CN103060432B - 一种预测前列腺癌易感性的方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预测前列腺癌易感性的方法和检测试剂盒，属于生物技术领域。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的RFX6基因3’端附近rs617426位点的基因型，预测受试者对前列腺癌的易感性；RFX6基因3’端附近的rs617426的基因型为GG时，受试者的易感性最高；rs617426的基因型为TG或TT时，受试者的易感性较低。本发明的优点是：首次阐述了rs617426基因多态性位点与前列腺癌的相关性，提供了一种预测前列腺癌易感性的方法，该方法可用于前列腺癌的早期预防诊断、辅助诊断，还可以用于新药研发。

Description

一种预测前列腺癌易感性的方法和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种预测前列腺癌易感性的方法和检测试剂盒，更具体的说是通过测定与前列腺癌相关基因RFX6的3’端附近rs617426位点多态性预测受试者对于前列腺癌的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断和新药开发，属于生物技术领域。

背景技术

前列腺癌（prostate cancer,PCa）是发生在男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤。美国在对1975-2006癌症发病率进行统计后，估算2010年PCa新发病例为217,730例，位居男性好发肿瘤中第一位，PCa的死亡人数估计为32,050，在男性肿瘤死亡率中位居第二。年龄是PCa的一个重要风险因素，年龄45岁以下的基本很少发病，随年龄的增长而增加。美国癌症协会统计，40岁以下的男性PCa发病率为1/8499，40-59岁男性中为1/38，60-69岁男性中为1/15，70岁以上男性中则为1/8。随着我们国家人口老龄化，PCa的发病率在我国正逐年上升，上海标化发病率从1973～1975年的1.8/10万上升至1997～1999年的5.5/10万，贵州省南部地区部分县市PCa的发病率已从1994～1998年的1.72/10万上升到2004～2008年的4.28/10万，成为威胁我国男性健康的公共问题。

目前进行PCa遗传病因研究，多采用大规模全基因组关联研究和小样本多人群中的验证，并且GWAS鉴定的多个PCa易感SNPs已在多个不同人群中被复制确定，证明了SNPs作为基因组标志的关联分析方法在PCa遗传研究中的有效性。SNPs是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1%为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。SNPs包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。

由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNPs以其密度高（平均每1kb就有1个）、代表性强（位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平）、遗传稳定性好（同微卫星多态性比较而言）、易于自动化分析（因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“＋/－或1/0”直接分型）等特点成为很好的遗传标志。

Rfx6（调节因子X6）——属于转录因子RFX（regulatory factor X-box binding）家族。位于chr15（54166958-54222377），19个外显子，编码蛋白长度1281，一个亚型，有B、C和D三个结构域，主要在胰腺表达，与其他同家族RFX比表达水平较低，在胰腺的发展和功能的调节中是关键的转录调节物。RFX6与RFX2和RFX3直接作用，而后二者在胰腺表达并发挥作用。

在胰腺中，Rfx6位于促内分泌因子Neurog3下游，其他多种胰岛转录因子的上游，在胰岛细胞分化中发挥作用。这两种基因的突变表现出相似而不同的表型。人类RFX6突变，会引起难治性腹泻和糖尿病，肠闭锁和胆道畸形，新生儿糖尿病。对Rfx6的充分理解有助于阐明胰岛及β细胞的形成、糖尿病的发病过程。

DNA-binding蛋白RFX6在新生血色沉着病的病理中发挥重要作用，血色沉着病HFE基因与前列腺癌的相关性突出了血色沉着病的病理学与前列腺癌的交互作用。

GPRC6A和RFX6基因附近位点，缩窄到基因RFX6区域的SNPs与前列腺癌显著相关，比最初的GWAS中与前列腺癌的相关位点GPRC6A/RFX6，RFX6基因变异可能是更优先的敏感位点。

