MX2007002589A - Asociacion de polimorfismos de proteinas con la cardiopatia coronaria. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a metodos para identificar un incremento del riesgo de cardiopatia coronaria en un individuo, en los que se determina en una muestra la presencia de un aminoacido distinto del Acido Glutaminico en la posicion 23 y/o la presencia de un aminoacido distinto de Valina en la posicion 337 en la proteina Kir6.2; mas aun, se reivindican sondas, cebadores, polipeptidos o polinucleotidos adecuados para dichos metodos.

Description

ASOCIACIÓN DE POLIMORFISMOS DE PROTEÍNAS CON LA CARDIOPATÍA CORONARIA La invención se refiere a métodos para identificar un incremento del riesgo de cardiopatía coronaria así como a sondas, cebadores, polipéptidos o polinucleótidos adecuados para dichos métodos. En los países desarrollados, las enfermedades cardiovasculares son la causa principal de muerte entre las personas de ambos sexos, y la cardiopatía coronaria, especialmente la enfermedad arterial coronaria, es la causa principal de las enfermedades cardiovasculares. La angina, también denominada angina de pecho, es un dolor torácico transitorio o una sensación de presión que se produce cuando el músculo cardiaco no recibe suficiente oxígeno. Cuando las arterias se estrechan o bloquean de manera que se impide el aumento del flujo sanguíneo al músculo cardiaco para satisfacer la mayor necesidad de oxígeno, se puede producir la isquemia, lo que resulta en dolor (es decir, angina). Habitualmente, la angina de pecho es consecuencia de una enfermedad arterial coronaria, aunque también puede ser ei resultado de otras cardiopatías coronarias. No siempre toda persona con isquemia tiene angina de pecho. La isquemia sin angina se denomina isquemia silenciosa. El peligro de la isquemia silenciosa reside en el hecho de que el tejido cardiaco se está dañando sin que el paciente presente síntomas. Por lo tanto, una posible lesión cardiaca no es a veces reconocida ni por el paciente ni por el médico responsable hasta que finalmente resulta en un infarto de miocardio. Por lo tanto, existe una gran necesidad de principios de diagnóstico para reconocer degeneraciones vasculares y especialmente coronarias (en el texto que sigue se refieren como cardiopatías coronarias) que permitan un diagnóstico precoz y, por lo tanto, medidas terapéuticas o preventivas precoces. Así, el objeto de la invención es pro orcionar métodos mejorados para el diagnóstico y tratamiento de la cardiopatía coronaria. Esto se consigue mediante un método para identificar un incremento del riesgo de cardiopatía coronaria en un individuo, en el que se determina en una muestra la presencia de un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o la presencia de un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kír6.2. En el texto que sigue, las abreviaturas estándar para los nucleótidos y los aminoácidos (tales como el código de tres o una letra de los aminoácidos) se utilizan indistintamente con los términos completos. La identificación del polimorfismo en la secuencia proteica de Kir6.2 que comprende el intercambio del aminoácido en la posición 23 (especialmente si es de Glu a Lys) y/o el intercambio del aminoácido en la posición 337 (especialmente si es de Val a lie) en la proteína Kir6.2 puede utilizarse para predecir un riesgo incrementado o normal de cardiopatía coronaria, preferiblemente enfermedad arterial coronaria y/o angina de pecho. Puede utilizarse, por ejemplo, en 1) métodos basados en la secuencíación de la región de interés de la proteína (por ejemplo, degradación estándar de proteínas, análisis de fragmentos de la secuencia de la proteína con espectrometría de masa); 2) métodos basados en la utilización de anticuerpos anti-Kir6.2 frente a la región de interés (por ejemplo, ELISA); 3) métodos basados en el análisis de la actividad funcional de Kir6.2 en ensayos in-vitro utilizando, por ejemplo', células humanas, animales, bacterianas o de levaduras. La presente invención se refiere además a un método para identificar un incremento del riesgo de cardiopatía coronaria en un individuo, en el que se determina en una muestra la presencia de una variación en la secuencia de nucleótidos de uno o ambos (preferiblemente ambos) alelos del gen Kir6.2 que da lugar a una secuencia polípeptídica de Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kír6.2. La identificación del polimorfismo de la secuencia de nucleótidos en uno o ambos alelos del gen Kir6.2 que da lugar a un intercambio de aminoácidos en la posición 23 (especialmente si es de Glu a Lys) y/o en la posición 337 (especialmente si es de Val a lie) en la proteína Kir6.2 puede utilizarse para predecir un riesgo incrementado de cardiopatías coronarias preferiblemente enfermedades arteriales coronarias y más preferiblemente angina de pecho, en individuos normales y preferiblemente en pacientes diabéticos. Puede utilizarse, por ejemplo, en 1) métodos basados en la secuenciación de la región de nucleótidos de interés (por ejemplo, pirosecuenciación, métodos de secuenciación que utilizan nucleótidos marcados radiactivamente, o nucleótidos que están marcados con un marcador fluorescente, análisis de fragmentos de la secuencia con espectrometría de masa); 2) métodos basados en la hibridación de secuencias de nucleótidos con la región de interés (por ejemplo, micromatrices de ADN); 3) métodos basados en el análisis de los productos de la amplificación de la región de nucleótidos de interés (por ejemplo análisis TaqMan™). El canal rectificador de la corriente de entrada de K+ Kir6.2 (KCNJ11 o Bir) es una subunidad del canal de potasio sensible a ATP de los islotes pancreáticos (IKATP)- El gen de Kir6.2 se ha mapeado en el cromosoma 11p15.1 y la proteína Kir6.2 consiste en 390 aminoácidos. Debido a su importante papel en la secreción de insulina estimulada por la glucosa, se piensa que Kir6.2 es un gen candidato para los defectos genéticos implicados en el principio de la diabetes mellitus tipo II (Yamada et al. (2001) Diabetes Metab Res Rev 17: 213-216). En la técnica se conocen varias secuencias proteicas, genómicas y de polínucleótidos codificadoras de Kir6.2. Por ejemplo, varias secuencias humanas proteicas / de ADN genómico / codificadoras están disponibles públicamente en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Edificio 38A, Bethesda, MD 20894, EEUU; www.ncbi.nhm.nih.gov) con los números de registro XP006398 (Seq. ID No. 3), (Seq. ID No. 5) (secuencia proteica) XM006398 (Seq. ID No. 4), (Seq. ID No. 6) (secuencia codificadora). Una secuencia genómica de Kir6.2 está disponible públicamente a partir de una secuencia genómica contigua que está publicada con el número de registro NCBI NT_009307 (cóntig. genómico del cromosoma 11 de homo sapiens; tamaño: 8.665.930 pb). El alineamiento de las secuencias de ARNm/codifícadoras/genómicas de Kir6.2 está disponible públicamente utilizando el enlace de internet siguiente: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?SendTo=on&db=nucleotide&dis pmax=1 &extrafeat=-1 &list_uids=NT_009307.12&showndispmax=1 &view=graph&_from=5656500& _to=5659500&_sfrom=5657000&_font=default&_llen=60&_slen=4000. Como puede deducirse de dicho alineamiento, la parte de la secuencia desde la posición 5.656.500 hasta 5.659.500 (SEQ ID No. 13) comprende el locus genómico de Kir6.2. Como se muestra en las figuras 2 y 3, las diferentes secuencias de Kir6.2 difieren en las posiciones 23 y/o 337 respecto a la secuencia proteica y respecto a las posiciones correspondientes de la secuencia codificadora (67/68/69 y 1.009/1.010/1.011 , respectivamente). Como la secuencia codificadora procede de los productos de la transcripción del ADN genómico, también tienen que existir varias variantes diferentes de las secuencias genómicas respecto a las posiciones 5.657.106/107/108 y 5.657.478/79/80. El término Kír6.2 se refiere a la proteína y ácido nucleico Kir6.2. El término proteína comprende polipéptidos así como proteínas que consisten en más de una cadena polípeptídica, por ejemplo, polipéptídos unidos entre sí mediante enlaces conocidos (por ejemplo, puentes S-S) para formar una unidad proteica. El término proteína Kír6.2 puede referirse a cualquier proteína o polipéptido Kir6.2 o fragmento funcional de éste. Un fragmento Kir6.2 puede ser, por ejemplo, cualquier proteína o ácido nucleico Kir6.2 que es más corto que las proteínas o ácidos nucleicos Kir6.2 que tienen secuencias según una de las SEQ ID 1 a 8 ó 13. Los fragmentos Kir6.2 son preferiblemente fragmentos funcionales de Kir6.2. Un fragmento funcional de una proteína Kir6.2 es un fragmento proteico que tiene al menos una de las funciones de Kir6.2, véase, por ejemplo, más arriba. Un ácido nucleico funcional de Kir6.2 es un fragmento de ácido nucleico de Kir6.2 que codifica, por ejemplo, una proteína Kir6.2 o un fragmento funcional de ésta o que es capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico Kir 6.2. Los términos secuencia de proteínas, secuencia de aminoácidos y secuencia de polipéptido se utilizan indistintamente en el contexto de esta solicitud. Sorprendentemente, los estudios de los inventores han mostrado que la variante más frecuente en la posición 23 del polipéptido Kir6.2 es un Glu (Ácido Glutamínico, E). Más aún, han mostrado que la variante más frecuente en la posición 337 es una Val (Valina, V). Así, estos aminoácidos en sus respectivas posiciones se consideran como Kir6.2 "tipo salvaje" en el alcance de esta solicitud. Así, si se hace referencia a intercambios o mutaciones o a variantes menos frecuentes de la secuencia de aminoácidos en el contexto de esta solicitud, se quiere decir desviaciones de los aminoácidos de tipo salvaje en la posición 23 y/o 337 de este "tipo salvaje". Las secuencias según SEQ ID No. 1 (NCBI No. de registro D50582; véase Fig. 1A) y 2 (NCBI No. de registro D50582; véase Fig. 1B) representan el Kir6.2 tipo salvaje respecto a la posición 23 y 337 de la secuencia polipeptídica (y, respectivamente, las posiciones 67/68/69 o la posición 1.009/1.010/1.011 de la codificadora y las posiciones 5.657.106/07/08 y 5.657.478/79/80 de la secuencia genómica). Las secuencias SEQ ID No. 3 (NCBI No. de registro XP 006398; Fig. 2A), SEQ ID No. 4 (NCBI No. de registro XM006398, Fig. 2B) que se obtienen de la base de datos de NCBI, y las secuencias nuevas SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6 por otra parte, presentan cada una un aminoácido menos frecuente bien en la posición 23 o en la posición 337 de la secuencia polipeptídica (y las variaciones de secuencia respectivas en la posición 67 o en la posición 1.009 de la secuencia de nucleótidos). Las secuencias nuevas SEQ ID No. 7 (Fig. 4A) y 8 (Fig. 4B) presentan variantes menos frecuentes en las posiciones 23 y 337 de la cadena de aminoácidos: Una Lisina en la posición 23 (con un AAG en las posiciones 67/68/69 de la secuencia codificadora) y una Isoleucina en la posición 337 de la secuencia de aminoácidos (con un ATC en las posiciones 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora). Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) representan variantes de una secuencia de nucleótidos dada que presentan intercambios en una única posición de nucleótidos; los SNP son muy conocidos en la técnica. Se han identificado varios polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el gen Kir6.2 que dan lugar a intercambios de aminoácidos en la proteína traducida, tal como E23K (intercambio de ácido Glutamínico por Lisina en la posición 23 de la proteína), L270V (intercambio de Leucina por Valína en la posición 270) y V377I. En un estudio reciente la variante de Kir6.2, E23K, se ha vinculado a la diabetes mellitus de tipo II en una población Caucásica (Hani et al. (1998) Diabetologia 41 : 1511 -1515). Sin embargo, hasta ahora no hay datos respecto a los efectos clínicos de las variantes de Kir6.2 en los seres humanos respecto a los trastornos cardiovasculares. Sorprendentemente, los estudios de los inventores han identificado por primera vez una correlación estrecha entre la presencia de mutaciones en las secuencias de aminoácidos en las posiciones 23 y/o 337 de la proteína Kir6.2 y una predisposición a cardiopatía coronaria. La detección de polimorfismos genéticos en el gen Kir6.2, en particular Kir6.2-23-KK (variantes de Kir6.2 que tienen Lisína (K) en la posición 23 de la proteína como consecuencia de polimorfismos en la posición correspondiente de ambos alelos del gen Kir6.2) y Kir6.2-337-ll (variantes de Kir6.2 que tienen Isoleucina (I) en la posición 337 de la proteína como consecuencia de polimorfismos en la posición correspondiente de ambos alelos del gen Kir6.2), mediante el análisis del ADN o proteína Kir6.2 humano pueden utilizarse, por ejemplo (a) como marcadores genéticos para tratamientos preventivos de cardiopatía coronaria, más específicamente enfermedad arterial coronaria y aún más específicamente angina de pecho, especialmente en pacientes diabéticos, (b) como un marcador genético para el ajuste de la dosis de fármacos, (c) como un marcador genético para el ajuste de la puesta a punto del cribado de fármacos y (d) como un marcador genético para la selección de pacientes en estudios de fase/clínicos. Al permitir una identificación precoz de una predisposición a cardíopatía coronaria, el método según la invención permite un tratamiento preventivo o curativo precoz del paciente antes de que aparezcan síntomas tales como angina o de que se produzcan lesiones en el tejido cardiaco: la identificación de uno o ambos de los intercambios de aminoácidos anteriores o de sus nucleótidos correspondientes a nivel de ARNm o genómico proporciona una indicación clara al médico responsable del tratamiento para cribar una lesión ya persistente del tejido o vasos cardiacos coronarios o para prescribir fármacos preventivos incluso antes de que aparezca la lesión y/o el dolor. Más aún, la correlación sorprendente entre dichos intercambios de aminoácidos y el inicio de la cardíopatía coronaria permite un tratamiento más eficaz de la cardiopatía coronaria indicando la necesidad de una dosificación más alta de determinados fármacos o indicando la necesidad de una medicación de un determinado tipo o de otro tipo cuando se compara con pacientes con cardiopatía coronaria que no presentan dichos intercambios de aminoácidos en Kir6.2.

