CN107058594A - 一种检测痛风易感基因snp基因型的方法、引物及试剂盒 - Google Patents

一种检测痛风易感基因snp基因型的方法、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种检测痛风易感基因SNP基因型的方法、引物及试剂盒，本发明公开了检测样品中rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的HRM方法，也公开了用于扩增和检测样品上述8个SNP的引物序列，本发明的有益效果在于，能够准确检测8个痛风易感基因位点的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的方法对上述8个痛风易感基因位点基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于痛风易患性的辅助判断。

Description

一种检测痛风易感基因SNP基因型的方法、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测一组痛风易感基因SNP位点基因型的方法。
背景技术
人ABCG2基因位于染色体4q22-q23，ABCG2五号外显子的rs2231142(c.421C>A)与尿酸盐水平和痛风具有相关性，而最新研究发现该多态A/A基因型频率与汉族男性和女性的痛风发生均有显著的相关性，汉族痛风女性患者中等位基因A的频率为0.422，远高于对照组(0.293)。ABCG2基因SNP位点rs72552713是该基因14号外显子，研究发现ABCG2基因SNP位点rs72552713(c.376C>T,p.Gln126Ter)的CT基因型、T等位基因与痛风和高血酸尿症的发生显著相关，而且携带该突变的痛风患者具有发病早、病程早期即表现出频繁发作和多关节受累的临床特点。BCAS3基因rs11653176，CNIH2基因rs4073582，GCKR基因rs1260326，KCNQ1 rs179785，位于12号染色体MYL2和CUX2基因间隔区rs2188380和RFX3基因rs12236871与痛风易感性相关。
痛风(Gout)是由嘌呤代谢紊乱和肾小管源性的尿酸排泄障碍而引起关节及某些器官损害的一种代谢疾病。由于生活水平的提高和饮食结构的改变，痛风发病率呈逐年上升趋势，欧美等痛风患病率有1.4-3.9％，中国的发病率为0.15-1.14％。痛风早期的临床表现为间断发作性急性关节炎，主要为单关节受累，肿痛一般持续7-10天，可通过药物或自发缓解，间歇期无症状。随着病程的延长，痛风发作次数、受累关节数逐渐增加，间歇期也开始出现症状，同时关节或皮肤软组织中痛风石形成，严重者出现关节毁损或致残，出现肾脏结石、慢性肾损伤等，最终可能发展成慢性肾功能衰竭。
高血酸尿症(Hyperuricemia，HUA)、饮酒、代谢综合征、高血压、肥胖、利尿剂的服用等危险因素都与痛风的发生发展有关。目前关于痛风的发病机制尚不清楚，但大量研究表明是痛风是一种由环境和遗传因素共同作用引起的多基因遗传病，目前已知的痛风相关基因有SLC2A9、ABCG2等。研究发现高血酸尿症人群中仅有10％左右的人可能发展成痛风，说明不直接参与尿酸代谢的基因也可能与痛风易感性有关。鉴于痛风对患者引起的严重危害和沉重的负担，对痛风易感基因的筛查和研究日益受到人们的关注。
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是在常规聚合酶链式反应(PCR)过程中饱和荧光染枓如Eva Green与DNA双链结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上便可判断是否存在突变或SNP。不同位点、杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形，所以HRM分析能够有效区分不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。
发明内容
本发明公开了检测样品中rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的HRM方法。
本发明公开了用于扩增和检测样品上述8个SNP的引物序列，所述的引物序列为如下八对中的任意一对或多对：
上游引物 下游引物
rs2231142 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3' 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'
rs72552713 5'-CGCGACCTGCCAATTTCAA-3' 5'-TCAGCCAAAGCACTTACCCA-3'
rs11653176 5'-GGGTGGCTCTTCTCTCCCA-3' 5'-TCTTGCCGGATGACAGTGAG-3'
rs4073582 5'-GGAGTCCTGATGGCAGACAC-3’ 5'-CTGCAGGACGGTGGAAGTAC-3'
rs1260326 5'-AGAGAAGACCAACCACATCCAG-3' 5'-ACCTGGGTCCCTTTGTCAC-3'
rs179785 5'-ACTTCATGTACGTGGACGGG-3' 5'-CCCATCCGCTGGTTCATTTG-3'
rs2188380 5'-TTCCAGTTCCTCCACATTCTT-3' 5'-TTACAGCAACCCTTGGAATCT-3'
rs12236871 5'-TGAGTAAACAGTATGATGTGGCT-3' 5'-CATGTGTGGGCTCCAGTATAA-3'
或上述引物的衍生序列，所述衍生序列为向5’端和/或3’端方向延伸一致数个碱基或删减一致数个碱基得到的序列。
本发明还提供一种检测rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的方法，该结果可用于基因SNP位点相关的痛风易患性风险评估，该方法包括如下步骤：
(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.8，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ IDNo.9-SEQ ID No.16；
(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；PCR扩增引物序列为上面提及的序列对或这些序列对的衍生序列，所述衍生序列为向5’端和/或3’端方向延伸一致数个碱基或删减一致数个碱基得到的序列；
作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：
作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。
作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本SNP位点的基因型：
如果与重组阴性质粒的熔解曲线重合，则痛风易感基因位点rs2231142的基因型为CC；rs72552713的基因型为CC；rs11653176的基因型为TT；rs4073582的基因型为GG；rs1260326的基因型为TT；rs179785的基因型为GG；rs2188380的基因型为TT；rs12236871的基因型为AA；
如果与重组阳性质粒的熔解曲线重合，则痛风易感基因SNP位点rs2231142的基因型为AA；rs72552713的基因型为TT；rs11653176的基因型为CC；rs4073582的基因型为AA；rs1260326的基因型为CC；rs179785的基因型为AA；rs2188380的基因型为CC；rs12236871的基因型为GG；
如果在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的，则痛风易感基因位点rs2231142的基因型为CA，rs72552713的基因型为CT；rs11653176的基因型为CT；rs4073582的基因型为GA；rs1260326的基因型为CT；rs179785的基因型为AG；rs2188380的基因型为CT；rs12236871的基因型为GA。
