CN101245393A

CN101245393A - 一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101245393A
Application number: CNA2008101026997A
Authority: CN
Inventors: 惠汝太; 陈敬洲; 石毅; 于晖; 杨涛; 孙凯; 张禅那
Original assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2008-08-20
Anticipated expiration: 2028-03-25
Also published as: CN101245393B

Abstract

本发明涉及一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒，属于医学生物技术和基因诊断领域。一种预测结肠癌易感性的方法，通过提取宿主细胞基因组DNA，测定受试者的C53基因多态性1808位点(rs2737)的基因型，预测受试者对结肠癌的易感性。本发明的优点是：首次阐明了C53基因多态性位点与结肠癌发病年龄的相关性，提供了一种预测结肠癌易感性的方法，该方法可用于结肠癌的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

Description

一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒，更具体地说是通过测定人C53基因多态性位点1808T/C(rs2737)预测受试者可能的结肠癌发病年龄，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于医学生物技术和基因诊断领域。

背景技术

癌症是一种严重危害人类健康的疾病，是仅次于心脑血管病的第二号杀手。根据世界卫生组织(WHO)报告，每年年全球新发癌症病人大约900万，死亡超过500万人，过去的20年，癌症患病率增长了一倍以上。全球癌症仍呈上升趋势，据世界卫生组织专家预测，未来25年全世界80多亿人口中，将有3亿人患肿瘤，其中1亿人因癌症而死亡，21世纪癌症将成为人类健康的“第一杀手”。根据全国性死因回顾调查表明，20年来中国的癌症发病和死亡率逐年上升，每5个因病死亡的人中，就有1个是死于癌症，每200个家庭中，有1个家庭因有癌症病人而遭受磨难。2006年，中国癌症死亡人数300万，根据专家预测，到2020年，死亡人数将会超过400万。癌症不仅严重危害人类的身体健康，也给社会和家庭带来了沉重的经济负担(我国癌症每年耗费至少约2000亿元人民币)。

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，以40岁～50岁年龄组发病率最高。据世界流行病学调查，结肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等地的发病率最高，居内脏种瘤前二位，在中国的发病率与死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常见恶性肿瘤。近年来各地资料显示随着人民生活水平的提高，饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势。中国的有关资料显示，结肠癌发病率占全部恶性肿瘤的第4位，而且有逐年增加的趋势。有数据显示，近年来，结肠癌中直肠癌多于结肠癌的情况有所改变，结肠癌的发病比例开始增加。虽然医疗条件不断改善，医疗技术也有很大提高，但结肠癌的发病率却一直上升，同时其治疗及预后情况也仍然不容乐观，5年存活率不到60％。研究表明，在早期检测出结肠癌的病人，5年存活率达到90％；而晚期检测出的病人，5年存活率则只有35％。这充分说明了结肠癌的早期诊断对于其治疗和预后起着巨大的作用。

结肠癌的检测，除了仪器设备，技术手段的改进，遗传因素的易感性也是目前世界上研究的热点之一。而遗传因素易感性的研究中，采用单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)作为基因组标志的关联分析方法是有效的。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需＞1％，SNP是双等位基因标记。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNP在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高，平均每1kb就有1个；代表性强，位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNP在人群中为双等位基因标记，可简单以“+/-或1/0”直接分型，成为很好的遗传标志。

作为本研究的候选基因，C53基因对于细胞的生长、迁移、粘附以及浸润都有重要的影响，有研究表明，C53基因与包括肺癌、肝癌、胃癌在内的多种癌症相关。而在已知的几个C53基因的SNP位点中，处于其mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)的1808T/C由于处于microRNA379的结合区域而受到我们的关注。

MicroRNA是近年来新发现的一类21-25nt长的单链小分子RNA。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。MicroRNA可以与编码基因的mRNA 3’-UTR相结合，形成不完全的碱基配对，抑制mRNA的表达或是促进mRNA的降解。MicroRNA广泛地参与了生长发育的全过程，包括干细胞分化、血细胞形成、心脏和骨骼肌发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢和免疫应答反应等。同时MicroRNA也涉及一系列的疾病的病理生理过程，包括癌症和心脑血管疾病等。目前普遍认为，大概有30％的人类基因受到MicroRNA的调控。

