CN109536602A - 一种前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒。试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。使用本发明所述试剂盒检测患者是否存在SLC26A4基因c.1656T>G突变，从而诊断前庭导水管扩大/Pendred综合征发生的原因，该试剂盒将有利于临床上开展前庭导水管扩大/Pendred综合征患者的SLC26A4突变筛查工作，为前庭导水管扩大/Pendred综合征患者的诊断提供依据。

Description

一种前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变 检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及在临床诊断前庭导水管扩大/Pendred综合征中应用的SLC26A4基因单个突变位点c.1656T>G(p.S552R)分型检测试剂盒。

背景技术

1997年Everett首先报道Pendred综合征的致病基因为SLC26A4基因。Pendred综合征表现为先天性的感音神经性耳聋，耳蜗畸形(前庭导水管扩大或Mondini畸形)合并甲状腺肿大，它的遗传方式为常染色体隐性遗传。1999年Usami在6个单纯前庭导水管扩大家庭(无甲状腺肿，无Mondini畸形)内进行SLC26A4基因全序列筛查，发现有4名患者为SLC26A4基因纯合或复合杂合突变，认为SLC26A4基因同样可以导致单纯前庭导水管扩大。2001年Campbell在6个前庭导水管扩大家系和5个Mondini畸形家系中各发现5名和4名患者存在SLC26A4基因突变，认为SLC26A4基因是颞骨畸形最主要的致病原因。由此，学者普遍认为SLC26A4基因突变可以导致Pendred综合征、单纯前庭导水管扩大或者合并内耳畸形的前庭导水管扩大。前庭导水管扩大是最常见的内耳畸形。临床表现为学语前感音神经性或混合型耳聋，有时呈波动性或渐进性。其波动性常与头部外伤、感冒有关，可伴有或不伴有眩晕。

SLC26A4基因mRNA全长4930bp，含有21个外显子，开放阅读框起始于2号外显子，全长2343bp，编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin，主要分布于甲状腺、内耳和肾脏。Pendrin相对分子量86000，具有11个跨膜区域，5个细胞外环，5个细胞内环，胞内氨基末端和胞外羧基末端。主要由疏水性氨基酸组成，属于离子转运体家族，研究表明其功能主要与碘/氯离子转运有关。Yang J等学者认为，SLC26A4基因突变可引起Pendrin蛋白功能障碍，氯离子转运障碍，导致内耳淋巴液流动异常，结果使前庭水管扩大，内淋巴管内压上升，内耳毛细胞受损和听神经萎缩，最终影响听力。还有研究表明Pendrin蛋白参与协调内耳的发育，在基因水平上，它均有连接同源异形盒与转录因子的功能。

SLC26A4基因目前发现的突变达120多种，遍布于各个外显子或其侧翼序列；其中错义突变占了绝大部分，此外还有剪接位点突变与框移突变。而且患者的基因型也多种多样，可以表现为一致的纯合状态，也可以是任意两种突变的组合，即表现为复合杂合状态，充分体现了突变类型的个体化，也提高了发现新的突变位点的难度。

由于SLC26A4基因突变种类多样，且在不同种族间呈现出明显的多样性，不同地域、种族的优势等位基因有所不同，所以发现不同地域人种各自所特有的突变位点显得尤为重要，但目前，尚缺乏此类针对特定人种的SLC26A4基因突变位点的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测SLC26A4基因c.1656T>G(p.S552R)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第1656位所对应的碱基。

优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。

优选的，所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：

SLC26A4-F1:5’-AGTTGAGTGCTGCTACCCAGCTC-3’；

SLC26A4-R1:5’-GCCTATTCCTGATTGGACC-3’。

优选的，所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：

SLC26A4-F2:5’-TGAGCAACTGTGACTTGACT-3’；

SLC26A4-R2:5’-ATTGCCCTACACAAAGGGAA-3’。

利用上述试剂盒检测SLC26A4基因c.1656T>G(p.S552R)突变的方法，包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，以上述PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第1656位的碱基进行分型鉴定。

优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与所述参考序列进行比对，确定待测个体对应于人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第1656位的基因型或等位基因类型。

优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型T/T、突变杂合型T/G或突变纯合型G/G。

上述试剂盒在前庭导水管扩大/Pendred综合征病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测待测样本(来自于患者的SLC26A4基因片段)中对应于人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第1656位是否存在c.1656T>G突变，从而判断该患者前庭导水管扩大/Pendred综合征发生的遗传性原因。其中，SLC26A4基因的c.1656T>G突变引起位于Pendrin蛋白第二跨膜区第552位丝氨酸变成了精氨酸(p.S552R)。

