CN109825576B - 听神经病谱系障碍相关的otof基因突变检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒，试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。使用本发明所述试剂盒检测患者中是否存在OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp缺失突变，从而诊断听神经病谱系障碍发生的原因。该试剂盒将有利于临床上开展听神经病谱系障碍患者的OTOF突变筛查工作，为听神经病谱系障碍患者的诊断提供依据。

Description

听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及在诊断听神经病/听神经病谱系障碍中应用的OTOF基因突变c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)分型检测试剂盒。

背景技术

听神经病(auditory neuropathy,AN)是耳蜗内毛细胞、听神经突触或听神经功能不良所导致的听力障碍。它是导致婴幼儿和青少年语言交流障碍的重要疾病，在每年新发的听力损失患儿中约占8％，其发病与遗传因素密切相关。

听神经病依据发病部位分为两型：Ⅰ型听神经病为突触后型；Ⅱ型听神经病为突触及突触前型。人工耳蜗植入对于双耳重度感音神经性耳聋患者，是最好的治疗选择，但仅对Ⅱ型听神经病有效。听神经病诊断依靠听力学及影像学检查，但依据听力学检查结果无法进行分型，目前致病基因型是分型的主要依据。与Ⅱ型听神经病谱系障碍相关的基因主要是OTOF基因。

OTOF(otoferlin)基因是第一个克隆的与非综合征型听神经病相关的基因，位于2p23的DFNB9基因座内。OTOF基因DNA序列全长101496bp，共有4种长短不同的转录本变异体。其中最长的亚型包含48个外显子，编码氨基酸长度为1997aa的蛋白质Otoferlin。Yasunaga等对多个常染色体隐性非综合征型语前聋家系进行候选基因研究，发现三个家系共21名患病成员的OTOF基因都在第18个外显子发生无义突变，提前生成终止密码子并形成截短蛋白，致使其编码的Otoferlin蛋白不完整。在内耳中，Otoferlin蛋白在成熟的耳蜗中只表达于内毛细胞，且大多表达于内毛细胞基底外侧部。该蛋白是一种钙离子感受器，基因突变可导致内毛细胞活动区囊泡的胞吐作用被抑制，神经递质释放减少，进而引起神经冲动的减少；此外，神经递质可能对突触后神经纤维有营养作用，如营养作用的减弱可导致突触后膜产生退行性病变，或许可以解释听神经病谱系障碍(ANSD)患者渐进性听力损失的特点。

根据文献报道OTOF基因突变在世界范围内广泛存在于SNHL人群中，同时也是ANSD患者的主要致病突变。根据文献统计我国汉族ANSD患者中约5.5％的散发病例可将病因归于OTOF基因的突变。不同地区和种族ANSD人群的突变谱还不完善，目前已知的OTOF基因突变类型有100余种，绝大多数为无义突变、截短突变或移码突变。OTOF基因是目前研究最为广泛和深入的ANSD相关基因。

综合国内外文献报道的治疗经验，相比传统助听器和药物治疗，人工耳蜗植入的干预效果更为确切，但差异很大，具体到个体患者的选择仍需谨慎。以往研究认为可参考以下几个方面预测植入后的效果：1、术前MRI如发现中枢系统病变，可能预示术后效果不佳，尤其是有蜗神经缺失或形态异常时；2、基因突变类型与术后疗效的关系还不确定，现有研究结果可作为参考，通常认为OTOF突变引起突触前病变导致的ANSD术后效果较好，推测是人工耳蜗提供的直接电刺激绕过了病变部位，而轴突损伤导致突触后病变和涉及听神经全程的病变(如遗传性共济失调症和耳聋-肌张力不全症-视神经元病)引起的ANSD术后效果较差。所以明确听神经病/听神经病谱系障碍致病基因，对患者进行分型并评估人工耳蜗的植入效果具有重要意义。目前尚未见到关于OTOF基因缺失突变NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含人OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位所对应的碱基。

优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。

优选的，所述PCR引物选自以下三对引物P1、P2、P3中的一对：

引物对P1的序列为：

OTOF-F-1:5’-AGGCAGCACCGGATTGGA-3’；

OTOF-R-1:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’；

引物对P2的序列为：

OTOF-F-2:5’-CCAACCCTCAGCTCCACCTA-3’；

OTOF-R-2:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’；

引物对P3的序列为：

OTOF-F-3:5’-GGGGACACGGGCTAATGCT-3’；

OTOF-R-3:5’-GCTCCTGTCCTTGTCTGTGCC-3’。

利用上述试剂盒检测OTOF基因c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)突变的方法，包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，以上述PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并根据该目标片段中对应于人OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位的碱基缺失情况进行分型鉴定。

优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列(Gene ID:9381)进行比对，确定待测个体对应于人OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位的基因型或等位基因类型。