在MicroRNA与编码基因的mRNA 3’-UTR结合的过程中，MicroRNA5’端的6～7个碱基对于结合的特异性起着决定性的作用，因此被称为“种子序列(seed sequence)”。因此与种子序列相对应的mRNA序列也就显得尤为重要，在这个序列内发生的碱基变化将直接影响MicroRNA与编码基因mRNA的结合，进而影响MicroRNA对基因的调控，而1808T/C正是处于这个区域内。通过实验，我们证实，1808T/C确实可以影响microRNA379与编码基因mRNA的结合。

目前，国内外未见利用C53基因多态性预测结肠癌发病年龄的方法及试剂的相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种预测结肠癌发病年龄的方法，以及这种方法在结肠癌的预防、辅助诊断和治疗中的用途。

本发明的第二个目的是提供两种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，第一种包括特异的PCR引物、限制性内切酶，以及含有上述引物和酶的试剂盒；第二种包括特异的PCR引物、LDR探针，以及含有上述引物和探针的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种预测结肠癌发病年龄的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的C53基因3’-UTR+1808位点(对应NCBI的SNP库中标准编号分别是rs2737基因型，预测受试者结肠癌可能的发病年龄。

一种分离核酸，是序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。本发明证实，C53基因型为AA纯合子时，受试者的易感性最高；增加结肠癌的风险为1.96倍。本发明中C53基因的单核苷酸多态性(SNP)具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列位点，是与结肠癌发病相关的高风险位点之一。

一组预测结肠癌发病年龄的引物，能特异性地扩增出含C53基因的1808位点的扩增产物，是序列表SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

一种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其由以下试剂组成：

30μl 10×PCR缓冲液，50μl 10mM dNTP混合液，20μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，各2μl 50pmol/μl F和R引物，30μl 10×酶切缓冲液，5μl 10U/μl Acc I内切酶，5ml纯水；F和R引物是序列表SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20℃。

一种分离核酸，具有序列表SEQ ID NO.4所示的碱基序列，该序列是与结肠癌发病相关的高风险SNP位点之一。

一组预测结肠癌发病年龄的引物序列，能特异性地扩增出含C53基因的1808位点的扩增产物，是序列表SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的碱基序列。

一组预测结肠癌发病年龄的探针序列，是序列表SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示的碱基序列。

一种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，由以下试剂组成：

20μl 10×HotStar PCR缓冲液，40μl 10mM dNTP混合液，20μl 100mM MgSO₄溶液，20μl 5U/μl HotStar DNA聚合酶，各2μl 50pmol/μl F和R引物，0.5μl 40U/μl Taq DNA连接酶，10μl 10×Taq DNA连接酶反应缓冲液，10μl 12.5pmol/μl/each LDR探针混合物，2ml纯水；F和R引物是序列表SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的碱基序列；LDR探针混合物是序列表SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20℃。

所述的LDR探针序列SEQ ID No.7的5’端磷酸化，3’端标记荧光染料FAM。

本发明提供了两种预测结肠癌发病年龄的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增C53基因的PCR引物对，特异的限制性内切酶，以及用于PCR扩增进行LDR检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

本发明具有以下优点：本发明首次阐明了C53基因多态性位点与结肠癌的相关性，提供了一种预测结肠癌发病年龄的方法，该方法可用于结肠癌的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。我们使用了两种试剂盒对SNP1808T/C进行分析：分别对应PCR-酶切分析法和新的LDR-PCR测序分型技术。传统的PCR-酶切分析试剂盒对实验平台要求较低，成本低廉，周期短。新的LDR-PCR测序分型试剂盒是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别；高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，这种试剂盒操作简便、结果稳定、灵敏度和准确率高。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为C53基因在结肠癌组织中表达情况图谱。