本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒内包含有上述引物对或其衍生序列、重组阴性质粒、重阳性质粒和PCR试剂。
所述的试剂盒用于辅助评估痛风易患性。
本发明的有益效果在于，能够准确检测rs2231142，rs72552713，rs11653176，rs4073582，rs1260326，rs179785，rs2188380的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的方法对上述8个痛风易感基因位点基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于痛风易患性的辅助判断。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。以rs2231142为例，在附图中：
图1为本发明的HRM方法灵敏度实验结果。
图2为样本用本发明的HRM方法分析结果。
图3为样本的rs2231142(c.421C>A)位点的测序结果；其中a为野生型序列，b为杂合突变型序列，c为纯合突变型序列。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方案对本发明做更详细阐述，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物和所用序列合成及测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1 rs2231142标准品的制备
要建立HRM分析方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守和特异性的序列，要保证反应的高特异性。本研究合成包含rs2231142(c.421C>A)位点的野生型和纯合突变型DNA序列，利用基因重组技术将其克隆到pMD18-T载体中，构建出pMD18-T-rs2231142的野生型和纯合突变型重组质粒，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量后作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs2231142的构建和转化
1.合成rs2231142(c.421C>A)野生型和纯合突变型DNA序列，本发明合成的序列228bp(如SEQ ID No.1)，序列如下：
(1)野生型序列
TAAACAGTCATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGCAGACTCCAAGGTAATGTG
(2)纯合突变型序列(SEQ ID No.9)
TAAACAGTCATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTAAAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGCAGACTCCAAGGTAATGTG
2.连接反应：将上述合成的DNA片段与pMD18-T进行连接，采用如下连接体系进行配制：
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
3.pMD18-T-rs2231142质粒的转化以及PCR鉴定
(1)从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻。
(2)取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟。
(3)42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min。
(4)于1.5ml EP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃120转轻摇培养90min。
(5)将上述培养液短暂离心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。
(6)从平板上挑取单克隆菌落于500μL Amp抗性LB液体培养基的1.5ml EP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。
(7)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇。
(8)用rs2231142的上下游引物扩增上述稀释菌液，PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。
引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：rs2231142-F 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'
下游引物：rs2231142-R 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'
体系如下：
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30sec，35个循环；72℃10min。
重组阴性质粒和重组阳性质粒提取
采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒，测定浓度和纯度，同时取10ul纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
二、标准品的获取和定量
(1)将步骤一得到的冻存的含有重组质粒pMD18-T-rs2231142的大肠杆菌DH5a100ul接种于15ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；
(2)采用北京百泰克生物科技有限公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒；
(3)利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计(ND5000)对提取的质粒测定浓度，根据A260/A280判断质粒的纯度。
实施例2 ABCG2 rs72552713标准品的制备
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs72552713的构建和转化
1.合成ABCG2 rs72552713(c.376C>T)野生型和纯合突变型DNA序列，本申请合成的序列300bp，序列如下：
(1)野生型序列
TCTTATAGGTTATTAGATGTCTTAGCTGCAAGGAAAGATCCAAGTGGATTATCTGGAGATGTTCTGATAAATGGAGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAATGTAATTCAGGTTACGTGGTACAAGTAAGTATTAGTGGGTTTGCATTTTCTGTTTCCTCTGTTTCTATATGGGTAAGTGCTTTGGCTGATAGTTCAATGTGCTTCCAGTTGATTATGTGACATGGTCCTAGAACTGACGTTCTTTACAGCAGCTTTTCTTAATTTCTCATAGACACTTATGTGAAAAGGCAGGGAGAATCT
(2)纯合突变型序列
TCTTATAGGTTATTAGATGTCTTAGCTGCAAGGAAAGATCCAAGTGGATTATCTGGAGATGTTCTGATAAATGGAGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAATGTAATTCAGGTTACGTGGTATAAGTAAGTATTAGTGGGTTTGCATTTTCTGTTTCCTCTGTTTCTATATGGGTAAGTGCTTTGGCTGATAGTTCAATGTGCTTCCAGTTGATTATGTGACATGGTCCTAGAACTGACGTTCTTTACAGCAGCTTTTCTTAATTTCTCATAGACACTTATGTGAAAAGGCAGGGAGAATCT