Así, otra modalidad de la invención se refiere a un método para ajustar la dosificación de un fármaco útil para tratar y/o prevenir la cardiopatía coronaria, en el que se determina en una muestra de un individuo la presencia de una Kír6.2 con a) un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6, b) una variación en la secuencia de nucleótidos en uno o ambos alelos del gen Kir6.2 que da lugar a un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6 o c) Kir6.2-23-KK y/o Kir6.2-337-ll. Y, otra modalidad más de la invención se refiere a un método para seleccionar individuos que responderán a un fármaco para la cardiopatía coronaria, en el que se determina en una muestra del individuo la presencia de Kir6.2 con a) un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6, b) una variación en la secuencia de nucleótidos en uno o ambos alelos del gen Kir6.2 que da lugar a un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6 o c) Kir6.2-23-KK y/o Kir6.2-337-ll. La selección de individuos se refiere preferiblemente a pacientes diabéticos; el fármaco es preferiblemente un fármaco para la prevención o tratamiento de enfermedad arterial coronaria y más preferiblemente, para angina de pecho. Preferiblemente, el intercambio de aminoácidos en la posición 23 es de Glu a Lys y/o el intercambio de aminoácidos en la posición 337 es de Val a lie. La muestra es preferiblemente una proteína o ácido nucleico aislado, una muestra biológica, tal como una muestra histológica, un extracto celular o tisular o una célula. En la técnica se conoce una amplia variedad de fármacos para el tratamiento o prevención de la cardiopatía coronaria o de la angina de pecho. Debido a que los presentes estudios han identificado por primera vez que Kir6.2 está implicada en los procesos subyacentes o relacionados con la cardiopatía coronaria, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a la utilización de Kir6.2 para la identificación de fármacos útiles para tratar y/o prevenir la cardiopatía coronaria. El término "fármaco" se refiere a cualquier sustancia o combinación de sustancias que pueden utilizarse para el tratamiento curativo o preventivo de un estado patológico en un individuo. Una sustancia puede ser cualquier sustancia biológica o química o extracto de producto natural, bien purificado, purificado parcialmente, sintetizado o fabricado mediante métodos bioquímicos o de biología molecular. Un fármaco considerado como útil o activo para prevenir o tratar una cardiopatía coronaria en el sentido de los diferentes aspectos de la presente invención puede ser cualquier sustancia o combinación de sustancias que tiene un efecto en una de las funciones de Kir6.2 o en la cantidad de Kir6.2 (proteína o ácido nucleico) en una célula o en la expresión de Kir6.2. Para este fin, la sustancia puede modular cualquiera de las funciones de Kir6.2 (por ejemplo, las listadas anteriormente). La actividad de la proteína Kir6.2 puede modularse por la sustancia, por ejemplo, mediante una interacción e interferencia directa del polipéptido/proteína Kir6.2 o los fragmentos de ésta. La sustancia también puede modular la expresión de Kir6.2, por ejemplo, a nivel de la transcripción (inciación, elongación, procesamiento, etc), estabilidad del transcrito, traducción. Más aún, puede modular la modificación posterior a la traducción, plegamiento proteico etc. de Kir6.2. La sustancia puede ejercer los efectos anteriores directa o indirectamente (indirectamente significa, por ejemplo, interfiriendo (positivamente o negativamente) con las cascadas de señalización naturales que tienen influencia en la función / actividad proteica / expresión etc. de Kir6.2) Otra modalidad de la presente invención se refiere a un método para cribar fármacos útiles para tratar y/o prevenir la cardiopatía coronaria que comprende las etapas a. Proporcionar dos muestras que contienen Kir6.2, b. Poner en contacto una muestra con un fármaco potencial, c. Determinar la actividad de Kir6.2 o la estructura de Kir6.2 en presencia y en ausencia del fármaco potencial, d. Comparar la actividad de Kir6.2 en presencia con la obtenida en ausencia del fármaco potencial. La actividad o estructura (es decir, plegamiento de la proteína Kír6.2) en presencia de la sustancia farmacéutica potencial también puede compararse con la actividad o estructura de la proteína Kir6.2 de tipo salvaje. Preferiblemente, la muestra contiene o es una proteína o un fragmento proteico aislado de Kir6.2 o un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico aislado de Kir6.2. En el contexto de esta invención el término "aislado" respecto a "proteína aislada", "ácido nucleico aislado" etc, se refiere a proteínas/ácidos nucleicos purificados a partir de fuentes naturales así como a proteínas/ácidos nucleicos recombinantes (que, por supuesto, también pueden estar purificados). Debido a que es muy probable que los intercambios de aminoácidos en Kir6.2 que se ha visto que se correlacionan con cardiopatía coronaria afecten al tratamiento y/o prevención de la cardíopatía coronaria, la Kir6.2 utilizada para una de las utilizaciones o los métodos anteriores puede ser, por ejemplo, a) una proteína Kir 6.2 o fragmento de ésta que contiene un aminoácido distinto del Ácido Glutamíníco en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2, b) un ácido nucleico Kir 6.2 o fragmento de éste que contiene una variación en la secuencia de nucleótidos en uno o ambos alelos del gen Kir6.2 que da lugar a un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kír6.2 o c) Kir6.2-23-KK y/o Kir6.2-337-ll. Pueden identificarse sustancias activas desde un punto de vista farmacéutico para el tratamiento y/o prevención de cardiopatías coronarias medíante cribado para detectar la capacidad de un fármaco potencial para restaurar la función y/o plegamiento proteico de una Kír6.2 que presenta uno o ambos de dichos intercambios de aminoácidos respecto a la proteína de tipo salvaje. En la técnica son muy conocidos los métodos y sistemas de cribado farmacéutico especialmente si se utilizan en un formato de alto rendimiento utilizando proteína o fragmentos de proteína aislados, células que expresan dicha proteína, etc. En la técnica son muy conocidos los métodos analíticos o sistemas analíticos adecuados, denominados ensayos que se utilizan para determinar la actividad o concentración de moléculas diana definidas, en el contexto de la presente invención, la actividad o plegamiento de Kir6.2 (denominados diana, principalmente proteínas o ácidos nucleicos), como un parámetro para la eficacia de un compuesto farmacéutico potencial. Los ensayos pueden ser, por ejemplo, métodos o sistemas analíticos bioquímicos que utilizan componentes aislados o parcialmente aislados que se juntan en una mezcla de reacción en un espacio y tiempo definidos, en los que puede ensayarse la eficacia de los compuestos farmacéuticos potenciales. Otro ejemplo de ensayos comprende métodos o sistemas analíticos bioquímicos, en los que pueden determinarse en una célula la actividad de la molécula diana y la eficacia de un potencial para influir en esta actividad. Un ensayo es cualquier tipo de método o sistema analítico para evaluar un proceso biológico. De manera adecuada, las cascadas moleculares y los mecanismos que representan partes de rutas metabólicas fisiológicas aunque también de condiciones patológicas se reproducen en sistemas celulares o bioquímicos (¡n vitro). La actividad farmacológica de un compuesto farmacéutico potencial puede determinarse así según su capacidad para interferir con o modular estas cascadas o mecanismos. Para la utilización en el cribado de fármacos, especialmente en el cribado con alto rendimiento de compuestos farmacéuticos nuevos, el ensayo debe ser reproducible y preferiblemente también escalable y robusto. El ensayo es preferiblemente adecuado para el cribado de alto rendimiento de sustancias químicas para detectar su capacidad de modular la actividad de la molécula diana que se está investigando. El tipo de ensayo depende, por ejemplo, del tipo de molécula diana utilizada (por ejemplo, polipéptido o polinucleótido) y de la "lectura ", es decir, el parámetro según el cual se determina la actividad de la molécula diana (véase más adelante). En el estado de la técnica se conocen comúnmente diferentes tipos de estos ensayos y están disponibles en el mercado a partir de proveedores comerciales. Los ensayos adecuados para los diferentes fines engloban ensayos con radioisótopos o fluorescentes, por ejemplo, ensayos de polarización de la fluorescencia (tales como los que ofrece comercialmente Panvera) o Packard BioScience (HTRF; ALPHAScreen™) para determinar la interacción de un miembro marcado con un miembro no marcado (por ejemplo, la interacción de receptores de la proteína marcados con sus ligandos sin marcar). Más ejemplos incluyen ensayos basados en células, en los que una línea celular expresa de manera estable (de manera ¡nducible o no; cromosómica o episómica) o de manera transitoria una proteína recombinante de interés. Estos ensayos comprenden, por ejemplo, ensayos de genes indicadores, en los que se mide la regulación de un determinado promotor o una ruta de transducción de señales de un miembro de una cascada de transducción de señales de acuerdo con la actividad de una enzima indicadora cuya expresión está bajo el control de dicho promotor determinado. Para este tipo de ensayo, tiene que construirse una línea de células recombinantes que contenga el gen indicador bajo el control de un promotor definido que se va a investigar o que está regulado por la cascada de señalización bajo investigación. Las enzimas indicadoras adecuadas son conocidas comúnmente en el estado de la técnica y comprenden la luciferasa de luciérnaga, la luciferasa de renilla (por ejemplo, disponible en el mercado a partir de Packard reagents) y ß-galactosidasa. Las líneas celulares adecuadas dependen del objeto del ensayo, pero comprenden principalmente líneas celulares que son fáciles de transfectar y fáciles de cultivar tales como, por ejemplo, HeLA, COS, CHO, NIH-3T3, etc. Los ensayos para medir el nivel intracelular de iones comprenden, por ejemplo, ensayos FLIPR (lector de placas con formación de imágenes fluorimétricas, disponible en el mercado en Molecular Devices), en los que una fuente de luz láser de argón combinada con una cámara CCD refrigerada permite realizar mediciones paralelas de señales de iones transitorios (tales como Ca2+, etc.) en placas de 384 pocilios dentro de las células (por ejemplo, células neuronales u otras células (por ejemplo, células que expresan de manera recombinante o naturalmente ciertos canales iónicos)). Los ensayos FLIPR permiten, por ejemplo, evaluar el calcio intracelular usando ciertos fluorocromos tales como Fluo-3, Fluo-4, o evaluar el pH intracelular usando BCECF o BCPCF o kits de ensayo FLIPR específicos, o detectar cambios del potencial de membrana usando, por ejemplo, DíBAC o kíts de ensayo FLIPR específicos, o evaluar la polarización de la membrana. Para la evaluación de otros iones intracelulares, por ejemplo, cinc o sodio, pueden usarse otros colorantes conocidos en el estado de la técnica. Los expertos en la técnica conocen habitualmente otros tipos de ensayos y otros tipos de lecturas. Para la determinación de la actividad de un canal iónico tal como la de Kir6.2 (que controla, por ejemplo, las concentraciones intracelulares de iones y que puede utilizarse así para determinar las concentraciones intracelulares de ¡ones) pueden utilizarse, por ejemplo, ensayos sensibles al potencial de membrana y marcadores tal como DiBAC o el kit del ensayo del potencial de membrana de Molecular Devices con tecnología FLIPR; el colorante JC-1 con la tecnología FLIPR que mide la polarización de la membrana mitocondrial; marcadores sensibles a iones, etc. Los ensayos basados en la técnica de registro zonal (patch-clamping) o la determinación de la salida de ion Rubidio basada en espectroscopia de adsorción atómica son especialmente adecuados para determinar las concentraciones intracelulares de potasio, y así sucesivamente. Los expertos en la técnica conocen más dispositivos automáticos y para detectar determinados cambios y estados en el interior de las células y comprenden, por ejemplo, el detector Acumen (lector de barrido láser basado en fluorescencia que permite la reconstitución tridimensional de la distribución de objetos marcados adecuadamente) por ACUMEN bioscíence. Otros tipos de ensayos y otros tipos de "lectura" son muy conocidos en la técnica. Para el método o utilización de cribado anterior, es preferible que la proteína Kir 6.2 comprenda o tenga la secuencia según SEQ ID No. 3, 5 ó 7. También se prefiere, que el fragmento proteico según el método o la utilización anterior comprenda o tenga la secuencia según SEQ ID No. 3, 5 ó 7. El ácido nucleico según el método de cribado anterior comprende o tiene preferiblemente la secuencia según SEQ ID No. 4, 6 u 8. Y el fragmento de ácido nucleico según dicho método de cribado comprende o tiene preferiblemente la secuencia según SEQ ID 4, 6 u 8. En muy probable que todos los intercambios de aminoácidos en la posición 23 de la variante de tipo salvaje Glu y/o en la posición 337 de la variante de tipo salvaje Val de Kir6.2 afecten a la predisposición a cardiopatías coronarias. Así, el intercambio de aminoácidos del tipo salvaje puede ser básicamente de cualquier tipo. Se prefiere, que los intercambios de aminoácidos en las posiciones 23 y/o 337 se refieran a la incorporación de aminoácidos con propiedades diferentes de las de los aminoácidos del tipo salvaje Glu23 y Val337, respectivamente. Así, se prefiere, que un aminoácido no polar o básico se sitúe en la posición 23 en lugar del ácido Ácido Glutamínico. Es aún más preferido, si es un aminoácido básico, especialmente Lisína (Lys, K). Respecto a la posición 337, que en el polipéptido de tipo salvaje ocupa el aminoácido no polar Valina (Val, V), se prefiere, que un aminoácido no polar con una cadena lateral más voluminosa que la de la Valina, un aminoácido básico o ácido se sitúe en la posición 337. Más preferiblemente, un aminoácido no polar con una cadena lateral más voluminosa que la de la Valina se sitúa en la posición 337 en el alcance de esta invención. Las modalidades más preferidas de los métodos anteriores comprenden variantes que portan una Lisina en la posición 23 de Kir6.2 y / o una Isoleucina en la posición 337 de Kir6.2. Debido a la degeneración del código genético, existen varias posibilidades de intercambios de nucleótidos que resultan en los intercambios de aminoácidos anteriores. El código genético es muy conocido (para referencia, véase también Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3° edición). Respecto al aminoácido en la posición 23 del polipéptido, el intercambio de Ácido Glutámíco por otro aminoácido puede producirse por una mutación de una o más de las posiciones 67/68/69 de la secuencia codificadora según SEQ. ID No. 1. Respecto al aminoácido en la posición 337, el intercambio de Valina por otro aminoácido puede producirse por una mutación de una o ambas de las posiciones 1.009 ó 1.010 de la secuencia de ADN según SEQ. ID No. 1. Debido a que, como se ha mencionado anteriormente, se prefieren determinados tipos de intercambios de aminoácidos, también se prefieren respecto a la secuencia de nucleótidos los intercambios de nucleótidos que resultan en dichos intercambios de aminoácidos preferidos. Aún más preferidos son los intercambios de nucleótidos que rinden un intercambio E23K (intercambio de Ácido Glutamínico por Lisína en la posición 23 de la secuencia del polipéptido) y/o V337I (intercambio de Valina por Isoleucina en la posición 337; véase también la figura 7). Los SNP más preferidos son G67A (intercambio de G por A en la posición 67 de la secuencia codificadora) y/o G1009A (intercambio de G por A en la posición 1.009 de la secuencia codificadora). Las modalidades preferidas también engloban intercambios de los nucleótidos respectivos en la secuencia genómica que afectan a la secuencia de aminoácidos en las posiciones 23 y / o 337 en la proteína Kír6.2. Según las modalidades preferidas de los diferentes aspectos de la presente invención, el individuo es un paciente diabético; y es aún más preferido si la diabetes es diabetes tipo II (diabetes mellitus). También se prefiere que la cardiopatía coronaria sea angina de pecho. Es ventajoso si el intercambio de aminoácidos en la posición 23 es de Glu a Lys y/o si el intercambio de aminoácidos en la posición 337 es de Val a lie. La muestra es preferiblemente una proteína o ácido nucleico aislado, una muestra histológica, un extracto celular o tisular o una célula. También se prefiere que la muestra se aisle del cuerpo humano. Otra modalidad preferida de la invención se refiere a uno de los métodos anteriores, en el que se determina la presencia de Kir6.2-23-KK y/o Kir6.2-337-ll en la muestra. La muestra puede ser, por ejemplo, biológica, tal como una muestra histológica, un extracto celular o tisular o una célula, y la muestra se aisla preferiblemente del cuerpo humano. El material biológico y las muestras biológicas comprenden, por ejemplo, células, preparaciones o partes de tejidos u órganos (por ejemplo, cerebro, sangre, hígado, bazo, riñon, corazón, vasos sanguíneos, etc.), que se obtienen preferiblemente de un vertebrado, y más preferiblemente de un mamífero incluyendo un ser humano. También están comprendidas células de un cultivo celular, preferiblemente un cultivo de células eucariotas que comprende células obtenidas a partir de organismos multicelulares y tejido (tales como células HeLA, CHO, COS, SF9 ó 3T3) o de organismos unicelulares tales como levaduras (por ejemplo s. pombe o s. cerevisiae), o un cultivo de células procariotas, preferiblemente Pichía o E.coli. Las células y las muestras obtenidas a partir de tejido pueden conseguirse mediante técnicas muy conocidas, tales como la toma de sangre, punción tisular o técnicas quirúrgicas. La preparación de moléculas recombinantes y la purificación de moléculas naturales tales como ADN o proteínas a partir de células o tejido, así como la preparación de extractos celulares o tisulares es muy conocida para el experto en la técnica (véase también, por ejemplo, la bibliografía estándar listada más adelante). La presencia del intercambio de aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis del ADN genómico del individuo. Las técnicas adecuadas son muy conocidas en la técnica y comprenden, por ejemplo: Diferentes técnicas de PCR, hibridación a chip, transferencia slot / dot o Southern. La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica in vitro que permite la amplificación específica de cadenas de secuencia que tienen cadenas de nucleótidos con una secuencia conocida en su región 5' y 3'. Con el fin de amplificar una secuencia determinada, es suficiente que se conozca la secuencia de la región 5' de la secuencia que se quiere amplificar. En este caso, debe generarse en primer lugar un fragmento del polinucleótido que se quiere amplificar (esto puede realizarse mediante técnicas conocidas, tales como digestión con una endonucleasa de restricción). Después, se acopla al extremo 3' del fragmento de polinucleótido generado una molécula de ADN de secuencia conocida (un "conector") mediante una ligasa (tal como ADN ligasa T4, que está disponible comercialmente a partir de diferentes proveedores). La secuencia resultante está así rodeada por dos secuencias conocidas, la secuencia en 5' conocida y la secuencia en 3' conocida del conector, lo que permite la amplificación específica por PCR (en este caso una PCR mediada por conector "ImPCR"). Para amplificar la secuencia elegida, se utilizan moléculas de ADN cortas de cadena única ("cebadores"), que son complementarias a las cadenas de secuencia que rodean la secuencia de polinucleótido que se quiere amplificar. El molde de polinucleótido puede ser ADN o ARN. Los cebadores se hibridan con el molde de cadena única y se elongan, en condiciones definidas y muy conocidas, mediante enzimas específicas, las denominadas polimerasas (bien ADN polimerasas que reconocen ADN como molde y que producen polinucleótidos de ADN complementarios o transcriptasas inversas que reconocen ARN como molde y que producen polinucleótídos de ADN complementarios), dando lugar de esta manera a la generación de cadenas nuevas de ADN que tienen una secuencia complementaria a la de la cadena molde. Mediante la elección de secuencias definidas de las etapas de incubación a temperaturas definidas y de intervalos de tiempo definidos, que se repiten periódicamente, se genera una secuencia de etapas de desnaturalización / hibridación / polimerización que finalmente da lugar a la amplificación exponencial del polinucleótido de interés. Con el fin de aplicar las temperaturas necesarias para la desnaturalización sin destruir la polimerasa, se utilizan enzimas estables al calor, que toleran temperaturas tan altas como 95°C y más, tal como ADN polimerasa Taq (ADN polimerasa de thermus aquaticus), PFU etc, ambas disponibles comercialmente a partir de diferentes proveedores. La elección de las polimerasas adecuadas depende del propósito de su utilización (por ejemplo, para la clonación por PCR, se eligen preferiblemente polimerasas con capacidad para corregir errores, tal como PFU) y se encuentra en la capacidad del experto en la técnica. Una reacción de PCR típica comprende el molde de polinucleótido (por ejemplo, 0,01 a 20 ng), dos cebadores adecuados (en una concentración de, por ejemplo, 0,2 a 2 µM cada uno), dNTP (en una concentración de, por ejemplo, 200µM cada uno), MgCI2 1 a 2mM y 1 a 10 unidades de una polimerasa estable al calor, tal como Taq. Los componentes y tampones típicos son muy conocidos por el experto en la técnica y están disponibles a partir de proveedores comerciales. Los cebadores adecuados pueden generarse mediante síntesis química según protocolos muy conocidos. Dichos cebadores también están disponibles comercialmente a partir de diferentes proveedoresl tales como MWG Biotech etc. Los moldes de ADN y ARN, también los moldes de ADNc, pueden generarse mediante procedimientos estándar muy conocidos (véase, por ejemplo, la bibliografía estándar que aparece más adelante) y también pueden obtenerse a partir de proveedores comerciales, tales como Promega y Stratagene, etc. Los métodos para la preparación de muestras biológicas que contienen ADN genómico (y / o ARN y / o proteína) son muy conocidos en la técnica. Para referencia, véanse, por ejemplo Sambrook et al., o Current Protocols ¡n Molecular Biology o Protein Science. Según una modalidad preferida de la invención, la presencia del intercambio de aminoácidos se determina mediante un método que consiste en o que comprende las etapas siguientes: e. Preparar a partir de un individuo una muestra biológica que contiene ADN genómico. f. Si la secuencia diana no se va a analizar directamente mediante métodos ¡n sítu, tales como PCR in situ o secuenciación genómica directa utilizando directamente la muestra anterior (por ejemplo, una muestra de tejido o células), el ADN genómico de la muestra según a) debe aislarse o al menos purificarse parcialmente. g. Amplificar un fragmento de polinucleótído mediante una reacción de PCR utilizando cebadores capaces de amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones de nucleótidos de la secuencia genómica de kir 6.2 que corresponden a las posiciones 67/68/69 y/o 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora, h. Secuenciar el fragmento de polinucleótido según c). Respecto a la secuencia genómica de Kir6.2 según SEQ ID No. 13 las "posiciones correspondientes" anteriores en la secuencia genómica son 5.657.106/5.657.107/5.657.108 y 5.657.978/5.657.979/5.657.980, respectivamente (véase la figura 8).