2010年，Takata R等鉴定了位于RFX6基因上的rs339331和PCa风险关联，此后，此位点在欧洲人群和中国人群中复制验证。rs339331位于RFX6基因第4内含子，用59个tag SNPs覆盖580kb区域（Chr.6:117.0–117.6Mb）作图分析其位于一个约200kb的关联区段，此区域涵盖有两个基因：GPRC6A，RFX6结合以上对RFX6功能的分析，我们推测RFX6基因为PCa易感基因并且选择了位于其的rs617426，在273个PCa患者和606个对照人群中分型后进行关联分析，结果确定了rs617426与中国人群PCa关联。

rs617426在染色体上位置为117,360,126，位于RFX6的3’端附近，rs617426是距离起始端501的SNP位点，此位点所在基因组位置可能会对基因转录有调节作用。经查询检索，截至目前，RFX6基因rs617426与PCa风险还未见有报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的方法。

本发明的第二个目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列为RFX6基因3’端附近的包含单苷酸多态性位点rs617426的核苷酸片段。图1为RFX6基因结构及rs617426多态性变异位点的示意图，rs617426位点标在RFX6基因图中3’端附近的相应位置。

所述单苷酸多态性位点rs617426的基因型为GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为TG或TT时，前列腺癌易感性较低。

一组检测前列腺癌易感性的引物，能扩增得到SEQ ID No.1所示的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列。

所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示。

一种前列腺癌易感性基因的检测方法，包括如下步骤：

（1）抽提样品的基因组DNA，扩增RFX6基因3’端附近的包含单苷酸多态性位点rs617426的核苷酸片段；

（2）检测步骤（1）产物中单苷酸多态性位点rs617426的基因型，基因型为GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为TG或TT时，前列腺癌易感性较低。

所述步骤（1）中的核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs617426位点位于该核苷酸序列的+501位。

所述扩增RFX6基因3’端附近的包含单苷酸多态性位点rs617426的核苷酸片段，使用的一组引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

本发明提供了一种检测前列腺癌易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增RFX6基因3’端附近rs617426位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：

一种预测PCa的试剂盒，供10人份检测应用，由以下试剂组成：

10μL 10×PCR缓冲液（购自Pharmacia）,

2μL 10mM dNTP混合液（购自Pharmacia）,

2μL Taq DNA聚合酶（2unit/μL）（购自Takara）,

1μL F1引物，为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

1μL R1引物，为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

8μL 10×LC-green PLUS饱和荧光染料；（购自美国Idaho公司）

2L寡核苷酸内参引物各0.5μL，浓度为10pmol/μL，其中低温内参引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID NO.6所示的序列，高温内参引物R为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

64L纯水。

使用方法：

1）PCR扩增：通过PCR扩增RFX6基因的3’端附近部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液1μL，10mmol/L dNTP0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L上游引物0.1μL，10pmol/L下游引物0.1μL，10×LC Green PLUS饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL（高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL）（序列见表1），基因组DNA1μL，加去离子水至10μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性1min，54℃退火30s，72℃延伸6s，总共45个循环，72℃总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃4min。PCR时于每一体系中加入20μl的石蜡油，以防止液体挥发。

2）基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-I96上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。

RFX6基因3’端附近单苷酸多态性位点rs617426在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如：体液（血液、腹水及尿液等）、组织细胞（如肝组织）等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含RFX63’端附近突变位点rs617426的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含RFX63’端附近突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。

在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据RFX63’端附近rs617426突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定rs617426基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。

本发明的优点是：本发明首次阐明了RFX63’端附近rs617426多态性位点与PCa的相关性，提供了一种预测PCa易感性的方法和试剂盒，该方法可用于PCa的预防、辅助诊断，还可以用于新药研发。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为RFX6基因结构及3’端附近多态性变异位点的示意图

图2为RFX6基因3’端附近rs617426位点经HRM分型溶解曲线图

图3为RFX6基因3’端附近rs617426位点的测序图

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下：

10×PCR缓冲液：10mM Tris-HCI(pH=8.3)，500mM氯化钾（KCI），10mM氯化镁（MgCI2），0.01%(W/V)白明胶

dNTP：脱氧核苷三磷酸

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

TE：10mM Tris-HCI(pH=7.5)，1mM EDTA(pH=8.0)