连接反应，pMD18-T-rs72552713质粒的转化，扩增程序/反应条件，重组阴性质粒和重组阳性质粒提取及标准品的获取和定量同实施例1。
pMD18-T-rs72552713质粒的PCR鉴定，用引物ABCG2-F和ABCG2-R扩增上述稀释菌液。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：ABCG2-F 5'-CGCGACCTGCCAATTTCAA-3'
下游引物：ABCG2-R 5'-TCAGCCAAAGCACTTACCCA-3'
实施例3 BCAS3 rs11653176标准品的制备
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs11653176的构建和转化
1.合成BCAS3 rs11653176(c.2638+1514T>C)野生型和纯合突变型DNA序列，本申请合成的序列270bp，序列如下：
(1)野生型序列
GGAAGGGGGCCTAAGTGAGGAATGTGGCTTACGGCACAGGCTTTTGCCTGCATCTCTGGGGTCCCTAGCCAGCCTCGGCTCACATAAACCGGAGCCCGGTGCCACTGGACCCATCCCCGGCAGCCTCCCTCTTCCGAGGCCTGGAGGAGCTCCCGGGTGGCTCTTCTCTCCCACCGCCTTCTCAGGAGCCCCTTGGAGCATCTCACTGTCATCCGGCAAGAGGATTTGAAGGTGCATTGAGTCACAGCTGTGGAACTTCAGCCTGGCATA
(2)纯合突变型序列
GGAAGGGGGCCTAAGTGAGGAATGTGGCTTACGGCACAGGCTTTTGCCTGCATCTCTGGGGTCCCTAGCCAGCCTCGGCTCACATAAACCGGAGCCCGGTGCCACTGGACCCATCCCCGGCAGCCTCCCTCTTCCGAGGCCTGGAGGAGCTCCCGGGTGGCTCTTCTCTCCCACCGCCTCCTCAGGAGCCCCTTGGAGCATCTCACTGTCATCCGGCAAGAGGATTTGAAGGTGCATTGAGTCACAGCTGTGGAACTTCAGCCTGGCATA
连接反应，pMD18-T-rs11653176质粒的转化，扩增程序/反应条件，重组阴性质粒和重组阳性质粒提取及标准品的获取和定量同实施例1。
pMD18-T-rs11653176质粒的PCR鉴定，用引物BCAS3-F和BCAS3-R扩增上述稀释菌液。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：BCAS3-F 5'-GGGTGGCTCTTCTCTCCCA-3'
下游引物：BCAS3-R 5'-TCTTGCCGGATGACAGTGAG-3'
实施例4 CNIH2 rs4073582标准品的制备
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs4073582的构建和转化
1.合成CNIH2 rs4073582(c.312-7G>A)野生型和纯合突变型DNA序列，本申请合成的序列350bp，序列如下：
(1)野生型序列
GCCTCTTCTGTCTGATGTTTCTGTGTGCAGCAGAGTGGGTGACCCTGGGCCTCAACATCCCCCTCCTCTTCTACCACCTCTGGAGGTGAGGGTAGCAGCTGCCTTGGGGAGGCTGAGATGGGGAACAGGGGCAGGATGGGGGTGGGAGTCCTGATGGCAGACACTCAGGCCCCTGTCTGCCCCAGGTACTTCCACCGTCCTGCAGATGGCTCTGAGGTCATGTATGATGCGGTCTCCATCATGAATGCTGACATTCTCAACTACTGCCAGAAGGAGTCCTGGTGCAAACTTGCCTTCTACCTGCTCTCCTTCTTCTATTACCTGTACAGGTGAGGCCTTGCCCACAGCAG
(2)纯合突变型序列
GCCTCTTCTGTCTGATGTTTCTGTGTGCAGCAGAGTGGGTGACCCTGGGCCTCAACATCCCCCTCCTCTTCTACCACCTCTGGAGGTGAGGGTAGCAGCTGCCTTGGGGAGGCTGAGATGGGGAACAGGGGCAGGATGGGGGTGGGAGTCCTGATGGCAGACACTCAGGCCCCTGTCTACCCCAGGTACTTCCACCGTCCTGCAGATGGCTCTGAGGTCATGTATGATGCGGTCTCCATCATGAATGCTGACATTCTCAACTACTGCCAGAAGGAGTCCTGGTGCAAACTTGCCTTCTACCTGCTCTCCTTCTTCTATTACCTGTACAGGTGAGGCCTTGCCCACAGCAG
连接反应，pMD18-T-rs4073582质粒的转化，扩增程序/反应条件，重组阴性质粒和重组阳性质粒提取及标准品的获取和定量同实施例1。
pMD18-T-rs4073582质粒的PCR鉴定，用引物CNIH2-F和CNIH2-R扩增上述稀释菌液。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：CNIH2-F 5'-GGAGTCCTGATGGCAGACAC-3'
下游引物：CNIH2-R 5'-CTGCAGGACGGTGGAAGTAC-3'
实施例5 GCKR rs1260326标准品的制备
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs1260326的构建和转化
1.合成GCKR rs1260326(c.1337T>C)野生型和纯合突变型DNA序列，本申请合成的序列300bp，序列如下：
(1)野生型序列
CAGGGGAGCAGGAGGAACAGCTGCACAGCCAGCCTTTCGACTCTGATGCCCTCCCCTTCTCCTAGACAACCTCACGGAGGTGCAGACTATAGTGGAGCAGGTGAAAGAGAAGACCAACCACATCCAGGCCCTGGCACACAGCACCGTGGGTCAGACCTTGCTGGTGAGAGTCCAGCCGTGACAAAGGGACCCAGGTGGCAGTTGCAGCCAGGCCTTCCTGGAGATGCCTCTCCTGCTCCTCTTTCTCTCTCTCCAGATCCCTCTGAAGAAGCTCTTTCCCTCCATCATCAGCATCACATG
(2)纯合突变型序列
CAGGGGAGCAGGAGGAACAGCTGCACAGCCAGCCTTTCGACTCTGATGCCCTCCCCTTCTCCTAGACAACCTCACGGAGGTGCAGACTATAGTGGAGCAGGTGAAAGAGAAGACCAACCACATCCAGGCCCTGGCACACAGCACCGTGGGTCAGACCTTGCCGGTGAGAGTCCAGCCGTGACAAAGGGACCCAGGTGGCAGTTGCAGCCAGGCCTTCCTGGAGATGCCTCTCCTGCTCCTCTTTCTCTCTCTCCAGATCCCTCTGAAGAAGCTCTTTCCCTCCATCATCAGCATCACATG
连接反应，pMD18-T-rs1260326质粒的转化，扩增程序/反应条件，重组阴性质粒和重组阳性质粒提取及标准品的获取和定量同实施例1。
pMD18-T-rs1260326质粒的PCR鉴定，用引物GCKR-F和GCKR-R扩增上述稀释菌液。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：GCKR-F 5'-AGAGAAGACCAACCACATCCAG-3'
下游引物：GCKR-R 5'-ACCTGGGTCCCTTTGTCAC-3'
实施例6 KCNQ1 rs179785标准品的制备
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs179785的构建和转化
1.合成KCNQ1 rs179785(c.1515-8555G>A)野生型和纯合突变型DNA序列，本申请合成的序列228bp，序列如下：
