KR101232100B1

KR101232100B1 - 관상 심장 질환과 단백질 다형성의 연관성

Info

Publication number: KR101232100B1
Application number: KR1020077005662A
Authority: KR
Inventors: 데틀레프 코치안; 하인츠 괴겔라인; 칼-에른스트 지글러; 마르티나 쟈콥스; 쟝-프랑소아 델로이체; 실벵 리카르; 상드렝 마세
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2004-09-10
Filing date: 2005-08-27
Publication date: 2013-02-12
Also published as: JP2008512103A; AU2005281927A1; DK1791976T3; IL181554A0; EP1637612A1; IL181554A; ATE447045T1; US20070292859A1; CA2579885A1; KR20070050473A; HK1107709A1; DE602005017409D1; AU2005281927B2; MX2007002589A; IL211178A; EP1791976B1; IL211178A0; JP5376802B2; BRPI0515346A; EP1791976A1

Abstract

본 발명은 개체에서 관상 심장 질환의 위험성 증가를 동정하는 방법에 관한 것이고, 여기서, Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산의 존재가 샘플중에서 측정된다. 더욱이, 당해 방법에 적합한 프로브, 프라이머, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.

관상 심장 질환, Kir6.2 단백질, 프로브, 프라이머

Description

관상 심장 질환과 단백질 다형성의 연관성{Association of protein polymorphisms with coronary heart disease}

본 발명은 관상 동맥 질환의 위험성 증가를 동정하는 방법 및 당해 방법에 적합한 프로브, 프라이머, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

서방에서는, 심혈관 질환이 남성 및 여성 모두에서 주요 사망 원인이고 관상 심장 질환, 특히, 관상 동맥 질환은 심혈관 질환의 주요 원인이다. 협심증으로도 호칭되는 앙기나는 심장 근육이 충분한 산소를 수용하지 못하여 발생하는 일시적 흉부 동통 또는 압박감이다. 동맥이 협소해지거나 차단될때, 근육으로의 혈류가 증가할 수 없어 보다 많은 산소의 필요성을 충족시킬 수 없는 경우, 허혈이 발생하며 동통(즉, 앙기나)을 유발한다.

일반적으로 협심증은 관상 동맥 질환으로부터 유발되지만 또한 기타 관상 심장 질환으로부터 유발될 수 있다. 허혈을 갖는 모든 사람이 협심증을 경험하는 것은 아니다. 앙기나 부재의 허혈은 무증상 허혈(silent ischemia)이라고 불리운다. 무증상 허혈의 위험은 환자가 이를 인지하지 못한채 심장 조직이 손상되고 있다는 사실에 있다. 따라서, 가능한 심장의 손상은 흔히 이것이 결국 심근 경색을 유발할때까지는 환자나 담당 의사에 의해 인지되지 못한다. 따라서, 혈관 및 특히 관상 퇴화(하기에서는 관상 심장 질환으로 언급함)를 인지하여 조기 진단에 이어서 조기 치료 또는 예방 대책을 가능하게 하는 진단 원리가 크게 요구된다.

따라서, 본 발명의 목적은 관상 심장 질환의 진단 및 치료를 위한 개선된 방법을 제공한다.

이것은 개체에서 관상 심장 질환의 위험성 증가를 동정하는 방법에 의해 달성되고, 여기서, 샘플에서 Kir6.2 단백질의 23번 위치에 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에 발린 이외의 다른 아미노산이 존재하는지가 결정된다.

하기에서, 뉴클레오타이드 및 아미노산의 표준 약어(예를 들어, 아미노산의 3문자 또는 1문자 코드)는 전체 용어와 동의어로서 사용된다.

Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 아미노산 대체(특히, Glu에서 Lys로의 대체) 및/또는 337번 위치에서 아미노산 대체(특히, Val에서 Ile로의 대체)를 포함하는 Kir6.2의 단백질 서열에서 다형성의 동정은 관심 심장 질환, 바람직하게는 관상 동맥 질환 및/또는 협심증에 대한 증가되거나 정상적인 위험성을 추정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어,

1) 목적하는 단백질 영역의 서열 분석을 기초로 하는 방법(예를 들어, 표준 단백질 분해, 질량 분광기를 사용한 단백질 서열 단편의 분석),

2) 목적하는 영역에 대한 항-Kir6.2 항체의 사용을 기초로 하는 방법(예를 들어, ELISA) 또는

3) 예를 들어, 사람, 동물, 세균 또는 효소 세포를 사용한 시험관내 분석에서 Kir6.2의 기능 활성의 분석을 기초로 하는 방법에 사용될 수 있다.

본 발명은 추가로, 개체에서 관상 심장 질환의 위험성 증가를 동정하는 방법에 관한 것이고, 여기서, Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드 서열을 유도하는 Kir6.2 유전자의 하나 또는 둘다(바람직하게는 둘다)의 대립형질 유전자상에서 뉴클레오타이드의 변이의 존재가 샘플중에서 측정된다.

Kir6.2 단백질에서 23번 위치에서 아미노산의 대체(특히, Glu에서 Lys로의 대체) 및/또는 337번 위치에서 아미노산의 대체(특히, Val에서 Ile로의 대체)를 유도하는 Kir6.2 유전자의 하나 또는 둘다의 대립형질유전자상에 뉴클레오타이드 서열 다형성의 동정은 정상적인 개체 및 바람직하게는 당뇨병 환자에서 관상 심장 질환, 바람직하게는 관상 동맥 질환 및 보다 바람직하게 협심증에 대한 증가된 위험성을 예측하는데 사용될 수 있다.

예를 들어,

1) 목적하는 뉴클레오타이드 영역에 대한 서열 분석을 기초로 하는 방법(예를 들어, 방사능 표지된 뉴클레오타이드 또는 형광 염료로 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 서열분석을 위한 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 서열분석 방법, 질량 분광기를 사용한 서열 단편의 분석);

2) 뉴클레오타이드 서열의 목적하는 영역으로의 하이브리드화를 기초로 하는 방법(예를 들어, DNA 아미크로어레이) 및

3) 목적하는 뉴클레오타이드 영역의 증폭 생성물의 분석을 기초로 하는 방법(예를 들어, TaqMan^TM 분석)에서 사용될 수 있다.

K⁺ 내향 조정 채널 Kir6.2(KCNJ11 또는 Bir)는 췌장섬 ATP 민감성 칼륨 채널(I_kATP)의 서브유니트이다. Kir6.2에 대한 유전자는 염색체 11p15.1로 맵핑되었고 Kir6.2 단백질은 390개 아미노산으로 구성되어 있다. 글루코스 자극된 인슐린 분비에서 이의 주요 역할때문에, Kir6.2는 II형 진성 당뇨병의 발병과 관련된 유전자 결손의 후보 유전자인 것으로 추정된다[문헌참조: Yamada et al.(2001) Diabetes Metab Res Rev 17:213-216].

Kir6.2의 여러 단백질, 게놈성 폴리뉴클레오타이드 및 암호화 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 여러 사람 단백질/게놈성 DNA/ 암호화 서열은 승인번호 XP006398(서열번호 3)(서열번호 5)(단백질 서열) 또는 XM006398(서열번호 4)(서열번호 6)(암호화 서열)하의 NCBI(National Center for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; www.ncbi.nhm.nih.gov) 데이타 베이스로부터 공개적으로 수득할 수 있다. 하나의 게놈성 Kir6.2 서열은 NCBI 승인 번호 NT_009307(호모 사피엔스 염색체 11 게놈성 콘티그.; 크기: 8665930 bp)하에 공개된 게놈성 연속 서열로부터 공개적으로 수득할 수 있다. mRNA/암호화/게놈 Kir6.2 서열의 정렬은 하기의 인터넷 링크를 사용하여 공개적으로 수득할 수 있다: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?SendTo=on&db=nucleotide&dispmax=1&extrafeat=- 1&list_uids=NT_009307.12&showndispmax=1&view=graph&_from=5656500&_to=5659500&_sfrom=5657000&_font=default&_llen=60&_slen=4000. 당해 정렬로부터 수득될 수 있는 바와 같이, 5656500번에서 5659500번 위치까지의 서열 스트레치는 게놈성 Kir6.2 좌를 포함한다. 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 상이한 Kir6.2 서열은 단백질 서열의 23번 위치 및/또는 337번 위치와 이를 암호화하는 서열의 상응하는 위치(각각, 67/68/69 및 1009/1010/1011)에서 상이하다. 암호화 서열은 게놈성 DNA의 전사 생성물로부터 유래하는 것이기때문에 5657106/107/108번 및 5657478/79/80번과 관련된 여러 상이한 게놈성 서열의 변이체가 또한 반드시 존재한다.

용어 Kir6.2는 Kir6.2 단백질 및 핵산을 언급한다. 용어 단백질은 폴리펩타이드, 및 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 단백질, 예를 들어, 공지된 결합(예를 들어, S-S 브릿지)을 수단으로 서로 연결되어 하나의 단백질 유니트를 형성하는 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 Kir6.2 단백질은 임의의 Kir6.2 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편을 언급할 수 있다. Kir6.2 단편은 예를 들어, 서열번호 1 내지 8 또는 13중 하나에 따른 서열을 갖는 Kir6.2 단백질 또는 핵산 보다 짧은 임의의 Kir6.2 단백질 또는 핵산일 수 있다. Kir6.2 단편은 바람직하게 Kir6.2의 기능성 단편이다. Kir6.2 단백질의 기능성 단편은 적어도 하나의 Kir6.2의 기능을 갖는 단백질 단편이다(상기 참조). Kir6.2의 기능성 핵산은 예를 들어, Kir6.2 단백질 또는 이의 기능성 단편을 암호화하거나, Kir6.2 핵산과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 Kir6.2 핵산 단편이다.

용어 단백질 서열, 아미노산 서열 및 폴리펩타이드 서열은 본원에서 동의어로 사용된다.

놀랍게도, 본 발명자의 연구는 Kir6.2 폴리펩타이드의 23번 위치에서 가장 흔한 변이체가 Glu(글루탐산, E)임을 밝혔다. 더욱이 당해 발명자들은 337번 위치에서의 가장 흔한 변이체가 Val(발린, V)임을 밝혔다. 따라서, 각각의 위치에서 당해 아미노산들은 본원의 범위내에서 Kir6.2의 "야생형"으로서 간주된다. 따라서, 본원에서 아미노산 서열의 대체 또는 돌연변이체 또는 덜 빈번한 변이체를 언급하는 경우, "야생형"의 23번 및/또는 337번 위치에서 야생형 아미노산으로부터 벗어남을 의미한다.

서열번호 1(NCBI 승인 번호 D50582; 도 1A 참조) 및 2(NCBI 승인 번호 D50582; 도 1B 참조)에 따른 서열은 폴리펩타이드 서열의 23 및 337번 위치(및 각각 암호화 서열의 67/68/69번 위치 또는 1009/1010/1011 위치 및 게놈성 서열의 5657106/07/08번 위치 및 5657478/79/80 위치)와 관련된 Kir6.2 야생형을 나타낸다. 한편, NCBI 데이타베이스로부터 유래하는 서열번호 3(NCBI 승인 번호 XP006398; 도 2A), 서열번호 4(NCBI 승인 번호 XM006398, 도 2B) 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 신규 서열은 각각 폴리펩타이드의 서열 23번 위치 또는 337번 위치에서 덜 빈번하게 존재하는 아미노산(각각 뉴클레오타이드 서열의 67번 또는 1009번 위치에서의 서열 변이체)을 함유한다. 서열번호 7(도 4A) 및 8(도 4B)의 신규 서열은 아미노산 쇄의 23번 및 337번 위치 둘다에서 덜 빈번하게 존재하는 변이체를 함유한다: 아미노산 서열의 23번 위치에서 라이신(암호화 서열의 67/68/69번 위치에서 AAG) 및 337번 위치에서 이소류신(암호화 서열의 1009/1010/1011번 위치에서 ATC).

단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 단일 뉴클레오타이드 위치에서 대체된 소정의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변이체를 나타낸다; SNP는 당업계에 널리 공지되어 있다.

해독된 단백질에서 아미노산 대체를 유도하는 여러 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 Kir6.2 유전자에서 동정되었는데, 예를 들어, E23K(단백질의 23번 위치에서 글루탐산으로부터 라이신으로의 대체), L270V(270번 위치에서 류신으로부터 발린으로의 대체) 및 V377I가 있다. 최근 연구에서, Kir6.2 변이체 E23K는 백인 집단의 II형 진성 당뇨병과 관련되어 있다(문헌참조: Hani et al.(1998) Diabetologia 41:1511-1515).

그러나, 지금까지 심혈관 장애와 관련된 사람의 Kir6.2 변이체의 임상적 효과에 대한 데이타는 유용하지 못하였다. 놀랍게도, 본 발명자의 연구는 최초로 Kir6.2 단백질의 23번 위치 및/또는 337번 위치에서 아미노산 서열내의 돌연변이 존재와 관상 심장 질환에 대한 소인간의 밀접한 연관성을 동정하였다.

