CN111057769A - 一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种检测与结直肠癌易感相关的miR‑218基因位点的试剂盒及其应用方法，该试剂盒通过miR‑218基因rs11134527位点序列的扩增引物对miR‑218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，通过检测miR‑218基因rs11134527位点基因型的探针检测miR‑218基因rs11134527位点的等位基因点对G/A的基因型，通过是否为GG基因型判断受检者患结直肠癌的风险；该试剂盒能推进结直肠癌特异性表达谱的确立，从而进一步建立结直肠癌诊断模型，同时还可筛选以rs11134527多态位点为靶标的有效药物，有利于结直肠癌的预防、早期诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒及其应用方法。
背景技术
近年来，我国的结直肠癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已成为威胁我国公众健康的主要恶性肿瘤之一，并且患者具有年轻化的趋势。目前已经证实的结直肠癌主要危险因素包括：高龄、高脂肪低纤维素的饮食、缺少运动、肥胖、过量饮酒、炎性肠病等。另外，近年来的研究发现，在一些个体中，常表现出明显的家族史，结直肠癌患者的子女患病风险比一般人群高2～4倍，这表明遗传因素在诱发结直肠癌的过程中发挥着重要作用。单核苷酸多态性(SNP)是影响个体对疾病发病风险的重要遗传因素。目前有关结直肠癌发病风险的研究主要集中在蛋白编码基因的SNP，而对于一类重要的非蛋白编码基因—miRNA基因的SNP与结直肠癌发病风险的关联分析尚待挖掘。
miRNA(microRNA，微小RNA)是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，近年来的研究发现，miRNA基因的SNP会影响miRNA与靶基因的互补情况，最终引起靶基因表达的改变，引发细胞功能紊乱甚至疾病的发生。SNP是指基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，SNP是人种之间、个体之间差异的遗传物质基础之一，SNP研究的理论基础是等位基因关联，它是指疾病性状的标记等位基因发生率的显著性改变，代表与疾病性状相关的等位基因在随机发生中的偏差，当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非患者时，即表明该标记与疾病关联。SNP在疾病基因定位中所发挥的作用主要包括：一是在疾病定位区域中寻找致病SNP，这种SNP的出现可能直接导致了基因在转录水平和翻译水平上的变化，即改变了基因表达量或者基因产物蛋白质的组成结构，从而导致某种疾病发生或使得个体对某种特殊的环境易感；二是SNP作为一个遗传标记，与疾病或表型紧密连锁。
研究表明，许多miRNA已被证明可以通过影响靶基因或细胞表达功能而提高结直肠癌的患病风险。基于此，许多发明提供与疾病相关的基因及其多态位点的核酸序列，构建对疾病进行遗传学诊断的试剂盒，并应用于对相关病症的辅助诊断和对个体是否具有易感性的评判，有利于完善对疾病的预防、早期诊断和治疗。经查找，检测多种疾病的试剂盒已被发明，如中国儿童哮喘易感性、胃癌、白血病、前列腺癌、结直肠癌等。对于结直肠癌也有多种基因及位点被应用于试剂盒进行检测，如JAM3、PCDH18、rs12522693及rs17836917。然而，现有技术中还没有一款可以检测miR-218基因rs11134527位点结直肠癌易感性的产品，用于解决受检者是否具有相关疾病易感性的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，该试剂盒通过检测miR-218基因rs11134527位点上的等位基因点对G/A判断受检者是否具有结直肠癌易感性，从而对结直肠癌易感人群进行遗传学筛选，达到早期预防、早期诊断、早期治疗结直肠癌的目的，在一定程度上减少结直肠癌的死亡率。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法。
为实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，所述miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物包括：
正向引物：5’-GGAAGCAGCGTCAGAGAGAG-3’，
反向引物：5’-TGCAATCTTCGGAAGTGTTCC-3’；
所述检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针包括：
FAM探针：5’-GCTCAGTGGGGGCCTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
A探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAT-3’，
G探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAC-3’。
为实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，它包括以下步骤：
步骤一、稀释DNA：将受检者的DNA进行稀释，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：向步骤一得到的DNA稀释液中加入dNTP、氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
上述技术方案中，所述步骤一中，将受检者的DNA经双蒸水稀释18～22倍，得到DNA稀释液。
上述技术方案中，所述步骤二中，向步骤一得到的DNA稀释液中加入1.5～2.5mM的dNTP、2.5～3.5mM的氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、一个单位的Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行过程为93～97℃110～130s、92～96℃20～40s、57～61℃80～100s、70～74℃50～70s、70～74℃9～11min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物。
上述技术方案中，所述步骤三中，向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、两个单位的Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行过程为90～94℃110～130s、92～96℃10～20s、48～52℃20～30s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
具体的，所述DNA稀释液与所述miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物的质量比为1:1.5～2.5。
具体的，所述PCR扩增产物与所述检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针的质量比为3～5:1。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，通过miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，通过检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针检测miR-218基因rs11134527位点的等位基因点对G/A的基因型，当rs11134527位点上的基因型为GG时，受检者结直肠癌的患病风险将大大增加，当受检者为AG和AA基因型，其患病率将降低。当用该试剂盒去检测受检者miR-218上的rs11134527位点的基因型时，若结果显示受检者该位点的基因型为GG，则提示受检者是结直肠癌易感者，需做好早期预防措施，并定期去医院检测是否出现结直肠早期病变。
(2)本发明提供的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，一方面，将SNP分析用于疾病检测，可快捷而准确地将基因检测提高到单碱基水平，从而有利于结直肠癌的预防、早期诊断和治疗；另一方面，本项目能够筛选以rs11134527多态位点为靶标的有效药物，即将单核苷酸多态位点rs11134527作为药物的潜在靶点来筛选和设计药物，找出具有调节疾病相关基因表达的活性分子，促进新的治疗结直肠癌药物的发现。
(3)本发明提供的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，为实现结直肠癌易感性的评判及早期治疗打下坚实的分子基础，同时扩大试剂盒检测结直肠癌易感性的基因数据库范围。与传统的检测手段相比，试剂盒的检测更及时、更特异，从而提高结直肠癌患者的生存率，降低死亡率，进一步推进疾病预防及控制的顺利进行，提高当代人的生活水平。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，其中，miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物包括：
正向引物：5’-GGAAGCAGCGTCAGAGAGAG-3’，