(1)野生型序列
AATTTGACCTATCCAGAAACAACGGCTCCTTCAGTGGGCTCAGCCCCTGAGACCACTCAGCCTGGGCTGTGTGCCCAGCGGCACTTCATGTACGTGGACGGGGCAGGCGGGCAGGCGGGCGTGGAGGAGCTAATGGGTAAGTTAGGCAGCACATTAACAAATGAACCAGCGGATGGGGGTGGGGAGCTCATCTCATTCATCTACAAATTATTAACAATAACTTGTTCA
(2)纯合突变型序列
AATTTGACCTATCCAGAAACAACGGCTCCTTCAGTGGGCTCAGCCCCTGAGACCACTCAGCCTGGGCTGTGTGCCCAGCGGCACTTCATGTACGTGGACGGGGCAGGCGGGCAGGCAGGCGTGGAGGAGCTAATGGGTAAGTTAGGCAGCACATTAACAAATGAACCAGCGGATGGGGGTGGGGAGCTCATCTCATTCATCTACAAATTATTAACAATAACTTGTTCA
连接反应，pMD18-T-rs179785质粒的转化，扩增程序/反应条件，重组阴性质粒和重组阳性质粒提取及标准品的获取和定量同实施例1。
pMD18-T-rs179785质粒的PCR鉴定，用引物KCNQ1-F和KCNQ1-R扩增上述稀释菌液。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：KCNQ1-F 5'-ACTTCATGTACGTGGACGGG-3'
下游引物：KCNQ1-R 5'-CCCATCCGCTGGTTCATTTG-3'
实施例7 MYL2-CUX2 rs2188380标准品的制备
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs2188380的构建和转化
1.合成MYL2-CUX2 rs2188380(n.338-9699T>C)野生型和纯合突变型DNA序列，本申请合成的序列250bp，序列如下：
(1)野生型序列
CCAAACTGGTTTCCAAAGCGCTTGTACTATCTTACATTCCCATCAGCAATGTACAAGAGTTCCAGTTCCTCCACATTCTTCCCCAGCATTTGGAATGGTCAATATATTAGATTCCAAGGGTTGCTGTAATTAATTGCCACAAACTGGGGGTCTTAAAACAAGAGAAACGTGTTTTCTCACAGCTCTGGAGGCCAGAAGTTTAAAGTCAAGAGTCAGCAGGGTTGATTCCCTCTGGAGGCTCTCAGGGAGA
(2)纯合突变型序列
CCAAACTGGTTTCCAAAGCGCTTGTACTATCTTACATTCCCATCAGCAATGTACAAGAGTTCCAGTTCCTCCACATTCTTCCCCAGCATTTGGAATGGTCAATACATTAGATTCCAAGGGTTGCTGTAATTAATTGCCACAAACTGGGGGTCTTAAAACAAGAGAAACGTGTTTTCTCACAGCTCTGGAGGCCAGAAGTTTAAAGTCAAGAGTCAGCAGGGTTGATTCCCTCTGGAGGCTCTCAGGGAGA
连接反应，pMD18-T-rs2188380质粒的转化，扩增程序/反应条件，重组阴性质粒和重组阳性质粒提取及标准品的获取和定量同实施例1。
pMD18-T-rs2188380质粒的PCR鉴定，用引物MYL2-CUX2-F和MYL2-CUX2-R扩增上述稀释菌液。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：MYL2-CUX2-F 5'-TTCCAGTTCCTCCACATTCTT-3'
下游引物：MYL2-CUX2-R 5'-TTACAGCAACCCTTGGAATCT-3'
实施例8 RFX3 rs12236871标准品的制备
一、重组阴性和阳性质粒pMD18-T-rs12236871的构建和转化
1.合成RFX3 rs12236871(n.287-13406A>G)野生型和纯合突变型DNA序列，本申请合成的序列250bp，序列如下：
(1)野生型序列
ATAGGTGTTTTGGGAAGTATGCATTGCAGCTCAAAGGAGCTTTGAATCATGTGAAAAATATTTTTGATAAAAATATGAGTAAACAGTATGATGTGGCTACCAAATAAACTGAGTTTTAATACTACATTAGCAAAATTATACAGAAAGAAGGAACTAATTATCTCTTTGCATTTATACTGGAGCCCACACATGGACTAATGCTAGGTTCTGACACTTTAAAAGGATGAATAGGCACATCTGTATTTCCAGA
(2)纯合突变型序列
ATAGGTGTTTTGGGAAGTATGCATTGCAGCTCAAAGGAGCTTTGAATCATGTGAAAAATATTTTTGATAAAAATATGAGTAAACAGTATGATGTGGCTACCAAATAAGCTGAGTTTTAATACTACATTAGCAAAATTATACAGAAAGAAGGAACTAATTATCTCTTTGCATTTATACTGGAGCCCACACATGGACTAATGCTAGGTTCTGACACTTTAAAAGGATGAATAGGCACATCTGTATTTCCAGA
连接反应，pMD18-T-rs12236871质粒的转化，扩增程序/反应条件，重组阴性质粒和重组阳性质粒提取及标准品的获取和定量同实施例1。
pMD18-T-rs12236871质粒的PCR鉴定，用引物RFX3-F和RFX3-R扩增上述稀释菌液。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：RFX3-F 5'-TGAGTAAACAGTATGATGTGGCT-3'
下游引物：RFX3-R 5'-CATGTGTGGGCTCCAGTATAA-3'
实施例9 HRM-PCR检测rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871方法的建立
一、待测样本的制备
提取30例样本的外周血基因组DNA，用作rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因PCR扩增的模板
(1)取1ml全血，加入3ml TE，颠倒混匀后静置10min，8000rpm离心5分钟，弃上清液。
(2)重复上述步骤2-3次至沉淀为白色
(3)加入900ul 10％SDS和10ul 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h。
(4)将离心管冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min。
(5)小心吸取上清后再加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min。
(6)取上清，加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清。
(7)加500ul 70％的乙醇洗涤沉淀，短暂离心后弃上清，开盖干燥至乙醇完全挥发。
(8)加50ul双蒸水或TE溶解DNA中，-20℃保存。
二、特异性引物的设计与合成
本发明通过对Ensemble数据库中rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因序列进行检索，选取适合设计引物的片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组HRM-PCR引物。
1、本申请选取的扩增序列rs2231142如下：5’-AATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTC TTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACG-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：rs2231142-F 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'