사람 DNA 또는 Kir6.2 단백질 분석에 의한 Kir6.2 유전자, 특히 Kir6.2-23-KK(Kir6.2 유전자의 대립형질유전자 둘다의 상응하는 위치에서의 다형성 결과로서 단백질의 23번 위치에서 라이신(K)을 갖는 Kir6.2 변이체) 및 Kir6.2-337-II(Kir6.2 유전자의 대립형질유전자 둘다의 상응하는 위치에서의 다형성 결과로서 단백질의 337번 위치에서 이소류신(I)을 갖는 Kir6.2 변이체)의 유전자적 다형성의 검출은 예를 들어, (a) 관상 심장 질환, 보다 특히, 관상 동맥 질환 및 보다 구체적으로, 특히 당뇨병 환자에서 협심증에 대한 예방적 치료를 위한 유전자 마커로서, (b) 약물 투여량의 조절을 위한 유전자 마커로서, (c) 약물 스크리닝 셋-업 적용을 위한 유전자 마커로서 및 (d) 양상/임상 연구에서 환자를 선별하기 위한 유전자 마커로서 사용될 수 있다.

관상 심장 질환에 대한 소인을 조기 동정함으로써, 본 발명에 따른 방법에 의해, 앙기나와 같은 증상 또는 심장 조직에 대한 손상이 발생하기 전에 환자를 조기에 예방적 또는 치료적으로 처치할 수 있다: 상기 대체된 아미노산 또는 mRNA 또는 게놈상에서의 뉴클레오타이드의 동정은 치료 담당의사가 관상 심장 조직 또는 혈관에 대한 기존에 존재하는 손상을 스크리닝하거나 손상 및/또는 동통이 발생하기 전에도 예방적 약제를 처방하기 위한 명백한 지침을 제공한다.

더욱이, 상기 아미노산 대체와 관상 심장 질환간의 놀라운 연관성은 특정 약제에 대한 고투여 용량의 필요성을 암시하거나 상기 Kir6.2 아미노산 대체를 나타내지 않는 관상 심장 질환 환자와 비교하여 특정/상이한 유형의 약물치료의 필요성을 지적함에 의해 관상 심장 질환이 보다 효과적으로 치료될 수 있도록 한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 관상 심장 질환을 치료하고/하거나 예방하는데 유용한 약제의 투여용량을 적용하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 개체의 샘플에서,

a) Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산,

b) Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 유도하는 Kir6.2 유전자의 대립형질 유전자중 하나 또는 둘다에서의 뉴클레오타이드 서열의 변이 또는

c) Kir6.2-23-KK 및/또는 Kir6.2-337-II을 갖는 Kir6.2의 존재가 측정된다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태는 관상 심장 질환 약제에 반응하는 개체를 선별하는 방법에 관한 것으로서, 여기서, 개체의 샘플에서,

개체의 선별은 바람직하게 당뇨병 환자에 대한 것이다; 약제는 바람직하게 관상 동맥 질환 및 가장 바람직하게는 협심증을 예방하거나 치료하기 위한 약제이다. 바람직하게, 23번 위치에서의 아미노산 대체는 Glu의 Lys로의 대체이고/이거나 337번 위치에서의 아미노산 대체는 Val의 Ile로의 대체이다. 샘플은 바람직하게 분리된 단백질 또는 핵산, 생물학적 샘플, 예를 들어, 조직학적 샘플, 세포 추출물 또는 조직 추출물 또는 세포이다.

관상 심장 질환 또는 협심증의 치료 또는 예방을 위한 광범위한 약제가 당업계에 공지되어 있다.

본 연구가 처음으로 관상 심장 질환과 연관되거나 관련된 과정에 Kir6.2가 관여함을 동정했기때문에, 본 발명의 추가의 측면은 관상 심장 질환을 치료하고/하 거나 예방하는데 유용한 약제의 동정을 위한 Kir6.2의 용도에 관한 것이다.

용어 "약제"는 개체의 질환 상태의 치료적 또는 예방적 처치를 위해 사용될 수 있는 임의의 물질 또는 배합된 물질을 언급한다. 물질은 임의의 생물학적 또는 화학적 물질 또는 천연 추출물일 수 있고, 생화학적 또는 분자 생물학적 방법 수단에 의해 정제되거나, 부분 정제되거나, 합성되거나 제조될 수 있다.

본 발명의 상이한 측면에서 관상 심장 질환을 예방하거나 치료하는데 유용하거나 효과적인 것으로서 간주되는 약제는 세포내 Kir6.2(단백질 또는 핵산)의 양 또는 Kir6.2 발현, 또는 Kir6.2의 기능들중 하나에 영향을 미치는 임의의 물질 또는 배합물일 수 있다.

이와 관련하여, 당해 물질은 Kir6.2의 기능들(예를 들어, 상기 열거된 것들)중 임의의 하나를 조절할 수 있다. Kir6.2 단백질 활성은 당해 물질에 의해, 예를 들어, Kir6.2 폴리펩타이드/단백질 또는 이의 단편의 직접적인 상호작용 및 간섭에 의해 조절될 수 있다. 당해 물질은 또한 예를 들어, Kir6.2의 발현, 예를 들어, 전사 수준(개시, 연장, 프로세싱등), 전사체 안정성, 해독을 조절할 수 있다. 더욱이, Kir6.2의 해독 후 변형, 단백질 폴딩을 조절할 수 있다. 당해 물질은 직간접적으로 상기 효과를 발휘할 수 있다(즉, 간접적으로는 Kir6.2 기능/단백질 활성/발현등에 영향력을 갖는 고유 시그날 전달 캐스케이드에 (양성으로 또는 음성으로) 간섭함에 의해).

본 발명의 또 다른 양태는,

a. Kir6.2를 함유하는 2개의 샘플을 제공하는 단계,

b. 하나의 샘플과 잠재적인 약제를 접촉시키는 단계,

c. 잠재적인 약제의 존재 및 부재하에 Kir6.2 활성 또는 Kir6.2 구조를 측정하는 단계 및

d. 잠재적인 약제의 존재하의 Kir6.2 활성과 당해 부재하의 활성을 비교하는 단계를 포함하는, 관상 심장 질환을 치료하고/하거나 예방하는데 유용한 약제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

잠재적인 약제학적 물질의 존재하에 활성 또는 구조(즉, Kir6.2 단백질의 폴딩)는 또한 야생형 Kir6.2 단백질의 활성 또는 구조와 비교할 수 있다.

바람직하게, 샘플은 Kir6.2을 함유하거나 Kir6.2의 분리된 단백질 또는 단백질 단편 또는 Kir6.2의 분리된 핵산 또는 핵산 단편이다.

본원에서, "분리된 단백질" 및 "분리된 핵산"등에서의 용어 "분리된"은 천연으로부터 정제된 단백질/핵산 뿐만 아니라 재조합 단백질/핵산(물론 또한 정제될 수 있는)을 언급한다.

관상 심장 질환과 관련 있는 것으로 동정된 Kir6.2내의 아미노산 대체는 관상 심장 질환의 치료 및/또는 예방에 영향을 줄 가능성이 매우 높기때문에, 상기 용도 및 방법 중 하나를 위해 사용되는 Kir 6.2는

a) Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 함유하는 Kir6.2 단백질 또는 이의 단편,

b) Kir6.2 유전자의 대립형질유전자중 하나 또는 둘다의 뉴클레오타이드 서 열이 변이되어 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 유도하는 Kir6.2 핵산 또는 이의 단편 또는

c) Kir6.2-23-KK 및/또는 Kir6.2-337-II일 수 있다.

당해 대체된 아미노산중 하나 또는 둘다를 야생형 단백질의 아미노산으로 대체시켜 Kir6.2의 단백질 기능 및/또는 폴딩을 복귀시키는 잠재적인 약제의 능력을 스크리닝함으로써, 관상 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제학적 활성 물질이 동정될 수 있다.

특히 고효율적 포맷으로 사용되는 경우, 분리된 단백질 또는 단백질 단편, 상기 단백질을 발현하는 세포를 사용한 약제학적 스크리닝 방법 및 시스템은 당업계에 널리 공지되어 있다.

본원에서 특정 표적 분자의 활성 또는 농도, Kir6.2(소위 표적물, 주로 단백질 또는 핵산)의 활성 또는 폴딩을 잠재적인 약제 화합물의 효과에 대한 계수로서 측정하는데 사용되는 분석법으로 통칭되는 적합한 분석 방법 또는 분석 시스템은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 분석법은 한정된 공간 및 시간내에 반응 혼합물에 함께 가해지는 분리된 또는 부분적으로 분리된 화합물을 사용하는 생화학학적 분석법 또는 시스템일 수 있고 여기서 잠재적인 약제 화합물의 효과가 시험될 수 있다. 분석법의 또 다른 예는 생화학적 분석법 또는 시스템을 포함하고 여기서, 표적 분자의 활성 및 이러한 활성에 영향을 주는 잠재 효과가 세포내에서 측정될 수 있다.

분석은 생물학적 과정을 모니터하기 위한 일종의 분석법 또는 시스템이다. 적합하게, 병리학적 증상 뿐만 아니라 생리학적 대사 경로의 일부를 구성하는 분자 캐스케이드 및 기작은 세포적 또는 생화학적(시험관내) 시스템내에 재현된다. 따라서, 잠재적인 약제 화합물의 약리학적 활성은 이들 캐스케이드 또는 기작에 간섭하거나 조절하는 능력에 따라 측정될 수 있다.

약물 스크리닝에 사용하기 위해, 특히, 신규 약제 화합물의 고효율적 스크리닝을 위해, 당해 분석법은 재현성이 요구되고 또한 바람직하게는 측정가능하고 강건할 필요가 있다. 당해 분석은 바람직하게 연구중의 표적 분자의 활성을 조절하는 화학적 물질의 능력을 고효율로 스크리닝하는데 적합하다. 분석 유형은 예를 들어, 사용되는 표적 분자의 유형(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드) 및 "판독", 즉 계수에 의존하고 이에 따라 표적 분자의 활성이 측정된다(하기 참조).

상이한 유형의 당해 분석법은 일반적으로 당업계에 널리 공지되어 있고 상업적으로 공급자로부터 구입할 수 있다.

상이한 목적을 위해 적합한 분석법은 방사능동위원소 또는 형광 분석, 예를 들어, 형광 분극 분석(예를 들어, 제조원(Panvera)으로부터 시판되는 것들) 또는 표지된 구성원과 비표지된 구성원의 상호작용(예를 들어, 표지된 단백질 수용체와 이의 비표지된 리간드의 상호작용)을 측정하기 위한 팩카드 바이오사이언스(HTRF; ALPHAScreen^TM)를 포함한다.

보다 많은 예로서 세포 기반 분석법을 포함하는데, 여기서, 세포주는 안정하 게(유도적으로 또는 아니거나; 염색체성 또는 에피좀성) 또는 일시적으로 목적하는 재조합 단백질을 발현한다. 이들 분석은 예를 들어, 리포터 유전자 분석을 포함하고, 여기서, 특정 프로모터의 조절 또는 시그날 전달 캐스케이드 구성원중 시그날 전달 경로의 조절이 리포터 효소의 활성에 따라 측정되고 이의 발현은 당해 특정 프로모터의 통제하에 있다. 당해 유형의 분석을 위해, 재조합 세포주는 자체가 연구 대상이거나 연구하에 있는 시그날 전달 캐스케이드에 의해 조절되는 특정 프로모터의 통제하에 리포터 유전자를 포함하도록 구성되어야만 한다. 적합한 리포터 효소는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제(예를 들어, 팩카드 레전트(Packard reagents)에 의해 시판됨), β-갈락토시다제를 포함한다. 적합한 세포주는 분석 목적에 의존하지만 거의 대부분 형질감염시키기 용이하고 배양하기 용이한, HeLA, COS, CHO, NIH-3T3등과 같은 세포주이다.

세포내 이온 농도를 측정하기 위한 분석은 예를 들어, FLIPR(형광측정 영상 플레이트 판독기, 제조원(Molecular Devices)로부터 시판됨) 분석을 포함하고, 여기서, 아르곤 레이져 광원은 냉각된 CCD 카메라와 함께 장착되어 384 웰 플레이트에서 세포(예를 들어, 신경 세포 또는 기타 세포(예를 들어, 재조합적으로 또는 천연적으로 특정 이온 채널을 발현하는 세포))내의 일시적 이온 시그날(예를 들어, Ca²⁺등)을 병행 측정할 수 있다. FLIPR 분석은 예를 들어, Fluo-3, Fluo-4와 같은 특정 형광단을 사용하여 세포내 칼슘을 모니터링하거나 BCECF 또는 BCPCF pr 특이적 FLIPR 분석 키트를 사용하여 세포내 pH를 모니터링하거나 예를 들어, DiBAC 또는 특이적 FLIPR 분석 키트를 사용하여 막 전위 변화를 검출하거나 막 분극화를 모 니터링할 수 있다. 기타 세포내 이온, 예를 들어, 아연 또는 나트륨을 모니터링하기 위해, 당업계에 공지된 기타 염료가 사용될 수 있다. 기타 유형의 분석 및 기타 유형의 판독법이 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.

Kir6.2(예를 들어, 세포내 이온 농도를 조절함에 따라서 세포내 이온 농도의 측정을 위해 사용될 수 있는)의 채널 활성과 같은 이온 채널 활성을 측정하기 위해, 예를 들어, 막 전위차 민감성 분석 및 염료가 사용될 수 있고 예를 들어, FLIPR 기술을 바탕으로 하는 DiBAC 또는 분자 장치 막 전위차 분석 키트; FLIPR 기술을 사용한 미토콘드리아 막 분극화 측정 JC-1 염료; 이온 민감성 염료등이 있다. 패취-클램핑을 기반으로 하는 분석 또는 원자 흡착 분광측정 기반 루비듐 이온 유출 측정법이 특히 세포내 칼륨 농도등을 측정하는데 적합하다. 세포내의 특정 변화 및 상태를 검출하기 위한 추가의 자동 장치가 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 제조원(ACUMEN bioscience)에 의한 Acumen 검출기(적합하게 표지된 대상의 분포를 3차원적으로 재구성하는 형광 기반 레이져 스캐닝 판독기)를 포함한다. 기타 유형의 분석법 및 기타 유형의 판독기는 당업계에 널리 공지되어 있다.