图2为报告载体荧光素酶活性分析图谱。

图3为三种基因型(AA型，GG型，AG型)酶切图谱。

图4为rs2737的LDR分型结果示意图：图4-1为CT基因型，图4-2为CC基因型，图4-3为TT基因型。

图5为SNP1808不同等位基因对结肠癌发病年龄的影响示意图。

图6为低发病年龄组患者中不同等位基因型的分布频率图。

具体实施方式

实施例1：C53表达水平与结肠癌恶性程度密切相关——人结肠癌组织芯片分析

一.实验材料：

人结肠癌组织芯片(cc05-11-005)购自西安超英生物科技有限公司，包含94个点，每个点均来自不同结肠癌病人的病理组织；免疫组化试剂盒购自北京中山生物公司。

二.实验方法：

(一)免疫组化检测C53基因在人结肠癌组织中的表达水平

1.C53抗体浓度：1∶200稀释

2.阴性对照用一抗稀释液代替；

3.实验详细染色步骤：

60℃烤片30分钟，常规脱蜡水化；抗原修复：以0.01M CB(柠檬酸盐缓冲液)(pH6.0)高压修复抗原，冷却至室温，PBS洗5分钟×2次；3％H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温10分钟，PBS洗5分钟×2次；滴加抗体，4℃冰箱过夜；0.1％Tween-PBS洗5分钟×3次；滴加聚合物增强剂，室温孵育20分钟；0.1％Tween-PBS洗5分钟×3次；滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温孵育30分钟；0.1％Tween-PBS洗5分钟×3次；DAB(3.3-四盐酸二氨基联苯胺)显色，蒸馏水洗终止显色；苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝；常规脱水透明，中性树胶封片；病理显微镜察片，按照着色深浅将C53基因表达水平分为高(3+)、中(2+)、低(1+)三个层次。

(二)统计分析C53基因表达水平与结肠癌恶性程度的关系

利用SPSS13.0软件，对C53基因表达水平与结肠癌分级以及浸润程度做线性相关分析。

三.实验结果：

图1为C53基因在结肠癌组织中表达情况图谱。阴性对照为免疫组化试剂盒内的一抗稀释液，C53基因表达水平按照着色深浅分为高(3+)、中(2+)、低(1+)三个层次。

表1：C53基因表达水平与结肠癌恶性程度相关性分析

统计结果显示，C53基因表达水平与结肠腺癌的分级有很强的相关性(Spearman相关系数＝0.47，P＝0.0000001)，与结肠腺癌的浸润程度也有一定相关性(Spearman相关系数＝0.21，P＝0.018)，而C53基因的表达水平与结肠粘液腺癌的恶性程度则没有相关性(P＝0.12，0.37)。

实施例2：结肠癌组织中microRNA379水平与C53基因表达水平呈负相关

一.实验材料：

人结肠癌组织芯片(cc05-11-006)购自西安超英生物科技有限公司，包含150个点，每个点均来自不同结肠癌病人的病理组织；microRNA379杂交探针为超英公司合成；原位杂交试剂盒购自碧云天生物技术研究所，C53抗体为本实验室自制(同实施例1)；免疫组化试剂盒购自北京中山生物公司。

二.实验方法：

(一)原位杂交检测microRNA379在人结肠癌组织中的表达水平

80℃烤片15分钟；二甲苯I 15分钟，二甲苯II 15分钟；无水乙醇I 5分钟，取出室温晾干；胃蛋白酶消化，37℃孵育10-30分钟或者显微镜下控制；梯度乙醇，室温凉干；设置阳性阴性对照(阳性对照为U6的探针，阴性对照为一段无义的RNA序列探针)；杂交：探针用杂交液稀释至10ng，滴加于组织块(或组织芯片)，37℃水浴过夜；TTBS(0.1％(V/V)Tween20(溶于Tris盐缓冲液)Tris盐缓冲液：100mmol/LTris·CL，PH7.50.9％(m/V)NaCl)溶液冲洗3次，每次10分钟；滴加抗体，37摄氏度孵育30-50分钟；TTBS溶液冲洗，脱色摇床上10分钟×3次；稀释50倍BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸对甲苯胺盐/氯化硝基四氮唑蓝)显色液，避光显色2-4小时；蒸馏水终止显色，置于脱色摇床上5分钟；复染，30ul/片，盖上盖玻片，显色3-5分钟；蒸馏水冲洗，置于摇床上15-30分钟；梯度乙醇，室温凉干；二甲苯I 15分钟。二甲苯II 15分钟；中性树胶封片；病理显微镜察片，按照着色深浅将microRNA379表达水平分为高(2+)、低(1+)两个个层次。

