAD防治药物存在一定困难。
启动子作为相关转录因子并结合RNA聚合酶的靶序列，可作为cis元件调控和调控转录起始点，对转录起始点的表达时间和程度具有重要的调控作用。基因启动子区域序列突变可影响RNA聚合酶和各种转录因子与顺式作用元件和反式作用元件的结合，从而最终影响基因转录水平的变化。
发明内容
本发明提供了一种体外检测SelS基因启动子突变的试剂及其在制备冠心病筛查试剂盒的应用，克服了上述现有技术之不足，本发明通过对冠心病人群筛查发现了SelS基因启动子新的突变位点，人群大样本成功验证后借助双荧光素酶报告基因、电泳迁移(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)等技术对其进行了功能分析研究，并基于此开发了SelS基因启动子突变检测试剂盒，为CAD遗传易感性、早期预防及早期诊断提供科学依据。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种体外检测SelS基因启动子突变的试剂，SelS基因启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，SelS基因启动子突变时，其核苷酸序列表中第84位至第89位缺失，试剂包括引物及探针，引物的核苷酸序列如下：
上游引物(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示)：GAAATTCGGTAAGAAATCCGTAAC；
下游引物(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示)：CGCAACGACTCACCCGTGG；
所述探针的核苷酸序列如下：
SelS野生型TP探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示)：CTGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGT；
SelS野生型BM探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示)：ACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCAG；
SelS突变型TP探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示)：CTGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGT；
SelS突变型BM探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示)：ACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCAG。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种体外检测SelS基因启动子突变的试剂在制备冠心病筛查试剂盒的应用。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述试剂盒为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂盒。
上述试剂盒还包括PCR扩增酶及相应缓冲液。
本发明公开了一种新的与冠心病易感性密切相关的SelS基因启动子突变位点，并基于该启动子突变位点开发用于冠心病筛查或预测的试剂盒，该发明所述SelS基因启动子突变位点的应用，可以更加精准的在分子水平上实现对冠心病的早期筛查，针对性强，灵敏度高。
附图说明
图1为SelS基因启动子位点(野生型)测序峰图。
图2为SelS基因启动子位点(杂合子)测序峰图。
图3为构建质粒测序峰图。
图4为野生测序结果与参比序列比对结果图。
图5为突变测序结果与参比序列比对结果图。
图6野生型、突变型酶切电泳图。
图7为293T细胞最佳转染条件摸索。
图8为双荧光素酶活性检测结果。
图9为EMSA实验。
图10为EMSA竞争性实验。
图6中，1：质粒；2：酶切片段；M：Marker。
图9中，箭头所指得位置为转录因子与蛋白结合条带位置。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
除非特别说明，本发明中的％均为质量百分数；除非特别说明，制备过程在常温、常压状态下进行；除非特别说明，本发明中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，本发明中采用的试验条件为本技术领域常规试验条件；除非特别说明，本发明中所用试剂均为市购；除非特别说明，本发明中的水为去离子水。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：一种冠心病易感基因为发生突变的SelS基因启动子，含有该SelS基因的待测样品可以从来自试验者的血液获得。SelS基因启动子突变时，其核苷酸序列表(SEQ IDNO:1所示)中第84位至第89位缺失。
实施例2：一种体外检测SelS基因启动子突变的试剂或试剂盒，所述试剂盒中包括引物、探针及扩增试剂。
引物的核苷酸序列如下：
上游引物(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示)：GAAATTCGGTAAGAAATCCGTAAC；
下游引物(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示)：CGCAACGACTCACCCGTGG；
所述探针的核苷酸序列如下：
SelS野生型TP探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示)：CTGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGT；
SelS野生型BM探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示)：ACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCAG；