优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型W/W、突变杂合型W/D或突变纯合型D/D，其中W:野生型；D:缺失。

上述试剂盒在听神经病谱系障碍病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测来自于待测样本(患者的OTOF基因片段)中对应于人OTOF基因CDS区(NM_01287489.1)第1945-1960位是否存在c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)缺失突变，从而判断该患者听神经病谱系障碍发生的遗传性原因。其中，OTOF基因发生c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)缺失突变，使氨基酸序列自649位发生移码改变，并使氨基酸的编码提前终止于第660位的氨基酸(p.R649Gfs*11)，形成Otoferlin的截短肽链，丧失其功能，不成熟的表达产物诱导启动体内调节机制，使变异的mRNA降解。

本发明的有益效果体现在：

本发明所提出的试剂盒可用于快速地检测OTOF基因特定突变位点，通过检测来自患者的DNA样本中是否存在OTOF基因c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)缺失突变，可以判断该患者听神经病谱系障碍发生原因，进而为临床诊断提供依据。

本发明所提出的试剂盒在用于听神经病谱系障碍的诊断时：1)本发明将为在听神经病谱系障碍患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；2)通过产前诊断筛查，明确胎儿是否携带c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)突变，降低聋儿的出生率，为社会和家庭减轻负担；3)将有利于为不同类型听神经病谱系障碍患者确定个体化治疗方案，避免人工耳蜗植入无效而造成的不必要的经济损失。

附图说明

图1为OTOF基因编码区核苷酸与氨基酸的对照(NM_001287489.1；NP_001274418.1)：突变位点位于OTOF基因CDS区(NM_01287489.1)第1945-1960位中16个碱基，用方框圈起来的是突变碱基对应的氨基酸。

图2为PCR反应过程示意图：示出了反应温度和时间，其中↓表示每个循环降低0.5℃。

图3为PCR产物电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱：示出了定量Marker的片段位置，扩增的目标序列为372bp。

图4A为OTOF基因测序结果图：示出了纯合突变序列(患者序列)，箭头表示缺失的位置。

图4B为OTOF基因测序结果图：示出了野生型序列，方框表示缺失的碱基序列。

图4C为OTOF基因测序结果图：示出了杂合突变序列(单杂合携带者序列)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，以下实施例用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明通过全外显子二代测序的方法，从一个近亲家系中查找致病基因位点。在对200例非综合征型听神经病谱系障碍患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查中，在一例听神经病谱系障碍患者发现OTOF基因的NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)纯合突变，OTOF基因突变与听神经病谱系障碍表型共分离。OTOF基因突变相关的听神经病/听神经病谱系障碍以常染色体隐性遗传的方式传递。目前国际上报道的与听神经病/听神经病谱系障碍相关的突变有117种，尚无NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp这一缺失突变的报道。

参见图1，上述突变(NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp)使位于OTOF基因CDS区(NM_001287489.1)的第1945-1960位的16个碱基缺失(即c.1945_1960del16bp突变)，使得氨基酸编码自第649位发生移码，在第660位的氨基酸密码子变为终止密码子，突变发生后基因表达产物由正常的1997个氨基酸长度的肽链变成了659个氨基酸。截短的氨基酸肽链启动体内调节机制，使变异的mRNA降解。

检测上述突变(c.1945_1960del16bp)可采用多种检测点突变的方法来进行，例如PCR(聚合酶链反应)-测序法、采用标记的OTOF基因DNA探针杂交法、用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。其中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：

1)采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组DNA；

2)以该DNA为模板，以针对OTOF基因CDS区(NM_001287489.1)第1945-1960位碱基设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；

3)将得到的PCR扩增产物进行直接测序分析，将测序所得到的序列与OTOF基因参考序列(Gene ID:9381)进行比较，确定待测个体OTOF基因是否存在c.1945_1960del16bp突变；

4)根据以上结果判断待测个体是否为OTOF基因突变c.1945_1960del16bp导致的听神经病谱系障碍。

在上述步骤2)中使用的PCR引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计：通常为15～30个碱基，GC含量为45～50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。

上述步骤2)所得到的PCR反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的OTOF核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。

根据检测方法的不同，用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的试剂盒中，除了包括PCR反应试剂，还包括检测PCR扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。

试剂盒容器内装有用以检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于PCR反应试剂，例如，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。

实例1

通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者，包括听神经病谱系障碍患者，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用蛋白酶降解的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用引物设计软件Primer5设计引物(扩增目标区域为OTOF基因的第17号外显子，参考序列：Gene ID:9381，扩增目标片段大小为372bp)，以基因组DNA为模板，BIORAD MyCycle热循环仪上进行PCR扩增。PCR扩增产物直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3730DNA测序仪。序列测序结果与GenBank中的序列(Gene ID:9381)比较，确定OTOF c.1945_1960del16bp突变，具体如下：