下游引物：rs2231142-R 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'
扩增片段大小为：63bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-GATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAAC-3’
/2、本申请选取的扩增rs72552713序列如下：
5’-TCTGGAGATGTTCTGATAAATGGAGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAATGTAATTCAGGTTACGTGGTACAA GTAAGTATTAGTGGGTTTGCATTTTCTGTTTCCTCTGTTTCTATATGGGTAAGTGCTTTGGCTGATAGTTCAATGTGCTTCCAGTTGATTATGTGA-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：ABCG2-F 5'-CGCGACCTGCCAATTTCAA-3'
下游引物：ABCG2-R 5'-TCAGCCAAAGCACTTACCCA-3'
扩增片段大小为：109bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-CGCGACCTGCCAATTTCAAATGTAATTCAGGTTACGTGGTACAAGTAAGTATTAGTGGGTTTGCATTTTCTG TTTCCTCTGTTTCTATATGGGTAAGTGCTTTGGCTGA-3’
3、本申请选取的扩增rs11653176序列如下：
5’-CCACTGGACCCATCCCCGGCAGCCTCCCTCTTCCGAGGCCTGGAGGAGCTCCCGGGTGGCTCTTCTCTCCCA CCGCCTTCTCAGGAGCCCCTTGGAGCATCTCACTGTCATCCGGCAAGAGGATTTGAAGGTGCATTGAG-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：BCAS3-F 5'-GGGTGGCTCTTCTCTCCCA-3'
下游引物：BCAS3-R 5'-TCTTGCCGGATGACAGTGAG-3'
扩增片段大小为：87bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-GGGTGGCTCTTCTCTCCCACCGCCTTCTCAGGAGCCCCTTGGAGCATCTCACTGTCATCCGGCAAGA-3’
4、本申请选取的扩增rs4073582序列如下：
5’-GATGGGGAACAGGGGCAGGATGGGGGTGGGAGTCCTGATGGCAGACACTCAGGCCCCTGTCTGCCCCAGGTA CTTCCACCGTCCTGCAGATGGCTCTGAGGTCATGTATGATGCG-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：CNIH2-F 5'-GGAGTCCTGATGGCAGACAC-3'
下游引物：CNIH2-R 5'-CTGCAGGACGGTGGAAGTAC-3'
扩增片段大小为：61bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-GGAGTCCTGATGGCAGACACTCAGGCCCCTGTCTGCCCCAGGTACTTCCACCGTCCTGCAG-3’
5、本申请选取的扩增rs1260326序列如下：
5’-GCAGACTATAGTGGAGCAGGTGAAAGAGAAGACCAACCACATCCAGGCCCTGGCACACAGCACCGTGGGTCA GACCTTGCTGGTGAGAGTCCAGCCGTGACAAAGGGACCCAGGTGGCAGTTGCAGCCAGGCCTT-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：GCKR-F 5'-AGAGAAGACCAACCACATCCAG-3'
下游引物：GCKR-R 5'-ACCTGGGTCCCTTTGTCAC-3'
扩增片段大小为：91bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-AGAGAAGACCAACCACATCCAGGCCCTGGCACACAGCACCGTGGGTCAGACCTTGCTGGTGAGAGTCCAGCC GTGACAAAGGGACCCAGGT-3’
6、本申请选取的扩增rs179785序列如下：
5’-GCCTGGGCTGTGTGCCCAGCGGCACTTCATGTACGTGGACGGGGCAGGCGGGCAGGCGGGCGTGGAGGAGCT AATGGGTAAGTTAGGCAGCACATTAACAAATGAACCAGCGGATGGGGGTGGGGAGCTCATCTCATTCA-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：KCNQ1-F 5'-ACTTCATGTACGTGGACGGG-3'
下游引物：KCNQ1-R 5'-CCCATCCGCTGGTTCATTTG-3'
扩增片段大小为：95bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-ACTTCATGTACGTGGACGGGGCAGGCGGGCAGGCGGGCGTGGAGGAGCTAATGGGTAAGTTAGGCAGCACAT TAACAAATGAACCAGCGGATGGG-3’
7、本申请选取的扩增rs2188380序列如下：
5’-ATCTTACATTCCCATCAGCAATGTACAAGAGTTCCAGTTCCTCCACATTCTTCCCCAGCATTTGGAATGGTC AATATATTAGATTCCAAGGGTTGCTGTAATTAATTGCCACAAACTGGGGGTCTTAAAACAAGAGAAA-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：MYL2-CUX2-F 5'-TTCCAGTTCCTCCACATTCTT-3'
下游引物：MYL2-CUX2-R 5'-TTACAGCAACCCTTGGAATCT-3'
扩增片段大小为：70bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-TTCCAGTTCCTCCACATTCTTCCCCAGCATTTGGAATGGTCAATATATTAGATTCCAAGGGTTGCTGTAA-3’
8、本申请选取的扩增rs12236871序列如下：
5’-CTCAAAGGAGCTTTGAATCATGTGAAAAATATTTTTGATAAAAATATGAGTAAACAGTATGATGTGGCTACC AAATAAACTGAGTTTTAATACTACATTAGCAAAATTATACAGAAAGAAGGAACTAATTATCTCTTTGCATTTATACTGGAGCCCACACATGGACTAATGCTAGGTTCTGACACTTTAAAAGGATGAATA-3’
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：RFX3-F 5'-TGAGTAAACAGTATGATGTGGCT-3'
下游引物：RFX3-R 5'-CATGTGTGGGCTCCAGTATAA-3'
扩增片段大小为：117bp。扩增的核苷酸序列为：
5’-TGAGTAAACAGTATGATGTGGCTACCAAATAAACTGAGTTTTAATACTACATTAGCAAAATTATACAGAAAG AAGGAACTAATTATCTCTTTGCATTTATACTGGAGCCCACACATG-3’
三、HRM-PCR反应体系和反应条件
以DNA为模板，以上述引物为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR体系：