SelS突变型TP探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示)：CTGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGT；
SelS突变型BM探针序列(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示)：ACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCAG。
目前关于复杂性状疾病的研究有两种策略，连锁分析的方法和病例-对照研究。由于冠心病是一种多因素疾病，是由遗传和环境因素共同作用的结果，因而采用连锁分析较为困难。从遗传的角度分析，冠心病/心肌梗死属于复杂遗传性状疾病。对该疾病的发生起作用的因素中，除环境因素外，起作用的基因总数估计多达上百条，各个基因之间又存在着相互作用，基因又和环境之间存在相互作用。冠心病的发生具有一定的家族聚集性，但更多的是一些散发病例。所以本发明采用病例对照研究。所述病例对照研究就是在采用随机挑选的两组人群中(病例和对照)比较某等位基因的频率。
实施例3：SelS基因启动子突变位点的筛查
本研究选取2016年1月-2017年12月在新疆医科大学第一附属医院心内科住院的48例冠心病患者作为测序对象。
纳入标准：CAD组：按照我院经皮冠状动脉造影证实至少有一支冠状动脉血管狭窄≥50％且无其他方面的心脏病疾患。对照组：选择2016年至2019年新疆地区人群慢性病调查中无任何心脏疾病者，两组在纳入研究前签署知情同意书。
剔除标准：CAD组：临床资料不全者及同时合并以下疾病之一者予以剔除。(如：主动脉夹层、风湿性心脏病、先天性心脏病者、多脏器功能衰竭以及具有精神障碍不能配合者)。
对照组：1、2016年至2019年新疆地区人群慢性病调查中证实患有任何心脏疾病者2、有心血管病家族史者3、吸毒者4、精神障碍者，予以剔除。
采用聚合酶链反应(PCR)和直接测序技术进行片段扩增及测序，参照HapMap、NCBI数据库，利用遗传学软件Haploview 4.2进行标签基因多态性的筛选。筛查出位于SelS基因启动子的新突变(the novel promoter mutation(-21CGGCGG/-))，即核苷酸序列表(SEQID NO:1所示)中第84位至第89位缺失。
实施例4：SelS基因启动子突变人群验证
通过205例CAD与213例年龄性别相匹配的健康对照组进行人群验证。通过直接测序的方法，发现仅1例冠心病组发生杂合突变。该突变可能是罕见突变。人群基线资料见表1。
方法：PCR反应体系(20μL)：基因组模板DNA 1μL(来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酚-氛仿法或者用盐析法提取出来即可)。
反应条件如下表所示：
反应体系如下表所示：
| ddH2O | 7.0μl |
| 2*Taq PCR master mix | 10.0μl |
| Primer F(10nM) | 1.0μl |
| Primer R(10nM) | 1.0μl |
| DNA | 1.0μl |
| 20.0μl |
引物如下：
上游引物(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示)：GAAATTCGGTAAGAAATCCGTAAC
下游引物(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示)：CGCAACGACTCACCCGTGG。
将扩增直接在测序仪上进行测序。测序条件参见生产厂家的操作手册。测序结果如图1、2所示，图1为野生型结果、图2为杂合子突变结果。
实施例5：SelS启动子位点突变影响SelS基因表达
为进一步从遗传的角度探讨SelS基因启动子突变位点和冠心病发病之间的关系，并为国内外已有的同类研究提供遗传流行病学的证据。采用全基因化学合成的方法制备SelS野生及突变片段；完成pGL3 SelS WT与pGL3 SelS MT质粒的构建。通过测序及双酶切验证双荧光素酶报告基因质粒构建成功(见附图3、4、5、6)。
方法：实验分组如下：
pGL3-basic+pRL-TK组(同时转染pGL3-basic质粒+pRL-TK质粒)
pGL3-control+pRL-TK组(同时转染pGL3-control质粒+pRL-TK质粒)
pGL3-WT-SelS+pRL-TK组(同时转染pGL3-WT-SelS质粒+pRL-TK质粒)
pGL3-MUT-SelS+pRL-TK组(同时转染pGL3-MUT-SelS质粒+pRL-TK质粒)
然后进行质粒最佳转染条件摸索。真核表达载体pAcGFP1-C1转染293T细胞预实验结果如图7所示，确定最佳转染条件：转染试剂
3000最佳浓度为0.37μL/孔(24孔板)，即每1mL培养液中需加入0.75μL
3000试剂；最佳转染时间为48h。后续转染正式实验以该最佳转染条件进行。
结果：通过双荧光素报告基因检测实验报告，我们可以发现SelS基因该启动子位点突变，使启动子活性显著下降(见表2和图8)。启动子作为RNA聚合酶及相关转录因子结合的靶序列，是调控和控制转录起始的顺式作用元件，控制着转录的起始时间和表达程度，因此对启动子的分析是研究表达调控作用的前提和基础，启动子的基因表达调控作用主要表现在顺式作用元件和反式作用因子、RNA聚合酶之间的相互作用，其实质是调控蛋白质和蛋白质、蛋白质和DNA之间的相互作用，启动子区序列的改变可影响RNA聚合酶及转录因子等各种反式作用因子与顺式作用。因此，我们可认为该位点突变可通过改变转录活性，进而影响SelS的表达含量，从而与冠心病的发生具有显著的关联性。
实施例6：SelS启动子突变位点EMSA、竞争性EMSA研究
EMSA是一种评估dna-蛋白质或rna-蛋白质相互作用的强大工具，通常被称为凝胶转移或凝胶阻滞。该试验的原理是，当进行电泳时，游离的DNA/RNA探针将与DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物迁移不同。EMSA可检测到细胞核中与DNA或RNA结合的转录因子。