상기 스크리닝 방법 또는 이의 사용을 위해, Kir6.2 단백질은 서열번호 3, 5 또는 7의 서열을 포함하거나 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 방법 또는 이의 용도에 따라 상기 단백질 단편은 서열번호 3, 5 또는 7에 따른 서열을 포함하거나 갖는 것이 바람직하다. 상기 스크리닝 방법에 따른 핵산은 바람직하게 서열번호 4, 6 또는 8에 따른 서열을 포함하거나 갖는다. 그리고, 상기 스크리닝 방법에 따른 핵산 단편은 바람직하게 서열번호 4, 6 또는 8에 따른 서열을 포함하거나 갖는 다.

야생형 Kir6.2의 23번 위치의 Glu에서 및/또는 337번 위치의 Val을 대체하는 모든 아미노산 변이는 관상 심장 질환에 대한 성향에 영향을 줄 가능성이 높다. 따라서, 기본적으로 야생형으로부터 아미노산 대체는 임의의 유형일 수 있다. 23번 위치 및/또는 337번 위치에서의 아미노산 대체가 각각 야생형 Glu23 및 Val337의 성질과는 상이한 성질을 갖는 아미노산이 혼입됨을 의미하는 것이 바람직하다. 따라서, 비극성 또는 염기성 아미노산이 산성 글루탐산 대신에 23번에 위치하는 것이 바람직하다. 염기성 아미노산, 특히, 라이신(Lys, K)인 것이 보다 바람직하다. 야생형 폴리펩타이드가 비극성 아미노산인 발린(Val, V)을 갖는 337번 위치에 대해서는 발린 보다 큰 용적의 측쇄를 갖는 비극성 아미노산, 염기성 또는 산성 아미노산이 337번에 위치하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 본 발명의 범위내에서 발린 보다 큰 용적의 측쇄를 갖는 비극성 아미노산이 337번에 위치한다. 당해 방법의 가장 바람직한 양태는 Kir6.2의 23번 위치에 라이신을 갖고 Kir6.2의 337번 위치에 이소류신을 갖는 변이체를 포함한다.

유전자 코드의 축퇴성 때문에, 상기 아미노산 대체를 유도하는 뉴클레오타이드 대체 가능성은 여러가지이다. 유전자 코드는 널리 공지되어 있다[문헌참조: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3^rd edition]. 폴리펩타이드의 23번 위치의 아미노산과 관련하여 글루탐산의 다른 아미노산으로의 대체는 서열번호 1에 따른 암호화 서열의 67/68/69번 위치중 하나 이상의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 337번 위치의 아미노산과 관련하여, 발린의 다른 아미노산으로의 대 체는 서열번호 1에 따른 DNA 서열의 1009번 또는 1010번 위치중 하나 또는 둘다의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 상기된 바와 같이, 특정 유형의 아미노산 대체가 바람직하기때문에, 뉴클레오타이드의 대체는 당해 바람직한 아미노산 대체를 유도하는 뉴클레오타이드 대체인 것이 바람직하다. 뉴클레오타이드 대체가 E23K 대체(폴리펩타이드 서열의 23번 위치에서 글루탐산의 라이신으로의 대체) 및/또는 V337I 대체(337번 위치의 발린에서 이소류신으로의 대체; 도 7 참조)를 유도하는 것이 보다 바람직하다. 가장 바람직한 SNP는 G67A(암호화 서열의 67번 위치에서 G의 A로의 대체) 및/또는 G1009A(암호화 서열의 1009번 위치에서 G의 A로의 대체)이다. 바람직한 양태는 또한 Kir6.2 단백질내의 23번 및/또는 337번 위치에서 아미노산 서열에 영향을 주는 게놈 서열내의 해당 뉴클레오타이드의 대체를 포함한다.

본 발명의 상이한 측면의 바람직한 양태에 따라, 개체는 당뇨병 환자이고 특히, 당뇨병이 II형 당뇨병(진성 당뇨병)인 것이 보다 바람직하다. 또한 관상 심장 질환이 협심증인 것이 바람직하다.

23번 위치의 아미노산인 Glu가 Lys로 대체되고/되거나 337번 위치의 아미노산인 Val이 Ile로 대체되는 것이 유리하다. 당해 샘플은 바람직하게 분리된 단백질 또는 핵산, 조직학적 샘플, 세포 또는 조직 추출물 또는 세포이다. 또한, 샘플이 인체로부터 분리되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 상기 방법중 하나를 언급하고, 여기서, Kir6.2-23-KK 및/또는 Kir6.2-337-II의 존재가 샘플중에서 측정된다. 당해 심플은 예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 조직학적 샘플, 세포 또는 조직 추출물 또 는 세포일 수 있고 당해 샘플은 바람직하게 인체로부터 분리된다.

생물학적 재료 및 생물학적 샘플은 예를 들어, 바람직하게는 척추동물로부터 및 보다 바람직하게는 사람을 포함하는 포유동물로부터 유래하는 세포, 조직 또는 기관(예를 들어, 뇌, 혈액, 간, 비장, 신장, 심장, 혈관등)의 제제 또는 일부를 포함한다. 또한 세포 배양물, 바람직하게는, 다세포 기관 및 조직으로부터 유래하는 세포(예를 들어, HeLA, CHO, COS, SF9 또는 3T3 세포) 또는 효모와 같은 단세 기관(예를 들어, 에스. 폼베(S. pombe) 또는 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)를 포함하는 진핵 세포 배양물 또는 원핵 세포 배양물, 바람직하게는, 피치아(Pichia) 또는 이. 콜리(E. coli) 기원의 세포이다. 조직 기원의 세포 및 샘플은 널리 공지된 기술, 예를 들어, 채혈, 조직 천공 또는 수술에 의해 수득할 수 있다. 세포 또는 조직으로부터 재조합 분자의 제조 및 DNA 또는 단백질과 같은 천연 분자의 정제 뿐만 아니라 세포 또는 조직 추출물의 제조는 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 하기 열거된 표준 문헌 참조).

대체된 아미노산의 존재는 예를 들어, 개체의 게놈 DNA를 분석함으로써 측정할 수 있다. 적합한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 차등 PCR 기술, 칩 하이브리드화, 슬롯/도트 또는 서던 블롯팅을 포함한다.

PCR(폴리머라제 연쇄 반응)은 5' 및 3' 인접 부위에서 공지된 서열의 뉴클레오타이드 스트레치를 갖는 서열 스트레치를 특이적으로 증폭시키는 시험관내 기술이다. 서열의 5' 영역의 서열이 공지되어 있다면 소정의 서열을 증폭시키기에 충분하다. 이 경우에, 증폭될 폴리뉴클레오타이드의 단편이 우선 제조되어야만 한 다(이것은 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 분해와 같은 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다). 다음에, 리가제(여러 공급업체로부터 시판되는 T4 DNA 리가제)를 사용하여 공지된 서열의 DNA 분자("링커")를 제조된 폴리뉴클레오타이드 단편의 3' 말단에 커플링시킨다. 따라서 수득된 서열은 2개의 공지된 서열, 즉 공지된 5'-서열 및 3'의 공지된 링커 서열에 의해 포위되고 PCR에 의해 특이적으로 증폭될 수 있다(이 경우에, 링커 매개 PCR "ImPCR").

선택된 서열을 증폭시키기 위해, 증폭될 폴리뉴클레오타이드 서열을 구성하는 서열 스트레치에 상보적인 짧은 일본쇄 DNA 분자(프라이머)를 사용한다. 폴리뉴클레오타이드 주형은 DNA이거나 RNA일 수 있다. 이어서 당해 프라이머는 일본쇄 주형에 어닐링되고 널리 확정 공지된 조건하에서 소위 폴리머라제(주형으로서 DNA를 인지하여 상보적인 DNA 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 DNA 폴리머라제 또는 주형으로서 RNA를 인지하고 상보적인 DNA 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 역전사효소)라고 불리우는 특이적 효소에 의해 연장되어 주형 쇄와 상보적인 서열을 갖는 새로운 DNA 쇄를 생성시킨다. 규정된 온도 및 규정된 시간 간격에서 주기적으로 반복되는 규정된 순서의 항온처리 단계를 선택하여 특정 순서의 변성/어닐링/중합 단계가 수행되고 이로써 결국 목적하는 폴리뉴클레오타이드가 지수적으로 증폭된다. 폴리머라제를 파괴하지 않으면서 변성시키는데 요구되는 온도를 적용하기 위하여, 95℃ 이상의 고온에 내성을 갖는 열안정성 효소, 예를 들어, Taq-DNA 폴리머라제(DNA 폴리머라제(제조원: thermus aquaticus)), PFU등(각각 상이한 공급업체로부터 시판됨)을 사용한다. 적합한 폴리머라제는 사용 목적(예를 들어, PCR에 의한 클로닝을 위해, PFU와 같은 교정 능력을 갖는 폴리머라제가 바람직하게 선택된다)에 따라 선택되고 이는 당업자의 기술에 속한다.

전형적인 PCR 반응은 폴리뉴클레오타이드 주형(예를 들어, 0.01 내지 20ng), 2개의 적합한 프라이머(예를 들어, 각각 0.2 내지 2μM의 농도), dNTP(예를 들어, 각각 200μM), 1 내지 2mM의 MgCl₂ 및 1 내지 10 유니트의 열안정성 폴리머라제(예를 들어, Taq)를 포함한다. 전형적인 성분 및 완충제는 당업자에게 널리 공지되어 있고 일반적으로 공급업체에 의해 시판된다.

적합한 프라이머는 널리 공지된 프로토콜에 따라 화학적 합성을 수단으로 제조될 수 있다. 당해 프라이머는 또한 제조원(MWG Biotech)등과 같은 상이한 공급업체에 의해 시판되고 있다.

DNA 및 RNA 주형, 또한 cDNA 주형은 널리 공지된 표준 과정에 의해 제조될 수 있거나(예를 들어, 하기 표준 문헌 참조) 제조원(Promega 및 Stratagene)등으로부터 구입할 수 있다.

게놈 DNA(및/또는 RNA 및/또는 단백질)를 함유하는 생물학적 샘플을 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., or Current Protocols in Molecular Biology or Protein Science]을 참조한다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라, 대체된 아미노산의 존재는:

e. 개체로부터 게놈 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 제조하는 단계,

f. 동일계 PCR 또는 상기 샘플(예를 들어, 조직 샘플 또는 세포)를 직접적으로 사용하여 게놈 서열을 직접적으로 분석하는 방법과 같은 동일계 방법에 의해 직 접적으로 분석되지 말아야 하는 경우, a)에 따른 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하거나 적어도 부분적으로 정제해야만 하는 단계,

g. 암호화 서열의 67/68/69번 위치 및/또는 1009/1010/1011번 위치에 상응하는 게놈 kir6.2 서열의 뉴클레오타이드 위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의해 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시키는 단계 및

h. c)에 따른 폴리뉴클레오타이드 단편을 서열 분석하는 단계로 이루어지거나 이를 포함하는 방법에 의해 측정된다.

서열번호 13에 따른 게놈 Kir6.2 서열과 관련하여, 게놈 서열내에서 상기 "상응하는 위치"는 각각 5657106/5657107/5657108 및 5657978/5657979/5657980이다(도 8 참조).

이어서, 상기 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 대체되도록 하는 게놈 서열내 대체된 하나 이상의 뉴클레오타이드의 존재는 공지된 표준 과정(예를 들어, 표지된 서열분석 프라이머를 사용하고 당해 시그날의 자가방사선 또는 형광 검출을 수행하는)에 따라 동정될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시키기 위해 적합한 프라이머의 선별 및 디자인은 당업자의 능력에 속한다. 문헌[Sambrook et al., 또는 Current Protocols in Molecular Biology or Protein Science]을 참조한다. 당해 프라이머의 제조도 마찬가지이고 또한 공급업체(MetaBion, Martinsried, Germany]로부터 주 문될 수 있다. 바람직하게, 서열분석 및/또는 증폭을 위해 서열번호 9, 10, 11 또는 12에 따른 하나 이상의 프라이머를 사용한다(도 5 참조).

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따라, 대체된 아미노산의 존재는:

a. 염색체/게놈 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 제조하는 단계,

b. a)에 따른 샘플로부터 염색체 DNA를 분리하는 단계,

c. 이것을 캐리어에 고정화시키는 단계 및

d. 엄중 조건하에, 당해 하나 또는 2개의 아미노산을 대체시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 대체된 Kir6.2 서열에 야생형 Kir6.2 서열 보다 높은 친화성으로 결합할 수 있는 하나 이상의 프로브를 고정화된 DNA에 하이브리드화시키는 단계를 포함하거나 이들로 이루어진 방법에 의해 측정된다.

표지된 프로브를 사용하여 자가방사선 또는 형광 측정과 같은 표준 방법에 따라 하이브리드화가 가시화될 수 있다.