La presencia de uno o más intercambios de nucleótidos en la secuencia genómica que dan lugar a uno o más de los intercambios de aminoácidos anteriores en la proteína puede identificarse entonces según procedimientos estándar conocidos (por ejemplo, utilizando cebadores de secuenciación marcados y realizando una detección de las señales autorradiográfica o fluorométrica). La selección y el diseño de cebadores adecuados para la amplificación del fragmento de polinucleótido anterior se encuentran en la capacidad del experto en la técnica. Para referencia, véanse, por ejemplo, Sambrook et al., o Current Protocols in Molecular Biology. Lo mismo resulta cierto para la preparación de dichos cebadores, que también pueden adquirirse a partir de proveedores comerciales (tales como MetaBion, Martinsried, Alemania). Preferiblemente, se utiliza al menos uno de los cebadores según SEQ. ID No. 9, 10, 11 ó 12 (véase la Fig. 5) para la secuenciacíón y/o amplificación. Según otra modalidad preferida de la presente invención, la presencia del intercambio de aminoácidos se determina mediante un método que comprende o consiste en las etapas siguientes: a. Preparar una muestra biológica que contiene ADN cromosómico / genómico. b. Aislar el ADN cromosómico a partir de la muestra según a). c. Inmovilizarlo en un vehículo. d. Hibridar el ADN inmovilizado con una o más sondas capaces de unirse a la Secuencia Kir6.2 que presenta uno o más intercambios de nucleótidos que dan lugar a uno o ambos de dichos intercambios de aminoácidos con una afinidad mayor que la que presenta para la Secuencia Kir6.2 de tipo salvaje en condiciones astringentes. La hibridación puede visualizarse según métodos estándar tales como autorradiografía o fluorescencia utilizando sondas marcadas según el caso. La presencia o ausencia de un intercambio de nucleótidos en la Secuencia genómica de Kir6.2 que da lugar a un intercambio de aminoácidos en la posición 337 y/o 23 en la proteína Kir6.2 puede identificarse entonces comparando los patrones de hibridación y / o las intensidades que resultan de las muestras del paciente con el patrón de hibridación y / o las intensidades de muestras control que contienen ADN genómico de tipo salvaje. Para la hibridación pueden utilizarse polinucleótidos y oligonucleótidos aislados en diferentes condiciones de astringencia. La astringencia describe condiciones de reacción que influyen en la especificidad de hibridación o apareamiento de dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias. La astringencia, y de esta manera la especificidad de una reacción depende, entre otras cosas, de la temperatura y condiciones tamponantes usadas para una reacción: por ejemplo, la astringencia, y de esta manera la especificidad, pueden incrementarse aumentando, por ejemplo, la temperatura de la reacción y/o reduciendo la fuerza iónica del tampón de la reacción. Existen condiciones de baja astringencia (y, de esta manera, de baja especificidad de reacción y de hibridación), por ejemplo, si una hibridación se realiza a temperatura ambiente en disolución 2xSSC. Las condiciones de alta astringencia comprenden, por ejemplo, una reacción de hibridación a 68°C en 0,1xSSC y una disolución de SDS al 0,1 %. Preferiblemente, se entiende que la hibridación en condiciones de astringencia en los diferentes aspectos de la presente invención es: 1) Hibridar una sonda marcada con una muestra de ácido nucleico a analizar a 65°C, o en el caso de sondas oligonucleotídicas, a 5°C por debajo de la temperatura de hibridación o fusión del dúplex que consiste en el oligonucleótido y la muestra (se entiende, en el texto que sigue, que la temperatura de hibridación y de fusión son sinónimos) durante una noche en Tris 50 mM pH 7,5, NaCI 1 M, SDS al 1%, Sulfato de Dextrano al 10% y 0,5 mg/ml de ADN de esperma de salmón o de arenque desnaturalizado. 2) Lavar durante 10 minutos en 2xSSC a temperatura ambiente. 3) Lavar durante 30 minutos en 1xSSC/SDS al 0,1 % a 65°C (o en el caso de oligonucleótidos: 5°C por debajo de la temperatura de hibridación). 4) Lavar durante 30 minutos en 0,1xSSC/SDS al 0,1% a 65°C (o en el caso de oligonucleótídos: 5°C por debajo de la temperatura de hibridación). Los oligonucleótídos son polinucleótidos y preferiblemente fragmentos de ADN que tienen una longitud de 15 a 30, preferiblemente 20 nucleótidos. La temperatura de hibridación se determina de acuerdo con la fórmula Tm=2x (número de A+T) + 4x (número de G+C)°C. Para preparar una disolución 2xSSC ó 0,1xSSC (o cualquier otro tipo de dilución de SSC), se diluye, por ejemplo, una disolución 20x SSC de forma acorde. 20xSSC consiste en NaCI 3 M/Na-Citrato 0,3 M x2H2O. Antes de realizar una reacción de hibridación, los polinucleótidos, si se quiere después de realizar una separación electroforétíca (después: Transferencia Southern (ADN) o Transferencia Northern (ARN)) o sin separación electroforética (transferencia slot o dot), se transfieren a una membrana adecuada, por ejemplo, una membrana de nilón o de nitrocelulosa. La hibridación se realiza utilizando una sonda marcada adecuadamente. Las técnicas de mareaje adecuadas son, por ejemplo, mareaje radiactivo o mareaje usando colorantes fluorescentes. La sonda es un polirribo o polidesoxirribonucleótido monocatenario que es monocatenario de manera natural o que es normalmente bicatenario y se ha hecho monocatenario por desnaturalización. Esta sonda se une a la muestra de ADN o de ARN (que también está en estado monocatenario) por emparejamiento de bases. El ADN puede, por ejemplo, inmovilizarse directamente en la matriz de un chip (tal como, por ejemplo, Affymetrix Chips, etc.) o en una membrana adecuada (por ejemplo, Nitrocelulosa, Nilón u otras adecuadas para transferencia dot o slot) o puede transferirse a una matriz de gel, separarse electroforéticamente y transferirse posteriormente a una membrana adecuada (por ejemplo, Nitrocelulosa, Nilón u otras adecuadas para Transferencias Southern). Los chips o membranas adecuados, así como los métodos correspondientes son muy conocidos en la técnica. Los métodos anteriores, tales como Hibridación a Chip, Transferencia Dot / Slot o Southern, son muy conocidos en la técnica (para referencia, se puede referir, por ejemplo, a la bibliografía listada más adelante). La elección y diseño de sondas adecuadas es muy conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., o Current Protocols in Molecular Biology). Lo mismo resulta cierto para la preparación de dichas sondas, que también están disponibles a partir de proveedores comerciales (tales como MetaBion, Martinsried, Alemania). Es adecuada, por ejemplo, cualquier sonda con una afinidad mayor para una parte de la secuencia genómica de Kir6.2 que comprende las posiciones de nucleótidos que corresponden a las posiciones 67/68/69 y/o 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora que presenta al menos un intercambio de nucleótidos que da lugar a uno de los intercambios de aminoácidos anteriores en la posición 23 y / o posición 337 de la proteína Kir6.2. Las sondas adecuadas cubren, por ejemplo, probablemente los Tripletes de nucleótidos genómicos según la figura 6. La presencia del intercambio de aminoácidos también puede determinarse mediante el análisis del ARN del individuo. Las técnicas adecuadas son muy conocidas en la técnica y comprenden, por ejemplo: técnicas de RT PCR, hibridación a chip o Transferencia Northern.