(一)待测血样提取与OTOF基因编码区的PCR扩增

1、待测对象血样DNA的制备

1.1研究对象

对200例散发听神经病耳聋患者和100名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行OTOF基因的筛查。

散发听神经病耳聋受试者采集自在西京医院(陕西省西安市)耳鼻咽喉头颈外科门诊做耳聋基因筛查的耳聋患者。听力正常对照是无耳聋家族史的听力正常受试者，对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5～10mL，采集时间是2009年10月。

1.2基因组DNA提取

1.2.1实验前准备及重要注意事项

(1)向蛋白酶K中加入制定用量的Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K(蛋白酶K)勿长时间室温存放，避免反复冻融，以免影响其活性。

(2)所有离心操作均在室温下完成。

(3)血样样品的储存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存最多10天，对于某些实验例如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，请将血液样品在2～8℃储存不超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。

1.2.2操作步骤

1)低速离心至血样分层，用移液枪去除上层血清，注意不要吸取或损坏中间层的黄膜层。

2)将全部血细胞转移至5mL离心管中，加入红细胞裂解液至总体积为4mL，上下颠倒混匀20次至沉淀充分分散。

3)6500g离心10min，弃去上清。

4)加入3mL Buffer FG1，涡漩振荡15s，使沉淀充分分散。

5)6500g离心10min，弃去上清，将离心管倒扣在干净的吸水纸上，吸干水分。

6)配制DNA提取液与蛋白酶K的混合液，混合比例为DNA提取液:蛋白酶K＝100:1，混合后涡漩振荡15s充分混匀，按需配制，现配现用。

7)向样品中加入配制好的DNA提取液与蛋白酶K的混合液1mL，立即充分涡漩振荡1min，直至溶液无团块。

8)将样品置于65℃水浴锅中温育15min，其间颠倒混匀3次，至样品颜色从红色变成淡绿色，说明蛋白完全消化。

9)向样品中加入2mL异丙醇，颠倒混匀10次至可见白色絮状沉淀。

10)取干净无菌的1.5mL离心管，做好标记，加入500μL预冷的75％乙醇。

11)用干净无菌的1mL移液器tip头挑取步骤9)中的白色絮状沉淀转移至步骤10)中准备好的75％乙醇中，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，注意不要倒掉白色絮状沉淀。

11)再次加入500μL预冷的75％乙醇，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，吸干。

12)打开管盖，室温干燥15min，至所有液体完全挥发。

13)加入380μL DNA溶解液，置于65℃水浴/金属浴中温育2h，同时进行振荡使DNA充分溶解。

14)分光光度计定量及检测纯度。

15)-20℃保存DNA。

2、OTOF基因编码区的PCR扩增

2.1引物序列

使用Primer5引物设计软件，参考序列基因Gene ID:9381)，序列合成后用于此检测，设计完成时间为2018年5月：

上游引物OTOF-F-1:5’-AGGCAGCACCGGATTGGA-3’；

下游引物OTOF-R-1:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’。

使用该引物进行PCR扩增所获得的片段大小为372bp。

2.2 PCR反应体系的建立(表1)

表1.OTOF基因的PCR反应体系

其中，PCR扩增使用天根公司PCR Mix。

反应条件：PCR反应在BIORAD My Cycle热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示。

PCR产物电泳流程：

1)配胶(1％琼脂糖)：称取0.4g琼脂糖，悬浮于40mL×TAE中(500ml锥形瓶)。

2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。

3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μL，10mg/mL)，摇匀。

4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250mL胶液全部倒入平板，插入梳尺。

5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TAE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

6)加样：用移液器按规定格式加样，最后加入MarkerDL2000。

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相。经过电泳后，有6条带可见，MarkerDL2000(TaKaRa)片段长度分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，DL2000的总浓度是300ng/5μL。电泳时取5μLDL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取5μL(PCR产物)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的大小及含量(参见图3)。

(二)OTOF基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量

PCR扩增产物的纯化(96孔板法)：

1)PCR扩增产物电泳结束后，在长波365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔号中。

2)4000rpm离心1min，加入500ul溶胶液，盖上封口膜，65℃水浴15min，定时。

3)检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μL混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600～800rpm震荡5min。

4)将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

5)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μL 8道电动移液器向每孔移入500μL洗液，盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

6)弃废液，吸水纸上轻磕，用50-1200μL 8道电动移液器向每孔移取500μL 70％乙醇盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

7)弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm水平震荡5min。

8)离心至1000rpm，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min。

9)2μL样品+6μL 1.4X溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，按照A01-H01的竖向顺序横向点入，中间空出2孔，分别加入1μL、2μL量的DL2000，300V电泳11min。