本发明的有益效果体现在：

本发明所提出的试剂盒可用于快速地检测SLC26A4基因特定突变位点，通过检测来自患者的DNA样本中是否存在SLC26A4基因c.1656T>G突变，可以判断该患者的前庭导水管扩大/Pendred综合征发生原因，进而为临床诊断提供依据。

本发明将为在前庭导水管扩大/Pendred综合征患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；同时，可以通过产前诊断筛查及新生儿SLC26A4基因突变的普遍筛查，降低前庭导水管扩大患儿的出生率，为社会和家庭减轻负担。

本发明针对420名前庭导水管扩大患者开展了SLC26A4基因的筛查，发现中国人特有的c.1656T>G突变(同源氨基酸序列的进化研究结果表明，该突变位点具有高度保守性，100名听力正常人的筛查中未检测到该突变，说明这一突变与前庭导水管扩大相关)，进而提供检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的试剂盒。该试剂盒将有助于快速、高效地在更大范围的前庭导水管扩大/Pendred综合征患者人群中进行突变位点的检测，为前庭导水管扩大/Pendred综合征开展临床干预提供重要的指导。

附图说明

图1为SLC26A4基因编码区核苷酸与氨基酸的对照：突变位于SLC26A4基因第1656位(T碱基)，突变后的碱基序列使第552位(方框内)氨基酸由丝氨酸突变为精氨酸。

图2为PCR反应过程示意图：示出了反应温度和时间，↓表示每个循环降低0.5℃。

图3A为SLC26A4基因测序结果图：杂合突变序列(患者序列，T/G)，箭头表示突变位点位置。

图3B为SLC26A4基因测序结果图：野生型序列(T/T)，箭头表示正常位点位置。

图4为突变位点处氨基酸物种保守性分析：突变位点为箭头所标识位置。

图5为扩增产物的电泳图谱：泳道1为Marker，泳道2为扩增的目标序列。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，以下实施例用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

SLC26A4基因突变相关的前庭导水管扩大/Pendred综合征以常染色体隐性遗传的方式传递。本发明应用候选基因筛查的方法对420例前庭导水管扩大患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查，在一例前庭导水管扩大患者中发现SLC26A4基因存在c.1656T>G杂合突变(且存在与已报道的另一突变位点形成复合杂合突变的情况)，导致前庭导水管扩大。目前报道的SLC26A4基因突变有120余种，尚无c.1656T>G突变的报道。

参见图1，上述突变(c.1656T>G)使位于SLC26A4基因编码区的第1656位碱基发生由T到G的颠换(野生型SLC26A4基因的标准序列可以参考，例如基因ID：5172)，使得第552位丝氨酸变成了精氨酸(p.S552R)。参见图4，该位点在各个物种之间是高度保守的。

检测上述突变(c.1656T>G)可采用多种检测点突变的方法来进行，例如PCR(聚合酶链反应)-测序法、标记的SLC26A4基因DNA探针杂交法、限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。其中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：

1)采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组DNA；

2)以该DNA为模板，以针对SLC26A4基因编码区第1656位碱基附近设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；

3)将得到的PCR扩增产物进行直接测序分析，将测序所得到的序列与SLC26A4正常基因的序列(基因ID：5172)进行比较，确定待测个体SLC26A4基因是否存在c.1656T>G突变；

4)根据以上结果判断待测个体是否为SLC26A4基因突变c.1656T>G导致的前庭导水管扩大/Pendred综合征。

在上述步骤2)中使用的PCR引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计：通常为15～30个碱基，GC含量为45～50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。

上述步骤2)所得到的PCR反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的SLC26A4核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。

根据检测方法的不同，用于检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的试剂盒中，除了包括PCR反应试剂，还包括检测PCR扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。

试剂盒容器内装有用以检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于PCR反应试剂，例如，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。

实例1

通过聋病门诊收集各种感音神经性耳聋患者，建立耳聋样本资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取3～5mL血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用试剂盒提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primer3设计引物(包含SLC26A4整个编码区以及外显子侧翼序列)，以基因组DNA为模板，PCR扩增目标片段。PCR扩增产物直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3730DNA测序仪。测序得到的序列与Genbank中的序列(基因ID：5172)比较确定SLC26A4基因突变位点。具体如下：