Según otra modalidad preferida de la presente invención, la presencia del intercambio de aminoácidos se determina mediante un método que comprende o consiste en las etapas siguientes: a. Proporcionar una muestra biológica que contiene ARN de un individuo. b. Si el ARN no se va a analizar directamente (tal como, por ejemplo, mediante PCR in-situ) el ARN se aisla o al menos se purifica parcialmente a partir de la muestra según a). c. Amplificar un fragmento de polinucleótído mediante una reacción de RT-PCR utilizando cebadores capaces de amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones 67 y / o 1.009 de la secuencia de ADNc de Kir6.2 d. Secuenciar el fragmento de polinucleótido según c). La secuenciación puede realizarse según procedimientos estándar. La visualización de la escalera de la secuencia generada puede realizarse, por ejemplo, mediante la utilización de cebadores o nucleótidos marcados con fluorescencia o radiactividad. La presencia o ausencia de uno o más intercambios de nucleótidos en la secuencia codificadora de Kir6.2 que dan lugar a un intercambio de aminoácidos en la posición 337 y/o 23 en la proteína Kir6.2 puede determinarse entonces mediante el análisis de la secuencia conseguida y comparándola con la secuencia de Kir6.2 de tipo salvaje. La elección y diseño de cebadores adecuados es muy conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., o Current Protocols in Molecular Biology). Lo mismo resulta cierto para la preparación de dichos cebadores, que también están disponibles a partir de proveedores comerciales (tales como MetaBion, Martinsried, Alemania). Es adecuado, por ejemplo, cualquier conjunto de cebadores capaz de amplificar un polinucleótido que comprende al menos una parte de la secuencia codificadora de Kir6.2 que se extiende de la posición 67 a 69 y / o posiciones 1.009 a 1.011. Los cebadores preferidos son, por ejemplo, aquellos según SEQ ID No 9 a 12. Según otra modalidad preferida de la presente invención, la presencia del intercambio de aminoácidos se determina mediante un método que comprende o consiste en las etapas siguientes: a. Proporcionar una muestra biológica que contiene ARN de un individuo. b. Aislar ARN a partir de la muestra según a). c. Inmovilizar el ARN en un vehículo. d. Hibridar el ARN con una o más sondas capaces de unirse en condiciones astringentes al ARN de Kir6.2 que codifica un polipéptido Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamíníco en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337 con mayor afinidad que la que presentan con un ARN de Kir6.2 que codifica un polipéptido Kir6.2 que presenta Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o Valina en la posición 337. La hibridación puede visualizarse según procedimientos estándar tales como autorradiografía o fluorescencia utilizando sondas marcadas según el caso. La presencia o ausencia de un intercambio de nucleótidos en la Secuencia codificadora de Kir6.2 que da lugar a un intercambio de aminoácidos en la posición 337 y/o 23 en la proteína Kir6.2 puede determinarse entonces mediante el análisis del patrón de hibridación y / o la intensidad de la señal y comparándolo con la de una muestra control que contiene ARN de Kír6.2 de tipo salvaje. El ARN puede, por ejemplo, inmovilizarse directamente en la matriz de un chip o en una membrana adecuada antes de la hibridación o puede ponerse en una matriz de gel y transferirse a una membrana adecuada después de realizar electroforesis en gel (Transferencia Northern). Para referencia, véase, por ejemplo, la bibliografía listada más adelante. La elección y diseño de sondas adecuadas es muy conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., o Current Protocols in Molecular Biology). Lo mismo resulta cierto para la preparación de dichas sondas, que también están disponibles a partir de proveedores comerciales tales como MetaBion, Martinsried, Alemania. Es adecuada, por ejemplo, cualquier sonda con una afinidad mayor para una parte de la secuencia de ARN de Kir6.2 que comprende las posiciones 67 a 69 y/o las posiciones 1.009 a 1.011 que presentan al menos un intercambio de nucleótidos que da lugar a uno de los intercambios de aminoácidos anteriores en la posición 23 y / o posición 337 de la proteína Kir6.2. La presencia del intercambio de aminoácidos también puede determinarse analizando el proteoma del individuo (es decir, las proteínas expresadas en el individuo). Las técnicas adecuadas son muy conocidas en la técnica y comprenden, por ejemplo: Análisis proteómico con chip, técnicas inmunohistológicas o inmunoquímícas a partir de muestras de proteínas, celulares o tisulares o análisis por Transferencia Western. Para referencia se refiere, por ejemplo, a la bibliografía listada más adelante. Según otra modalidad preferida de la presente invención, la presencia del intercambio de aminoácidos se determina mediante un método que comprende o consiste en las etapas siguientes: a. Proporcionar una muestra biológica que contiene proteínas de un individuo. b. Aislar la proteína a partir de la muestra según a). c. Inmovilizarla en un vehículo. d. Realizar una reacción de unión con un anticuerpo capaz de unirse con mayor afinidad a Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamíníco en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídica que a Kir6.2 que presenta Ácido Glutamínico en la posición 337 y/o Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídica (en condiciones que no permiten la unión a la proteína de tipo salvaje o que lo hacen pero con una afinidad mucho menor); e. Hacer visible la unión del anticuerpo a la proteína; (por ejemplo, mediante un primer anticuerpo marcado o un segundo anticuerpo marcado, etc.) La proteína puede, por ejemplo, inmovilizarse directamente en la matriz de un chip o en una membrana adecuada o en otro tipo de vehículo, tal como una placa de ELISA. La proteína también puede ponerse en un gel, y transferirse a e inmovilizarse en un vehículo (tal como una membrana adecuada) después de haberse realizado una electroforesis en gel (Transferencia Western). Según otra modalidad preferida más de la presente invención, la presencia del intercambio de aminoácidos se determina mediante un método que comprende o consiste en las etapas siguientes: a. Proporcionar una muestra histológica de un individuo. b. Realizar una reacción de unión con un anticuerpo capaz de unirse con mayor afinidad a Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídica que a Kir6.2 que presenta Ácido Glutamínico en la posición 337 y/o Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídica (en condiciones que no permiten la unión a la proteína Kír6.2 de tipo salvaje o al menos con una afinidad mucho menor). c. Hacer visible la unión del anticuerpo a la proteína; (por ejemplo, medíante un primer o segundo anticuerpo marcado). La presencia o ausencia de la mutación puede determinarse entonces analizando la muestra histológica marcada y comparando la intensidad de la señal con la de una muestra control (por ejemplo, una muestra del mismo paciente tratada con un primer anticuerpo o antisuero inespecífico (es decir, un primer anticuerpo o antisuero que no es reactivo para Kir6.2 que presenta la mutación o que reacciona mucho menos con Kir6.2 que presenta la mutación si se compara con el primer anticuerpo o antisuero específico) o con un primer anticuerpo específico para la proteína Kir6.2 de tipo salvaje y / o una muestra control que se sabe que contiene sólo la proteína Kir6.2 de tipo salvaje). La detección de la unión se realiza preferiblemente mediante métodos inmunohistoquímícos o inmunorradiológicos. Según una modalidad preferida de los métodos anteriores, el intercambio de aminoácidos en la posición 23 es de Glu (tipo salvaje) a Lys; también se prefiere que el intercambio de aminoácidos en la posición 337 sea de Val (tipo salvaje) a He. Respecto a los diferentes aspectos de la presente invención, la cardiopatía coronaria es preferiblemente una enfermedad arterial coronaria y es aún más preferido si es angina de pecho. Según más modalidades preferidas de los diferentes aspectos de la presente invención se determina en la muestra la presencia de Kir6.2-23-KK (variantes de la proteína Kir6.2 que tienen Usina (K) en la posición 23 de la proteína como consecuencia de un polimorfismo de nucleótidos en ambos alelos del gen Kir6.2) y / o Kír6.2-337-ll (variantes de la proteína Kir6.2 que tienen Isoleucina (I) en la posición 337 de la proteína como consecuencia de un polimorfismo de nucleótidos en ambos alelos del gen Kir6.2). La muestra puede ser cualquier muestra que contiene Kir6.2 que presenta el o los polimorfismos respectivos. Es ventajoso que las muestras se preparen de manera que se facilite el ensayo de su o sus polimorfismos respectivos. Los ejemplos adecuados dependen del método de detección aplicado y son, por ejemplo, muestras histológicas, extractos celulares o tisulares o células, preferiblemente si se aislan del cuerpo humano. Las técnicas adecuadas para la identificación de los polimorfismos respectivos, tales como PCR, técnicas de matrices basadas en ácidos nucleicos o proteínas, técnicas inmunohistológicas o ¡nmunoquímicas utilizando anticuerpos adecuados, son conocidas por el experto en la técnica. Lo mismo resulta cierto para la elección y producción de conjuntos de cebadores adecuados y anticuerpos o anti-sueros. Respecto a dichas técnicas se refiere, por ejemplo, a la bibliografía listada más adelante. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de ensayo para ensayar la presencia de un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y / o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2, Kir6.2-23-KK o Kír6.2-337-ll, en el que el kit contiene al menos un medio para la detección de dicha presencia en la proteína. En el contexto de la presente invención, un kit de partes (abreviado: kit) se entiende que es cualquier combinación de los componentes identificados en esta solicitud que están combinados, coexistiendo en el espacio, en una unidad funcional, en el que el kit puede contener más componentes. Los medios pueden ser, por ejemplo, un anticuerpo que discrimina en sus características de unión entre Kír6.2 que presenta Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o Valina en la posición 337 y una proteína Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337. La fabricación de anticuerpos específicos es muy conocida en la técnica. Para referencia se refiere, por ejemplo, a la bibliografía listada más adelante. Más aún, se prefiere que el kit contenga un anticuerpo secundario marcado. El kit puede contener además reactivos, tampones, etc. adecuados para realizar las reacciones de unión y / o mareaje y semejantes. También es adecuado que se incluyan instrucciones para la utilización (tales como un manual u hoja que describe las condiciones de reacción, composición de los tampones, etc. adecuadas). Según un ejemplo preferido, el medio es un anticuerpo (es decir, un anticuerpo monoclonal, un antisuero policlonal o un anticuerpo recombinante) que diferencia en sus características de unión entre Kir6.2 de tipo salvaje y Kir6.2 que presenta un intercambio de aminoácidos en la posición 23 y/o 337. Dicho anticuerpo puede unirse, por ejemplo, con mayor afinidad a la proteína Kir6.2 que es de tipo salvaje respecto a la posición 23 y / o 337 o puede unirse con mayor afinidad a una ó más de las variantes menos frecuentes respecto a la posición 23 y / o 337. También es ventajoso que se incluya un conjunto de anticuerpos en el kit de ensayo, en el que cada anticuerpo es capaz de detectar específicamente uno de los polimorfismos; prácticamente, también se incluye un anticuerpo control que reconoce sólo la proteína de tipo salvaje (y posiblemente también un anticuerpo o antisuero inespecífico para determinar las señales de fondo), y también pueden incluirse reactivos útiles o necesarios para realizar la técnica de detección elegida (tales como transferencias de proteínas, técnicas de matrices u otras técnicas ¡nmunológicas o inmunohistoquímicas). El acceso a o la fabricación de anticuerpos adecuados y la elección de reactivos útiles o necesarios para formar kits de ensayo es muy conocido en la técnica. Más aún, la fabricación de anticuerpos con las características de unión deseadas la realizan comercialmente diferentes proveedores, tales como BioTrend, Colonia, Alemania. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de ensayo para ensayar la presencia de una variación en la secuencia de nucleótidos de Kir6.2 en uno o ambos alelos del gen Kír6.2 que da lugar a una secuencia polipeptídica de Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2, en el que el kit contiene al menos un medio para la detección de dicha variación en la secuencia de nucleótidos. Otro medio es, por ejemplo, un cebador de secuenciación adecuado o un conjunto de cebadores para la amplificación específica de ADN o ARN sólo de Kir6.2 de tipo salvaje y/o un conjunto de cebadores para la amplificación de ADN o ARN sólo de Kir6.2 que presenta una mutación en la posición 23 y/o 337. La elección de y el acceso a cebadores adecuados que se pueden utilizar para la secuenciación o amplificación específica de determinadas secuencias es una capacidad del experto en la técnica (véanse, por ejemplo, cebadores y condiciones según el ejemplo 2). Los reactivos útiles y necesarios para realizar la reacción de secuenciacíón o la amplificación, tales como una polimerasa, tampones, nucleótidos etc. también pueden incluirse en el kit de ensayo (véanse, por ejemplo, cebadores y condiciones según el ejemplo 2). Es muy ventajoso que el kit contenga un conjunto de diferentes cebadores de secuenciación o conjuntos de cebadores de PCR que sean específicos para diferentes polimorfismos de Kir6.2, de manera que puede determinarse la presencia de diferentes tipos de polimorfismos de Kir6.2. Según otra modalidad preferida, el medio es una sonda de ácido nucleico que reconoce Kir6.2 de tipo salvaje y / o Kir6.2 que presenta una mutación en la posición 23 y/o 337. El acceso a y la elección de sondas útiles para realizar la técnica de detección elegida (por ejemplo, todos los tipos de transferencia de ácidos nucleicos, técnicas de matrices u otro tipo de técnicas con chip) también reside en la capacidad del experto en la técnica. Lo mismo ocurre con la elección de reactivos adecuados que también pueden incluirse en el kit de ensayo. Preferiblemente, en el kit de ensayo se incluye un conjunto de diferentes sondas que reconocen diferentes polimorfismos. El aminoácido en la posición 23 es preferiblemente Lys y el de la posición 337 es preferiblemente lie. Se prefiere que la secuencia de nucleótidos de Kir6.2 presente una G en la posición 67 de la secuencia codificadora. También se prefiere que la secuencia de nucleótidos de Kir6.2 presente una A en la posición 1.009 de la secuencia codificadora. Según una modalidad preferida, el kit de ensayo contiene un conjunto de cebadores capaz de amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones 67 y / o 1.009 de la secuencia codificadora de Kir6.2. Los cebadores preferidos son, por ejemplo, aquellos según SEQ ID No 9 a 12. Según otra modalidad preferida, el kít de ensayo contiene al menos un conjunto de cebadores para amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones 5.657.106/7/8 y / o 5.657.978/79/80 de la secuencia genómica de Kir6.2 según SEQ ID No. 13. Los cebadores preferidos son, por ejemplo, aquellos según SEQ ID No 9 a 12. Según otra modalidad preferida, el kit de ensayo contiene una o más sondas de ácido nucleico que reconocen específicamente el ADN o ARN genómico de Kir6.2 con una secuencia de nucleótidos que codifica un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337 en condiciones astringentes. Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido Kir6.2 aislado o a un fragmento de éste que presenta Lisina en la posición 23 e Isoleucina en la posición 337 de la secuencia polipeptídica. Una modalidad preferida de la invención se refiere a un polipéptido Kir6.2 aislado según SEQ ID No.7 o a un fragmento de éste que comprende las posiciones de aminoácidos 23 y / o 337. Otro aspecto más de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica uno de los polipéptidos K23/I337- Kir6.2 anteriores o fragmentos de éstos que comprenden las posiciones 23 y 337. Una modalidad preferida de la invención se refiere a un polinucleótido Kir6.2 aislado según SEQ ID No.8 o a un fragmento de éste que comprende las posiciones de nucleótidos 67 y 1.009 (preferiblemente también las posiciones 68, 69, 1.010 y 1.011), o a un polinucleótido aislado que híbrida con las secuencias de ADN anteriores o sus cadenas complementarias en condiciones de alta astringencia. Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido Kir6.2 aislado o a un fragmento de éste que presenta Ácido Glutamínico en la posición 23 e Isoleucina en la posición 337 de la secuencia polipeptídica. Una modalidad preferida de la invención se refiere a un polipéptido Kir6.2 aislado según SEQ ID No.5 o a un fragmento de éste que comprende las posiciones de aminoácidos 23 y / o 337.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica uno de los polipéptidos E23/I337- Kir6.2 anteriores o fragmentos de éstos que comprenden las posiciones 23 y 337. Una modalidad preferida de la invención se refiere a un polinucleótido Kir6.2 aislado según SEQ ID No.6 o a un fragmento de éste que comprende las posiciones de nucleótidos 67 y 1.009 (preferiblemente también las posiciones 68, 69, 1.010 y 1.011), o a un polinucleótido aislado que híbrida con las secuencias de ADN anteriores o sus cadenas complementarias en condiciones de alta astringencia. Otro aspecto de la invención se refiere a una sonda para la detección de variaciones de nucleótidos en el gen o ARN de Kir6.2 que comprende o consiste en al menos 17, preferiblemente 19 a 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia de Kir6.2 que abarca la posición 67 y / o 1.009 de la secuencia codificadora de Kir6.2 o que abarca las posiciones 5.657.106/07/08 y/o 5.657.978/79/80 de la secuencia genómica de Kir6.2. Otro aspecto de la invención se refiere a cebadores o conjuntos de cebadores para la amplificación de polinucleótidos Kir6.2 en el que los polinucleótidos amplificados comprenden al menos la posición 67 y / o 1.009 de la secuencia codificadora de Kir6.2 y/o la posición 5.657.106/07/08 y/o 5.657.978/79/80 de la secuencia genómica de Kir6.2. En el texto que sigue, la presente invención se explica con más detalle mediante varios ejemplos, que no se pretende que limiten el alcance de la presente invención.