10)将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像，图像必须保证marker条带清晰。

11)对照纯化前后胶图，根据PCR定量标准在PCR记录表上标注每孔扩增产物纯化后所得测序模板的浓度并稀释至指定浓度，对回收后电泳无条带的样品按照4μL样品+5μL1.4X溴酚蓝再次电泳鉴定。

12)将稀释后上述模板离心2min，离心至4000rpm，标记Lims系统模板状态，确认提交前需要再次核对上述模板状态，确认无误后将上述模板4℃冰箱保存。

(三)纯化的OTOF基因编码区PCR扩增产物的直接测序

1、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求见表2。

DNA纯度：OD260/OD280＝1.6～2.0。

DNA浓度：PCR产物10ng/μL。

表2.DNA用量

PCR产物长度(bp)	测序反应加入模板量(ng)
		100～200	1～3
200～500	3～10
		500～1000	5～20
1000～2000	10～40
		>2000	40～100

2、测序反应

1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如96孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

3)目前的反应体系为5μL，各种试剂加入量如表3所示。

表3.OTOF基因PCR扩增产物的测序反应体系

其中，BDT为美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的荧光染料。5×GCbuffer是美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的缓冲液。

4)样品放于PCR仪(热循环仪)上，所作反应的过程见表4。

表4.OTOF基因PCR扩增产物的测序反应过程

5)反应完的样品要及时从PCR仪(热循环仪)上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

3、测序反应物的纯化和测序

1)向每孔中加入20μL 80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；

2)在每孔中加入30μL 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

3)重复步骤2)再两次；

4)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

5)加入5μL甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

6)上机前95℃变性5min，放置冰上2min，离心后上ABI 3730测序仪。

测序结果如图4A、图4B、图4C所示。

(四)检测耳聋相关基因OTOF突变位点(c.1945_1960del16bp)试剂盒及其应用

1、试剂盒的组成

(1)扩增用引物：

上游引物：OTOF-F-1:5’-AGGCAGCACCGGATTGGA-3’；

下游引物：OTOF-R-1:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3”

(2)PCR扩增用PCR Mix 2×

(4)dNTP 2.5mM

(5)Big-Dye mix(美国应用生物系统公司(ABI)生产)

2、使用方法

主要包括如下步骤：

1)PCR扩增

用软件Primer 5.0对OTOF基因的编码区设计PCR引物，反应条件见(图2)。

2)PCR产物纯化

PCR产物电泳，凝胶纯化及电泳定量。

3)测序反应及验证

以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在BIORAD My Cycle热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABI 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与正常序列(Gene ID:9381)比较，以确定突变是否存在。

200例患者中，1例听神经病谱系障碍患者的OTOF基因检测发现为c.1945_1960del16bp纯合突变。对100名听力正常者的筛查中未发现c.1945_1960del16bp突变者。

实例2

扩增引物(设计完成时间2018年5月)如下，其他同实例1(扩增目标区域为OTOF基因的第17号外显子，参考序列：Gene ID:9381)：

上游引物OTOF-F-2:5’-CCAACCCTCAGCTCCACCTA-3’

下游引物OTOF-R-2:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’

实例3

扩增引物(设计完成时间2018年5月)如下，其他同实例1(扩增目标区域为OTOF

基因的第17号外显子，参考序列：Gene ID:9381)：

OTOF-F-3:5’-GGGGACACGGGCTAATGCT-3’

OTOF-R-3:5’-GCTCCTGTCCTTGTCTGTGCC-3’。

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒

<160> 6

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aggcagcacc ggattgga 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccaggtaggg cagatggaag t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccaaccctca gctccaccta 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccaggtaggg cagatggaag t 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggggacacgg gctaatgct 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gctcctgtcc ttgtctgtgc c 21

Claims (5)

1.一种检测分子标记的试剂在制备听神经病谱系障碍病因学分析试剂中的应用，其特征在于：所述分子标记为OTOF基因c.1945_1960del16bp突变。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的方法包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并根据该目标片段中对应于OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位的碱基缺失情况进行分型鉴定。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR引物选自以下三对引物P1、P2、P3中的一对：

引物对P1的序列为：

OTOF-F-1:5’-AGGCAGCACCGGATTGGA-3’；

OTOF-R-1:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’；

引物对P2的序列为：

OTOF-F-2:5’-CCAACCCTCAGCTCCACCTA-3’；

OTOF-R-2:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’；

引物对P3的序列为：

OTOF-F-3:5’-GGGGACACGGGCTAATGCT-3’；

OTOF-R-3:5’-GCTCCTGTCCTTGTCTGTGCC-3’。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列进行比对，确定待测个体对应于OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位的基因型或等位基因类型。

5.根据权利要求2所述变的应用，其特征在于：根据比对确定的基因型包括野生纯合型W/W、突变杂合型W/D或突变纯合型D/D。

Images