(一)待测血样提取与SLC26A4基因编码区的PCR扩增

1、待测对象血样DNA的制备

1.1研究对象

对就诊于西京医院(陕西省西安市)耳鼻咽喉头颈外科门诊的100例散发前庭导水管扩大患者和100名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行SLC26A4基因的筛查。

对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样3～5mL(2014年1月)。

1.2基因组DNA提取

1.2.1实验前准备及重要注意事项

(1)所有离心操作均在室温下完成。

(2)血样样品的储存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存最多10天，对于某些实验例如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，请将血液样品在2～8℃储存不超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。

1.2.2操作步骤

1)低速离心至血样分层，用移液枪去除上层血清，注意不要吸取或损坏中间层的黄膜层。

2)将全部血细胞转移至5mL离心管中，加入红细胞裂解液至总体积为4mL，上下颠倒混匀20次至沉淀充分分散。

3)6500g离心10min，弃去上清。

4)加入3mL红细胞裂解液，涡漩振荡15s，使沉淀充分分散。

5)6500g离心10min，弃去上清，将离心管倒扣在干净的吸水纸上，吸干水分。

6)配制DNA提取液与蛋白酶K的混合液，混合比例为DNA提取:蛋白酶K＝100:1，混合后涡漩振荡15s充分混匀，按需配制，现配现用。

7)向样品中加入配制好DNA提取液与蛋白酶K的混合液1mL，立即充分涡漩振荡1min，直至溶液无团块。

8)将样品置于65℃水浴锅中温育15min，其间颠倒混匀3次，至样品颜色从红色变成淡绿色，说明蛋白完全消化。

9)向样品中加入2mL异丙醇，颠倒混匀10次至可见白色絮状沉淀。

10)取干净无菌的1.5mL离心管，做好标记，加入500μL预冷的75％乙醇。

11)用干净无菌的1mL移液器tip头挑取步骤9)中的白色絮状沉淀转移至步骤10)中准备好的75％乙醇中，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，注意不要倒掉白色絮状沉淀。

11)再次加入500μL预冷的75％乙醇，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，吸干。

12)打开管盖，室温干燥15min，至所有液体完全挥发。

13)加入380μL DNA溶解液，置于65℃水浴/金属浴中温育2h，同时进行振荡使DNA充分溶解。

14)分光光度计定量及检测纯度。

15)-20℃保存DNA。

2、SLC26A4基因编码区的PCR扩增

2.1引物序列(使用Primer3在线设计软件，参考序列基因ID：5172，序列合成后用于此检测，引物设计完成时间为2018年3月)

SLC26A4-F1:5’-AGTTGAGTGCTGCTACCCAGCTC-3’

SLC26A4-R1:5’-GCCTATTCCTGATTGGACC-3’

使用该引物进行PCR扩增所获得的片段大小为312bp。

2.2PCR反应体系的建立(表1)

表1.SLC26A4基因的PCR反应体系

其中，PCR扩增使用天根生化科技有限公司PCR Mix(Taq酶、缓冲液、dNTP)。

反应条件：PCR反应在BIORAD My Cycle热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示：

1)94℃预变性4分钟；

2)94℃变性30秒，61℃(起始退火温度，后每个循环降低0.5℃)退火30秒，72℃延伸40秒，12个循环；

3)再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30个循环；

4)反应结束后再72℃延伸5分钟，4℃保存。

PCR产物电泳流程：

1)配胶(1％琼脂糖)：称取0.4g琼脂糖，悬浮于40mL×TAE中(500mL锥形瓶)。

2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。

3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μL，10mg/mL),摇匀。

4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。

5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TAE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

6)加样：用移液器按规定格式加样，最后加入MarkerDL2000。

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相。经过电泳后，有6条带可见，MarkerDL2000(TaKaRa)片段长度分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。取5μL DL2000和5μL PCR产物进行电泳。根据PCR产物电泳后的条带位置与DL2000条带位置的比较，判断PCR产物的大小，参见图5。

(二)SLC26A4基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量

PCR扩增产物的纯化(96孔板法)：

1)PCR扩增产物电泳结束后，在长波365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔号中。

2)4000rpm离心1min，加入500μL溶胶液，盖上封口膜，65℃水浴15min。

3)检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μL混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600～800rpm震荡5min。