Ejemplos: Los polimorfismos de Kir6.2 en la posición 23 y en la posición 337 de la proteína Kir6.2 (NCBI número de registro para la secuencia de la proteína de tipo salvaje: D 50582 (SEQ. ID No 1.; Figura 1A); NCBI número de registro para la secuencia codificadora: D 05852 (SEQ. ID No. 2; Figura 1 B)) se analizaron en una cohorte de pacientes con diabetes tipo I y II (principalmente tipo II, es decir, diabetes mellitus). Ejemplo 1 : Sujetos de estudio (población de estudio) El ADN genómico de 335 pacientes se cribó para SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) en el gen Kir6.2 que da lugar a las variantes de la proteína Kir6.2-E23K y Kir6.2-V337l. Los criterios de inclusión fueron: Individuo caucásico de ascendencia Germana, condición clínica estable y angiograma coronario. Los criterios de exclusión fueron: enfermedad aguda distinta de ACS, enfermedad no cardiaca crónica (es decir, artritis reumática) e historia de enfermedad maligna en los cinco años previos. Las características básicas de esta cohorte de pacientes se presentan en la Tabla 2. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado por escrito. Ejemplo 2: Detección de SNP mediante secuenciación y análisis 2,1 : Amplificación de la región genómica con polimorfismo de interés Cebadores de amplificación: A: Para la detección de un intercambio de nucleótidos en las posiciones 5.657.978/79/80 de la secuencia del gen Kír6.2 con el número de registro NT_009307. Cebador directo M67: 5'-AGGTGGAGGTAAGGAAGAG-3' (SEQ ID. No. 9) Cebador inverso M67: 5'-GGTGAAGATGAGCAATGTG-3' (SEQ ID. No. 10) B: Para la detección de un intercambio de nucleótidos en las posiciones 5.657.106/07/08 de la secuencia del gen Kir6.2 con el número de registro NT_009307. Cebador directo M1009: 5'-GGGTGGCAACAGCATCTTC-3' (SEQ ID. No.11) Cebador inverso M1009: 5'-TGGCTCAGGACAGGGAATC-3' (SEQ ID. No.12) Los cebadores también pueden aplicarse para la amplificación de las secuencias codificadoras de Kir6.2. Protocolo de PCR para la amplificación: Todos los reactivos son de Applied Biosystems (Foster City, EE.UU): 20 ng de ADN genómico; 1 unidad de TaqGold-polimerasa; tampón 1 x Taq-polímerasa; 500 µM de dNTP; 2,5 mM de MgCI2; 200 nM de cada par de cebadores de amplificación (para la secuencia véase Pares de cebadores para la amplificación 1.A y 1.B más arriba); H2O hasta 5 µl. Programa de amplificación para PCR/genotipado: 95°C x 10 min x 1 ciclo 95°C x 30 s 70°Cx30s x 2 ciclos; 95°C x 30 s 65°Cx30s x 2 ciclos; 95°C x 30 s 60°C x 30 s x 2 ciclos; 95°C x 30 s 56°C x 30 s 72°Cx30s x 40 ciclos; 72°Cx10min 4°C x 30 s x 1 ciclo; 2,2: Identificación de polimorfismos de interés Protocolo para la minisecuenciación y detección de polimorfismos: Todos los reactivos son de Applied Biosystems (Foster City, EE.UU.).2 µl de producto de PCR purificado; 1,5 µl de kit BigDye terminator; 200 nM de un cebador de secuenciación (para la secuencia véase cebador directo o inverso de amplificación 1.A y 1.B más arriba); H2O, hasta 10 µl.