(二)免疫组化检测C53基因在人结肠癌组织中的表达水平

实验方法同实施例1。

(三)统计分析结肠癌组织中microRNA379水平与C53水平的相关性

三.实验结果：

表2：结肠癌组织中microRNA379水平与C53基因表达水平的相关性分析

统计结果显示，结肠癌组织中microRNA379水平与C53基因表达水平呈负相关(相关系数＝-0.192，OR值＝0.37，95％可信区间＝0.15-0.86，P＝0.018)。此结果表明C53基因确实与microRNA379相结合。

实施例3：C53基因1808位点不同基因型对microRNA379结合活性的影响

一.实验材料：

1.生物材料：人结肠癌细胞系HCT116购自中国医学科学院基础研究所细胞中心；pMIR-Report载体、microRNA379前体以及对照购自Ambion公司；内参pRL-CMV质粒购自Promega公司。

2.工具酶及常用试剂：Lipofectamine 2000(LF2000)、DMEM、Opti-MEM I、FetalBovine Serum购自GIBCO BRL公司；Dual-lucifferase Reporter Assay试剂盒购自Promega公司；EndoFree Plasmid Maxi Kit购自QIAGEN公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。

3.按照常规方法配制下列试剂并灭菌：磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)、DMEM高糖培养基、LB培养基、溴化乙锭(EB)溶液(10mg/ml)、TE缓冲液。

二.实验方法：

1.载体构建：依本领域常规操作，将设计好的带有C53基因1808位点不同基因型的单链DNA片段退火，并与经过SpeI和HindIII双酶切的pMIR-Report载体相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，酶切筛选得到携带不同基因型的报告系统载体(pMIR-CC，野生型和pMIR-TT，突变型)。

带有C53基因1808位点不同基因型的单链DNA片段由奥科公司合成：

野生型序列：

5’-ACTAGTGCACCTGATGGTGATCTTGGCACTCTCCATGTTCTCTACAAGAAG

CTGTGGTGATTGGCCCTGTGGTCTACCAGGAAGCTT-3’；(SEQ ID No.10)和

5’-TGATCACGTGGACTACCACTAGAACCGTGAGAGGTACAAGAGATGTTCTT

CGACACCACTAACCGGGACACCAGATGGTCCTTCGAA-3’；(SEQ ID No.11)

突变型序列

5’-ACTAGTGCACCTGATGGTGATCTTGGCACTCTCCATGTTCTCTACAAGAAG

CTGTGGTGATTGGCCCTGTGGTCTATCAGGAAGCTT-3’(SEQ ID No.12)和

5’-TGATCACGTGGACTACCACTAGAACCGTGAGAGGTACAAGAGATGTTCTT

CGACACCACTAACCGGGACACCAGATAGTCCTTCGAA-3’(SEQ ID No.13)。

2.大量提取无内毒素的质粒DNA：挑单克隆菌落于5ml LB中(kana+)，37℃、300rpm振摇8小时，按1∶500的比例稀释至100ml，37℃，300rpm振摇12～16小时；6,000rpm，4℃离心15分钟，收获细菌，倒尽上清；将细菌重悬于10ml Buffer P1(含RNase A 100μg/ml)，加10ml Buffer P2，轻轻颠倒混匀4～6次，室温放5分钟。准备QIAfilter Cartridge：把盖放到QIAfilter Maxi Cartridge上，并将Cartridge放在一管上；加10ml预冷的Buffer P3，轻轻颠倒混匀4～6次，将裂解液移入QIAfilter Cartridge中，室温放置10分钟，过滤至50ml管中；加2.5ml Buffer ER，颠倒混匀10次，放冰上30分钟；(以下操作在超净台中操作)用10ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip500，将过滤后的裂解液加入tip中，使其自然流下，加30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip两次，用15mlBuffer QN洗脱DNA，并用无菌管收集；加10.5ml(0.7V)异丙醇沉淀DNA，混匀，11,000rpm，4℃离心30分钟；用5ml Endotoxin-free的70％乙醇洗DNA沉淀，11,000rpm离心10分钟，弃上清，空气中干燥；重溶于endotoxin-free的TE中。