이어서, Kir6.2 단백질의 337번 위치 및/또는 23번 위치에서 아미노산을 대체시키는 게놈 Kir6.2 서열내에서 대체된 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재는 환자 샘플 기원의 하이브리드화 패턴 및/또는 강도를 야생형 게놈 DNA를 함유하는 대조군 샘플의 하이브리드화 패턴 및/또는 강도와 비교하여 동정될 수 있다.

분리된 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드는 상이한 엄중 조건에서 하이브리드화하기 위해 사용될 수 있다.

엄중 조건은 하이브리드화의 특이성 또는 2개의 일본쇄 핵산 분자의 어닐링에 영향을 주는 반응 조건을 의미한다. 엄중 조건 및 이에 따른 반응의 특이성은 특히, 반응을 위해 사용되는 온도 및 완충액 조건에 의존한다. 엄중 조건 및 이에 따른 특이성은 예를 들어, 반응 온도를 증가시키고/시키거나 반응 완충액의 이온 강도를 저하시킴에 의해 증가될 수 있다. 낮은 엄중 조건(및 이에 따른 낮은 반응 및 낮은 하이브리드화 특이성)은 예를 들어, 하이브리드화가 2 x SSC-용액에서 실온에서 수행되는 경우이다. 고 엄중 조건은 예를 들어, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS 용액에서의 하이브리드화 반응을 포함한다.

본 발명의 상이한 측면내에서 엄중 조건하의 하이브리드화는 바람직하게:

1) 50mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 0.5mg/ml의 변성된 연어 또는 연어 정자 DNA에서 밤새 표지된 프로브를 65℃에서 분석될 핵산 샘플과 하이브리드화시키거나, 올리뉴클레오타이드의 경우에 올리고뉴클레오타이드 및 샘플로 이루어진 이본쇄의 어닐링 또는 용융 온도(여기서, 어닐링 온도 및 용융 온도는 하기에서 동의어로서 이해된다) 보다 5℃ 낮은 온도에서 하이브리드화시키는 것,

2) 실온에서 2 x SSC에서 10분동안 세척하는 것,

3) 65℃(또는 올리고뉴클레오타이드의 경우: 어닐링 온도 보다 5℃ 낮은 온도)에서 30분동안 1 x SSC/0,1% SDS에서 세척하는 것 및

4)65℃(또는 올리고뉴클레오타이드의 경우: 어닐링 온도 보다 5℃ 낮은 온도)에서 30분동안 0.1 x SSC/0.1% SDS에서 세척하는 것으로 이해된다.

올리고뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드이고 바람직하게는 길이가 15 내지 30개, 바람직하게는 20개의 뉴클레오타이드인 DNA-단편이다. 어닐링 온도는 수 학식 Tm = 2 x (A + T의 수) + 4 x (G + C의 수)℃에 따라 측정한다.

2 x SSC 또는 0.1 x SSC(또는 임의의 기타 종류의 SSC 희석물)를 제조하기 위해, 예를 들어, 20 x SSC 용액을 희석한다. 20 x SSC는 3M NaCl/0.3M Na-시트레이트 x 2H₂O로 이루어진다.

하이브리드화 반응을 수행하기 전에, 폴리뉴클레오타이드는 경우에 따라 전기영동 분리를 수행한 후(이어서 서던 블롯(DNA) 또는 노던 블롯(RNA)) 또는 전기영동 분리 없이(이어서 슬롯 또는 도트 블롯) 예를 들어 나일론 또는 니트로셀룰로스 막과 같은 적합한 막으로 이동시킨다. 하이브리드화는 적합하게 표지된 프로브를 사용하여 수행한다. 적합한 표지화 기술은 예를 들어, 방사선활성 표지화 또는 형광 염료를 사용한 표지화이다. 당해 프로브는 천연적으로 일본쇄이거나 이본쇄이며 변성에 의해 일본쇄로 되는 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드이다. 이러한 프로브는 염기쌍 형성에 의해 DNA 또는 RNA 샘플(또한 일본쇄)과 결합한다.

예를 들어, DNA는 직접적으로 칩 매트릭스(예를 들어, 어피메트릭스 칩등) 또는 적합한 막(예를 들어, 니트로셀룰로스, 나일론 또는 도트 또는 슬롯 블롯을 위해 적합한 것들)상에 고정화될 수 있거나 겔 매트릭스로 이동되어 전기영동적으로 분리되거나 적합한 막(예를 들어, 니트로셀룰로스, 나일론 또는 서던 블롯을 위해 적합한 것들)에 블롯팅될 수 있다. 당해 방법 뿐만 아니라 적합한 칩 또는 막은 당업계에 널리 공지되어 있다. 칩 하이브리드화, 도트/슬롯 또는 서던 블롯팅과 같은 상기 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(참조를 위해 하기 목록된 문헌 을 참조한다).

적합한 프로브의 선별 및 디자인은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Sambrook et al., or Current Protocols in Molecular Biology). 당해 프로브의 제조방법도 마찬가지이고 또한 공급업체(MetaBion, Martinsried, Germany)로부터 시판된다. 예를 들어, Kir6.2 단백질의 23번 및/또는 337번 위치에서 하나의 아미노산을 대체시키는 하나 이상의 대체된 뉴클레오타이드를 함유하는 암호화 서열의 67/68/69번 및/또는 1009/1010/1011번에 상응하는 뉴클레오타이드 위치를 포함하는 게놈 Kir6.2 서열의 일부에 대해 높은 친화성을 갖는 임의의 프로브가 적합하다. 적합한 프로브는 예를 들어, 바람직하게 도 6에 따른 게놈 뉴클레오타이드 트리플렛을 포함한다.

대체된 아미노산의 존재는 또한 개체의 RNA를 분석함에 의해 측정될 수 있다. 적합한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, RT PCR 기술, 칩 하이브리드화 또는 노던 블롯팅을 포함한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따라, 대체된 아미노산의 존재는,

a. 개체의 RNA를 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계,

b. RNA가 직접적으로 분석되지 말아야하는 경우(예를 들어, 동일계 PCR을 수단으로), RNA을 a)에 따른 샘플로부터 분리되거나 적어도 부분적으로 정제하는 단계,

c. Kir6.2 cDNA 서열의 67번 및/또는 1009번 위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하는 RT-PCR 반응을 수단으로 폴 리뉴클레오타이드 단편을 증폭시키는 단계 및

d. c)에 따른 폴리뉴클레오타이드 단편의 서열을 분석하는 단계를 포함하거나 이들로 이루어진 방법에 의해 측정된다.

서열분석은 표준 과정에 따라 수행할 수 있다. 제조된 서열 래더(ladder)의 가시화는 예를 들어, 형광 또는 방사능으로 표지된 프라이머 또는 뉴클레오타이드를 사용함에 의해 수행될 수 있다.

이어서 Kir6.2 단백질의 337번 위치 및/또는 23번 위치에서 하나 이상의 아미노산을 대체시키는 Kir6.2 암호화 서열내에서 대체된 하나 이상의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재는 수득된 서열을 분석하고 이를 야생형 Kir6.2 서열과 비교함에 의해 측정될 수 있다.

적합한 프라이머의 선택 및 디자인은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Sambrook et al., or Current Protocols in Molecular Biology). 당해 프라이머의 제조방법도 마찬가지이고 또한 공급업체(MetaBion, Martinsried, Germany)로부터 시판된다. 예를 들어, 67 내지 69번 위치 및/또는 1009 내지 1011번 위치에 걸쳐있는 Kir6.2 암호화 서열의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭시킬 수 있는 임의의 프라이머 세트가 적합하다. 예를 들어, 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머가 바람직하다.

a. 개체의 RNA를 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계,

b. a)에 따른 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계,

c. RNA를 캐리어상에 고정화시키는 단계 및

d. 23번 위치에 글루탐산 및/또는 337번 위치에 발린을 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드를 암호화하는 Kir6.2 RNA에 대한 것 보다 높은 친화성으로 엄중조건하에 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드를 암호화하는 Kir6.2 RNA에 결합할 수 있는 하나 이상의 프로브를 고정화된 RNA에 하이브리드화시키는 단계를 포함하거나 이들로 이루어진 방법에 의해 측정된다.

하이브리드화는 표지된 프로브를 사용하는 자가방사선 또는 형광 이미지화와 같은 표준 과정에 따라 가시화될 수 있다.

이어서 Kir6.2 단백질의 337번 위치 및/또는 23번 위치에서 아미노산을 대체시키는 Kir6.2 암호화 서열에서 대체된 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재는 하이브리드화 패턴 및/또는 시그날 강도를 분석하고 이를 Kir6.2 야생형 RNA를 함유하는 대조군 샘플에 대한 것과 비교함에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, RNA는 하이브리드화전에 직접적으로 칩 매트릭스 또는 적합한 막상에 고정화될 수 있거나 겔 매트릭스에 첨가하여 겔 전기영동(노던 블롯팅)을 수행한 후 적합한 막으로 블롯팅될 수 있다. 하기 목록의 문헌을 참조한다.

적합한 프로브의 선별 및 디자인은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Sambrook et al., or Current Protocols in Molecular Biology). 당해 프로브의 제조방법도 마찬가지이고 또한 공급업체(MetaBion, Martinsried, Germany)로부터 시판된다. 예를 들어, Kir6.2 단백질의 23번 및/또는 337번 위치에서 하나의 아미 노산을 대체시키는 하나 이상의 대체된 뉴클레오타이드를 함유하는 암호화 서열의 67 내지 69번 및/또는 1009 내지 1011번 위치를 포함하는 Kir6.2 RNA 서열의 일부에 대해 높은 친화성을 갖는 임의의 프로브가 적합하다.

대체된 아미노산의 존재는 또한 개체의 프로테옴을 분석함에 의해 측정될 수 있다(즉, 개체내에서 발현되는 단백질). 적합한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 단백질, 세포 또는 조직 샘플 또는 웨스턴 블롯 분석법으로부터의 프로테옴 칩 분석, 면역조직학적 또는 면역화학적 기술을 포함한다. 참조를 위해 하기 목록의 문헌을 참조한다.

a. 개체 기원의 단백질을 함유하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계,

b. a)에 따른 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,

c. 이것을 캐리어상에 고정화시키는 단계,

d. 폴리펩타이드 쇄의 337번 위치에서 글루탐산 및/또는 337번 위치에서 발린을 함유하는 Kir6.2에 대한 것 보다 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 함유하는 Kir6.2에 대해 높은 친화성으로 결합할 수 있는 항체와의 결합 반응을 수행하는 단계(야생형 단백질로의 결합을 허용하지 않는 조건 또는 친화성이 훨씬 적은 조건하에) 및

e. 단백질로의 항체 결합을 가시화시키는 단계(예를 들어, 표지된 제1 항체 또는 표지된 제2 항체등을 수단으로)를 포함하거나 이들로 이루어진 방법에 의해 측정된다.

단백질은 예를 들어, 직접적으로 칩 매트릭스 또는 적합한 막 또는 ELISA 플레이트와 같은 또 다른 유형의 캐리어상에 고정화될 수 있다. 단백질은 또한 겔상에 첨가하여 겔 전기영동 후 캐리어(적합한 막과 같은)로 이동시키고 고정화될 수 있다(웨스턴 블롯).

a. 개체의 조직학적 샘플을 제공하는 단계,

b. 폴리펩타이드 쇄의 337번 위치에서 글루탐산 및/또는 337번 위치에서 발린을 함유하는 Kir6.2에 대한 것 보다, 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 함유하는 Kir6.2에 보다 높은 친화성으로 결합할 수 있는 항체를 사용하여 결합 반응을 수행하는 단계(야생형 Kir6.2 단백질로의 결합을 허용하지 않는 조건 또는 친화성이 훨씬 적은 조건하에),

c. 단백질로의 항체 결합을 가시화시키는 단계(예를 들어, 표지된 제1 항체 또는 표지된 제2 항체등을 수단으로)를 포함하거나 이들로 이루어진 방법에 의해 측정된다.

이어서, 돌연변이의 존재 또는 부재는 표지된 조직학적 샘플을 분석하고 시그날의 강도를 대조군 샘플(예를 들어, 모의 제1 항체 또는 항혈청으로 처리된 동일 환자 기원의 샘플(즉, 제1 항체 또는 항혈청은 돌연변이를 함유하는 Kir6.2에 대해 반응성이 아니거나 특이적 제1 항체 또는 항혈청 보다 적게 돌연변이를 함유하는 Kir6.2와 반응한다) 또는 야생형 Kir6.2 단백질에 대해 특이적인 제1 항체 및 /또는 야생형 Kir6.2 단백질만을 함유하는 것으로 공지된 대조군 샘플)의 것과 비교하여 측정될 수 있다.

결합 검출은 바람직하게 면역조직화학적 또는 면역방사선학적 방법에 의해 수행된다.

당해 방법의 바람직한 양태에 따라, 23번 위치에서 아미노산은 Glu(야생형)로부터 Lys로 대체된다. 또한 337번 위치의 아미노산이 Val(야생형)로부터 Ile로 대체되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상이한 측면과 관련하여, 관상 심장 질환은 바람직하게 관상 동맥 질환이고 협심증인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 상이한 측면의 추가 바람직한 양태에 따라, Kir6.2-23-KK(Kir6.2 유전자의 2개의 대립형질유전자상에 뉴클레오타이드 다형성의 결과로서 23번 위치에 라이신(K)을 갖는 Kir6.2 단백질 변이체) 및/또는 Kir6.2-337-II(Kir6.2 유전자의 2개의 대립형질유전자상의 뉴클레오타이드 다형성의 결과로서 단백질의 337번 위치에 이소류신(I)를 갖는 Kir6.2 단백질 변이체)의 존재는 샘플내에서 측정된다.