实施例1：血液样本收集和基因组DNA的提取：

（1）PCa患者均经组织病理学诊断，共选取来自北京和天津地区无血缘关系的PCa患者273例（年龄：4693岁，平均72.3岁），同地区的年龄匹配的对照606例（年龄：58–94岁，平均70.4岁），均为男性，无PCa家族史、DRE阴性并且PSA<4ng/mL。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合世界医学会赫尔辛基宣言：人体医学研究的伦理原则。（2）根据下列方法，制备人基因组DNA。①首先在已标号的1.5mLEP管中加1000μL红细胞裂解液，后加入400μLEDTA抗凝血（抗凝血加入前颠倒混匀3-5次），颠倒混匀，室温静置10分钟；②13000rpm离心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480μl核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20μL蛋白酶K（用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K），颠倒混匀，65℃孵箱10分钟，（期间不时上下混匀，确保无凝块）；④取出后降至室温，加300μL蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；⑤将上清液移至新EP管中，加入670μL预冷的异丙醇，充分颠倒混匀（10次以上），可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；⑥弃上清液并确保沉淀留在EP中，加入670μL70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；⑦弃上清，使管内乙醇挥发干净；⑧加入TE溶解液(400μL)，充分溶解，然后对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/μL，放置于4℃备用，剩余基因组DNA置-20℃冰箱保存。

实施例2SNP的识别鉴定

本发明采用PCR-高分辨率溶解曲线（HRM）分析法和PCR测序技术同时对RFX6的3’near gene区的rs617426位点（其等位位点为T/G）的基因型进行检测。

1）PCR-HRM引物的确定

从Genebank中查取rs617426附近的DNA碱基序列（SEQ ID NO.1），引物设计在Oligo6.0和primer5.0软件下完成。目的片段定位在RFX6基因3’near gene区，全长70bp，确定了正义链F1（+453bp--+470bp）与反义链R1（+503bp--+572bp），特异性引物序列如下：

F1：5’-AGGCATGGATATGATATG-3’（SEQ ID NO.2）

R1：5’-GAGATTAAGGAGTCAAGTAG-3’（SEQ ID NO.3）

2）PCR-HRM反应体系及条件

通过PCR扩增RFX6的3’near gene基因区的rs617426位点所在片段，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液1μL，10mmol/L dNTP0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L上游引物0.1μL，10pmol/L下游引物0.1μL，10×LC Green PLUS饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL（高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL）3’端C3封闭，阻止延伸，见表1），基因组DNA 1μL，加去离子水至10μL。PCR时于每一体系中加入20μl的石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性1min，54℃退火30s，72℃延伸6s，总共45个循环，72℃总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃4min。

表1高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度

3）HRM判定基因型

将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-I96上进行HRM分析：从45℃开始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，到98℃结束，用LightScanner Call IT软件对采集后的曲线（图2）进行分析，判定基因型。

4）测序验证

从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取3例样本进行测序验证。测序样本重新进行PCR扩增，测序引物序列为：F2：5’-AGGCATGGATATGATATG-3’（SEQID NO.8），R2：5’-GCATTCCGATTCTATGTAAC-3’(SEQ ID NO.9)，扩增片段长254bp。PCR反应总体系为30μL,包含：基因组DNA3μL，10×PCR Buffer3μL，10mmol/L dNTP0.6μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.6μL，上下游引物（10pmol/μL）各0.3μL，去离子水补充至总体积30μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min后进入主循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸7min。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证（图3）。

实施例3基因SNP与PCa的相关性

统计方法：运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。利用SPSS11.0软件Pearson卡方检验计算RFX6基因3’near gene上rs617426多态性位点的等位基因、基因型在PCa病例组与正常对照组间的分布频率，logistic回归评价PCa的患病风险OR值及其95%CI可信区间，以P<0.05为差异显著性标准。

结果：位于RFX6基因3’near gene的SNP rs617426多态位点的基因型和等位基因频率在病例与对照组间的分布及与PCa的关联分析详见表2。表2RFX6基因3’near geneSNP rs617426多态性位点的基因型和等位基因频率在中