反向引物：5’-TGCAATCTTCGGAAGTGTTCC-3’；
检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针包括：
FAM探针：5’-GCTCAGTGGGGGCCTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
A探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAT-3’，
G探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAC-3’。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，它包括以下步骤：
步骤一、稀释DNA：将受检者的DNA经双蒸水稀释20倍，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：向步骤一得到的DNA稀释液中加入2mM的dNTP、3mM的氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、一个单位的Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行过程为95℃120s、94℃30s、59℃90s、72℃60s、72℃10min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、两个单位的Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行过程为92℃120s、94℃15s、50℃25s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
本实施例中，DNA稀释液与miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物的质量比为1:2。
本实施例中，PCR扩增产物与检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针的质量比为4:1。
实施例2。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，其中，miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物包括：
正向引物：5’-GGAAGCAGCGTCAGAGAGAG-3’，
反向引物：5’-TGCAATCTTCGGAAGTGTTCC-3’；
检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针包括：
FAM探针：5’-GCTCAGTGGGGGCCTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
A探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAT-3’，
G探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAC-3’。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，它包括以下步骤：
步骤一、稀释DNA：将受检者的DNA经双蒸水稀释19倍，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：向步骤一得到的DNA稀释液中加入2.3mM的dNTP、3.3mM的氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、一个单位的Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行过程为96℃115s、95℃25s、60℃85s、73℃55s、73℃9.5min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、两个单位的Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行过程为93℃115s、95℃13s、51℃23s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
本实施例中，DNA稀释液与miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物的质量比为1:1.7。
本实施例中，PCR扩增产物与检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针的质量比为3.5:1。
实施例3。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，其中，miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物包括：
正向引物：5’-GGAAGCAGCGTCAGAGAGAG-3’，
反向引物：5’-TGCAATCTTCGGAAGTGTTCC-3’；
检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针包括：
FAM探针：5’-GCTCAGTGGGGGCCTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
A探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAT-3’，
G探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAC-3’。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，它包括以下步骤：
步骤一、稀释DNA：将受检者的DNA经双蒸水稀释21倍，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：向步骤一得到的DNA稀释液中加入1.7mM的dNTP、2.7mM的氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、一个单位的Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行过程为94℃125s、93℃35s、58℃95s、71℃65s、71℃10.5min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、两个单位的Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行过程为91℃125s、93℃17s、49℃27s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
本实施例中，DNA稀释液与miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物的质量比为1:2.3。
本实施例中，PCR扩增产物与检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针的质量比为4.5:1。
实施例4。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，其中，miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物包括：
正向引物：5’-GGAAGCAGCGTCAGAGAGAG-3’，
反向引物：5’-TGCAATCTTCGGAAGTGTTCC-3’；
检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针包括：
FAM探针：5’-GCTCAGTGGGGGCCTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
A探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAT-3’，
G探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAC-3’。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，它包括以下步骤：
步骤一、稀释DNA：将受检者的DNA经双蒸水稀释18倍，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：向步骤一得到的DNA稀释液中加入2.5mM的dNTP、3.5mM的氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、一个单位的Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行过程为97℃110s、96℃20s、61℃80s、74℃50s、74℃9min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、两个单位的Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行过程为94℃110s、96℃10s、52℃20s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