샘플은 각각의 다형성 Kir6.2를 함유하는 임의의 샘플일 수 있다. 각각의 다형성에 대한 용이한 시험을 허용하는 방식으로 샘플이 제조되는 경우가 유리하다. 적합한 예는 적용된 검출 방법에 의존하고 예를 들어, 조직학적 샘플, 세포 또는 조직 추출물 또는 바람직하게 인체로부터 분리된 세포이다. 각각의 다형성을 동정하기 위해 적합한 기술(예를 들어, PCR, 핵산 또는 단백질 기반의 정렬 기술, 적합한 항체를 사용하는 면역조직학적 또는 면역화학적 기술)은 당업자에게 공지되 어 있다. 적합한 프라이머 세트 및 항체 또는 항혈청의 선별 및 생산도 마찬가지이다. 당해 기술과 관련하여 예를 들어, 하기 목록의 문헌을 참조한다.

본 발명의 또 다른 측면은 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산의 존재, Kir6.2-23-KK 또는 Kir6.2-337-II의 존재를 시험하기 위한 시험 키트에 관한 것이고, 이때, 키트는 단백질내에서 당해 존재를 검출하기 위한 수단 하나 이상을 함유한다. 본원에서, 구성 부분들의 키트(짧은 형태의 키트)는 기능성 유니트에 배합되고 공간적으로 공존하는 본원에서 동정된 성분들의 배합물일 수 있고 추가의 성분을 함유할 수 있다.

예를 들어, 당해 수단은 23번 위치에서 글루탐산 및/또는 337번 위치에서 발린을 함유하는 Kir6.2와 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 함유하는 Kir6.2 단백질에 대한 결합 특성이 상이한 항체일 수 있다. 특이적 항체의 제조는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 참조를 위해 하기 목록의 문헌을 참조한다. 더욱이, 키트가 표지된 제2 항체를 함유하는 경우 바람직하다. 키트는 추가로 결합 및/또는 표지화 반응등을 수행하기 위해 적합한 시약, 완충제등을 함유할 수 있다. 또한 사용 지침서(예를 들어, 바람직한 반응 조건, 완충제 조성등을 기재하는 매뉴얼 또는 쉬트)가 포함된 경우가 적합할 수 있다.

바람직한 실시예에 따라, 당해 수단은 야생형 Kir6.2와 23번 위치 및/또는 337번 위치에서 대체된 아미노산을 함유하는 Kir6.2에 대한 결합 특성이 상이한 항 체(즉, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항혈청 또는 재조합 항체)이다. 당해 항체는 예를 들어, 23번 위치 및/또는 337번 위치에서 야생형인 Kir6.2 단백질과 고친화성으로 결합할 수 있거나 23번 및/또는 337번 위치에서 덜한 빈도의 변이체 하나 이상에 고친화성으로 결합할 수 있다. 또한, 시험 키트내에 한 세트의 항체가 포함되는 경우가 유리한데, 이때, 각각의 항체는 다형성인 것들중 하나를 특이적으로 검출할 수 있다. 현실적으로, 야생형 단백질만을 인지하는 대조군 항체(능히, 또한 배경 시그날을 측정하기 위한 모의 항체 또는 항혈청)가 또한 포함되고 선택된 검출 기술을 수행하는데 유용하거나 필요한 시약이 또한 포함될 수 있다. 적합한 항체로의 접근법 및 제조 방법 및 시험 키트를 어셈블리하는데 유용하거나 필요한 시약의 선택은 당업계에 널리 공지되어 있다. 더욱이. 목적하는 결합 특성을 갖는 항체의 제조는 상이한 공급업체(Bio Trend, Cologne, Germany)에 의해 수행된다.

본 발명의 또 다른 측면은 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드 서열을 유도하는, Kir6.2 유전자중 하나의 대립형질유전자 또는 2개의 대립형질 유전자상에 Kir6.2 뉴클레오타이드 서열의 변이체 존재 유무를 시험하기 위한 시험 키트에 관한 것이고, 여기서, 당해 키트는 뉴클레오타이드 서열내 당해 변이체를 검출하기 위한 하나 이상의 수단을 함유한다.

또 다른 수단은 예를 들어, 야생형 Kir6.2의 DNA 또는 RNA의 특이적 증폭만을 위해 적합한 서열분석 프라이머 또는 프라이머 세트 및/또는 23번 위치 및/또는 337번 위치에 돌연변이를 함유하는 Kir6.2의 DNA 또는 RNA의 증폭만을 위한 프라이 머 세트이다. 특정 서열의 특이적 서열 분석 또는 증폭에 대해 사용될 수 있는 적합한 프라이머의 선별 및 접근법은 당업자의 능력이다(예를 들어, 실시예 2에 따른 프라이머 및 조건 참조). 폴리머라제, 완충제, 뉴클레오타이드등과 같은 서열분석 반응 또는 증폭을 수행하기 위해 유용하고 필요한 시약은 또한 시험 키트에 포함될 수 있다(예를 들어, 실시예 2에 따른 프라이머 및 조건 참조). 상이한 Kir6.2 다형성에 대해 특이적인 상이한 서열분석 프라이머 또는 PCR 프라이머 세트의 어셈블리를 함유하여 Kir6.2내 다양한 종류의 다형성 존재를 측정할 수 있는 키트가 매우 유리하다.

또 다른 바람직한 양태에 따라, 당해 수단은 야생형 Kir6.2 및/또는 23번 위치 및/또는 337번 위치에서 돌연변이를 함유하는 Kir6.2를 인지하는 핵산 프로브이다. 선택된 검출 기술을 수행하는데 유용한 프로브의 접근법 및 선택(예를 들어, 모든 종류의 핵산 블롯트, 어레이 기술 또는 다른 종류의 칩 기술)은 또한 당업자의 기술 범위내에 있다. 또한 시험 키트에 포함될 수 있는 적합한 시약의 선택도 마찬가지이다. 바람직하게, 상이한 다형성을 인지하는 상이한 프로브의 한 세트가 시험 키트내에 포함된다.

23번 위치의 아미노산은 바람직하게 Lys이고 337번 위치의 아미노산은 Ile이다.

Kir6.2의 뉴클레오타이드 서열이 암호화 서열의 67번 위치에서 G를 함유하는 경우가 바람직하다. 또한 Kir6.2의 뉴클레오타이드 서열이 암호화 서열의 1009 위치에서 A를 함유하는 경우가 바람직하다.

바람직한 양태에 따라, 시험 키트는 Kir6.2 암호화 서열의 67 및/또는 1009번 위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 포함한다. 바람직한 프라이머는 예를 들어, 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머이다.

또 다른 바람직한 양태에 따라, 시험 키트는 서열번호 13에 따른 게놈 Kir6.2 서열의 5657106/7/8번 위치 및/또는 5657978/79/80번의 위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함한다. 바람직한 프라이머는 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머이다.

또 다른 바람직한 양태에 따라, 시험 키트는 엄중 조건하에서 23번 위치에 글루탐산 이외의 다른 아미노산 및/또는 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 Kir6.2 게놈 DNA 또는 RNA를 특이적으로 인지하는 하나 이상의 핵산 프로브를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 폴리펩타이드 서열의 23번 위치에서 라이신을 갖고 337번 위치에서 이소류신을 갖는 분리된 Kir6.2 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 서열번호 7에 따른 분리된 Kir6.2 폴리펩타이드 또는 23번 및/또는 337번에 아미노산을 포함하는 이의 단편에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 K23/I337-Kir6.2 폴리펩타이드 또는 23번 및 337번 위치를 포함하는 이의 단편중 하나를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 서열번호 8에 따른 분리된 Kir6.2 폴리 뉴클레오타이드 또는 67번 및 1009번 위치(바람직하게는 또한 68번, 69번, 1010번 및 1011번 위치)의 뉴클레오타이드를 포함하는 이의 단편, 또는 고엄중 조건하에 당해 DNA 서열 또는 이의 상보적인 쇄에 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 분리된 Kir6.2 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드 서열의 23번 위치에 글루탐산 및 337번 위치에 이소류신을 갖는 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 서열번호 5에 따른 분리된 Kir6.2 폴리펩타이드 또는 23번 위치 및/또는 337번 위치의 아미노산을 포함하는 이의 단편에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 E23/I337-Kir6.2 폴리펩타이드중 하나를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 23번 위치 및 337번 위치를 포함하는 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 서열번호 6에 따른 분리된 Kir6.2 폴리뉴클레오타이드 또는 67번 위치 및 1009번 위치(바람직하게 또한 68번, 69번, 1010번 및 1011번의 위치)의 뉴클레오타이드를 포함하는 이의 단편, 또는 고엄중 조건하에 당해 DNA 서열과 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 쇄에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 Kir6.2 암호화 서열의 67번 위치 및/또는 1009번 위치를 포함하거나 게놈 Kir6.2 서열의 5657106/07/08번 위치 및/또는 5657978/79/80번 위치를 포함하는 Kir6.2 서열의 17개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 19 내지 100개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 Kir6.2 유전자 또는 RNA내에서 변이된 뉴클레오타이드를 검출하기 위한 프로브에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 Kir6.2 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 프라이머 또는 프라이머 세트에 관한 것이고, 이때, 증폭된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 암호화 Kir6.2 서열의 67번 및/또는 1009번 위치 및/또는 게놈 Kir6.2 서열의 5657106/07/08번 위치 및/또는 5657978/79/80번을 포함한다.

하기에서, 본 발명은 여러 실시예를 수단으로 보다 상세하게 설명되지만 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

Kir6.2 단백질의 23번 및 337번 위치에서 Kir6.2 다형성(야생형 단백질 서열의 NCBI 승인 번호: D 50582(서열번호 1: 도 1A); 암호화 서열에 대한 NCBI 승인 번호: D 05852(서열번호 2; 도 1B)은 I형 및 II형 당뇨병(거의 II형의 진성 당뇨병)을 앓는 환자 집단에서 분석하였다.

실시예 1: 연구 과제(연구 집단)

335명 환자의 게놈 DNA는 단백질 변이체 Kir6.2-E23K 및 Kir6.2-V337I를 유도하는 Kir6.2 유전자내의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성)에 대해 스크리닝하였다. 포함 기준은 다음과 같다: 독일 조상의 코카서스인 개체, 안정적인 임상 조건 및 심혈관 조형술. 배제 기준은 다음과 같다: ACS 이외의 급성 질환, 만성 비-심장 질환(즉, 류마티스 관절염) 및 이전 5년 이내에 악성 질환의 병력을 가진자. 당해 환자 집단의 기본 특징은 표 2에 명시되어 있다. 모든 환자는 서식 통지된 동의서에 서명하였다.

실시예 2: 서열분석 및 분석에 의한 SNP 검출

2.1: 목적하는 다형성을 갖는 게놈 영역의 증폭

증폭 프라이머:

A: 승인번호 NT_009307의 Kir6.2 유전자 서열의 5657978/79/80번 위치에서 대체된 뉴클레오타이드의 검출용.

정배향 프라이머 M67: 5'-AGGTGGAGGTAAGGAAGAG-3'(서열번호 9)

역배향 프라이머 M67: 5'-GGTGAAGATGAGCAATGTG-3'(서열번호 10)

B: 승인번호 NT_009307의 Kir6.2 유전자 서열의 5657106/07/08번의 위치에서 대체된 뉴클레오타이드 검출용.

정배향 프라이머 M1009: 5'-GGGTGGCAACAGCATCTTC-3'(서열번호 11)

역배향 프라이머 M1009: 5'-TGGCTCAGGACAGGGAATC-3'(서열번호 12)

프라이머는 또한 Kir6.2 암호화 서열의 증폭용으로 사용될 수 있다.

증폭을 위한 PCR 프로토콜:

모든 시약은 제조원(Applied Biosystems)(Foster City, USA)으로 부터 구입하였다: 20ng의 게놈 DNA; 1유니트의 TaqGold 폴리머라제; 1 x Taq 폴리머라제 완충액; 500μM의 dNTP; 2.5mM의 MgCl₂; 200nM의 각 증폭 프라이머 쌍(서열에 대해 증폭 프라이머쌍 1.A 및 1.B 참조); H₂O 적정 5㎕.

PCR/유전자형 검사를 위한 증폭 프로그램:

95℃ x 10분 x 1 사이클

95℃ x 30초

70℃ x 30초 x 2 사이클;

95℃ x 30초

65℃ x 30초 x 2 사이클;

95℃ x 30초

60℃ x 30초 x 2 사이클;

95℃ x 30초

56℃ x 30초

72℃ x 30초 x 40 사이클

72℃ x 10분

4℃ x 30초 x 1 사이클;

2.2: 목적하는 다형성의 동정

다형성의 소형서열분석 및 검출을 위한 프로토콜

모든 시약은 제조원(Applied Biosystems(Foster City, USA))로부터 구입하였다. 2㎕의 정제된 PCR 생성물; 1.5㎕의 BigDye 종결인자 키트; 200nM의 하나의 서열분석 프라이머(서열에 대해 정배향 또는 역배향 증폭 프라이머 1.A 및 1.B 참조); H₂O 적정 10㎕.