3.细胞转染：分别用250μl Opti-MEM I稀释4μg质粒DNA和10μl Lipofectamine2000，室温放置5分钟；将前两者混合，室温放置20分钟；用生理盐水洗涤细胞，加入1.5ml无抗含10％小牛血清的DMEM培养基；20分钟后，向混合液中加500μl无抗含10％小牛血清的DMEM培养基，混匀后加入细胞中，置37℃、5％CO₂培养箱内5-6小时之后换为1％血清的DMEM继续培养。

4.荧光素酶活性检测：用脂质体Lipofectamine 2000，分别将pMIR-CC或pMIR-TT与microRNA379前体或对照，以及内参pRL-CMV共转染入结肠癌HCT116细胞，24小时后，弃培养基，用PBS洗一次，去掉PBS；加300μl 1×PLB，在摇床上室温孵育15分钟，使细胞完全裂解；将裂解液移入1.5ml离心管中离心，去掉沉淀；取100μl LARII及20μl裂解液至荧光管中，混匀；测量萤火虫荧光素酶的活性；再加入100μl Stop&Gol Reagent，测量海胆荧光素酶的活性。

三.实验结果：

图2为报告载体荧光素酶活性分析图谱。携带C53SNP1808CC基因型的报告载体(pMIR-CC)，转染microRNA379前体与转染microRNA对照组相比较，转染microRNA379前体组的荧光素酶的活性下降了43％，(P＝0.015)；携带C53SNP1808TT基因型的报告载体(pMIR-TT)，转染microRNA379前体与转染microRNA对照组的荧光素酶活性则没有明显的差异(P＝0.86)。此结果说明，不同基因型能够显著地影响C53基因与microRNA379的结合活性。

实施例4：预测结肠癌发病年龄的试剂盒及方法(PCR-RFLP法)

PCR扩增的目的片段为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列；PCR引物为序列表SEQ ID NO.2-3所示的碱基序列；各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶等均为TaKaRa或NEB公司产品；其余各种试剂为进口或国产分析纯试剂。

一.试剂盒成分：

30μl 10×PCR缓冲液；(100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl₂)

50μl 10mM dNTP混合液；(dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM)

20μl 5U/μl Taq DNA聚合酶；

各2μl 50pmol/μl F和R引物：

F引物：5′-CAAGAACCCCACGAAAACAG-3′(SEQ ID NO.2)

R引物：5′-AAGATGGAAAGCCACAGGAA-3′(SEQ ID NO.3)

30μl 10×酶切缓冲液；(50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)₂，1mM DTT(pH 7.9))

5μl 10U/μl Acc I内切酶；

5ml超纯水(ddH₂O)；

本试剂盒供10人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。

二.使用方法

1.PCR扩增目的片段：

PCR扩增条件：总反应体系为10μl，包括20ng基因组DNA 1.0μl(提取方法见实施例6)，PCR引物(5pmol/μl)各0.6μl，dNTP混合液(10mmol/L)0.2μl，10×PCR缓冲液(含15mmol/L Mg²⁺)1.0μl，Taq聚合酶(5U/μl)0.1μl，用灭菌蒸馏水(纯水、ddH₂O)补充至10μl。

PCR反应参数：首先95℃变性10分钟，随后进行35个循环，每一循环包括94℃变性30秒，在相应的退火温度退火30秒，72℃延伸40秒。最后，72℃延伸10分钟，4℃保存。所用的PCR循环仪是ABI公司的PE9700型。

扩增序列为SEQ ID NO.1：序列的第147位即为该SNP的位点，有A/G两种基因型。

CAAGAACCCCACGAAAACAGGTGCGAAGCCTCAACTGCAGGCTCAGAGAAGCAGCATAAGGAACTGTCAGTACTGAAGCAAGAGTTTTTTCCTCTTTTATTAAGTCCGCTATACTAACTAGAAGGAGAATCTGTGGTTTTCGCCTG