Programa de amplificación para la secuenciación: 96°C x 2min x 1 ciclo; 96°C x 10 s 55°C x 10 s 65°C x 4min x 30 ciclos; 72°C x 7 min 4°C x 30 s x 1 ciclo; Análisis de los productos de secuenciación: Las secuencias se analizaron en primer lugar con programas de análisis de la secuenciación (Applied Biosystems, Foster City, EEUU) para la extracción de los datos sin procesar y se procesaron con Phred (llamada a bases), Phrap (ensamblaje), Polyphred (llamada a SNP) y Consed (vista de resultados). Phred, Phrap, Polyphred y Consed son programas diseñados en WashU por Phil Green (http://www.genome.washington.edu). Las reacciones de PCR dieron lugar a la identificación de un intercambio de G por A en la posición 67 y de A por G en la posición 1.009 de la secuencia codificadora. 2,3: Correlación de los intercambios de aminoácidos en la Proteína Kír6.2 con cardiopatía coronaria Con el fin de analizar la influencia de los polimorfismos de Kir6.2 en el resultado clínico en pacientes con trastornos cardiovasculares y metabólicos, los inventores realizaron análisis de correlación de los polimorfismos de Kir6.2 E23K, L270V y I337V en una cohorte de pacientes de 335 individuos con diabetes tipo I o II. Con más de 350 parámetros clínicos la angina de pecho correlacionó significativamente con pacientes homocigotos para Lisina (K) en la posición 23 y/o Valina (V) en la posición 337 de la proteína Kir6.2. Kir6.2-23-EE (tipo salvaje para la posición 23) define el grupo de individuos en el que los dos alelos de Kir6.2 codifican una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Ácido Glutámico (Glu o E) en la posición 23 de la proteína Kir6.2, siendo este grupo homocigoto para este polimorfismo de Kir6.2 en la posición 23 de la proteína Kir6.2. K¡r6.2-23-EK define el grupo de individuos en el que uno de los alelos de Kir6.2 codifica una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Ácido Glutámico (Glu o E) en la posición 23 de la proteína Kir6.2 y el otro alelo de Kir6.2 codifica una variante del gen de Kír6.2 que da lugar a Lisina (Lys o K) en la posición 23 de la proteína Kir6.2, siendo este grupo heterocigoto para estos polimorfismos de Kir6.2 en la posición 23 de la proteína Kír6.2. Kir6.2-23-KK define el grupo de individuos en el que los dos alelos de Kir6.2 codifican una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Lisina (Lys o K) en la posición 23 de la proteína Kír6.2, siendo este grupo homocigoto para este polimorfismo de Kir6.2 en la posición 23 de la proteína Kír6.2. Kir6.2-23-KK también define una muestra biológica de pacientes en la que los dos alelos de Kir6.2 codifican una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Lisina (Lys o K) en la posición 23 de la proteína Kir6.2. Kir6.2-337-11 define el grupo de individuos en el que los dos alelos de Kir6.2 codifican un variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Isoleucina (lie o I) en la posición 337 de la proteína Kir6.2, siendo este grupo homocigoto para este polimorfismo de Kir6.2 en la posición 337 de la proteína Kir6.2. Kir6.2-337-11 también define una muestra biológica de pacientes en la que los dos alelos de Kir6.2 codifican una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Isoleucína (lie o I) en la posición 337 de la proteína Kir6.2. Kir6.2-337-IV define el grupo de individuos en el que uno de los alelos de Kir6.2 codifica una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Isoleucína (lie o I) en la posición 337 de la proteína Kir6.2 y el otro alelo de Kir6.2 codifica una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Valina (Val o V) en la posición 337 de la proteína Kir6.2, siendo este grupo heterocígoto para estos polimorfismos de Kir6.2 en la posición 337 de la proteína Kír6.2. Kir6.2-337-W (tipo salvaje para la posición 337) define el grupo de individuos en el que los dos alelos de Kir6.2 codifican una variante del gen de Kir6.2 que da lugar a Valina (Val o V) en la posición 337 de la proteína Kir6.2, siendo este grupo homocigoto para este polimorfismo de Kir6.2 en la posición 337 de la proteína Kír6.2. Métodos estadísticos para la correlación genotipo/fenotipo: Todos los análisis se realizaron con el paquete estadístico SAS (Versión 6.12, SAS Institute GmbH, Heidelberg/Alemania). Para la detección de asociaciones entre polimorfismos genéticos y un gran número de parámetros clínicos relevantes, se calcularon estadísticas descriptivas (mediana, cuartiles) y se realizaron ensayos de Wilcoxon de suma de rangos. El ensayo de Wilcoxon de suma de rangos se utiliza para la comparación de dos muestras independientes. El cálculo de la estadística del ensayo se basa en rangos en la muestra agrupada. La búsqueda de asociaciones entre los SNP y factores de riesgo y enfermedades se realizó de una manera similar. Se realizó el Ensayo de Chi-Cuadrado y se calcularon números y porcentajes para describir los datos. El Ensayo de Chi-Cuadrado es un ensayo estadístico para calcular la dependencia de dos variables. Los valores de las variables están contenidos en dos o más clases. Para analizar la asociación de estas variables se utilizó una tabla de contingencia. Esta tabla contiene tantas filas como el número de modalidades de la primera variable y tantas columnas como el número de modalidades de la segunda variable. Cada celdilla contiene una característica especial del paciente. Para construir un ensayo estadístico, se calculan las diferencias de las frecuencias calculadas y observadas. Después de inspeccionar los resultados, se seleccionaron las variables relevantes. Para tener en cuenta las co-variables de confusión, se utilizó una regresión logística para validar los resultados. El método de la regresión logística se utiliza para analizar la influencia de varias variables explicativas en una variable determinada de respuesta. El ensayo estadístico asociado proporciona un valor p. La interpretación de este valor p es que existe una influencia significativa de la variable explicativa asociada.

Para una variable binaria, se calculó la razón de posibilidades. La razón de posibilidades es la razón de las posibilidades de que un evento se producirá en un grupo respecto a las posibilidades de que el evento se producirá en el otro grupo. Ejemplo 3: Análisis La distribución de las variantes de Kir6.2, E23K y V337I en 335 individuos se muestra en la Tabla 2. Como se indica en las Tablas 3 a 8, puede observarse una relación sólida de Kir6.2-23-KK y Kir6.2-337-ll, Kir6.2-23-EK y Kir6.2-337-VI y Kir6.2-23-EE y Kir6.2-337-W. Por lo tanto, todos los datos de los análisis estadísticos obtenidos para, por ejemplo, Kir6.2-23-KK deben ser similares a los de Kir6.2-337-ll. Los pacientes diabéticos que presentan Kir6.2-23-KK y Kir6.2-337-II muestran una asociación incrementada con angina de pecho. La significancia estadística calculada con el ensayo de Chi-cuadrado para la asociación del genotipo Kir6.2-23-KK en pacientes diabéticos con angina de pecho es valor p = 0,015 y para la asociación del genotipo Kir6.2-337-ll en pacientes diabéticos con angina de pecho es valor p = 0,012 (Figura 2A y Figura 3A). La regresión logística para analizar la influencia de factores de confusión, tales como infarto de miocardio e hipertensión resultó en un valor p = 0,0088 para la asociación del genotipo Kir6.2-23-KK en pacientes diabéticos con angina de pecho y valor p = 0,0072 para la asociación del genotipo Kir6.2- 337-II en diabetes con angina de pecho (Figura 2B y Figura 3B).