서열분석을 위한 증폭 프로그램:

96℃ x 2분 x 1 사이클;

96℃ x 10초

55℃ x 10초

65℃ x 4분 x 30사이클;

72℃ x 7분

4℃ x 30초 x 1 사이클;

생성물의 서열분석:

먼저 미가공 데이타 추출용 서열분석 소프트웨어를 사용하여 서열 분석하고 Phred(베이스 칼러(caller)), Phrap(어셈블러), Polyphred(SNP 칼러) 및 Consed(결과 뷰어)로 처리하였다. Phred, Phrap, Polyphred 및 Consed는 기관(WashU by Phil Green(http://www.genome.washington.edu)에서 디자인된 소프트웨어이다. PCR 반응으로 암호화 서열의 67번 위치에서 G가 A로 대체되고 1009번 위치에서 A가 G로 대체된 것을 동정하였다.

2.3: Kir6.2 단백질에서 아미노산 대체와 관상 심장 질환과의 관련성

심혈관 및 대사 장애를 앓는 환자의 임상 결과에 대한 Kir6.2 다형성의 영향을 분석하기 위해, 발명자는 I형 또는 II형 당뇨병을 앓는 335명 개체의 환자 집단에서 Kir6.2 다형성 E23K, L270V 및 I337V의 관련성 분석을 수행하였다. 350개 이상의 임상 계수중에 협심증은 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 라이신(K) 및/또는 337번 위치에서 발린(V)에 대해 동형접합성인 환자와 상당한 관련이 있었다.

Kir6.2-23-EE(23번 위치에서의 야생형)은 일군의 개체를 한정하고 여기서, Kir6.2 대립형질유전자 둘다는 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산(Glu 또는 E)을 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하고 있고 당해 그룹은 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 당해 Kir6.2 다형성에 대해 동형접합성이다.

Kir6.2-23-EK는 일군의 개체를 한정하고 여기서, Kir6.2 대립형질유전자중 하나는 Kir6.2의 23번 위치에서 글루탐산(Glu 또는 E)를 유도하는 Kir6.2 유전자를 암호화하고 있고 다른 Kir6.2 대립형질유전자는 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 라이신(Lys 또는 K)을 유도하는 Kir6.2 단백질을 암호화하고 있으며 당해 그룹은 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 당해 Kir6.2 다형성에 대해 이종접합성이다.

Kir6.2-KK는 일군의 개체를 한정하고, 여기서, Kir6.2 대립형질유전자 둘다는 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 라이신(Lys 또는 K)를 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하고 있고 당해 그룹은 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 당해 Kir6.2 다형성에 대해 동형접합성이다. Kir6.2-23-KK는 또한 Kir6.2 대립형질유전자 둘다는 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 라이신(Lys 또는 K)을 유도하는 Kir6.2 다형성에 대해 동형접합성이다. Kir6.2-23-KK는 또한 Kir6.2 대립형질유전자 둘다가 Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 라이신(Lys 또는 K)를 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하고 있는 환자의 생물학적 샘플을 한정한다.

Kir6.2-337-II는 일군의 개체를 한정하고, 여기서, Kir6.2 대립형질유전자 둘다는 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 이소류신(Ile 또는 I)을 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하고 있고 당해 그룹은 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 Kir6.2 다형성에 대해 동형접합성이다. Kir6.2-337-II는 또한 Kir6.2 대립형질유전자 둘다가 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 이소류신(Ile 또는 I)을 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하는 환자의 생물학적 샘플을 한정한다.

Kir6.2-337-IV는 일군의 개체를 한정하고, 여기서, Kir6.2 대립형질유전자중 하나는 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 이소류신(Ile 또는 I)을 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하고 있고 다른 Kir6.2 대립형질유전자는 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 발린(Val 또는 V)을 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하며, 당해 그룹은 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 당해 Kir6.2 다형성에 대해 이종접합성이다.

Kir6.2-337-VV(337번 위치에 대해 야생형)은 일군의 개체를 한정하고, 여기서, Kir6.2 대립형질유전자 둘다는 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 발린(Val 또는 V)를 유도하는 Kir6.2 유전자 변이체를 암호화하고 당해 그룹은 Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 당해 Kir6.2 다형성에 대해 동형접합성이다.

유전자형 검사/표현형 검사 관련성에 대한 통계학적 방법

SAS 통계학적 팩키지(버젼 6.12, SAS Institute GmbH, Heidelberg/Germany)를 사용하여 모든 분석을 수행하였다. 유전자 다형성과 다수의 임상적 관련 계수간의 연관성 검출을 위해, 기술통계를 산출하였고(메디안, 4분위수) 윌콕슨-등급-합계-시험(Wilcoxon-rank-sum-test)을 수행하였다. 윌콕슨-등급-합계-시험은 2개의 독립된 샘플을 비교하기 위해 사용한다. 시험 통계의 계산은 모은 샘플에서 등급을 기준으로 한다. SNP와 위험성 인자 및 질환관의 연관성 연구는 유사한 방법으로 수행하였다. 카이-제곱-시험(Chi-Square-Test)은 2개의 변수의 의존성을 계산하기 위한 통계학적 시험이다. 변수값은 2개 이상의 부류에 포함된다. 당해 변수의 연관성을 분석하기 위해, 분할표를 사용한다. 당해 표는 제1 변수의 실제 수만큼 많은 가로행과 제2 변수의 실제 수 많은 세로행을 포함한다. 세포마다 특정 환자의 특성을 함유하고 있다. 시험 통계를 작성하기 위해, 계산된 빈도수 및 관찰된 빈도수의 차이를 산출한다. 당해 결과를 조사한 후, 관련 변수를 선택하였다. 혼동 보조 변수를 고려하기 위해, 로지스틱 회귀분석을 사용하여 결과를 입증한다. 로지스틱 회귀분석법을 사용하여 특정 반응 변수에 대한 여러 실제 변수의 영향을 분석한다. 연관된 통계학적 시험은 p-값을 제공한다. 당해 p값은 연관된 실제 변수의 영향이 상당한 것으로 해석된다.

이진 변수에 대해, 교차비를 계산하였다. 교차비는 특정 반응이 다른 그룹에서 일어날 가능성에 대한 하나의 그룹에서 발생할 가능성에 대한 비이다.

실시예 3: 분석

335명 개체중에 Kir6.2 변이체인 E23K와 V337I의 분포는 표 2에 나타낸다. 표 3 내지 표 4에 명시된 바와 같이, Kir6.2-23-KK와 Kir6.2-337-II, 및 Kir6.2-23-EK와 Kir6.2-337-VI의 강한 연계성이 나타날 수 있다. 따라서, 예를 들어, Kir6.2-23-KK에 대해 수득된 모든 통계학적 분석 테이타는 Kir6.2-337-II의 데이타와 유사해야만 한다.

Kir6.2-23-KK 및 Kir6.2-337-II를 갖는 당뇨병 환자는 협심증과의 연관성이 증가되었음을 보여준다. 당뇨병 환자에서 협심증과 Kir6.2-23-KK 유전자형의 연관성에 대해 카이-제곱 시험으로 계산된 통계학적 유의성은 0.015의 p값이고 당뇨병 환자에서 협심증과 Kir6.2-337-II 유전자형의 연관성에 대해서는 0.012의 p값이다(도 2A 및 도 3A).

심근 경색 및 고혈압과 같은 혼동 인자의 영향을 분석하기 위한 로지스틱 회귀분석법에서 당뇨병 환자에서 협심증과 Kir6.2-23-KK 유전자형의 연관성에 대해 p값이 0.0088이고 당뇨병에서 협심증과 Kir6.2-337-II 유전자형의 연관성에 대해 p값이 0.0072이다(도 2B 및 도 3B).

Kir6.2-23-KK 유전자형을 갖는 당뇨병 환자에서 협심증에 대한 증가된 위험성의 교차비는 1.601이고 Kir6.2-337-II 유전자형에서는 1.615이다(도 2C 및 도 3C).

여기에서 나타낸 데이타는 23번 위치에서 글루타민을 라이신으로 대체시키는 Kir6.2 유전자내 돌연변이(특히, Kir6.2-23-KK) 및 337번 위치에서 발린을 이소류 신으로 대체시키는 Kir6.2 유전자내 돌연변이(특히, Kir6.2-337-II)는 당뇨병 환자에서 협심증에 대한 위험 마커를 나타낸다. 협심증은 관상 심장 질환에 대한 징후이기때문에, 이들 마커는 일반적으로 관상 심장 질환을 지적하는 것으로 예상될 수 있다. 더욱이, Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 아미노산을 대체시키는 Kir6.2 유전자의 다른 돌연변이(특히, 산성 글루타민이 비극성 또는 바람직하게는 염기성 아미노산으로 대체된 것들)는 동일하거나 유사한 효과를 갖는다고 예상될 수 있다. 발린이 다른 아미노산, 특히 산성 또는 염기성 또는 보다 큰 용적의 지방족 아미노산으로 대체되는 337번 위치에서의 아미노산 대체에 대해서도 동일한 결과를 예측할 수 있다. 당해 아미노산 대체는 또한 비-당뇨 환자에서 관상 심장 질환, 특히, 협심증의 발병과 매우 밀접한 관련이 있을 가능성이 높다.

참조문헌:

도 1:

폴리펩타이드 쇄의 23번 위치(글루탐산) 및 337번 위치(발린)(암호화 서열의 67/68/69번 위치에서의 코돈 GAG 및 1009/1010/1011번 위치에서의 코돈 GTC에 상응함)에서 가장 빈번한 변이체를 함유하는 Kir6.2(KCNJ11)의 단백질 서열 및 암호화 뉴클레오타이드 서열. 이들 변이체는 Kir6.2-23K-337V(또는 2개의 대립형질유전자가 23번 및 337번 위치에서 유사한 경우 KK 및/또는 VV)로서 언급된다. 당해 Kir6.2 변이체의 단백질 승인 번호(NCBI 단백질 데이타베이스)는 D50582이다. 암호화 서열내에 ATG 뿐만 아니라, 폴리펩타이드 서열의 23번 및 337번 위치 및 이에 상응하는 뉴클레오타이드 위치가 밑줄쳐져 있다.

도 2:

23번 위치에서 변이체 라이신 및 337번 위치에서 가장 빈번한 변이체인 발린(암호화 서열의 67/68/69번 위치에서의 코돈 AAG 및 1009/1010/1011번 위치에서의 코돈 GTC에 상응함)을 함유하는 Kir6.2(KCNJ11)의 단백질 서열 및 암호화 뉴클 레오타이드 서열. 당해 Kir6.2 변이체의 단백질 서열 승인 번호(NCBI 단백질 데이타베이스)는 XP_006398(도 2A; 서열번호 2)이다. 뉴클레오타이드 서열에 대한 승인 번호(NCBI 뉴클레오타이드 데이타베이스)는 XM_006398(도 2B; 서열번호 4)이다. 폴리펩타이드 서열의 23번 위치 및 337번 위치 및 암호화 서열내 상응하는 뉴클레오타이드 위치는 밑줄쳐져 있다.

도 3:

23번 위치에서 가장 빈번한 변이체 글루탐산 및 337번 위치(암호화 서열의 67/68/69번 위치에서의 코돈 GAG 및 1009/1010/1011번 위치에서의 코돈 ATC에 상응함)에서 변이체 이소류신을 함유하는 Kir6.2(KCNJ11)의 단백질 서열 및 암호화 뉴클레오타이드 서열. 단백질 서열은 발린 대신 이소류신을 갖는 337번 위치를 제외하고는 서열 승인 번호 D50582에 따른 "야생형" Kir6.2의 서열에 상응한다. 암호화 서열은 구아노신 대신 아데노신을 갖는 1009번 위치를 제외하고는 서열 승인 번호 D50582에 따른 "야생형" Kir6.2의 서열에 상응한다. 폴리펩타이드 서열의 23번 및 337번 위치 및 암호화 서열내 상응하는 뉴클레오타이드 위치는 밑줄쳐져 있다.

도 4:

23번 위치에서 변이체 라이신 및 337번 위치(암호화 서열의 67/68/69번 위치에서의 코돈 AAG 및 1009/1010/1011번 위치에서의 코돈 ATC에 상응함)에서 변이체 이소류신을 함유하는 단백질 서열 및 암호화 뉴클레오타이드 서열. 단백질 서열은 글루탐산 대신에 라이신을 갖는 23번 위치 및 발린 대신 이소류신을 갖는 337번 위치를 제외하고는 서열 승인 번호 D50582에 따른 "야생형" Kir6.2의 서열에 상응한 다. 암호화 서열은 구아노신 대신에 아데노신을 갖는 67번 위치 및 구아노신 대신에 아데노신을 갖는 1009번 위치를 제외하고는 "야생형" Kir6.2의 서열에 상응한다. 폴리펩타이드 서열의 23번 위치 및 337번 위치 및 암호화 서열내 상응하는 뉴클레오타이드 위치는 밑줄쳐져 있다.

도 5:

Kir 6.2 암호화 서열의 67/68/69번 위치에 상응하는 Kir6.2 게놈 서열의 위치에서 대체된 뉴클레오타이드를 검출하기 위한 DNA 프라이머 M67 정배향(서열번호 9) 및 역배향(서열번호 10) 및 서열 승인 번호에 따른 Kir6.2 암호화 서열의 1009/1010/1011번 위치에 상응하는 Kir6.2 게놈 서열의 위치에서 대체된 뉴클레오타이드를 검출하기 위한 DNA 프라이머 M1009 정배향(서열번호 11) 및 역배향(서열번호 12). 서열번호 25에서 위치는 각각 5657106/107/108번 및 5657978/79/80번이다.