TAGACCACAGGGCCAATCACCACAGCTTCTTGTAGAGAACATGGAGAGTGCCAAGATCACCATCAGGTGCCGCTTCCTTCCTGTGGCTTTCCATCTT

2.限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分型

(1)SNP1808(rs2737)的酶切位点：

TGTGGTTTTCGCCTG

TAGACCACAGGGCCAATCACCACA

↑Acc I(GTAGAC)

TGTGGTTTTCGCCTG

TAGACCACAGGGCCAATCACCACA

下划线表明的是限制性内切酶Acc I的识别序列，箭头和大写字是SNP的等位基因。AA基因型的扩增片段不存在Acc I酶切位点，将出现一个244bp片段；GG基因型存在Acc I酶切位点，将出现147bp和97bp两个片段；AG基因型则产生244bp、147bp和97bp三个片段。

(2)PCR产物酶切体系(20μl)：

PCR产物 8.0μl

10×酶切缓冲液 2.0μl

Acc I(10U/μl) 0.3μl

ddH₂O 9.7μl

(3)37℃温育3小时后，加入10×上样缓冲液1μl终止反应；

(4)取8μl上述产物，4.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

图3为三种基因型(AA型，GG型，AG型)酶切图谱。

该试剂盒的优点是：对实验平台要求较低，对技术人员也没有特殊的技术要求，只要接受简单的分子生物学操作培训即可；成本低廉，检测所需时间短。

实施例5：预测结肠癌发病年龄的试剂盒及方法(PCR-LDR法)

PCR扩增的目的片段为序列表SEQ ID NO.4所示的碱基序列；PCR引物为序列表SEQ ID NO.5-6所示的碱基序列；LDR探针为序列表SEQ ID NO.7-9所示的碱基序列；为各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶等均为TaKaRa或NEB公司产品；其余各种试剂为进口或国产分析纯试剂。

一.试剂盒成分：

20μl 10×HotStar PCR缓冲液；(100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mMMgCl₂，100μg/ml BSA)

40μl 10mM dNTP混合液；(dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM)

20μl 100mM MgSO₄溶液

20μl 5U/μl HotStar DNA聚合酶；

各2μl 50pmol/μl F和R引物：

F引物：5’-GAAGATGGAAAGCCACAGGA-3’(SEQ ID NO.5)

R引物：5’-TCAACTGCAGGCTCAGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)

0.5μl 40U/μl Taq DNA连接酶；

10μl 10×Taq DNA连接酶反应缓冲液；

10μl 12.5pmol/μl/each LDR探针混合物(探针用SYBR Green荧光染料进行标记)：

5’-P-TAGACCACAGGGCCAATCACCACAGTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’(SEQ ID NO.7)

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGAATCTGTGGTTTTCGCCTGG-3’(SEQ ID NO.8)

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGAATCTGTGGTTTTCGCCTGA-3’(SEQ ID NO.9)

2ml超纯水(ddH₂O)；

本试剂盒供10人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。

二.使用方法

1.通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段

表3：PCR系统(20μl体系)

PCR反应参数：

PCR产物检测：

用3％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在LDR反应中加入的量。

2.通过LDR反应测定C53基因SNP+1808多态性

LDR系统(10μl体系)：

LDR反应参数：

测序仪：ABI PRISM 3100。

SEQ ID NO.4：序列的第99位即为该SNP的位点，有C/T两种基因型。

GAAGATGGAAAGCCACAGGAAGGAAGCGGCACCTGATGGTGATCTTGGCACTCTCCATGTTCTCTACAAGAAGCTGTGGTGATTGGCCCTGTGGTCTA

CAGGCGAAAACCACAGATTCTCCTTCTAGTTAGTATAGCGGACTTAATAAAAGAGGAAAAAACTCTTGCTTCAGTACTGACAGTTCCTTATGCTGCTTCTCTGAGCCTGCAGTTGA。

图4为LDR分型结果示意图。

该试剂盒的优点是：操作简便、结果稳定、灵敏度和准确率高。

实施例6：基因组DNA的提取

共计收集结肠癌患者222例，平均年龄58.97±13.87岁，其中男性占57.2％。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。