方法：如图9所示，通过EMSA实验，进行启动子功能研究。通过设立SelS基因野生型(泳道1)及突变型(泳道2)、阴性对照(泳道3)、阳性对照(泳道4)共四组样本，进行凝胶迁移实验。由图可见阳性对照有一条明显得条带，阴性对照无条带，野生型有两条带，突变型有一条带。从初步得实验结果可知，SelS转录因子有与蛋白结合的复合物形成。进一步通过竞争性实验确定目前显示得条带是否是特异性转录因子与核蛋白结合产物。
结果：最上面的条带为特异性结合条带，中间为非特异性结合条带，最下面为游离探针片段。1号泳道未加入样本，因此未见任何结合条带；2号用到加入了生物素标记的野生型探针，未加入野生型的冷探针，可见特异性结合条带；3号与4号用到，加入了野生型的生物素标记探针，同时加入了27倍与80倍的野生型冷探针，结果未见特异性的条带，说明过量的野生型冷探针将DNA蛋白复合物完全结合了，因此特异性的生物素标记条带就没有了；5号泳道与6号泳道加入了野生型生物素标记的探针，同时加入了27倍与80倍的突变型冷探针，结果可见特异性的条带，说明过量的突变型冷探针无法将DNA蛋白复合物完全结合(见图10)。上述结果说明：SelS基因启动子区域有特定的绑定核蛋白质，其突变可导致SelS的转录活性显著降低，可能与冠心病的发病机制有关。
本发明公开了一种新的与冠心病易感性密切相关的SelS基因启动子突变位点，并基于该启动子突变位点开发用于冠心病筛查或预测的试剂盒，该发明所述SelS基因启动子突变位点的应用，可以更加精准的在分子水平上实现对冠心病的早期筛查，针对性强，灵敏度高。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1病例组与对照组基线特征
表2双荧光素酶活性检测结果(
n＝12)
注：△与pGL3-basic+pRL-TK比较，P<0.01；▲与pGL3-control+pRL-TK比较，P<0.01；
序列表
<110> 新疆医科大学第一附属医院
<120> 体外检测SelS基因启动子突变的试剂及其在制备冠心病筛查试剂盒的应用
<130>
<160> 7
<170> Patent-In 3.5
<210> 1
<211> 6612
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccacgacc gcgtccgggc gcgccacgtg tgcgtaggag cgcaccggaa gcgcccggct 60
ggaggcgcgg cggcagggct gggcggcggc ggcggcggcg gtcatggaac gccaagagga 120
gtctctgtcc gcgcggccgg ccctggagac cgaggggctg cgcttcctgc acaccacggg 180
tgagtcgttg cggggcagcc gggcgcgcgc cgccactttt gcgacgcgca gccatgatgg 240
gtgggtcgtc cgccgctgca ccgggcgccg gagcctggga ggcctgggaa cggtcgggcg 300
ttggcgctta cgcggacctt gggcagcagg cccggacctt gcgcggaggc ttctcgggag 360
ccgcacttcc ctgggcggct cggctgtccc ttgtttgcgc aagtcttttt tgcgaaccaa 420
gcccttcctg tggtagttac tggggtcact cggccgttgg cgtttgcctc tgggacccgt 480
cccacacagc cccatacaca ctcctgactc cccgcgctgt cacccctttc tatgtggctc 540
tgaaaggcct ttgccttcct gattcagatt agttgctctt cattcttcaa aacccagttg 600
ctgtgccctc cacactctaa ctgcccccga ctccccagat ggttgggaag tctcacttct 660
cagtgatccc tgaattgtcg cacttcttga gttcgtgttt taacgatcta cttaggaggc 720
tttttcctca gcctagacca tgaaggcttt gagggcagga gttacacttt gtgtttgttg 780
agtcttatgg aaaggtcaac tagtagtgtc atttttagtt ttttgaaaac tgtttttctt 840
ttcagtgggc tccctgctgg ccacctatgg ctggtacatc gtcttcagct gcatccttct 900
ctacgtggtc tttcagaagc tttccgcccg gctaagagcc ttgaggcaga ggcagctgga 960
ccgagctgcg gctgctgtgg gttagtgcct gataaccgaa atgaaagcgg tggttttgca 1020
cctcctttat attaagagtt agtctcttag taaaagtaag aggggccaca caggaagacc 1080
ctgtctctat ttaaaaaaaa aaaaaatagc cgggagtggc ggcacgcacc tgtagtccca 1140
gctgctcagg aggctgaggc gggataatca cttgagtcca gggagtcaaa gctgcagtgg 1200
gctatgctcg ggccacacta cactccagcc tgggcaattg attgagacct tgtctttaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaagt aggaagtata tggttctcgg tggggcgcgg tggctcacac 1320
ctgtaatccc agcactttgg gaagccgagg caggaggatg acttgaggtc aggggttcga 1380