其中引物采用rs2231142-F和rs2231142-R；rs72552713-F和rs72552713-R、rs11653176-F和rs11653176-R；rs4073582-F和rs4073582-R；rs1260326-F和rs1260326-R；rs179785-F和rs179785-R；rs2188380-F和rs2188380-R、rs12236871-F和rs12236871-R，HRM-PCR采用生工生物(上海)，Green-2-Go qPCR Mastermix试剂盒。HRM分析仪为百源基因ASA-9600实时荧光定量PCR仪。
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s
HRM分析：
94℃90s
60℃30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
四、灵敏度实验
将重组阳性质粒和重组阴性质粒均稀释至50ng/μl，然后二者混合进行梯度稀释，重组阳性质粒占比依次为50％、25％、12.5％、5％、2％和1％，按照上述HRM-PCR反应体系和参数进行扩增，分析突变检出范围，即灵敏度。
反应体系如下：
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
结果参照图1，实验数据显示，当rs2231142阳性质粒与阴性质粒体积比分别为1:1、1:3、1:7、1:19、1:49和1:99时，能检测出阳性质粒，所以本申请所用HRM检测方法的灵敏度为1％。
实施例3应用本发明的检测方法检测样本基因突变
已实施例9步骤中的检测条件，对35例样本进行HRM分析，与rs2231142阳性质粒和阴性质粒熔解曲线对照比较，依此确定样本中的突变类型。根据HRM分析结果针对每种基因型随机挑选1个样本在生工生物(上海)进行Sanger测序验证。
HRM分析结果参见表1和图2，数据显示20例样本中痛风易感基因SNP位点rs2231142野生型有21例，C>A杂合突变型有9例，C>A纯合突变型5例。
Sanger测序结果参见图3：其中a为样本编号6的测序结果，b为样本编号21的测序结果，c为样本编号33的测序结果；与本发明方法检测的结果完全一致。
表1应用本发明的方法对样本的分析结果
样本编号 基因型 样本编号 基因型
1 纯合突变型 19 杂合突变型
2 野生型 20 野生型
3 野生型 21 杂合突变型
4 杂合突变型 22 野生型
5 杂合突变型 23 野生型
6 野生型 24 杂合突变型
7 野生型 25 纯合突变型
8 野生型 26 野生型
9 野生型 27 杂合突变型
10 杂合突变型 28 野生型
11 野生型 29 杂合突变型
12 野生型 30 野生型
13 野生型 31 野生型
14 纯合突变型 32 野生型
15 野生型 33 纯合突变型
16 杂合突变型 34 野生型
17 野生型 35 野生型
18 纯合突变型
实施例4用于检测痛风易感基因8个SNP位点基因型的试剂盒
本发明的用于检测rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的试剂盒包括以下组分：
(1)rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871标准品；
(2)引物：8个SNP位点引物序列为：
(3)含饱和荧光染料Eva Green的PCR扩增试剂
应用该试剂盒检测痛风易感基因SNP位点rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的方法与实施例9相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 洁若, 古
<120> 一种检测痛风易感基因SNP基因型的方法、试剂盒及引物
<130> PJ171
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taaacagtca tggtcttaga aaagactcat tatcattatg tctcattaaa atgctatttg 60
ccttaaggat gatgttgtga tgggcactct gacggtgaga gaaaacttac agttctcagc 120
agctcttcgg cttgcaacaa ctatgacgaa tcatgaaaaa aacgaacgga ttaacagggt 180
cattcaagag ttaggtctgg ataaagtggc agactccaag gtaatgtg 228
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcttataggt tattagatgt cttagctgca aggaaagatc caagtggatt atctggagat 60
gttctgataa atggagcacc gcgacctgcc aatttcaaat gtaattcagg ttacgtggta 120
caagtaagta ttagtgggtt tgcattttct gtttcctctg tttctatatg ggtaagtgct 180
ttggctgata gttcaatgtg cttccagttg attatgtgac atggtcctag aactgacgtt 240
ctttacagca gcttttctta atttctcata gacacttatg tgaaaaggca gggagaatct 300
<210> 3
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaagggggc ctaagtgagg aatgtggctt acggcacagg cttttgcctg catctctggg 60
gtccctagcc agcctcggct cacataaacc ggagcccggt gccactggac ccatccccgg 120
cagcctccct cttccgaggc ctggaggagc tcccgggtgg ctcttctctc ccaccgcctt 180
ctcaggagcc ccttggagca tctcactgtc atccggcaag aggatttgaa ggtgcattga 240
gtcacagctg tggaacttca gcctggcata 270
<210> 4
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcctcttctg tctgatgttt ctgtgtgcag cagagtgggt gaccctgggc ctcaacatcc 60
ccctcctctt ctaccacctc tggaggtgag ggtagcagct gccttgggga ggctgagatg 120
gggaacaggg gcaggatggg ggtgggagtc ctgatggcag acactcaggc ccctgtctgc 180
cccaggtact tccaccgtcc tgcagatggc tctgaggtca tgtatgatgc ggtctccatc 240
atgaatgctg acattctcaa ctactgccag aaggagtcct ggtgcaaact tgccttctac 300
ctgctctcct tcttctatta cctgtacagg tgaggccttg cccacagcag 350
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caggggagca ggaggaacag ctgcacagcc agcctttcga ctctgatgcc ctccccttct 60
cctagacaac ctcacggagg tgcagactat agtggagcag gtgaaagaga agaccaacca 120
catccaggcc ctggcacaca gcaccgtggg tcagaccttg ctggtgagag tccagccgtg 180
acaaagggac ccaggtggca gttgcagcca ggccttcctg gagatgcctc tcctgctcct 240