프라이머 세트는 또한 NCBI 서열 승인 번호 D50582에 따른 Kir6.2 cDNA의 특이적 증폭을 위해 적용가능하다. 프라이머 M67 정배향(서열번호 9) 및 역배향(서열번호 10)은 RNA 수준에서 Kir6.2 유전자내에서 대체된 뉴클레오타이드를 검출하기 위해, Kir6.2 cDNA의 뉴클레오타이드 67/68/69번을 포함하는 영역을 증폭시킨다. 프라이머 M1009 정배향(서열번호 11) 및 역배향(서열번호 12)은 RNA 수준에서 Kir6.2 유전자내에서 대체된 뉴클레오타이드를 검출하기 위해, Kir6.2 cDNA의 뉴클레오타이드 1009/1010/1011번을 포함하는 영역을 증폭시킨다.

도 6:

몇몇 Kir6.2 변이체의 게놈 및 암호화 서열의 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 대한 고찰. 게놈 서열내 위치 번호는 NCBI 승인 번호 NT_009307하에 호모 사피엔스 염색체 11 게놈 콘티그로부터 유래된 것이다(또한 Kir6.2 게놈 좌를 포함하는 콘티그의 일부에 대해 도 10을 참조한다).

도 7:

폴리펩타이드 쇄의 23번 위치에서 글루탐산으로부터 라이신으로의 아미노산 대체 및 337번 위치에서 발린으로부터 이소류신으로의 아미노산 대체를 유도하는 Kir6.2 뉴클레오타이드 서열의 변이. 당해 위치는 서열번호 25(이것은 단백질 서열의 337번 위치에서 발린을 암호화하고 있음)에 상응하는 게놈 Kir6.2 서열의 5657106/7/8번 및 5657978/79/80번의 위치와 관련이 있다. 가장 빈번하게 나타나는 변이체(즉, 야생형)은 표준 문자로 기재하고 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서 당해 야생형으로부터 이탈된 것은 굵은 문자로 나타낸다. 23번 아미노산에 대해, 단일 뉴클레오타이드의 대체 G67A가 라이신이 당해 폴리펩타이드 쇄에 삽입되도록 하는 반면 G69A 대체만으로는 아미노산 서열이 변화되지 않는다. 당해 유형의 돌연변이는 일반적으로 사일런트 돌연변이로서 언급된다. 한편, 상기 2개의 뉴클레오타이드가 함께 대체되는 경우, 라이신은 또한 23번 위치에 삽입된다. 아미노산 쇄의 337번 위치에 대해, 단일 뉴클레오타이드 대체 C1011T, C1011A 및 C1011G는 사일런트인 반면, 단일 뉴클레오타이드 대체 G1009A는 C1011T 또는 C1011A가 G1009A와 함께 대체되는 경우에도 폴리펩타이드 쇄의 337번 위치에 이소류신을 삽입시킨다. 67/68/69번 및/또는 1009/1010/1011번 위치에서 대체되어 23 번 위치에서 G 또는 K외에 또는 337번 위치에서 V 또는 I외에 다른 아미노산을 각각 삽입시킬 수 있다(유전자 코드로부터 비롯되는 이들 관련성은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다).

도 8:

5657106/107/108번 위치에서 뉴클레오타이드 GAC(암호화 서열의 1009/1010/1011번 위치에서 코돈 GTC에 상응하고 따라서 폴리펩타이드 서열의 337번 위치에서 아미노산 발린을 함유하는 단백질 변이체를 암호화함)를 함유하고 5657978/79/80번 위치에서 뉴클레오타이드 CTT(암호화 서열의 67/68/69번 위치에서 코돈 AAG에 상응하고 따라서 펩타이드 서열의 23번 위치에서 아미노산 라이신을 함유하는 단백질 변이체를 암호화함)를 함유하는 Kir6.2(KCNJ11)의 게놈 서열. 지적된 뉴클레오타이드 트리플렛은 굵은 활자를 갖고 밑줄쳐져 있다. 서열번호 9 내지 12에 따른 PCR 프라이머의 하이브리드화 위치는 또한 굵은 활자를 갖고 밑줄쳐져 있다. 당해 Kir6.2 게놈 변이체를 포함하는 호모 사피엔스 염색체 11 게놈 연속 서열로서 공개적으로 유용한 서열 승인 번호(NCBI 뉴클레오타이드 데이타베이스)는 NT_009307(서열번호 25)이다.

표 해설:

표 1:

모든 분석이 수행될 환자 집단의 기본적인 특징

표 2:

분석된 당뇨병 환자 집단에서 Kir6.2 변이체의 분포

표 3:

카이-제곱 시험에 의해 계산된, 당뇨병 환자에서 단백질의 23번 위치에서의 Kir6.2 변이체와 협심증과의 연관성. 협심증 양성 그룹에서 Kir6.2-23-KK의 빈도수가 증가된 보유자가 관찰될 수 있다.

표 4:

로지스틱 회귀분석법에 의한 당뇨병 환자에서 협심증과 Kir6.2-23-KK 연관성에 대한 통계학적 유의성의 계산.

표 5:

Kir6.2-23-EK 및 Kir6.2-23-EE 보유자와 비교하여 Kir6.2-23-KK 보유자가 협심증을 가질 당뇨병 환자의 위험성에 대한 교차비의 계산

표 6:

카이-제곱 시험에 의해 계산된, 당뇨병 환자에서 협심증과 단백질 337번 위치에서의 Kir6.2 변이체와의 연관성. 협심증 양성 그룹에서 빈도수가 증가된 Kir6.2-337-II 보유자가 관찰될 수 있다.

표 7:

로지스틱 회귀분석법에 의한 당뇨병 환자에서 협심증과 Kir6.2-337-II의 연관성에 대한 통계학적 유의성의 계산.

표 8:

Kir6.2-337-VI 및 Kir6.2-337-VV 보유자와 비교하여 Kir6.2-337-II 보유자가 협심증을 가질 당뇨병 환자의 위험성에 대한 교차비의 계산.

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160 Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg 165 170 175 Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg 180 185 190 His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser 195 200 205 Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr 210 215 220 Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met 225 230 235 240 Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile 245 250 255 Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro 260 265 270 Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu 275 280 285 Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr 290 295 300 Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala 305 310 315 320 Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr 325 330 335 Val Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp 340 345 350 His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu 355 360 365 Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile 370 375 380 Ser Pro Asp Ser Leu Ser 385 390 <210> 2 <211> 1173 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60 cctgccgagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120 aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180 accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240 tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300 gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360 ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420 gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480 gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540 ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600 cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660 cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 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Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala 85 90 95 His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr 100 105 110 Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln 115 120 125 Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu 130 135 140 Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn 145 150 155 160 Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg 165 170 175 Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg 180 185 190 His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser 195 200 205 Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr 210 215 220 Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met 225 230 235 240 Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile 245 250 255 Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro 260 265 270 Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu 275 280 285 Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr 290 295 300 Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala 305 310 315 320 Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr 325 330 335 Val Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp 340 345 350 His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu 355 360 365 Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile 370 375 380 Ser Pro Asp Ser Leu Ser 385 390 <210> 4 <211> 1173 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60 cctgccaagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120 aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180 accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240 tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300 gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360 ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420 gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480 gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540 ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600 cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660 cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720 gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780 attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840 ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900 cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960 gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccgt caaagtgccc 1020 acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080 ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140 aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173 <210> 5 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg 1 5 10 15 Leu Ala Glu Asp Pro Ala Glu Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn 35 40 45 Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val 50 55 60 Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu 65 70 75 80 Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala 85 90 95 His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr 100 105 110 Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln 115 120 125 Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu 130 135 140 Ala Ile Leu Ser Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn 145 150 155 160 Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg 165 170 175 Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg 180 185 190 His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser 195 200 205 Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr 210 215 220 Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met 225 230 235 240 Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile 245 250 255 Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro 260 265 270 Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu 275 280 285 Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr 290 295 300 Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala 305 310 315 320 Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr 325 330 335 Ile Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp 340 345 350 His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu 355 360 365 Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile 370 375 380 Ser Pro Asp Ser Leu Ser 385 390 <210> 6 <211> 1635 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ctgaggctgg tattaagaag tgaagtggga cccaggtgga ggtaaggaag agtctggtgg 60 ggagttatct cagaagtgag gccagcacag gctgagtgca gccccagggt gagaaggtgc 120 ccaccgagag gactctgcag tgaggcccta ggccacgtcc gaggggtgcc tccgatgggg 180 gaagcccctc cctgggggtc accggagcca tgctgtcccg caagggcatc atccccgagg 240 aatacgtgct gacacgcctg gcagaggacc ctgccgagcc caggtaccgt gcccgccagc 300 ggagggcccg ctttgtgtcc aagaaaggca actgcaacgt ggcccacaag aacatccggg 360 agcagggccg cttcctgcag gacgtgttca ccacgctggt ggacctcaag tggccacaca 420 cattgctcat cttcaccatg tccttcctgt gcagctggct gctcttcgcc atggcctggt 480 ggctcatcgc cttcgcccac ggtgacctgg cccccagcga gggcactgct gagccctgtg 540 tcaccagcat ccactccttc tcgtctgcct tccttttctc cattgaggtc caagtgacta 600 ttggctttgg ggggcgcatg gtgactgagg agtgcccact ggccatcctg agcctcatcg 660 tgcagaacat cgtggggctc atgatcaacg ccatcatgct tggctgcatc ttcatgaaga 720 ctgcccaagc ccaccgcagg gctgagaccc tcatcttcag caagcatgcg gtgatcgctc 780 tgcgccacgg ccgcctctgc ttcatgctac gtgtgggtga cctccgcaag agcatgatca 840 tcagcgccac catccacatg caggtggtac gcaagaccac cagccccgag ggcgaggtgg 900 tgcccctcca ccaggtggac atccccatgg agaacggcgt gggtggcaac agcatcttcc 960 tggtggcccc gctgatcatc taccatgtca ttgatgccaa cagcccactc tacgacctgg 1020 cacccagcga cctgcaccac caccaggacc tcgagatcat cgtcatcctg gaaggcgtgg 1080 tggaaaccac gggcatcacc acccaggccc gcacctccta cctggccgat gagatcctgt 1140 ggggccagcg ctttgtgccc attgtagctg aggaggacgg acgttactct gtggactact 1200 ccaagtttgg caacaccatc aaagtgccca caccactctg cacggcccgc cagcttgatg 1260 aggaccacag cctactggaa gctctgaccc tcgcctcagc ccgcgggccc ctgcgcaagc 1320 gcagcgtgcc catggccaag gccaagccca agttcagcat ctctccagat tccctgtcct 1380 gagccatggt ctctcgggcc ccccacacgc gtgtgtacac acggaccatg tggtatgtag 1440 cccagccagg gcctggtgtg aggctgggcc agcctcagct cagcctcccc ctgctgctca 1500 tccagggtgt tacaaggcac ttgtcactat gctatttctg gcctcagcag gaacctgtac 1560 tgggttattt ttgtccctgc tcctcccaac ccaatttagg actggctcac ccctctcccc 1620 cgcccaaggc tgcag 1635 <210> 7 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg 1 5 10 15 Leu Ala Glu Asp Pro Ala Lys Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn 35 40 45 Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val 50 55 60 Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu 65 70 75 80 Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala 85 90 95 His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr 100 105 110 Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln 115 120 125 Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu 130 135 140 Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn 145 150 155 160 Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg 165 170 175 Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg 180 185 190 His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser 195 200 205 Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr 210 215 220 Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met 225 230 235 240 Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile 245 250 255 Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro 260 265 270 Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu 275 280 285 Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr 290 295 300 Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala 305 310 315 320 Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr 325 330 335 Ile Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp 340 345 350 His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu 355 360 365 Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile 370 375 380 Ser Pro Asp Ser Leu Ser 385 390 <210> 8 <211> 1173 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60 cctgccaagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120 aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180 accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240 tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300 gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360 ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420 gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480 gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540 ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600 cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660 cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720 gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780 attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840 ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900 cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960 gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccat caaagtgccc 1020 acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080 ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140 aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 rwardrmrma ggtggaggta aggaagag 28 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 rvrsrmrmgg tgaagatgag caatgtg 27 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 rwardrmrmg ggtggcaaca gcatcttc 28 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 12 rvrsrmrmtg gctcaggaca gggaatc 27 <210> 13 <211> 3102 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <400> 13 stnsccaggt gctttttcag ggaccaagta gagctggggc ctgaccacag gcacttcttg 60 gagccacaga cgcaaagcag cagccctcgg ggattgttct tccccagcca ccggcccaga 120 gtgtggctgg tcaatcgtgg ggacccagga ctggctggac gcacagctct agggcccagt 180 acctcccaca gcctctgcag ccttgggcgg gggagagggg tgagccagtc ctgaattggg 240 ttgggaggag cagggacaaa aataacccag tacaggttcc tgctgaggcc agaaatagca 300 tagtgacaag tgccttgtaa caccctggat gagcagcagg gggaggctga gctgaggctg 360 gcccagcctc acaccaggcc ctggccgggc tacataccac atggtccgtg tgtacacacg 420 cgtgtggggg gcccgagaga ccatggctca ggacagggaa tctggagaga tgctgaactt 480 gggcttggcc ttggaccgag tcctgtccct tagmrvrscc atgggcacgc tgcgcttgcg 540 caggggcccg cgggctgagg cgagggtcag agcttccagt aggctgtggt cctcatcaag 600 ctggcgggcc gtgcagagtg gtgtgggcac tttgacggtg ttgccaaact tggagtagtc 660 cacagagtaa cgtccgtcct cctcagctac aatgggcaca aagcgctggc cccacaggat 720 ctcatcggcc aggtaggagg tgcgggcctg ggtggtgatg cccgtggttt ccaccacgcc 780 ttccaggatg acgatgatct cgaggtcctg gtggtggtgc aggtcgctgg gtgccaggtc 840 gtagagtggg ctgttggcat caatgacatg gtagatgatc agcggggcca ccaggaagat 900 gctgttgcca cccacgccgt tctccatggg gatgtccact tctacgacaa cggtgggmrw 960 ardcctggtg gaggggcacc acctcgccct cggggctggt ggtcttgcgt accacctgca 1020 tgtggatggt ggcgctgatg atcatgctct tgcggaggtc acccacacgt agcatgaagc 1080 agaggcggcc gtggcgcagg gcgatcaccg catgcttgct gaagatgagg gtctcagccc 1140 tgcggtgggc ttgggcagtc ttcatgaaga tgcagccaag catgatggcg ttgatcatga 1200 gccccacgat gttctgcacg atgaggatca ggatggccag tgggcactcc tcagtcacca 1260 tgcgcccccc aaagccaata gtcacttgga cctcaatgga gaaaaggaag gcagacgaga 1320 aggagtggat gctggtgaca cagggctcag cagtgccctc gctgggggcc aggtcaccgt 1380 gggcgaaggc gatgagccac caggccatgg cgaagagcag ccagctgcac aggaaggaca 1440 tggtgaagat gagccacttc tactccaatg tgtgtggcca cttgaggtcc accagcgtgg 1500 tgaacacgtc ctgcaggaag cggccctgct cccgggttac amrvrsatgt tcttgtgggc 1560 cacgttgcag ttgcctttct tggacacaaa gcgggccctc cgctggcggg cacggtacct 1620 gggcttggca gggtcctctg ccaggcgtgt cagcacgtat tcctcgggga tgatgccctt 1680 gcgggacagc atggctccgg tgacccccag ggaggggctt cccccatcgg aggcacccct 1740 cggacgtggc ctagggcctc actgcagagt cctctcggtg ggcaccttct caccctgggg 1800 ctgcactcag cctgtgctgg cctcacttct gagataactc cccaccagac tcttccttac 1860 ctccacctgg gtcccacttc acttcttaat accagcgaga aggaatggag gtggamrwar 1920 dctcaggccg ggcgcggtgg ctcacgcctg taatcccagt acgttgggag gctgaggagg 1980 gcagatcact aggtcaggag ttcgagacca gcctgaccaa catggtgaaa ccccatctct 2040 actaaaaata caaaagttag ccgggcatgg tggtgcgcac ctgtaatccc agctactcag 2100 gaagctgagg caggagaatc gcttgaaccc gagaggcgga ggttgcagtg agccaagatc 2160 acgccactgc actccagcct gggcgacaga gcgagactcc gtctcaaaaa caaaaaacaa 2220 aacaaaaaaa acagcctcac ccttgagccc acctgcctgg cgcctaggga gcccccaacc 2280 ctgccggctc tccacctggc cctgcgtcct cccccagctt cccccaccag ctgaccaccc 2340 ctgggcctcc cgctaagagc ccttctcccc gcccagcctg ccttcccagc ccagctcaga 2400 acttaacacc tccggatctc tcccactaac cggacctcac ccccacctcc gggtctcccg 2460 cctcacctgt ctggccttcg ggctcccagg ctccagctca ggtcctggcc acccccgccc 2520 cgtctctcct ccaggtgcgc cccctatgtc ctactccacc cctcccggag cgcccccgcc 2580 gctttccgga tccccctcca gctctcgtcc tctctgtctc cttgggatcc tgcgttctct 2640 ggagtcacca ccccacccgg ctcaaccgcg gctccccgga cctgcgcgcg acccggcggg 2700 gctgactccg agtcgcggcc tcccggtccc tgccgcccgc ccgcgccgcg gctcccgctc 2760 cgcgccgggt cccggccccg cccgccgccg ccgctgcacc tgctcctgct cctcacgcca 2820 cggccgtcgc ctccccgccc cctcccgccg cccgggcgct cgcggctggc cgtcctcccg 2880 tctgtctgtc cgtccgtggg tccgcggaga ccgacctggg ctaggcaggg gtctaggacg 2940 gcgggagggg ggcgcacgag gagaggaacg gggccgggga ccgccagggg gagcccgacc 3000 tgcaccggag cgcagggggc ggggccggag caagcccccg cccctcccgc gcccctcccc 3060 gcccccgccc tccacctccc ctcccgggac tcacaacccg gc 3102