gaacagcctg gccaacatgg tgaaaccctg tctctactaa aaatacaaat attagtgggg 1440
cgtggtgacg ggcacctgta atcccagcta ttagggtggc tgaggcagga gaaatcgctt 1500
gaacctggga gctggagatt gcagtgagct gagattgtgc cactgcactc cagcctgggc 1560
aacagagtga gactgtcttt tctttctttt tttttttttt ttctatgaga tggagtctag 1620
ccttgttgca aagagcgaga ctctatgagt agacgttatg aatagaaatg agttcatttc 1680
tattcataat gctatttgga aggatttttc ttttctgtag aaacaaatac ttaagaatct 1740
tctgcgctaa ttaagggatg gataatgatt tagaaaactt tatatttcct tggtagtctt 1800
ccaggattct agtcagccta gagactgtgg gtgtcactga ggtatccaag atgtgctctg 1860
tgtggccact atcccaggct ttatgaatcg gaattgctca ggggaactca gaaattggca 1920
tttctaacag atttctggtg atgtagatat ttcgggctaa aatccgtggc tcagcaacag 1980
acccctgccc cctgaagcag taaaatgtat gcagaggggt taggagtact tatgtaaaaa 2040
tatgttgttt cattgtctga tatccatacc tctttatact tttaataata tggacactca 2100
aaagtttcta ttttatattg tacacagtgc tttatctcca tttttttctg acattttaga 2160
acctgatgtt gttgttaaac gacaagaagc tttagcagct gctcgactga aaatgcaaga 2220
agaactaaat gcgcaagttg aaaagcataa ggaaaaactg aaacaagtat gaactggttt 2280
cagtttgaat gtgtgcatag aaattgtctg aggtttagtg gctaacgatg cctgtgtctg 2340
tgttgtctat aagcttctag gaccaggtcc tatcccatta gattcaataa gcatttcagt 2400
tcctaccatg taagtattgg tgatatcaag aagaatacac gattgttagg gaacactaga 2460
tgtgtgaata tattaccatg aaaggtccag agcacaaaag gagggacagg ctggagcagg 2520
gagcatgtga gtgtgtgtgt gcatgtgcct gtgtcttccc cattaccaaa aatgtcctga 2580
caggagtgag tttcagaaga atggagtcag taatcttttt catgaaacat tttgctttct 2640
ttaatagtgt acaaaaacca aagctgctct atgtgagtta aactcacact accagatcac 2700
aacagtttta ttaactaaag aaaacgaggg tgaagtttgt tctgaaagac atttaaatta 2760
agaattatca gagttagctt tgtctttgag agaaatggca gcttctgaat tctttctgta 2820
aaatgtgatt gtttctcagc ttgaagaaga aaaaaggaga cagaagattg aaatgtggga 2880
cagcatgcaa gaaggaaaaa gttacaaagg aaatgcaaag aagccccagg tgactggaga 2940
cctcggccgg ctggcatgcg gtagatgaag attgccaagt agaatgtttt aattgcttct 3000
tacactactg tgtgtgttca aacaggagga agacagtcct gggccttcca cttcatctgt 3060
cctgaaacgg aaatcggaca gaaagccttt gcggggagga ggtaagcacc actgatgtca 3120
aatgttaaca gattttcaac acttacagga tatagttacc ttttaggaac aagattgttt 3180
gtttctttgt ccataaatta agactaattc cttaggattg tgaagattca ataaaggaaa 3240
cagatgcaaa tcacctccta ggtcctcact aagtacttag aaggattgta cttatagtat 3300
tctaacttga tccttctgca gccccgtaga gggagagcta agtagggtga ggaattgtct 3360
gccaatcttc agatgagtgt caaggagctg gaacacagtg gttttggtct ttctggctgg 3420
gaccaccttg tttcttgcaa ataacaagga gtagcagaca gatgctcatc caaagctgct 3480
tcctgtgtgc agcactgccc cggggactct ggatgatgcc acagcagtct gtcttcatcc 3540
catccctgag aatttcaaat ctgggaagat gggactcaca aacgaaaata agcaatcctt 3600