ctttctctct ctccagatcc ctctgaagaa gctctttccc tccatcatca gcatcacatg 300
<210> 6
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatttgacct atccagaaac aacggctcct tcagtgggct cagcccctga gaccactcag 60
cctgggctgt gtgcccagcg gcacttcatg tacgtggacg gggcaggcgg gcaggcgggc 120
gtggaggagc taatgggtaa gttaggcagc acattaacaa atgaaccagc ggatgggggt 180
ggggagctca tctcattcat ctacaaatta ttaacaataa cttgttca 228
<210> 7
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccaaactggt ttccaaagcg cttgtactat cttacattcc catcagcaat gtacaagagt 60
tccagttcct ccacattctt ccccagcatt tggaatggtc aatatattag attccaaggg 120
ttgctgtaat taattgccac aaactggggg tcttaaaaca agagaaacgt gttttctcac 180
agctctggag gccagaagtt taaagtcaag agtcagcagg gttgattccc tctggaggct 240
ctcagggaga 250
<210> 8
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ataggtgttt tgggaagtat gcattgcagc tcaaaggagc tttgaatcat gtgaaaaata 60
tttttgataa aaatatgagt aaacagtatg atgtggctac caaataaact gagttttaat 120
actacattag caaaattata cagaaagaag gaactaatta tctctttgca tttatactgg 180
agcccacaca tggactaatg ctaggttctg acactttaaa aggatgaata ggcacatctg 240
tatttccaga 250
<210> 9
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
taaacagtca tggtcttaga aaagactcat tatcattatg tctcattaaa atgctatttg 60
ccttaaggat gatgttgtga tgggcactct gacggtgaga gaaaacttaa agttctcagc 120
agctcttcgg cttgcaacaa ctatgacgaa tcatgaaaaa aacgaacgga ttaacagggt 180
cattcaagag ttaggtctgg ataaagtggc agactccaag gtaatgtg 228
<210> 10
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcttataggt tattagatgt cttagctgca aggaaagatc caagtggatt atctggagat 60
gttctgataa atggagcacc gcgacctgcc aatttcaaat gtaattcagg ttacgtggta 120
taagtaagta ttagtgggtt tgcattttct gtttcctctg tttctatatg ggtaagtgct 180
ttggctgata gttcaatgtg cttccagttg attatgtgac atggtcctag aactgacgtt 240
ctttacagca gcttttctta atttctcata gacacttatg tgaaaaggca gggagaatct 300
<210> 11
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggaagggggc ctaagtgagg aatgtggctt acggcacagg cttttgcctg catctctggg 60
gtccctagcc agcctcggct cacataaacc ggagcccggt gccactggac ccatccccgg 120
cagcctccct cttccgaggc ctggaggagc tcccgggtgg ctcttctctc ccaccgcctc 180
ctcaggagcc ccttggagca tctcactgtc atccggcaag aggatttgaa ggtgcattga 240
gtcacagctg tggaacttca gcctggcata 270
<210> 12
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcctcttctg tctgatgttt ctgtgtgcag cagagtgggt gaccctgggc ctcaacatcc 60
ccctcctctt ctaccacctc tggaggtgag ggtagcagct gccttgggga ggctgagatg 120
gggaacaggg gcaggatggg ggtgggagtc ctgatggcag acactcaggc ccctgtctac 180
cccaggtact tccaccgtcc tgcagatggc tctgaggtca tgtatgatgc ggtctccatc 240
atgaatgctg acattctcaa ctactgccag aaggagtcct ggtgcaaact tgccttctac 300
ctgctctcct tcttctatta cctgtacagg tgaggccttg cccacagcag 350
<210> 13
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caggggagca ggaggaacag ctgcacagcc agcctttcga ctctgatgcc ctccccttct 60
cctagacaac ctcacggagg tgcagactat agtggagcag gtgaaagaga agaccaacca 120
catccaggcc ctggcacaca gcaccgtggg tcagaccttg ccggtgagag tccagccgtg 180
acaaagggac ccaggtggca gttgcagcca ggccttcctg gagatgcctc tcctgctcct 240
ctttctctct ctccagatcc ctctgaagaa gctctttccc tccatcatca gcatcacatg 300
<210> 14
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aatttgacct atccagaaac aacggctcct tcagtgggct cagcccctga gaccactcag 60
cctgggctgt gtgcccagcg gcacttcatg tacgtggacg gggcaggcgg gcaggcaggc 120
gtggaggagc taatgggtaa gttaggcagc acattaacaa atgaaccagc ggatgggggt 180
ggggagctca tctcattcat ctacaaatta ttaacaataa cttgttca 228
<210> 15
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccaaactggt ttccaaagcg cttgtactat cttacattcc catcagcaat gtacaagagt 60
tccagttcct ccacattctt ccccagcatt tggaatggtc aatacattag attccaaggg 120