Claims

Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산의 존재, Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산의 존재 또는 이 둘 모두의 존재가 샘플 중에서 측정되는, 당뇨병 환자에서 협심증의 위험성 증가를 동정하는 방법.
Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드 서열을 유도하는 Kir6.2 유전자의 하나 또는 둘 다의 대립형질 유전자상에서 Kir6.2 뉴클레오타이드 서열의 변이의 존재가 샘플 중에서 측정되는, 당뇨병 환자에서 협심증의 위험성 증가를 동정하는 방법.
a) Kir6.2 단백질의 23번 위치에 글루탐산 이외의 다른 아미노산, Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 다,

b) Kir6.2 단백질의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, Kir6.2 단백질의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 다를 유도하는 Kir6.2 유전자의 하나 또는 둘 다의 대립형질 유전자상에서 뉴클레오타이드 서열의 변이, 또는

c) Kir6.2-23-KK, Kir6.2-337-II 또는 이 둘 모두

를 갖는 Kir6.2의 존재가 당뇨병 환자의 샘플 중에서 측정되는, 당뇨병 환자에서 협심증을 치료하거나, 당뇨병 환자에서 협심증을 예방하거나 또는 당뇨병 환자에서 협심증을 치료 및 예방하는데 유용한 약제의 투여용량을 조절하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 23번 위치의 아미노산이 Lys인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 337번 위치의 아미노산이 Ile인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 Kir6.2 암호화 서열의 서열번호 2의 67번 위치에 A를 함유하는 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 Kir6.2 암호화 서열의 서열번호 2의 1009번 위치에 G를 함유하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병이 진성 당뇨병인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Kir6.2-23-KK의 존재, Kir6.2-337-II의 존재 또는 이 둘 모두의 존재가 샘플 중에서 측정되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 조직학적 샘플, 세포 추출물 또는 조직 추출물 또는 세포인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 사람 기원의 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대체된 아미노산의 존재가,

a) 암호화 서열의 서열번호 2의 67/68/69번 위치, 1009/1010/1011번 위치 또는 이 둘 다의 위치에 상응하는 게놈 Kir6.2 서열의 뉴클레오타이드 위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하는 PCR 반응을 통해 게놈 DNA를 함유하는 생물학적 샘플로부터 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시키는 단계 및

b) a)에 따른 폴리뉴클레오타이드 단편의 서열을 분석하는 단계

에 의해 측정되는 방법.
제12항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 단편의 증폭이 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머중 하나 이상을 사용하여 수행되는 방법.
제12항에 있어서, 서열 분석 반응이 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머중 하나를 사용하여 수행되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대체된 아미노산의 존재가,

a) 게놈 DNA를 함유하는 생물학적 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계,

b) 이것을 캐리어에 고정화시키는 단계 및

c) 야생형 Kir6.2 서열에 대해서 보다 높은 친화성으로, 하나 또는 2개의 아미노산 대체를 유도하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 대체를 함유하는 Kir6.2 서열에 엄중 조건하에 결합할 수 있는 하나 이상의 프로브를 상기 고정화된 DNA에 하이브리드화시키는 단계에 의해 측정되는 방법.
제15항에 있어서, 분리된 게놈 DNA가,

a) 칩 매트릭스 또는 막상에 고정화되거나,

b) 겔 매트릭스에 가해지고 막으로 블롯팅되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대체된 아미노산이,

a) Kir6.2 cDNA 서열의 서열번호 2의 67번 위치, Kir6.2 cDNA 서열의 서열번호 2의 1009번 위치 또는 이 둘 다의 위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하고, 개체 기원의 RNA를 함유하는 생물학적 샘플을 사용하여, RT-PCR 반응에 의해 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시키는 단계 및

b) a)에 따른 폴리뉴클레오타이드 단편의 서열을 분석하는 단계

에 의해 측정되는 방법.
제17항에 있어서, 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머 하나 이상이 사용되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대체된 아미노산이,

a) 개체 기원의 RNA를 함유하는 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계,

b) 이것을 캐리어에 고정화시키는 단계 및

c) Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 23번 위치에 글루탐산, Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 337번 위치에 발린 또는 상기 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드를 암호화하는 Kir6.2 RNA에 대해서 보다 높은 친화성으로, Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드를 암호화하는 Kir6.2 RNA에 엄중 조건하에 결합할 수 있는 하나 이상의 프로브를 상기 고정화된 RNA와 하이브리드화시키는 단계

에 의해 측정되는 방법.
제19항에 있어서, 분리된 RNA가,

a. 칩 매트릭스 또는 막상에 고정화되거나,

b. 겔 매트릭스에 가해진 후 막으로 블롯팅되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대체된 아미노산이,

a) 개체 기원의 단백질을 함유하는 생물학적 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,

b) 이것을 캐리어상에 고정화시키는 단계,

c) Kir6.2 폴리펩타이드 쇄의 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산, 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 또는 상기 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2에 대해서 보다 높은 친화성으로, Kir6.2 폴리펩타이드 쇄의 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, Kir6.2 폴리펩타이드 쇄의 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2에 결합할 수 있는 항체와의 결합 반응을 수행하는 단계 및

d) 단백질로의 항체 결합을 가시화시키는 단계

에 의해 측정되는 방법.
제21항에 있어서, 분리된 단백질이

a) 칩 매트릭스 또는 막에 고정화되거나,

b) 겔 매트릭스로 이동된 후 막에 고정화되거나,

c) ELISA 플레이트에 고정화되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대체된 아미노산이,

a) 개체 기원의 조직학적 샘플 상에서, 폴리펩타이드 쇄의 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산, 폴리펩타이드 쇄의 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 또는 상기 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2에 대해서 보다 높은 친화성으로, 폴리펩타이드 쇄의 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, 폴리펩타이드 쇄의 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2에 결합할 수 있는 항체를 사용하여 결합 반응을 수행하는 단계 및

b) 단백질로의 항체 결합을 가시화시키는 단계

에 의해 측정되는 방법.
제23항에 있어서, 결합의 검출이 면역조직학적 또는 면역방사선학적 반응에 의해 수행되는 방법.
Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 모두, Kir6.2-23-KK 또는 Kir6.2-337-II의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 수단을 포함하는, 상기 아미노산의 존재를 시험하여, 당뇨병 환자에서 협심증의 위험성 증가를 동정하기 위한 시험 키트.
Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, Kir6.2 단백질의 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘다를 함유하는 Kir6.2 폴리펩타이드 서열을 유도하는 Kir6.2 유전자의 하나 또는 둘 다의 대립형질 유전자상에서 Kir6.2 뉴클레오타이드 서열의 변이의 존재를 검출하기 위한 하나 이상의 수단을 포함하는, 상기 뉴클레오타이드 서열의 변이의 존재를 시험하여, 당뇨병 환자에서 협심증의 위험성 증가를 동정하기 위한 시험 키트.
제25항 또는 제26항에 있어서, 서열번호 1의 23번 위치의 아미노산이 Lys인, 시험 키트.
제25항 또는 제26항에 있어서, 서열번호 1의 337번 위치의 아미노산이 Ile인, 시험 키트.
제25항에 있어서, 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산, 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 또는 상기 아미노산 둘 다를 함유하는 Kir6.2 간의 결합 특성이 상이한 항체를 함유하는, 시험 키트.
제26항에 있어서, Kir6.2의 뉴클레오타이드 서열이 암호화 서열의 서열번호 2의 67번 위치에 G를 갖는, 시험 키트.
제26항 또는 제30항에 있어서, Kir6.2의 뉴클레오타이드 서열이 암호화 서열의 서열번호 2의 1009번 위치에 A를 갖는, 시험 키트.
제26항 또는 제30항에 있어서, Kir6.2 암호화 서열의 서열번호 2의 67번 위치, Kir6.2 암호화 서열의 서열번호 2의 1009번 위치 또는 상기 위치 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 함유하는, 시험 키트.
제32항에 있어서, 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머 하나 이상을 함유하는, 시험 키트.
제26항 또는 제30항에 있어서, 서열번호 13에 따른 Kir6.2 게놈 서열의 606/607/608번 위치, 서열번호 13에 따른 Kir6.2 게놈 서열의 1478/1479/1480번의 위치 또는 상기 위치 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 함유하는, 시험 키트.
제34항에 있어서, 서열번호 9 내지 12에 따른 프라이머 하나 이상을 함유하는, 시험 키트.
제26항 또는 제30항에 있어서, 엄중 조건하에 서열번호 1의 23번 위치에서 글루탐산 이외의 다른 아미노산, 서열번호 1의 337번 위치에서 발린 이외의 다른 아미노산 또는 상기 다른 아미노산 둘 다를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 Kir6.2 게놈 DNA 또는 RNA를 특이적으로 인지하는 하나 이상의 핵산 프로브를 함유하는, 시험 키트.
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