ggtgattctg gctaagagtt gcaagttact gctgaggaag gaaagaacaa acacactaga 3660
acactgtagg aaccaaggcg gaagattttg tatcctccat aggaggagag gggcaccgca 3720
gaggccctga tggtgtcttt gaggactgag gaaagactgg ggcatgggct ccaaggcagc 3780
agggccacag acttggctga ccttaaacgc tgagctgtaa tcccctttgt gtcagaagac 3840
taaacctggc ttgctgtaga gaaggtgatg catctggaaa gaaaatgcta tttttaaatg 3900
gtcctgccgg aagcttattt ttagacacat agaggtgata tttaggagag gaatggaaat 3960
cgtagaagat ggaatgcagg gtgtgcttgc ctgcacggcc tctttcagca tccccagcat 4020
ttctgagctg ggacttttga ctagcctggc tttacaaata aggaaactga ggcacagtgt 4080
ttaattgccc aaagattcca ctataagtaa ggagtaaaag taacatttaa gttctgggtg 4140
gccctagaac cttagcactc aaccaggtta ccagttgtgc actgactttg ggaagctcat 4200
gagggagtgg ggtggttggg ggtagggaag gatacagaag accccgttct gactggtaga 4260
agtgacaagt ttgactcttg atttttttta atctgttttc tgtagcgtga acagccctta 4320
tttgaatgta tgagttttag taagcactgt gataggagga ttcatatact taaatcaggc 4380
cctcttgaga gagttttttg gtgacccttt tgcatgtgtt tcggaggttg ggacaaagaa 4440
gctgaatgac ttttttcccc accagacaat cagttcaaat ggcaatcaca atataaaggt 4500
tttttttttt ttcacatagc taaaaggttt ttttaaatgt cccttaggat ctgtatcttt 4560
gcagtgcttt gcgtgtcact ctcataattt tattgtggat atacaatgtt cccagatttt 4620
cagattttta tcaatactgt tgtgctgctt ttctgtcctc ccaggttata acccgttgtc 4680
tggtgaagga ggcggagctt gctcctggag acctggacgc agaggcccgt catctggcgg 4740
atgaggctaa gaatcttgtt agtgtcactt ttgacattag caagatgaac ccttaaccct 4800
cgattcaatt gccttacgca cgcttttcac agtgactagc caaggggagg tggggttgat 4860
ttctgttcct aactacacct gcatatgtca gggctccagt cagcaaaagg tatagatgtt 4920
gcctctaggc atgaggtcat tggtcacatt ctacttggag acagtgattg cattcattga 4980
tttcatggtt aattgctagt tggtaggtaa aggcctctag atgattagca atcttgataa 5040
aagaggccta gtaatgttct tttgaggtta gaaatccttg ctgctaggac agtctctgtg 5100
acaggttgcg ttgaatgatg tcttccttat caatggtgag cccaccagtg aggattactg 5160
atgtggacag ttgatggggt ttgtttctgt atatttattt ttatgtacag aactttgtaa 5220
aaacgaaact atttaaaaaa caagaataac atttttagca tctttattca aggagattta 5280
tggacttcaa tttgtctatc aaacattaaa tagcttttta ttacaacctc taactattac 5340
ttatttctct atttattatt actcacccaa aataagtctg gcaagtggca gacagctgcc 5400
gtgattttga aagttgacag actccttggg gttcatccac aaaattgggt gcttggagtc 5460
gagttgccga attactggga taaagaaaca tcgtgcctca aggttcctca taggctgacc 5520
aggtttctac gtgacctctc agttattccc ttacgccatg actcatcttt tacgctcttg 5580
tccagaggca ctatcagcag ttttggataa agagccaaac agtaaatatt ttagacttta 5640
caggccacat atgatctctg tcacatagtc ttaggttttt atatttttaa aggattgttt 5700
ttaaaaaaga ttctctgctc atgggctgga tttgggctga atgctgtagt gtgtggaccc 5760
cgtctagatc atcagaagga aaaacattaa ccttcagaat agggggtaat tcgctgcaaa 5820
agtactatag aatggtctca tacataaatt agtcaacatt tgttatctcc tgcaggtaga 5880