国人群中病例对照组间的分布及与PCa的关联分析

注：OR：比值比；CI：可信区间。HWE：Hardy-Weinberg平衡。

由表2可见，RFX6基因3’near gene的rs617426位点的G等位基因，即在其DNA互补链上为C等位基因，在患者群体中的分布频率显著高于其在健康正常人群中的分布频率（67.7%vs.60.8%），具有显著性差异（年龄校正P＝0.008），而且G位点的OR值为1.33，95%CI：1.08-1.65；在隐性模型中（G/Gvs.T/T+T/G），其基因型在病例组中的分布频率显著高于对照组中的（年龄校正P＝0.002），等位基因和基因型与PCa关联分析均表明RFX6基因3’near gene的rs617426位点的G等位基因可能与PCa患病呈正相关，有可能增加PCa的发病风险。

实施例4检测试剂盒

制备检测PCa相关风险的试剂盒，包含有可扩增出RFX6基因3’near gene的rs617426位点的引物对，及其他PCR-HRM相应试剂。本发明试剂盒供10人份检测应用，于-20℃避光保存，其组分、含量和来源包括：

10μL 10×PCR缓冲液（Pharmacia）,

2μL 10mM dNTP混合液（Pharmacia）,

2μL Taq DNA聚合酶（2unit/μL）（Takara）,

1μL F1（SEQ ID NO.2）（10pmol/μL），

1μL R1（SEQ ID NO.3）（10pmol/μL）引物，（上海生工合成）

8μL 10×LC-green PLUS饱和荧光染料（美国Idaho公司），

2μL寡核苷酸内参（10pmol/μL）（高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.5μL），（序列见表1），

64μL纯水。

经PCR-HRM检测后，可轻易检测出RFX6基因3’near gene的rs617426位点的多态性。

验证试验：采用本试剂盒，随机选取PCa患者样本10例，对照组样本10例，经PCR-HRM检测RFX6基因3’端附近的rs617426位点的多态性。

一．方法

1.PCR扩增：通过PCR扩增RFX6基因的3’端附近部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液1μL，10mmol/L dNTP0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L上游引物0.1μL，10pmol/L下游引物0.1μL，10×LC Green PLUS饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL（高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL）（序列见表1），基因组DNA1μL，加去离子水至10μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性1min，54℃退火30s，72℃延伸6s，总共45个循环，72℃总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃4min。PCR时于每一体系中加入20μl的石蜡油，以防止液体挥发。

2）基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-I96上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。

二．结果：

结果显示，PCa患者样本RFX6基因3’端附近rs617426位点的基因型为GG；对照组样本rs617426位点的基因型为TG或TT。

本发明具有实用性的例证：

本发明的RFX6基因3’near gene的rs617426多态性的检测方法可用于分析人基因组DNA上此位点的G等位位点，即在其DNA互补链上为C等位位点，应用于对PCa的辅助性诊断，可评估个体有多大的PCa患病风险，以利于开展PCa的早期预防和治疗。

利用本发明阐述RFX6基因3’near gene的rs617426位点的碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节RFX6基因表达的活性分子，促进PCa新药研发。

本发明建立的检测RFX6基因3’near gene的rs617426位点多态性的核酸序列，可高灵敏度，特异性的应用于PCa基因辅助诊断的试剂盒。

如上所诉，得出结论，RFX6基因3’near gene的rs617426位点的多态性与PCa具显著相关性。因此，根据本发明测定此多态性，可用于PCa的基因辅助诊断。

本发明叙述了RFX6基因3’near genePCa相关的新突变位点，并提供了一种测定基因多态性的方法，而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定RFX6基因3’near gene的rs617426多态性。

本发明提供了一种测定PCa相关基因多态性的基因辅助诊断方法。

Claims (1)

1.一种检测前列腺癌易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

10μL10×PCR缓冲液；

2μL10mM dNTP混合液；

2μL Taq DNA聚合酶，2unit/μL；

1μL F1引物，为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

1μL R1引物，为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

8μL10×LC-green PLUS饱和荧光染料；

2μL寡核苷酸内参引物各0.5μL，浓度为10pmol/μL，其中低温内参引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID NO.6所示的序列，高温内参引物R为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

64μL纯水。