根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16μl和20μl，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着颠倒混匀并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10体积的3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/μl，置-20℃冰箱保存。

实施例7：C53SNP1808基因型对结肠癌发病年龄的影响

一.实验方法

1.测定C53SNP1808多态性位点基因型

分别采用实施例4和实施例5所述的试剂盒和方法对实施例6提取得到的结肠癌患者基因组DNA样本进行检测。

2.统计方法：

利用SPSS13.0软件进行分析，检验Hardy-Weinberg平衡检测，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P＜0.05认为统计学的差异显著。采用ANOVA检验计算不同基因型对结肠癌的发病年龄的影响。

二.实验结果：

经检测分析得到，不同基因型对结肠癌的发病年龄的影响：

图5为SNP1808不同等位基因对结肠癌发病年龄的影响示意图。在222例结肠癌患者中，携带CC基因型的患者平均发病年龄为55.3岁，而携带TT基因型的患者平均发病年龄为63.0岁(95％可信区间＝2.6到12.8岁，P＝0.003)。可见，C53的1808基因多态性显著影响了结肠癌的发病年龄。

图6为低发病年龄组患者中不同等位基因型的分布频率图。CC基因型在45岁以下发病年龄患者中的分布频率为10.8％，远远低于其在整个患病人群中的分布频率(26.6％)。

本发明具有实用性的例证：

1)本发明的C53基因多态性的检测方法可用于分析C53基因上的SNP1808位点的多态性，应用在对结肠癌的辅助性诊断和对个体可能的结肠癌发病年龄进行评估。以利于开展结肠癌的早期干预和治疗。

2)利用本发明阐述冠结肠癌心病基因的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节C53表达的活性分子，促进结肠癌新药的开发。

3)本发明建立的检测C53基因多态性的核酸序列和结肠癌相关位点，可高灵敏度、特异性地应用于结肠癌基因诊断用的试剂盒。

如上所述，得出结论，C53基因的多态性与结肠癌的发病年龄具显著相关性。因此，根据本发明，测定多态性可用于进行基因诊断。

本发明叙述了C53基因结肠癌相关的SNP位点，并提供了一种测定C53基因多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定C53基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定结肠癌相关基因多态性的基因诊断方法。

序列表

Claims

1.一种预测结肠癌发病年龄的方法，其特征在于：该方法通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的C53基因1808位点(rs2737)的基因型，预测受试者可能的结肠癌发病年龄。

2.一种分离核酸，是序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

3.一组预测结肠癌发病年龄的引物，能特异性地扩增出含C53基因的1808位点的扩增产物，是序列表SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

4.一种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

30μl 10×PCR缓冲液，50μl 10mM dNTP混合液，20μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，各2μl 50pmol/μl F和R引物，30μl 10×酶切缓冲液，5μl 10U/μl Acc I内切酶，5ml超纯水；F和R引物是序列表SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20℃。

5.一种分离核酸，具有序列表SEQ ID NO.4所示的碱基序列。

6.一组预测结肠癌发病年龄的引物序列，能特异性地扩增出含C53基因的1808位点的扩增产物，是序列表SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的碱基序列。

7.一组预测结肠癌发病年龄的探针序列(寡核苷酸序列)，是序列表SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示的碱基序列。

8.一种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

20μl 10×HotStar PCR缓冲液，40μl 10mM dNTP混合液，20μl 100mM MgSO₄溶液，20μl 5U/μl HotStar DNA聚合酶，各2μl 50pmol/μl F和R引物，0.5μl 40U/μl Taq DNA连接酶，10μl 10×Taq DNA连接酶反应缓冲液，10μl 12.5pmol/μl/each LDR探针混合物，2ml超纯水；F和R引物是序列表SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的碱基序列；LDR探针混合物是序列表SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20℃。

9.根据权利要求8所述的预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其特征在于：所述的LDR探针序列SEQ ID No.7的5’端磷酸化，3’端标记荧光染料FAM。