Las razones de posibilidades de un riesgo incrementado de angina de pecho en pacientes diabéticos con el genotipo Kir6.2-23-KK es 1 ,601 y con genotipo Kir6.2-337-ll 1 ,615 (Figura 2C y Figura 3C). Los datos mostrados en la presente memoria demuestran que las mutaciones en el gen de Kir 6.2 que dan lugar a un intercambio en la posición 23 de Glutamina por Lisina, especialmente Kir6.2-23-KK y las mutaciones en el gen de Kir6.2 que dan lugar a un intercambio de aminoácidos en la posición 337 de Valina por Isoleucina, especialmente Kir6.2-337-ll, representan unos marcadores de riesgo para la angina de pecho en pacientes diabéticos. Como la angina de pecho es un signo de cardiopatía coronaria, puede esperarse que estos marcadores sean indicativos de cardiopatía coronaria en general. Más aún, puede esperarse que otras mutaciones en el gen de Kir6.2 que dan lugar a un intercambio de aminoácidos en la posición 23 en la proteína Kir6.2, especialmente aquellos en los que se intercambia la Glutamina que es acida por un aminoácido no i polar o preferiblemente básico, tengan el mismo efecto o un efecto similar. Los mismo puede esperarse para intercambios de aminoácidos en la posición 337 que intercambian Valina por otros aminoácidos especialmente aminoácidos alifáticos ácidos o básicos o más voluminosos. Es muy probable que estos intercambios de aminoácidos también correlacionen muy de cerca con la aparición de cardiopatía coronaria, especialmente angina de pecho, en pacientes no diabéticos. Bibliografía: Yamada Y, Kuroe A, Li Q, Someya Y, Kubota A, Ihara Y, Tsuura Y, Seino Y (2001). Genomic variation in pancreatic ion channel genes in Japanese type 2 diabetic patients. Diabetes Metab Res Rev 17:213-216. Hani EH, Boutin P, Durand E, Inoue H, Permutt MA, Velho G, Froguel P (1998). Missense mutations ¡n the pancreatic islet beta cell inwardly rectifying K+ channel gene (KIR6.2/BIR): a meta-analysis suggests a role in the polygenic basis of Type II diabetes mellitus in Caucasians. Díabetologia 41 :1511-1515. Bibliografía estándar para métodos de laboratorio Si no se indica otra cosa, los métodos de laboratorio estándar se realizaron según la bibliografía estándar siguiente: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pág; Current Protocols in Molecular Biology; actualizado regularmente, por ejemplo, Volumen 2000; Wiley & Sons, Ine; Editores: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl. Current Protocols in Human Genetics; actualizado regularmente; Wiley & Sons, Ine; Editores: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith. Current Protocols in Protein Science; actualizado regularmente; Wiley & Sons, Ine; Editores: John E. Coligan, Bén M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wíngfield. Molecular Biology of the Cell; tercera edición; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. Nueva York y Londres, 1994; Short Protocols in Molecular Biology, 5a edición, por Frederick M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), octubre 2002, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York" Leyendas de las Figuras: Figura 1 : Secuencia proteica y secuencia de nucleótidos codificadora de Kir6.2 (KCNJ11) que presenta las variantes más frecuentes en la posición 23 (Ácido Glutámico) y en la posición 337 (Valina) de la cadena polipeptídíca (que se corresponden con los codones GAG en las posiciones 67/68/69 y GTC en las posiciones 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora). Estas variantes se refieren como Kir6.2-23K-337V (o KK y/o W si ambos alelos son ¡guales respecto a la posición 23 y/o 337). El número de registro de la proteína (base de datos de proteínas NCBI) de esta variante de Kir6.2 es D50582. Las posiciones 23 y 337 de la secuencia polipeptídica y las posiciones de los nucleótidos correspondientes, así como el ATG en la secuencia codificadora están subrayadas. Figura 2: Secuencia proteica y secuencia de nucleótidos codificadora de Kir6.2 (KCNJ11) que presenta la variante Lisina en la posición 23 y la variante más frecuente Valina en la posición 337 (que se corresponden con los codones AAG en las posiciones 67/68/69 y GTC en las posiciones 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora). El número de registro de la secuencia proteica (base de datos de proteínas NCBI) de esta variante de Kir6.2 es XP_006398 (Figura 2A; SEQ ID No. 2). El número de registro de la secuencia de nucleótidos (base de datos de nucleótidos NCBI) es XM_006398 (Figura 2B; SEQ ID No. 4). Las posiciones 23 y 337 de la secuencia polipeptídica y las posiciones de los nucleótidos correspondientes en la secuencia codificadora están subrayadas. Figura 3: Secuencia proteica y secuencia de nucleótidos codificadora de Kir6.2 (KCNJ11) que presenta la variante más frecuente Ácido Glutámico en la posición 23 y la variante Isoleucina en la posición 337 (que se corresponden con los codones GAG en las posiciones 67/68/69 y ATC en las posiciones 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora). La secuencia proteica se corresponde con la de Kir6.2 de "tipo salvaje" según el número de registro de secuencia D50582 excepto para la posición 337, que presenta una Isoleucina en lugar de una Valina. La secuencia codificadora se corresponde con la de Kír6.2 de "tipo salvaje" según el número de registro de secuencia D50582 excepto para la posición 1.009, que presenta una Adenosina en lugar de una Guanosina. Las posiciones 23 y 337 de la secuencia polipeptídica y las posiciones de los nucleótidos correspondientes en la secuencia codificadora están subrayadas. Figura 4: Secuencia proteica y secuencia de nucleótidos codificadora de Kir6.2 (KCNJ11) que presenta la variante Lisína en la posición 23 y la variante Isoleucina en la posición 337 (que se corresponden con los codones AAG en las posiciones 67/68/69 y ATC en las posiciones 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora). La secuencia proteica se corresponde con la de Kir6.2 de "tipo salvaje" según el número de registro de secuencia D50582 excepto para la posición 23, que presenta una Lisina en lugar de un Ácido Glutamínico y la posición 337, que presenta una Isoleucina en lugar de una Valina. La secuencia codificadora se corresponde con la de Kir6.2 de "tipo salvaje" según el número de registro de secuencia D50582 excepto para la posición 67, que presenta una Adenosina en lugar de una Guanosína y la posición 1.009, que presenta una Adenosina en lugar de una Guanosina. Las posiciones 23 y 337 de la secuencia polipeptídica y las posiciones de los nucleótidos correspondientes en la secuencia codificadora están subrayadas. Figura 5: Cebadores de ADN M67 directos (SEQ ID No.9) e inversos (SEQ ID No.10) para la detección de intercambios de nucleótidos en las posiciones de la secuencia genómica de Kir6.2 que corresponden a las posiciones 67 / 68/ 69 de la secuencia codificadora de Kir6.2 y cebadores de ADN M1009 directos (SEQ ID No.11) e inversos (SEQ ID No.12) para la detección de intercambios de nucleótidos en las posiciones de la secuencia genómica de Kir6.2 que corresponden a las posiciones 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora de Kir6.2 según el número de registro de secuencia. Respecto a SEQ ID No. 25, las posiciones son 5.657.106/107/108 y 5.657.978/79/80, respectivamente. El conjunto de cebadores también es aplicable a la amplificación específica del ADNc de Kir6.2 según el número de registro de secuencia NCBI D50582. Los cebadores M67 directos (SEQ ID No. 9) e inversos (SEQ ID No. 10) amplifican una región que comprende los nucleótidos 67/68/69 del ADNc de Kir6.2 para la detección de intercambios de nucleótidos en el gen de Kir6.2 a nivel del ARN. Los cebadores M1009 directos (SEQ ID No. 11) e inversos (SEQ ID No. 12) amplifican una región que comprende los nucleótidos 1.009/1.010/1.011 del ADNc de Kir6.2 para la detección de intercambios de nucleótidos en el gen de Kir6.2 a nivel del ARN. Figura 6: Visión global de las posiciones de nucleótidos correspondientes de secuencias genómicas y codificadoras de algunas variantes de Kir6.2. La numeración de las posiciones en la secuencia genómica se ha obtenido del contigo del cromosoma 11 de Homo sapiens con el número de registro NCBI NT_009307 (véase también la figura 10 para la parte del contigo que comprende el locus genómico de Kír6.2). Figura 7: Variaciones de la secuencia de nucleótidos de kKir6.2 que dan lugar a un intercambio de aminoácidos de Ácido Glutámico a Lisína en la posición 23 y de Valina a Isoleucina en la posición 337 de la cadena polipeptídica. Las posiciones de los nucleótidos se refieren a la secuencia codificadora de Kir6.2. Estas posiciones se correlacionan con las posiciones 5.657.106/7/8 y 5.657.978/79/80 de la secuencia genómica de Kir6.2 según SEQ ID No. 25 (en la que SEQ ID No. 25 codifica valina en la posición 337 de la secuencia proteica). Las variantes más frecuentes (es decir, el tipo salvaje) están en letras normales, las desviaciones de este tipo salvaje en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos se proporcionan en negrita. Respecto al aminoácido 23, el único intercambio de nucleótidos G67A resulta en la incorporación de una Lisina a la cadena polipeptídíca, mientras que el intercambio G69A solo no resulta en ningún cambio en la secuencia de aminoácidos. Este tipo de mutación se refiere habitualmente como mutación silenciosa. En el caso, por otra parte, de que los dos intercambios de nucleótidos anteriores se produzcan simultáneamente, también se incorpora una Lisina en la posición 23. Respecto a la posición 337 de la cadena de aminoácidos, los intercambios de nucleótidos únicos C1011T, C1011A y C1011G son silenciosos, mientras que el intercambio de nucleótidos único G1009A da lugar a la incorporación de una Isoleucina en la posición 337 de la cadena polipeptídica, incluso si los intercambios C1011T o C1011A se producen simultáneamente con el intercambio G1009A. Otros intercambios en las posiciones 67/68/69 y / o 1.009/1.010/1.011 son posibles, lo que resulta en la incorporación de aminoácidos en la cadena polipeptídíca distintos de G o K en la posición 23 o V o I en la posición 337, respectivamente (estas correlaciones que resultan del código genético son conocidas en la técnica). Figura 8: Secuencia genómica del locus de Kir6.2 (KCNJ11) que presenta los nucleótídos GAC en las posiciones 5.657.106/107/108 (que corresponden al codón GTC en las posiciones 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora y por lo tanto codifican una variante proteica que presenta el aminoácido Valina en la posición 337 de la secuencia polipeptídica) y que presenta los nucleótidos CTT en las posiciones 5.657.978/79/80 (que corresponden al codón AAG en las posiciones 67/68/69 de la secuencia codificadora y por lo tanto codifican una variante proteica que presenta el aminoácido Lisina en la posición 23 de la secuencia peptídica). Los tripletes de nucleótidos indicados están en negrita y subrayados. Las posiciones de hibridación de los cebadores de PCR según SEQ ID No. 9 a 12 también están en negrita y subrayados. Las secuencias de los cebadores se eligen para permitir la amplificación de polinucleótidos utilizando como molde el ADNc de Kir6.2. El número de registro de secuencia (base de datos de nucleótidos NCBI) mediante el que está disponible públicamente la Secuencia genómica contigua del cromosoma 11 de homo sapiens que comprende esta variante genómica de Kir6.2 es NT_009307 (SEQ ID No.25). Leyendas de las tablas: Tabla 1 : Características básicas de la cohorte de pacientes en la que se han realizado todos los análisis. Tabla 2: Distribución de las variantes de Kir6.2 en la cohorte de pacientes diabéticos analizada. Tabla 3: Asociación de las variantes de Kir6.2 en la posición 23 de la proteína con angina de pecho en pacientes diabéticos calculada mediante un ensayo Chi-cuadrado. Puede observarse una frecuencia incrementada de los portadores de Kir6.2-23-KK en el grupo positivo para la angina de pecho. Tabla 4: Cálculo de la significancia estadística para la asociación de Kir6.2-23-KK con la angina de pecho en pacientes diabéticos mediante regresión logística. Tabla 5: Cálculo de las razones de posibilidades para el riesgo de que pacientes diabéticos tengan angina de pecho de portadores de Kir6.2-23-KK comparado con los portadores de Kir6.2-23-EK y Kir6.2-23-EE. Tabla 6: Asociación de las variantes de Kir6.2 en la posición 337 de la proteína con angina de pecho en pacientes diabéticos calculada mediante un ensayo Chi-cuadrado. Puede observarse una frecuencia incrementada de los portadores de Kir6.2-337-ll en el grupo positivo para la angina de pecho. Tabla 7: Cálculo de la significancia estadística para la asociación de Kir6.2-337-ll con la angina de pecho en pacientes diabéticos mediante regresión logística. Tabla 8: Cálculo de las razones de posibilidades para el riesgo de que pacientes diabéticos tengan angina de pecho de portadores de Kir6.2-337-ll comparado con los portadores de Kir6.2-337-VI y Kir6.2-337-W.

Tabla 1 'Mediana y Cuartiles (Q1-Q3) Tabla 2: Tabla 3: Tabla 4: Tabla 5: Tabla 6: Tabla 7: Tabla 8:

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para identificar un incremento del riesgo de cardiopatía coronaria en un individuo, en el que se determina en una muestra la presencia de un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o la presencia de un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2. 2.- Un método para identificar un incremento del riesgo de cardiopatía coronaria en un individuo, en el que se determina en una muestra la presencia de una variación en la secuencia de nucleótidos de Kir6.2 en uno o ambos alelos del gen de Kir6.2 que da lugar a una secuencia polipeptídica de Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o la presencia de un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.

2.

3.- Un método para ajustar la dosificación de un fármaco útil para tratar y/o prevenir la cardiopatía coronaria, en el que se determina en una muestra de un individuo la presencia de una Kir6.2 con a) un aminoácido distinto del Ácido Glutamíníco en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2, b) una variación en la secuencia de nucleótidos en uno o ambos alelos del gen Kir6.2 que da lugar a un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kirß o c) Kir6.2-23-KK y/o Kir6.2-337-ll.