4)将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

5)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μL 8道电动移液器向每孔移入500μL洗液，盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。

6)弃废液，重复步骤5)。

7)弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm水平震荡5min。

8)离心至1000rpm，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min。

9)2μL样品加6μL 1.4X溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，marker DL2000取5μL，300V电泳11min。

10)将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像，图像必须保证marker条带清晰。DL2000的总浓度是300ng/5μL，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp和100bp，每条带的含量为50ng。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR纯化产物的含量。

(三)纯化的SLC26A4基因编码区PCR扩增产物的直接测序

1、纯化的PCR扩增片段的纯度与用量要求

DNA纯度：OD260/OD280＝1.6～2.0。

DNA浓度：PCR产物10ng/μL。

DNA用量与PCR产物长度对应关系如表2所示：

表2.DNA用量

PCR产物长度(bp)	测序加入量(ng)
		100～200	1～3
200～500	3～10
		500～1000	5～20
1000～2000	10～40
		>2000	40～100

2、测序反应

1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如96孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

3)目前的反应体系为5μL，各种试剂加入量如表3所示。

表3.SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应体系

其中，BDT为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。

4)样品放于BIORAD My Cycle热循环仪上，所作反应的过程见表4。

表4.SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应过程

5)反应完的样品要及时从PCR仪(热循环仪)上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

3、测序反应物的纯化和测序

1)向每孔中加入20μL 80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；

2)在每孔中加入30μL 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

3)重复步骤2)再两次；

4)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

5)加入5μL甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

6)上机前95℃变性5min，放置冰上2min，离心后上ABI 3730测序仪。

测序结果如图3A、图3B所示。

(四)检测耳聋相关基因SLC26A4突变位点(c.1656T>G)试剂盒及其应用

1、试剂盒的组成

(1)扩增用引物：

SLC26A4-F1:5’-AGTTGAGTGCTGCTACCCAGCTC-3’

SLC26A4-R1:5’-GCCTATTCCTGATTGGACC-3’

(2)PCR扩增用Taq酶5U/μL

(3)10×缓冲液(含15mL MgCl₂)

(4)dNTP 2.5mM

(5)BDT(美国应用生物系统公司)

2、使用方法

主要包括如下步骤：

1)PCR扩增

利用软件Primer 3对SLC26A4基因的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，反应条件见图2。

2)PCR产物纯化

PCR产物电泳，凝胶纯化及电泳定量。

3)测序反应及验证

以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在BIORAD My Cycle热循环仪上进行测序反应。反应结束后，产物上样于ABI 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与NCBI网站检索到的SLC26A4基因标准序列(基因ID：5172)比较，以确定突变是否存在。

100例患者中，1例前庭导水管扩大患者的SLC26A4基因检测发现患者为c1656T>G杂合突变。对100名听力正常者的筛查中未发现c.1656T>G突变者。

实例2

扩增引物(设计完成时间2018年3月)如下，其他同实例1：

SLC26A4-F2:5’-TGAGCAACTGTGACTTGACT-3’；

SLC26A4-R2:5’-ATTGCCCTACACAAAGGGAA-3’。

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 一种前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agttgagtgc tgctacccag ctc 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcctattcct gattggacc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgagcaactg tgacttgact 20

<210> 4

<211>20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

attgccctac acaaagggaa 20

Claims (9)

1.一种用于检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含SLC26A4基因编码区第1656位所对应的碱基。

2.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。

3.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。

4.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：

SLC26A4-F1:5’-AGTTGAGTGCTGCTACCCAGCTC-3’；

SLC26A4-R1:5’-GCCTATTCCTGATTGGACC-3’。

5.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.1656C>T突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：

SLC26A4-F2:5’-TGAGCAACTGTGACTTGACT-3’；

SLC26A4-R2:5’-ATTGCCCTACACAAAGGGAA-3’。

6.一种检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于SLC26A4基因编码区第1656位的碱基进行分型鉴定。

7.根据权利要求6所述一种检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的方法，其特征在于：所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列进行比对，确定待测个体对应于SLC26A4基因编码区第1656位的基因型或等位基因类型。

8.根据权利要求6所述一种检测SLC26A4基因c.1656T>G突变的方法，其特征在于：根据比对确定的基因型包括野生纯合型T/T、突变杂合型T/G或突变纯合型G/G。

9.一种如权利要求1所述的试剂盒在前庭导水管扩大/Pendred综合征病因学分析中的应用。