本实施例中，DNA稀释液与miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物的质量比为1:1.5。
本实施例中，PCR扩增产物与检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针的质量比为3:1。
实施例5。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，其中，miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物包括：
正向引物：5’-GGAAGCAGCGTCAGAGAGAG-3’，
反向引物：5’-TGCAATCTTCGGAAGTGTTCC-3’；
检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针包括：
FAM探针：5’-GCTCAGTGGGGGCCTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
A探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAT-3’，
G探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAC-3’。
一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，它包括以下步骤：
步骤一、稀释DNA：将受检者的DNA经双蒸水稀释22倍，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：向步骤一得到的DNA稀释液中加入1.5mM的dNTP、2.5mM的氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、一个单位的Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行过程为93℃130s、92℃40s、57℃100s、70℃70s、70℃11min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、两个单位的Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行过程为90℃130s、92℃20s、48℃30s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
本实施例中，DNA稀释液与miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物的质量比为1:2.5。
本实施例中，PCR扩增产物与检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针的质量比为5:1。
实验
本发明针对miR-218基因rs11134527位点与结直肠癌发病风险的相关性进行了试验，采用66例结直肠癌患者与124例健康对照者的外周静脉血液样本，对miR-218基因rs11134527位点的基因型进行分析，并采用Binary Logistic回归模型分析评估rs11134527多态性与结直肠癌的关联性，具体步骤如下：
步骤一、稀释DNA：采集66例结直肠癌患者与124例健康对照者的外周静脉血液样本的DNA，使用双蒸水稀释20倍，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：取步骤一得到的DNA稀释液1μL，向其中加入2mM的dNTP 2μL、3mM的氯化镁溶液0.6μL、正向引物1μL、反向引物1μL、PCR缓冲液2μL、一个单位的Taq DNA聚合酶0.2μL和双蒸水12.2μL，然后在PCR仪上进行过程为95℃120s、94℃30s、59℃90s、72℃60s、72℃10min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：取步骤二得到的PCR扩增产物4μL，向其中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针1μL、PCR缓冲液1μL、两个单位的Taq DNA连接酶0.05μL和双蒸水4μL，然后在DNA测序仪上进行过程为92℃120s、94℃15s、50℃25s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得66例结直肠癌患者与124例健康对照者的miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
如表1的实验数据所示，在显性模型中病例组miR-218基因rs11134527位点的AG+AA和GG两种基因型频率分别为77.3％和22.7％，对照组分别为88.7％和11.3％。经数据分析显示：显性模型中OR为2.31，95％CI为1.04～5.15，P为0.04，两组基因型频率比较差异有统计学意义，由此可揭示miR-218基因rs11134527位点与结直肠癌有关联性，基因型GG是人群罹患结直肠癌的危险因素。
表1：对照组和病例组结直肠癌风险分析结果
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒，其特征在于：包括miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、dNTP、氯化镁溶液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶和PCR缓冲液，所述miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物包括：
正向引物：5’-GGAAGCAGCGTCAGAGAGAG-3’，
反向引物：5’-TGCAATCTTCGGAAGTGTTCC-3’；
所述检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针包括：
FAM探针：5’-GCTCAGTGGGGGCCTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，
A探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAT-3’，
G探针：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCACTCCTGATACTAATCAC-3’。
2.一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、稀释DNA：将受检者的DNA进行稀释，得到DNA稀释液；
步骤二、PCR扩增：向步骤一得到的DNA稀释液中加入dNTP、氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
步骤三、基因型检测：向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
3.根据权利要求2所述的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，其特征在于：所述步骤一中，将受检者的DNA经双蒸水稀释18～22倍，得到DNA稀释液。
4.根据权利要求2所述的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，其特征在于：所述步骤二中，向步骤一得到的DNA稀释液中加入1.5～2.5mM的dNTP、2.5～3.5mM的氯化镁溶液、miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物、PCR缓冲液、一个单位的Taq DNA聚合酶和双蒸水，然后在PCR仪上进行过程为93～97℃110～130s、92～96℃20～40s、57～61℃80～100s、70～74℃50～70s、70～74℃9～11min的PCR反应，对miR-218基因rs11134527位点的基因序列进行扩增，得到PCR扩增产物。
5.根据权利要求2所述的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，其特征在于：所述步骤三中，向步骤二得到的PCR扩增产物中加入检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针、PCR缓冲液、两个单位的Taq DNA连接酶和双蒸水，然后在DNA测序仪上进行过程为90～94℃110～130s、92～96℃10～20s、48～52℃20～30s的LDR反应，检测miR-218基因rs11134527位点的基因型，即得受检者miR-218基因rs11134527位点的基因型结果。
6.根据权利要求2所述的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，其特征在于：所述DNA稀释液与所述miR-218基因rs11134527位点序列的扩增引物的质量比为1:1.5～2.5。
7.根据权利要求2所述的一种检测与结直肠癌易感相关的miR-218基因位点的试剂盒的应用方法，其特征在于：所述PCR扩增产物与所述检测miR-218基因rs11134527位点基因型的探针的质量比为3～5:1。
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