atattccgtg gttgcttctt gaccaaggga aatacagtct ggctgtgaga gacttaaaat 5940
ctcttgagga gcgctctgga gaatggctga aggagaggaa acaggagcct tgagcagtgt 6000
aattacaaac aaataggttg gcatagtctt aagtctttga gtctagagag atttgagttt 6060
tgttttgcct gtggaggcaa ttgggggttt caggtcaaag agagggtcag tggaaacaag 6120
ggtgggcctt gtgaggtgtg gggaagccct gggaccctca ctccccttcc agtgtgtaac 6180
tggattggct cccaccagcc cagaagattt acgacgtggg aaatggtata cttggattaa 6240
aatatttcat ccagatttgt ttacatctag agagaacccc ttgtaggtta taaggaaact 6300
ttttaacatt cttccttgaa tatattttct gtagctgaaa atgtttgtga agtggctgtc 6360
aactacacat cgcatgagta gaggggctct gggtcggggt ttcatatgca gcagagcagc 6420
tcccttgctg ccgtccatca agagccctca acacaagagt ttgttataaa tagaaataaa 6480
cgacaaaaag tagaggggta tgtttaagta cactattaga tgtgactgac taccttgaaa 6540
cctgattttt ttccatgggg agaaacagtg cttgaattct gcatgccccc cttgcatcta 6600
gcaccttttg gt 6612
<210> 2
<211>24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaattcggt aagaaatccg taac 24
<210> 3
<211>19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcaacgact cacccgtgg 19
<210> 4
<211>30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgggcggcg gcggcggcgg cggcggcggt 30
<210> 5
<211>30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accgccgccg ccgccgccgc cgccgcccag 30
<210> 6
<211>24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgggcggcg gcggcggcgg cggt 24
<210> 7
<211>24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accgccgccg ccgccgccgc ccag 24
Claims (4)
1.一种体外检测SelS基因启动子突变的试剂，其特征在于SelS基因启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，SelS基因启动子突变时，其核苷酸序列表中第84位至第89位缺失，试剂包括引物及探针，引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；所述探针包括SelS野生型TP探针、SelS野生型BM探针序列、SelS突变型TP探针和SelS突变型BM探针，
SelS野生型TP探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，
SelS野生型BM探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，
SelS突变型TP探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示，
SelS突变型BM探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。
2.一种根据权利要求1所述的体外检测SelS基因启动子突变的试剂在制备冠心病筛查试剂盒的应用。
3.根据权利要求2所述的体外检测SelS基因启动子突变的试剂在制备冠心病筛查试剂盒的应用，其特征在于试剂盒为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂盒。
4.根据权利要求2或3所述的体外检测SelS基因启动子突变的试剂在制备冠心病筛查试剂盒的应用，其特征在于试剂盒还包括PCR扩增酶及相应缓冲液。
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2020
- 2020-11-23 CN CN202011323061.3A patent/CN112342292A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113637738A (zh) * | 2021-08-08 | 2021-11-12 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 与冠心病相关的snp位点及其应用 |
| CN113637738B (zh) * | 2021-08-08 | 2023-07-28 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 与冠心病相关的snp位点及其应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210209 |