ttgctgtaat taattgccac aaactggggg tcttaaaaca agagaaacgt gttttctcac 180
agctctggag gccagaagtt taaagtcaag agtcagcagg gttgattccc tctggaggct 240
ctcagggaga 250
<210> 16
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ataggtgttt tgggaagtat gcattgcagc tcaaaggagc tttgaatcat gtgaaaaata 60
tttttgataa aaatatgagt aaacagtatg atgtggctac caaataagct gagttttaat 120
actacattag caaaattata cagaaagaag gaactaatta tctctttgca tttatactgg 180
agcccacaca tggactaatg ctaggttctg acactttaaa aggatgaata ggcacatctg 240
tatttccaga 250
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gatgggcact ctgacggt 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gttgttgcaa gccgaagagc 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cgcgacctgc caatttcaa 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcagccaaag cacttaccca 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gggtggctct tctctccca 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tcttgccgga tgacagtgag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggagtcctga tggcagacac 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctgcaggacg gtggaagtac 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agagaagacc aaccacatcc ag 22
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acctgggtcc ctttgtcac 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acttcatgta cgtggacggg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cccatccgct ggttcatttg 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ttccagttcc tccacattct t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ttacagcaac ccttggaatc t 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgagtaaaca gtatgatgtg gct 23
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
catgtgtggg ctccagtata a 21

Claims (6)

1.一种检测痛风易感基因SNP基因型PCR-HRM引物，其特征在于，所述的引物序列为如下任意一对或多对：
上游引物 下游引物 rs2231142 5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3' 5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3' rs72552713 5'-CGCGACCTGCCAATTTCAA-3' 5'-TCAGCCAAAGCACTTACCCA-3' rs11653176 5'-GGGTGGCTCTTCTCTCCCA-3' 5'-TCTTGCCGGATGACAGTGAG-3' rs4073582 5'-GGAGTCCTGATGGCAGACAC-3’ 5'-CTGCAGGACGGTGGAAGTAC-3' rs1260326 5'-AGAGAAGACCAACCACATCCAG-3' 5'-ACCTGGGTCCCTTTGTCAC-3' rs179785 5'-ACTTCATGTACGTGGACGGG-3' 5'-CCCATCCGCTGGTTCATTTG-3' rs2188380 5'-TTCCAGTTCCTCCACATTCTT-3' 5'-TTACAGCAACCCTTGGAATCT-3' rs12236871 5'-TGAGTAAACAGTATGATGTGGCT-3' 5'-CATGTGTGGGCTCCAGTATAA-3'
或上述引物对的衍生序列。
2.一种检测痛风易感基因SNP基因型的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.8，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ IDNo.9-SEQ ID No.16；
(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，再对扩增产物进行HRM分析，收集数据；
(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本SNP位点的基因型：
如果与重组阴性质粒的熔解曲线重合，则痛风易感基因位点rs2231142的基因型为CC；rs72552713的基因型为CC；rs11653176的基因型为TT；rs4073582的基因型为GG；rs1260326的基因型为TT；rs179785的基因型为GG；rs2188380的基因型为TT；rs12236871的基因型为AA；
如果与重组阳性质粒的熔解曲线重合，则痛风易感基因SNP位点rs2231142的基因型为AA；rs72552713的基因型为TT；rs11653176的基因型为CC；rs4073582的基因型为AA；rs1260326的基因型为CC；rs179785的基因型为AA；rs2188380的基因型为CC；rs12236871的基因型为GG；
如果在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的，则痛风易感基因位点rs2231142的基因型为CA，rs72552713的基因型为CT；rs11653176的基因型为CT；rs4073582的基因型为GA；rs1260326的基因型为CT；rs179785的基因型为AG；rs2188380的基因型为CT；rs12236871的基因型为GA。
3.如权利要求2所述的所述的方法，其特征在于，HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
4.如权利要求2所述的所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增时的反应体系为：
5.如权利要求2所述的所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增时反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒内包含有如权利要求1所述的引物对或其衍生序列、重组阴性质粒、重阳性质粒和PCR试剂。
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