4.- Un método para seleccionar individuos que responderán a un fármaco para la cardiopatía coronaria, en el que se determina en una muestra del individuo la presencia de Kir6.2 con a) un aminoácido distinto del Ácido Glutamíníco en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6, b) una variación en la secuencia de nucleótidos en uno o ambos alelos del gen Kír6.2 que da lugar a un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kír6 o c) Kir6.2-23-KK y/o Kir6.2-337-ll. 5.- La utilización de una proteína o ácido nucleico Kir6.2 para la identificación de fármacos útiles para tratar y/o prevenir la cardiopatía coronaria. 6.- Un método para cribar fármacos útiles para tratar y/o prevenir la cardiopatía coronaria que comprende i. Proporcionar dos muestras que contienen Kir6.2, j. Poner en contacto una muestra con un fármaco potencial, k. Determinar la actividad o la estructura de Kir6.2 en presencia y en ausencia del fármaco potencial, I. Comparar la actividad o la estructura de Kir6.2 en presencia con la obtenida en ausencia del fármaco potencial. 7. La utilización según la reivindicación 5 o el método según la reivindicación 6 utilizando a) una proteína Kír6.2 que contiene un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2, b) un ácido nucleico Kir6.2 que contiene una variación en la secuencia de nucleótidos en uno o ambos alelos del gen Kir6.2 que da lugar a un aminoácido distinto del Ácido Glutamíníco en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kír6.2 o c) Kir6.2-23-KK y/o Kír6.2-337-ll. 8.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que tKir6.2 es una proteína o fragmento proteico aislado de Kir6.2 o un ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico aislado de Kir6.2. 9.- El método o la utilización según la reivindicación 8, en el que la proteína comprende o tiene la secuencia según SEQ ID No. 3, 5 ó 7. 10.- El método o la utilización según la reivindicación 8, en el que el fragmento de la proteína comprende o tiene la secuencia correspondiente a una parte de SEQ ID No. 3, 5 ó 7 que comprende las posiciones de aminoácidos 23 y / o 337. 11.- El método o la utilización según la reivindicación 8, en el que el ácido nucleico comprende o tiene la secuencia según SEQ ID No. 4, 6 u 8. 12.- El método o la utilización según la reivindicación 8, en el que el fragmento de ácido nucleico comprende o tiene la secuencia correspondiente a una parte de SEQ ID No. 4, 6 u 8 que comprende las posiciones 67 y / o 1.009 si el fragmento se obtiene del ADNc de Kir6.2 y que comprende las posiciones 5.657.978 y / o 5.657.106 si el fragmento se obtiene del ADN genómico de Kir 6.2. 13.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el aminoácido en la posición 23 de la proteína es Lys. 14.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el aminoácido en la posición 337 de la proteína es lie. 15.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14 en el que la secuencia de nucleótidos presenta una A en la posición 67 de la secuencia codificadora de Kir6.2. 16.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15 en el que la secuencia de nucleótidos presenta una G en la posición 1.009 de la secuencia codificadora de Kir6.2. 17.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el individuo es un paciente diabético. 18.- El método o la utilización según la reivindicación 17, en el que la diabetes es diabetes mellitus. 19.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cardiopatía coronaria es angina de pecho. 20.- El método o la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4 ó 13 a 19, en el que se determina en la muestra la presencia de Kir6.2-23-KK y/o Kir6.2-337-ll. 21.- El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 19, en el que la muestra es una muestra histológica, un extracto celular o tisular o una célula. 22.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 21 , en el que la muestra se aisla del cuerpo humano. 23.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13 a 22, en el que se determina la presencia del intercambio de aminoácidos por a. Preparación de una muestra biológica que contiene ADN genómico; b. Y preferiblemente: Aislamiento del ADN cromosómico a partir de la muestra según a); c. Amplificación de un fragmento de polinucleótido mediante una reacción de PCR utilizando cebadores capaces de amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones de nucleótidos de la secuencia genómica de Kir6.2 que corresponde a las posiciones 67/68/69 y/o 1.009/1.010/1.011 de la secuencia codificadora; d. Secuenciación del fragmento de polinucleótido según c); 24.- El método según la reivindicación 23, en el que la amplificación del fragmento de polinucleótído se realiza utilizando al menos uno y preferiblemente dos de los cebadores según SEQ. ID No. 9 a 12. 25.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, en el que la reacción de secuenciación se realiza utilizando uno de los cebadores según SEQ ID No. 9 a 12. 26.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13 a 22, en el que se determina la presencia del intercambio de aminoácidos por e. Preparación de una muestra biológica que contiene ADN genómico f. Aislamiento del ADN genómico a partir de la muestra según a) g. Inmovilización de éste en un vehículo h. Hibridación del ADN inmovilizado con una o más sondas capaces de unirse a la Secuencia Kir6.2 que presenta uno o más intercambios de nucleótidos que dan lugar a uno o ambos de dichos intercambios de aminoácidos con una afinidad mayor que la que presenta para la Secuencia Kir6.2 de tipo salvaje en condiciones astringentes. 27.- El método según la reivindicación 26, en el que el ADN genómico aislado se i. Inmoviliza en la matriz de un chip, una membrana adecuada o j. Transfiere a una matriz de gel y transfiere a una membrana adecuada. 28.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13 a 22, en el que se determina el intercambio de aminoácidos por k. Obtención de una muestra biológica que contiene ARN de un individuo I. Preferiblemente: Aislamiento del ARN a partir de la muestra según a) m. Amplificación de un fragmento de polinucleótido mediante una reacción de RT-PCR utilizando cebadores capaces de amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones 67 y / o 1.009 de la secuencia de ADNc de Kir6.2 n. Secuencíación del fragmento de polínucleótido según c). 29.- El método según la reivindicación 28, en el que se utiliza al menos uno de los cebadores según SEQ ID No. 9 a 12. 30.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13 a 22, en el que se determina el intercambio de aminoácidos por o. Obtención de una muestra biológica que contiene ARN de un individuo; p. Aislamiento del ARN a partir de la muestra según a); q. Inmovilización de éste en un vehículo; r. Hibridación del ARN con una o más sondas capaces de unirse en condiciones astringentes al ARN de Kir6.2 que codifica un polipéptído Kír6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337 con mayor afinidad que la que presentan con un ARN de Kir6.2 que codifica un polipéptido Kir6.2 que presenta Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o Valina en la posición 337. 31.- El método según la reivindicación 30, en el que el ARN aislado se s. Inmoviliza en la matriz de un chip o una membrana adecuada, o t. Transfiere a una matriz de gel y después se transfiere a una membrana adecuada. 32.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13 a 22, en el que se determina el intercambio de aminoácidos por u. Obtención de una muestra biológica que contiene proteínas de un individuo; v. Aislamiento de la proteína a partir de la muestra según a); w. Inmovilización de ésta en un vehículo; x. Modalidad de una reacción de unión con un anticuerpo capaz de unirse con mayor afinidad a Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídica que a Kir6.2 que presenta Ácido Glutamíníco en la posición 337 y/o Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídica; y. Hacer visible la unión del anticuerpo a la proteína; 33.- El método según la reivindicación 32, en el que la proteína aislada se z. Inmoviliza en la matriz de un chip o una membrana adecuada; aa. Transfiere a una matriz de gel y después se inmoviliza en una membrana adecuada, o bb. Inmoviliza en una placa de ELISA. 34.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13 a 22, en el que se determina el intercambio de aminoácidos por ce. Obtención de una muestra histológica de un individuo dd. Modalidad de una reacción de unión con un anticuerpo capaz de unirse con mayor afinidad a Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamíníco en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídica que a Kir6.2 que presenta Ácido Glutamínico en la posición 337 y/o Valina en la posición 337 de su cadena polipeptídíca; ee. Hacer visible la unión del anticuerpo a la proteína. 35.- El método según la reivindicación 34, en el que la detección de la unión se realiza mediante una reacción inmunohistoquímica o inmunorradiológica. 36.- Un kit de ensayo para ensayar la presencia de un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y / o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2, Kir6.2- 23-KK o Kir6.2-337-ll, en el que el kit contiene al menos un medio para la detección de dicha presencia en la proteína. 37.- Un kit de ensayo para ensayar la presencia de una variación en la secuencia de nucleótidos de Kir6.2 en uno o ambos alelos del gen Kir6.2 que da lugar a una secuencia polipeptídica de Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o un aminoácido distinto de Valina en la posición 337 en la proteína Kir6.2, en el que el kit contiene al menos un medio para la detección de dicha variación en la secuencia de nucleótidos. 38.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37, en el que el aminoácido en la posición 23 es Lys. 39.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, en el que el aminoácido en la posición 337 es lie. 40.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 36, 38 ó 39 que contiene un anticuerpo que discrimina en sus características de unión entre Kir6.2 que presenta Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o Valina en la posición 337 y una proteína Kir6.2 que presenta un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en la posición 23 y/o de Valina en la posición 337. 41.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en el que la secuencia de nucleótidos de Kir6.2 presenta G en la posición 67 de la secuencia codificadora. 42.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39 ó 41 , en el que la secuencia de nucleótidos de Kir6.2 presenta una A en la posición 1.009 de la secuencia codificadora. 43.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, 41 ó 42 que contiene un conjunto de cebadores capaz de amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones 67 y / o 1.009 de la secuencia codificadora de Kir6.2. 44.- El kit de ensayo según la reivindicación 43 que contiene al menos uno de los cebadores según SEQ ID No. 9 a 12. 45.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39 ó 41 a 43, que contiene un conjunto de cebadores capaz de amplificar un fragmento de polinucleótido que comprende las posiciones

5.657.106/107/108 y/o 5.657.978/79/80 de la secuencia genómica de Kir

6.2 según SEQ ID No. 13. 46.- El kit de ensayo según la reivindicación 45 que contiene al menos uno de los cebadores según SEQ ID No. 9 a 12. 4

7.- El kit de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, 41 ó 42 que contiene una o más sondas de ácido nucleico que reconocen específicamente ADN o ARN genómico de Kir6.2 con una secuencia de nucleótidos que codifica un aminoácido distinto del Ácido Glutamínico en ia posición 23 y/o Valina en la posición 337 en condiciones astringentes. 4

8.- Polipéptido Kir6.2 aislado o fragmento de éste que comprende las posiciones 23 y 337, que presenta Lisina en la posición 23 e Isoleucina en la posición 337 de la secuencia polipeptídíca. 4

9.- Polipéptido Kir6.2 aislado que comprende o consiste en la secuencia según SEQ ID No. 7 o fragmento de éste que comprende las posiciones de aminoácidos 23 y 337. 50.- Polipéptido Kir6.2 aislado o fragmento de éste que comprende las posiciones 23 y 337, que presenta Ácido Glutamínico en la posición 23 e Isoleucina en la posición 337 de la secuencia polipeptídíca. 51.- Polípéptido Kir6.2 aislado que comprende o consiste en la secuencia según SEQ ID No. 5 o fragmento de éste que comprende las posiciones de aminoácidos 23 y 337. 52.- Polinucleótído aislado que codifica una proteína Kir6.2 o un fragmento de éste según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 54. 53.- Polinucleótido aislado que comprende la secuencia según SEQ ID No. 6 u 8 o un fragmento de éste que comprende las posiciones de nucleótidos 67 y 1.009. 54.- Polinucleótido aislado que híbrida con la secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 54 ó 55 o sus cadenas complementarias en condiciones de alta astringencia. 55.- Sonda para la detección de variaciones de nucleótidos en el gen o ARN de Kir6.2 que comprende o consiste en al menos 17, preferiblemente 19 a 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia codificadora de Kir6.2 que comprende las posiciones 67 y/o 1.009 o de la secuencia genómica de Kír6.2 según SEQ ID No. 13 que comprende las posiciones 5.657.106/107/108 y/o 5.657.978/79/80. 56.- Cebadores para la amplificación de polinucleótidos Kir6.2 en los que los polinucleótidos amplificados comprenden las posiciones 67 y/o 1.009 de la secuencia codificadora de Kir6.2 y/o la posición 5.657.978 y/o 5.657.106 de la secuencia genómica de Kir6.2 según SEQ ID No. 13.